Summary
Denne protokol præsenterer en metode til decellularisering og efterfølgende hydrogel dannelse af murine bryst fedt puder efter ex vivo bestråling.
Abstract
Stråling er en terapi for patienter med tredobbelt negativ brystkræft. Virkningen af stråling på den ekstracellulære matrix (ECM) af sundt brystvæv og dets rolle i lokal gentagelse på den primære tumor site er ukendt. Her præsenterer vi en metode til decellularization, lyofilisering, og fabrikation af ECM silicagelrogeler afledt af murine bryst fedt puder. Resultaterne er præsenteret på effektiviteten af decellularization proces, og rheologiske parametre blev vurderet. Gfp-og luciferase-mærkede brystkræft celler indkapslet i silicagelrogeler viste en stigning i spredningen i bestrålede silicagelrogeler. Endelig, phalloidin konjugat farvning blev anvendt til at visualisere cytoskelet organisation af indkapslede tumorceller. Vores mål er at præsentere en metode til opdigte silicagelrogeler til in vitro-undersøgelse, der efterligner in vivo brystvæv miljø og dets reaktion på stråling for at studere tumor celle adfærd.
Introduction
Kræft er karakteriseret ved overskydende spredning af celler, der kan unddrage apoptose og også metastaserer til fjerntliggende steder1. Brystkræft er en af de mest almindeligt forekommende former blandt kvinder i USA, med en anslået 266.000 nye tilfælde og 40.000 dødsfald i 20182. En særlig aggressiv og svær at behandle subtype er tredobbelt negativ brystkræft (TNBC), som mangler østrogen receptor (ER), progesteron receptor (PR), og human epidermal vækstfaktor (HER2). Strålebehandling er almindeligt anvendt i brystkræft at eliminere resterende tumorceller efter lumpectomy, men over 13% af TNBC patienter stadig oplever gentagelse på den primære tumor site3.
Det er kendt, at strålebehandling er effektiv til at afbøde metastase og gentagelse, fordi kombinationen af lumpektomi og stråling resulterer i samme langsigtede overlevelse som mastektomi4. Men, det er for nylig blevet påvist, at strålebehandling er forbundet med lokal gentagelse til den primære tumor site i immunkompromitterede indstillinger5,6. Også, det er velkendt, at stråling ændrer den ekstracellulære matrix (ECM) af normale væv ved inducerende fibrose7. Derfor er det vigtigt at forstå den rolle, stråling-induceret ECM ændringer i dikterer tumor celle adfærd.
Decellularized væv har været anvendt som in vitro-modeller til at studere sygdom8,9. Disse decellularized væv bevare ECM sammensætning og rekapitulate komplekset in vivo ECM. Denne decellularized væv ECM kan yderligere behandles og fordøjet til at danne rekonstituerede ECM silicagelrogeler, der kan bruges til at studere cellevækst og funktion10,11. For eksempel, injicerbare silicagelrogeler afledt af decellularized humant lipoaspirat og fra myokardievæv tjente som ikke-invasive metoder til vævsteknik, og en hydrogel afledt af svin lungevævet blev udnyttet som en in vitro metode til testning mesenchymal stamcelle fastgørelse og levedygtighed12,13,14. Virkningen af normale vævs stråling skader på ECM egenskaber, dog, er ikke blevet undersøgt.
Hydrogels afledt af ECM har det største potentiale for in vitro-undersøgelse af in vivo fænomener. Flere andre materialer er blevet undersøgt, herunder kollagen, fibrin, og matrigel, men det er vanskeligt at syntetisk rekapitulere sammensætningen af ECM13. En fordel ved at bruge ECM-afledte silicagelrogeler er, at ECM indeholder de nødvendige proteiner og vækstfaktorer for en bestemt væv14,15. Bestråling af normalt væv under lumpektomi forårsager betydelige ændringer i ECM, og ECM-afledte silicagelrogeler kan bruges til at studere denne effekt in vitro. Denne metode kan føre til mere komplekse og mere præcise in vitro-modeller af sygdom.
I denne undersøgelse, vi udsat murine bryst fat Pads (MFP'er) til stråling ex vivo. Mfp''erne var decellularized og lavet til præ-gel opløsning. Hydrogels blev dannet med indlejrede 4T1 celler, en murine TNBC cellelinje. De rheologiske egenskaber af hydrogel materialet blev undersøgt, og tumor celle dynamik blev evalueret inden for hydrogels. Hydrogels fremstillet af bestrålede MFP'er forbedret tumor celle spredning. Fremtidige undersøgelser vil indarbejde andre celletyper til at studere celle-celle interaktioner i forbindelse med kræft recidiv efter behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og protokoller godkendt af Vanderbilt University institutionel Animal Care og brug udvalg.
1. klargøring og ex vivo-bestråling af MFP'er
- Offer athymic nu/nu mus (8 – 10 uger) ved hjælp af CO2 kvælning efterfulgt af livmoderhals dislokation.
- Rengør huden med 70% ethanol.
- Saml bryst fat Pads (MFP'er) fra ofrede mus ved hjælp af præ-steriliseret saks og pincet i et 15 ml konisk rør, der indeholder komplette rpmi-medier (rpmi suppleret med 1% penicillin-streptomycin og 10% føtal kvægserum) (Se tabellen over materialer ).
- Irradiat prøver til 20 Gy ved hjælp af en cæsium kilde.
- Bring de bestrålede MFP'er og komplette RPMI-medier ind i et biosikkerheds kabinet. Medierne vil være afhængige af cellen linje, der skal dyrkes i den endelige hydrogel. Fyld 6 cm eller 10 cm retter med nok medier til at nedsænkes MFP'er. For 6 cm retter, brug 8 mL medier, og for 10 cm retter, brug 20 mL medier.
- Inkubér i en 37 °C/5% CO2 kubator i to dage. Længden af tiden i inkubator kan justeres.
- Skyl vævet i fosfat-bufferet saltvand (PBS), Vis overskydende fugt, og Placer Mfp'erne i 15 mL koniske rør til opbevaring ved-80 °C indtil decellularisering. Denne frysning trin aids decellularization skridt og prøven skal fryses, selv om de næste trin er ellers klar.
2. decellularization (tilpasset fra referencer12,16,17)
Bemærk: denne procedure blev tilpasset fra tidligere offentliggjorte metoder fokuseret på fedtvæv decellularization, som omfattede natriumdeoxycholate ionisk rengøringsmiddel i stedet for natriumdodecyl sulfat til at fjerne DNA effektivt12,16 , 17.
- På dag 1fjernes frosne MFP'er fra-80 °c og tø ved stuetemperatur.
- Når optøede, tørre MFP'er kortvarigt på en delikat opgave tørre. Vægte Mfp''erne ved hjælp af en analytisk skala.
- Ved hjælp af et par pincet med saks eller en skalpel, opdele væv op i 3 mm x 3 mm x 3 mm prøver til undersøgelse af den intakte ECM og det resterende væv til hydrogel produktion.
Bemærk: antallet af prøver afhænger af antallet af prøvningsmetoder, for eksempel er indsamlingen af to prøver beskrevet nedenfor: en for paraffin indlejring (trin 2,5) og en for frysning i kryostat indlejrings medium, hvis det ønskes (Se tabellen over materialer og trin 2,6). - Veje vævene. Hvis indlejring i paraffin til skæring, Fortsæt til trin 2,5. Hvis frysning i kryostat Embedding medium til skæring, Fortsæt til trin 2,6.
- I en kemisk hætte, nedsænkes vævet i 10% neutral Buffered formalin (NBF) (Se tabellen over materialer) i 24 timer ved 4 °c. Vask 3 gange i PBS i 5 minutter hver. Væv nedsænkes i 30% saccharose i 48 h ved 4 °C.
- Afvejes vævet nu, hvor dette stykke er blevet fjernet. Fortsæt til trin 2,6.
- I en kemisk hætte placeres MFP-enheder i en etiketkassette, der er preppet med kryostat Embedding medium. Tilføj mere kryostat Embedding medium til at dække vævet.
- Anbring kassetten i et bæger med 2-methylbutan (Se tabellen over materialer), der er forkølet med flydende nitrogen. Bægerglasset skal have nok 2-methylbutan til at dække bunden, men ikke nok til at nedsænkes kassetten, fordi kryostat indlejrings mediet ikke må røre 2-methylbutan. Lad kassetten sidde i 2-methylbutan, indtil kryostat indlejrings mediet fryser og bliver uigennemsigtigt.
- Pak kassetten (-erne) ind i folie, etiket og Efterlad ved-80 °C, indtil den anvendes til skæring.
Bemærk: væv, der anbringes umiddelbart i kryostat-indlejrings mediet, blev opdelt i 5 μm, mens væv inkuberet i saccharose blev opdelt i 30 μm for at fastholde fedtcellerne morfologi.
- Brug pincet til manuelt at massere det resterende væv.
Bemærk: Vævsstykker kan også placeres i 10% NBF for 24 – 48 timer, skylles i PBS og efterlades i 70% ethanol, indtil de indlejre i paraffin. Efter indlejring kan 5 μm-sektioner anvendes til hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvning (Se afsnit 7 nedenfor). - Sæt Mfp'erne i 6 cm retter med 5 mL 0,02% trypsin/0,05% EDTA opløsning. Inkubér ved 37 °C i 1 time. spray og aftør skålene med 70% ethanol, før de placeres i inkubatoren.
- Brug 0,7 mm strainere til at vaske MFP'er med deioniseret (DI) vand ved at hælde vand over vævet tre gange. Brug pincet til manuelt at massere vævet ind mellem skyller.
- Kort tør væv på en delikat opgave tørre og veje. Anbring vævet i et præ-autoclaveret bægerglas, der indeholder en omrøring med passende størrelse. Dække væv med 60 mL 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Se tabellen over materialer) pr 1 g væv og rør i 1 h ved stuetemperatur. Brug mindst 20 mL.
- Dump væv og indhold i en si. Skyl bægerglasset med DI vand, og hæld det på væv. Gentag to gange. Brug pincet til manuelt at massere vævet ind mellem skyller.
- Kort tør væv på en delikat opgave tørre og veje. Anbring væv og rør tilbage i de samme bægre, og dæk med 60 mL 4% deoxycholsyre pr. 1 g væv. Rør i 1 time ved stuetemperatur. Brug mindst 20 mL.
- Dumpe væv og indhold i en mesh-si. Skyl bægerglasset med DI vand, og hæld det på væv. Gentag to gange. Brug pincet til manuelt at massere vævet ind mellem skyller.
- Kort tør væv på en delikat opgave tørre og veje.
- Placer vævet i samme bæger med fersk DI-vand suppleret med 1% penicillin-streptomycin. Dæk stramt med paraffin folie. Lad natten ligge ved 4 °C.
- Vask strainere og bægre til brug den følgende dag.
- På dag 2, dræne bægerglas indhold i en Strainer. Kort tør væv på en delikat opgave tørre og veje.
- Placer MFP'er i samme bæger med en passende størrelse røre bar. Dæk med 60 mL 4% ethanol/0,1% pereddikesyre opløsning pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 2 timer ved stuetemperatur.
- Dump væv og indhold i en 0,7 mm Strainer. Brug pincet til manuelt at massere vævet. Placer indholdet tilbage i bægerglasset. Vask vævet ved at dække det med 60 mL 1x PBS pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 15 minutter ved stuetemperatur. Gentag en gang.
- Dump væv og indhold i en 0,7 mm Strainer. Brug pincet til manuelt at massere vævet. Placer indholdet tilbage i bæger. Vask vævet ved at dække det med 60 mL DI vand pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 15 minutter ved stuetemperatur. Gentag en gang.
- Kort tør væv på en delikat opgave tørre og veje. Dump væv og indhold i en si. Brug pincet til manuelt at massere vævet.
- Placer indholdet tilbage i bæger. Dække vævet med 60 mL 100% n-propanol pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 1 time ved stuetemperatur.
- Kort tør væv på en delikat opgave tørre og veje. Dump væv og indhold i en 0,7 mm Strainer. Brug pincet til manuelt at massere vævet.
- Placer indholdet tilbage i bæger. Vask vævet ved at dække det med 60 mL DI vand pr. 1 g væv. Brug mindst 20 mL. Rør i 15 minutter ved stuetemperatur. Gentag tre gange.
- Dump væv og indhold i en si. Gentag trin 2.3 – 2.6 for at indsamle stykker af væv til saccharoseinkubation og frysning i kryostat Embedding medium.
- Kort tør væv på en delikat opgave tørre og veje. Placeres i et mærket 15 mL rør. Fryse ved-80 °C natten over.
3. lyofilisering
- Fjern 15 mL-rørene fra-80 °C og Anbring på tøris. Opbevar prøverne frosne på tøris indtil på lyophilizer.
- Fjern hætter. Brug et gummibånd til at vedhæfte en delikat opgave tørre til toppen for at dække åbningen. Læg prøver på lyofilisatoren i mindst 2 dage.
- Fjern prøverne fra lyophilizer og Placer rørene på tøris. Fjern delikate opgave servietter afvejer hver prøve på en analytisk skala. Fastgør hætter og Placer ved-80 °C natten over.
4. fræsning
- Fyld en lavvandet beholder med flydende nitrogen. Fjern prøverne fra-80 °C-fryseren. Afvejes hver lyofiliseret MFP.
- Placer en prøve i mørtel. Brug en kryogen handske til at holde mørtel i det flydende nitrogen.
- Brug en Pestle fastgjort til en håndholdt boremaskine til at fræser prøven. Mill i 1 minut intervaller for at kontrollere fremskridt og fjerne dykket hånd fra flydende nitrogen. Mindst 5 min.
- Gentag for alle prøver. Spray og tør mørtel og Pestle med ethanol mellem hver prøve.
- Opbevar pulveriserede prøver i 15 mL rør ved-80 °C, indtil de er klar til brug.
Bemærk: prøverne kan anvendes straks eller opbevares natten over.
5. dannelse af hydrogel
- Hvis det opbevares ved-80 °C natten over, fjernes og tø ved stuetemperatur. Mens optøning, Beregn den nødvendige vægt af pepsin (Se tabel over materialer) og volumen af saltsyre (HCL) nødvendig for hver prøve, der resulterer i en opløsning med 1% w/v prøve pulver og 0,1% w/v pepsin i 0,01 M HCL. Tilsæt pepsin til HCL til form en pepsin-HCl opløsning.
- Tilsæt prøve pulver og pepsin-HCl opløsning til et 15 mL rør. Tilsæt en lille Stir bar, og rør i 48 h.
- Anbring rørene på is i 5 min. Beregn det nødvendige volumen på 10x PBS for hver prøve, der resulterer i en opløsning med en 1x PBS-koncentration. Tilsæt det passende volumen på 10x PBS til hvert rør.
- Tilsæt 10% v/v 0,1 M NaOH til hver opløsning for at nå pH 7,4. Brug et pH-papir til at teste enkeltvis.
Bemærk: gel-opløsningen kan opbevares ved 4 °C i en uge.
6. indkapgende celler i silicagelrogeler
- Brug af GFP-og luciferase-mærkede celler
- Ved hjælp af pH 7,4 gel opløsningen, resuspension foderpiller gfp-og luciferase-mærkede 4t1 celler til en koncentration af 500.000 eller 1.000.000 celler/ml gel opløsning. Der tilsættes 16 μL gel-celle opløsning til hver brønd i et 16-brøndkammer slids. Inkuber i 30 min ved 37 °C.
- Tilsæt 100 μL komplet RPMI-medie til hver brønd. Fortsæt inkubation for 48 h ved 37 °C. GFP-og luciferase-mærkede celler kan visualiseres ved hjælp af Fluorescens mikroskopi ved 0 timer, 24 timer og 48 timer efter gelering.
Bemærk: celle spredning kan måles for GFP-og luciferase-mærkede 4T1 celler, der anvendes her ved at tilføje (S)-4,5-dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl) -4-thiazolecarboxylic syre kaliumsalt (Se tabellen over materialer) til brøndene i 10 min og udføre bioluminescens Imaging ved hjælp af et bioluminescens billedbehandlingssystem (Se tabel over materialer). Efter bioluminescens Imaging kan cytoskelettet visualiseres (se pkt. 10).
- Brug af celler uden etiket
- Ved hjælp af pH 7,4 gel-opløsningen resuspension pelleteret ikke-mærkede 4T1-celler til en koncentration på 500.000 eller 1.000.000 celler/mL gel opløsning. Der tilsættes 16 μL gel-celle opløsning til hver brønd i et 16-brøndkammer slids og en 96-brønd plade. Inkuber i 30 min ved 37 °C.
- Tilsæt 100 μL medier til hver brønd. Fortsæt inkubation for 48 h ved 37 °C.
Bemærk: cellernes levedygtighed kan måles (Se afsnit 11). 16-brøndkammer sliden kan bruges til billeddannelse, og 96-brønd pladen kan bruges til kvantificering.
7. H & E farvning
- For formalin-fast, paraffin-indlejret væv, under flette dias, der indeholder 5 μm sektioner to gange i 100% xylen (5 – 10 min) for afparaffinisering. Rehydreres ved nedsænkning i 100%, 95%, 85% og 70% ethanol i 5 min hver efterfulgt af DI vand i 5 min. Fortsæt til trin 7,6.
- For frosne vævs sektioner tages sektioner straks fra fryseren og nedsænkes dem i 10% NBF i 10 min. vask i 1x PBS tre gange i 5 minutter hver. Skyl i vand i 5 min.
- Plette kerner med hematoxylinlegemer i 3 min. Skyl i rindende ledningsvand.
- Skelne ved at dyppe 1 – 2 gange i 0,3% syre alkohol (0,3% HCl i 70% ethanol). Skyl i rindende ledningsvand i 5 min.
- Tilsæt blåne agent for 30 s. Skyl i rindende ledningsvand i 5 min. Nedsænk i 95% ethanol for 30 s.
- Inkuber med eosin i 90 s ved stuetemperatur. Dehydrat i 3 ændringer af 100% ethanol i 5 min hver.
- Nedsænk to gange i 100% xylen i 5 minutter hver. Tilsæt distyren-blødgører-xylen (DPX0-monterings mediet til diaset, og Tilføj en dækseddel. Lad det helbrede natten før billeddannelse.
8.1-([4-(xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol-farvning
- Forbered 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol opløsning.
- Tilsæt 0,5 g af 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol pulver til et bægerglas med 100 mL propylenglycol. Opvarmes til 95 – 100 °C under omrøring i mindst 30 min. undgå, at temperaturen overstiger 100 °C.
- Fjern bæger fra varme og lad det køle lidt. Hæld opløsningen gennem Grade 4 kvalitativ filtrerpapir for at fjerne eventuelle rester af partikler.
Bemærk: opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur og skal filtreres gennem et 0,45 μm sprøjte filter umiddelbart før farvning.
- Pletter frosne vævs sektioner.
- Fjern slides fra-80 °C fryser og lufttørre i 30 min. pre-cool 10% NBF ved-20 °C i 30 min i en Coplin krukke. Fastgør slides ved stuetemperatur i 10 min. vask i DI vand 3 gange for 5 min hver.
- Fjern overskydende vand ved hjælp af en delikat opgave tørre før nedsænkes i propylenglykol 2 gange i 5 min hver. Fjern slides fra propylenglycol. Skyl ikke.
- Placer slides i sprøjte filtreret olie rød O farvningsopløsning i 3 timer ved stuetemperatur.
- Skelne ved at placere slides i 85% propylenglycol i 5 min. Skyl prøverne i PBS to gange i 5 min. hver.
- Plet prøver med hematoxylinlegemer i 30 s. vask i rindende ledningsvand i 5 minutter og Placer derefter diasene i DI vand.
- Monter prøverne ved hjælp af vandigt baseret monterings medium, og lad mediet tørre natten over før billeddannelse.
9. rheology
- Bring præ-gel-opløsninger fra trin 5,4 til rheometer på is.
- Fastgør en 25 mm arm og plade til rheometer. Åbn reologi-softwaren på den computer, som er sluttet til rheometer.
- Udfør roterende kortlægning, og bestem nulgabet. Løft armen, når den er færdig.
- Pipetten 500 μL præ-gel på pladen. Sænk armen, indtil præ-gel opløsningen helt indtager hullet mellem pladen og armen. Være konservativ, fordi sænkning af armen forbi dette punkt vil resultere i præ-gel opløsning breder sig ud af siden.
- Udfør en frekvens fejning på præ-gel-opløsningen fra 0,1 – 100 Hz, efter at den er forblevet ved 37 °C i 30 minutter.
- Løft rheometer armen, når den er færdig. Tør væsken af med en delikat opgave serviet. Skyl med DI vand og tør med en delikat opgave serviet. Gentag trin 9.4-9.6 med yderligere prøver.
10. phalloidin konjugat farvning af F-actin
- Bring phalloidin konjugat opløsning til stuetemperatur. Centrifugér kortvarigt ved lav hastighed før åbningen. Alikvot opløsning til analysen, og opbevar resten ved-20 °C.
- 1000x phalloidin konjugat stamopløsning fortyndes til en 1x arbejdsopløsning ved tilsætning af 1 μL stamopløsning til 1 mL 1x PBS + 1% bovint serumalbumin (BSA). Dette gør nok til 10 brønde (100 μL/brønd).
Bemærk: man kan bruge almindelig 1x PBS, men 1x PBS + BSA foretrækkes for at forhindre phalloidin konjugat fra stikning til røret. Denne opløsning må ikke opbevares efter analysen. 1 μL blåt fluorescerende farvestof (Se tabel over materialer) arbejdsopløsning kan tilsættes til pletter for kerner. Arbejdsopløsningen kan foretages ved at blande 1 μL 20 mM blåt fluorescerende farvestof med 11,3 μL 1x PBS. - Aspirere medier fra brønde (trin 6,1). Skyl brønde med 1x PBS.
- Tilføj 10% NBF. Inkuber brønde med 10% NBF i 20 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatant. Vask 3 gange med PBS i 5 minutter hver gang.
- Tilsæt 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol i PBS i 5 min. aspirat og vask 3 gange med PBS i 5 minutter hver gang.
- Tilsæt 100 μL arbejdsopløsning fra trin 10,2 til hver brønd. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Aspirer og vask 3 gange med PBS i 5 minutter hver gang. Efterlades i PBS ved 4 °C.
- Aspirer og fjern brønde fra pakningen på kammer sliden. Brug nåle næse pincet til at fjerne pakningen fra sliden. Montering og dækglas prøver ved hjælp af vandigt baseret monterings medium. Lad det hærde (5 min).
- Overhold cellerne under et fluorescens mikroskop ved excitation/emission på 590/618 nm.
11. analyse af levedygtighed
- Skyl cellerne med Dulbecco's PBS (DPBS). Tilsæt 100 μl dpbs indeholdende 1 μm værelse am og 2 μm ethidium homodimer til hver brønd. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Billede det 16-brønds kammer slide ved Fluorescens mikroskopi. Calcein acetoxymethyl (calcein AM) kan observeres ved excitation/emission = 494/517 nm. Ethidium homodimer kan observeres ved excitation/emission = 528/645 nm.
- Læs 96-brønd pladen på en plade læser ved hjælp af de samme bølgelængder i trin 11,2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MFP'er blev decellulariseret efter bestråling ved hjælp af den procedure, der er vist i figur 1a. MFP'er præ-decellularization (figur 1b) og post-Decellularization (figur 1c) er vist. Decellularisering blev bekræftet ved hjælp af hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvning, og 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farvning blev anvendt til at evaluere lipid indhold (figur 2). De rheologiske egenskaber ved ECM-silicagelrogeler blev også vurderet ved 37 °c (figur 3). Opbevarings modulus var højere end tabs modulus for alle forhold, hvilket viste stabil hydrogel dannelse.
Gfp-og luciferase-mærket 4t1 brystkarcinom celler blev indkapslet i hydrogels. Celle spredning blev undersøgt ved Fluorescens mikroskopi, bioluminescens målinger og levedygtighed farvning 48 h efter indkapsling (figur 4). Bestrålede silicagelrogeler viste en stigende tendens i tumor celle proliferation. Phalloidin konjugat blev anvendt til at visualisere F-actin i de indkapslede celler (figur 5). Denne teknik kan bruges til at undersøge celle morfologi og cytoskelet egenskaber.
Figur 1: eksperimentel arbejdsgang. A) skematisk dannelse af hydrogel. Digitale kamera billeder blev taget af MFP'er præ-(B) og post-decellularization (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: bekræftelse af decellularization og de-lipidering i MFP'er. Hematoxylin og eosin farvning (H & E) af unirudstrålede MFP'er indlejret i paraffin og sektioneret ved 5 μm (A) blev sammenlignet med MFP'er, frosset i kryostat Embedding medium (5 μm sektioner) før (B) og efter decellularization (C), inkuberet med saccharose før frysning i kryostat indlejring medium og sektioneret ved 30 μm (D). 1-([4-(xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farvning blev gjort for at visualisere lipid retention i MFP'er frosset i kryostat indlejring medium (5 μm sektioner) før (E) og efter decellularization (F) og inkuberet med saccharose før frysning i kryostat indlejring medium og sektioneret ved 30 μm sektioner (G). Skala søjler repræsenterer 50 μm. Decell = decellularization. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: bekræftelse af dannelsen af hydrogel. Rheology blev anvendt til at bestemme opbevarings-og tabs modulus for kontrol (A) og bestrålede (B) præ-gel-opløsning fremstillet af MFP'er ved 37 °c og 0,5% stamme. Fejllinjer viser standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: tumor celle spredning i bestrålede ECM-hydrogels. 4T1 celle spredning 48 h efter inokulation er vist med præ-gel afledt af kontrol (A) og bestrålede (B) MFP'er.C) bioluminescens signal fra 4t1-celler indlejret i kontrol og bestrålede hydrogels. Calcein er farvede levende celler og ethidium homodimer farvede døde celler blev evalueret i kontrol (D) og bestrålede (E) hydrogels, og forholdet mellem levende og døde blev kvantificeret (F). Skala søjler repræsenterer 200 μm. Fejllinjer viser standardfejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: cytoskelet egenskaber i ECM hydrogels. Celler inden for (A) kontrol og (B) bestrålede ECM-silicagelrogeler farves med phalloidin konjugat for at visualisere F-actin (rød) og blåt fluorescerende farvestof for at visualisere kerner (blå) i bestrålede MFP'er. Scale bar repræsenterer 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Vævs vægt (g) | Kontrol (0 Gy) |
Bestrålet (20 Gy) |
| Initial MFP vægt | 0,461 | 0,457 |
| MFP vægt efter fjernelse af histologi prøve | 0,423 | 0,416 |
| MFP vægt efter decellularization | 0,025 | 0,025 |
| Decellularized MFP vægt efter histologi prøve fjernelse | 0,015 | 0,016 |
Tabel 1: vævs vægte før og efter decellularisering. Repræsentative vævs vægte for hver betingelse blev målt før og efter MFP-decellularisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode til hydrogel dannelse er i høj grad afhængig af mængden af start vævet. Murine MFP'er er små, og den decellularization proces resulterer i en betydelig reduktion af materiale (tabel 1). Processen kan gentages med flere MFP'er for at øge det endelige udbytte. Fræsning er et andet vigtigt skridt, der kan føre til tab af materiale. Andre har vist succes med en Cryogen mølle, men denne protokol er baseret på fræsning via en håndholdt mørtel og elektrisk boremaskine med en Pestle fastgørelse8,17. Dette har den fordel, at lavere kapitalomkostninger og minimering af materielle tab, men kan indføre variation i det endelige produkt.
En udfordring til bekræftelse af decellularization og de-lipidering er i frysning fedtvæv i kryostat indlejring medium. Figur 2a viser H & E farvning af en unirudstrålede MFP indlejret og skåret i paraffin. Særskilte kerner er synlige på kanterne af fedtvæv i nærheden af knudepunkter med andre celler, og fedtcellerne morfologi er velholdt. Figur 2b , C, E, F Vis MFP'er fremstillet ved at indlejre og fryse MFP'er i kryostat Embedding medium og skæring 5 μm skiver. Denne proces var ude af stand til at bevare fedtcellerne morfologi og form. Men, decellularization blev bekræftet gennem tabet af kerner og andre spor af DNA (figur 2c), og de-lipidering blev visualiseret med tabet af neutral lipid indhold farvning (figur 2F). Adipocyte morfologi blev opretholdt ved at inkuberet mfp'ere i saccharose, indlejring og frysning i kryostat Embedding medium, og skæring 30 μm skiver (figur 2D, G). Mens visualisering af H & E farvning var vanskeligt med denne metode (figur 2D), 1-([4-(xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farvning bekræftet tilbageholdelse af fedtcellerne morfologi (figur 2g).
Vi har udviklet en in vitro hydrogel model, der kan efterligne in vivo normale vævs mikromiljø og dets reaktion på strålingsskader. ECM silicagelrogeler er blevet fabrikeret i lignende undersøgelser, men virkningen af stråling skader på tumor celle adfærd er ikke blevet vurderet9,12,16,17,18. Vi forventer, at bestråling af MFP'er vil ændre ECM remodeling og sammensætning, og disse kompositoriske ændringer vil blive karakteriseret i fremtidige undersøgelser. Vi observerede en stigende tendens i spredningen af 4t1 celler inden for bestrålede ECM silicagelrogeler ved hjælp af både bioluminescens Imaging og levedygtighed farvning (figur 4). Derudover brugte vi phalloidin konjugat til at plette F-actin filamenter i indkapslede tumorceller og fandt en kvalitativ stigning i actin Alignment og tumor celle forlængelse i bestrålede ECM hydrogels, hvilket tyder på en stigning i vedhæftningsstyrke og invasiv kapacitet (figur 5)19,20. Fremtidige eksperimenter vil undersøge ændringer i fokale vedhæftnings dynamik og protease-mediated remodeling til evaluering af celle migration og invasion.
Denne metode blev udviklet ved hjælp af en murine TNBC cellelinje, men denne metode kan bruges som en platform til evaluering af spredning og invasivitet af andre celletyper. Fremtidige undersøgelser kan omfatte immunceller til at bestemme deres rolle som reaktion på stråling samt andre former for vævsskade (f. eks kirurgi). Selv om denne undersøgelse evaluerede ECM silicagelrogeler fra MFP'er bestrålede ex vivo, vil yderligere undersøgelser undersøge in vivo stråling af MFP'er til at evaluere effekten af fysiologiske stråling respons og infiltrere immunceller på ECM egenskaber. Vi har etableret en metode til at fabrikere ECM silicagelrogeler fra mus MFP'er til at studere effekten af normal vævs stråling på tumor celle adfærd, og denne teknik kan udvides til humant væv for en mere relevant hydrogel model. Samlet, undersøge normale vævsskader gennem ECM silicagelrogeler kan føre til indsigt i rollen af ECM ændringer efter strålebehandling i lokal gentagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Laura L. Bronsart for at levere GFP-og luciferase-4T1 celler, Dr. Edward L. LaGory for rådgivning om 1-([4-(Xylylazo) xylyl] AZO) -2-naphthol farvning, Dr. Craig L. Duvall for IVIS og lyophilizer brug, og Dr. Scott A. Guelcher for rheometer Bruge. Denne forskning blev finansielt støttet af NIH Grant #R00CA201304.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin, Cube with Spigot | VWR | 16004-128 | - |
| 2-methylbutane | Alfa Aesar | 19387 | - |
| AR 2000ex Rheometer | TA Instruments | 10D4335 | rheometer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A1933-25G | - |
| calcein acetoxymethyl (calcein AM) | Molecular Probes, Inc. | C1430 | - |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth Chemistry & Biology | L-8820 | (S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt |
| DPX Mountant for Histology | Sigma-Aldrich | 06522-500ML | - |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Gibco | 14040133 | - |
| Eosin-Y with Phloxine | Richard-Allan Scientific | 71304 | eosin |
| ethidium homodimer | Molecular Probes, Inc. | E1169 | ethidium homodimer-1 (EthD-1) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0926-500ML | - |
| Fisher Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | cryostat embedding medium |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | aqueous based mounting medium |
| FreeZone 4.5 | Labconco | 7751020 | lyophilizer |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | blue fluorescent dye |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | - |
| IVIS Lumina III | PerkinElmer | CLS136334 | bioluminescence imaging system |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark | delicate task wipes | |
| n-Propanol (Peroxide-Free/Sequencing), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1130-500 | - |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625-25G | 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol |
| OPS Diagnostics CryoGrinder | OPS Diagnostics, LLC | CG-08-02 | - |
| PBS (10X), pH 7.4 | Quality Biological, Inc. | 119-069-151 | Phosphate-buffered saline |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | - |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-5G | pepsin |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | 77240-100ML | - |
| Phalloidin-iFluor 594 Reagent (ab176757) | abcam | ab176757 | phalloidin conjugate |
| Propylene glycol | Sigma-Aldrich | W294004-1KG-K | - |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Bluing Reagent | Richard-Allan Scientific | 7301L | bluing agent |
| Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211 | Richard-Allan Scientific | 7211 | - |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | 11875-093 | - |
| Sodium deoxycholate, 98% | Frontier Scientific | JK559522 | deoxycholic acid |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | - |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200-056 | - |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 4 | Whatman | 1004-110 | grade 4 qualitative filter paper |
| Xylenes (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X5-4 | - |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
- Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
- Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
- Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
- Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
- Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
- Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
- Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
- Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
- Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
- Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
- Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
- Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
- Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).
