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Neuroscience

Évaluation de la latéralisation de l'hémisphère avec enregistrement potentiel de terrain local bilatéral dans le cortex moteur secondaire des souris

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59310
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1
1School of Life Sciences, Guangzhou University, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, South China Normal University, 3School of Life Sciences, South China Normal University

Summary

Nous présentons l'enregistrement électrophysiologique in vivo du potentiel local de champ (LFP) dans le cortex moteur secondaire bilatéral (M2) des souris, qui peut être appliqué pour évaluer la latéralisation d'hémisphère. L'étude a révélé des niveaux modifiés de synchronisation entre le M2 gauche et droit chez les souris APP/PS1 par rapport aux témoins WT.

Abstract

Cet article démontre des procédures complètes et détaillées pour l'enregistrement et l'analyse bilatérales in vivo du potentiel local de champ (LFP) dans les secteurs corticaux des souris, qui sont utiles pour évaluer les déficits possibles de la tardalité, aussi bien que pour l'évaluation de la connectivité cérébrale et de l'accouplement des activités du réseau neuronal chez les rongeurs. Les mécanismes pathologiques sous-jacents à la maladie d'Alzheimer (MA), une maladie neurodégénérative commune, restent largement inconnus. Une latéralité cérébrale altérée a été démontrée chez les personnes vieillissantes, mais si oui ou non la latéralisation anormale est l'un des premiers signes de la MA n'a pas été déterminée. Pour étudier ceci, nous avons enregistré des LFP bilatéraux dans les souris de modèle d'AD de 3-5 mois, APP/PS1, avec des contrôles sauvages de type de littermate (WT). Les LPF du cortex moteur secondaire gauche et droit (M2), spécifiquement dans la bande gamma, étaient plus synchronisés chez les souris APP/PS1 que chez les témoins WT, suggérant une asymétrie hémisphérique diminuée de M2 bilatéral dans ce modèle de souris AD. Notamment, les processus d'enregistrement et d'analyse des données sont flexibles et faciles à réaliser, et peuvent également être appliqués à d'autres voies cérébrales lors de la conduite d'expériences qui se concentrent sur les circuits neuronaux.

Introduction

La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme la plus courante de démence1,2. Le dépôt de dépôt de la protéine bêta-amyloïde extracellulaire (protéine amyloïde, A) et les enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires (TNT) sont les principales caractéristiques pathologiques de l'AD3,4,5, mais les mécanismes sous-jacents à l'AD la pathogénie reste largement peu claire. Le cortex cérébral, une structure clé dans la cognition et la mémoire, est altéré dans AD6, et les déficits moteurs tels que la marche lente, difficulté à naviguer dans l'environnement et les perturbations de la démarche se produisent avec l'âge avancé7. Des enchevêtrements de dépôt et de neurofibrillaire ont également été observés dans le cortex prémoteur (PMC) et la zone motrice supplémentaire (SMA) chez les patients atteints de la MAA8 et chez les personnes âgées ayant un impact cognitif9, ce qui indique la participation d'un moteur altéré. dans la pathogénie de la MA.

Le cerveau est formé par deux hémisphères cérébraux distincts qui sont divisés par une fissure longitudinale. Un cerveau sain présente des asymétries structurelles et fonctionnelles10, ce qu'on appelle la « latéralisation », permettant au cerveau de faire face efficacement à de multiples tâches et activités. Le vieillissement entraîne une détérioration de la cognition et de la locomotion, ainsi qu'une réduction de la latéralité cérébrale11,12. Les capacités motrices de l'hémisphère gauche sont facilement apparentes dans le cerveau sain13, mais dans la latéralité aberrante de cerveau d'AD se produit en conséquence de l'échec de la dominance gauche d'hémisphère liée à l'atrophie corticale gauche14, 15,16. Par conséquent, une compréhension d'une altération possible de la latéralisation du cerveau dans la pathogénie de la MA et les mécanismes sous-jacents peut fournir de nouvelles connaissances sur la pathogénie de la MA et conduire à l'identification de biomarqueurs potentiels pour le traitement.

La mesure électrophysiologique est une méthode sensible et efficace d'évaluation des changements dans les activités neuronales des animaux. La réduction de l'asymétrie hémisphérique chez les aînés (HAROLD)17 a été documentée par la recherche électrophysiologique avec le temps interhémisphérique synchronisé de transfert, qui montre l'affaiblissement ou l'absence de l'asymétrie hémisphérique à monaurally présenté stimuli de la parole chez les personnes âgées18. Utilisant APP/PS1, l'un des modèles de souris AD les plus couramment utilisés19,20,21,22, en combinaison avec l'enregistrement extracellulaire bilatéral in vivo de LFP à gauche et à droite M2, nous a évalué les déficits possibles de latéralité dans AD. En outre, avec des paramètres simples, la fonction intégrée du logiciel d'analyse de données (voir le Tableau des matériaux) fournit un moyen plus rapide et plus simple d'analyser la synchronisation des signaux électriques que mathématiquement langage de programmation complexe, qui est convivial pour les débutants avec l'électrophysiologie in vivo.

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Protocol

Tous les animaux ont été jumelés dans des conditions standard (12 h de lumière/obscurité, environnement à température constante, libre accès à la nourriture et à l'eau) selon les lignes directrices et les expériences du ministère chinois des Sciences et de la Technologie sur les animaux de laboratoire. par le comité d'éthique local de l'Université de Guangzhou. Il s'agit d'une procédure de non-survie.

REMARQUE : Pour les données présentées dans les résultats représentatifs, APP/PS1 (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J) souris double-transgéniques et les contrôles de type sauvage (WT) à l'âge de 3-5 mois, ont été utilisés pour les enregistrements (n - 10, par groupe).

1. Anesthésie animale et chirurgie

  1. Pesez et anesthésiez la souris par votre régime d'anesthésie approuvé de votre comité local de soins aux animaux.
  2. Effectuer une pince de la queue ou des orteils avec des forceps pour confirmer l'anesthésie profonde avant la chirurgie.
  3. Placez la souris dans un appareil stéréotaxique et fixez sa tête.
  4. Appliquer la pommade pour les yeux sur les deux yeux pour garder humide. Suivez vos directives locales en matière de soins aux animaux concernant l'analgésie pré- et postopératoire.
  5. Raser les cheveux à l'aide de tondeuses chirurgicales. Faire une petite incision (12-15 mm) au milieu de la zone chirurgicale exposée avec des ciseaux. À l'aide de forceps, retirez doucement le cuir chevelu de la ligne médiane.
  6. Séparer la peau doucement et enlever les tissus résiduels. Nettoyez le crâne à l'aide de bourgeons de coton recouverts de peroxyde d'hydrogène.
  7. Percer deux petits trous de radii de 1,0 à 1,5 mm sur les deux côtés gauche et droit du crâne pour permettre l'insertion des microélectrodes d'enregistrement dans les régions M2 sous un stéréomicroscope (Figure 1A).
    REMARQUE : Emplacements stéréotaxiques de M2 bilatéral : 1,94 mm antérieur au bregma, 1,0 mm latérale à la ligne médiane, et 0,8-1,1 mm ventral à la dura.
  8. Retirer soigneusement la dura mater à l'aiguille de tungstène.
  9. Tirez des micropipettes borosilicate en verre (diamètre extérieur : 1,0 mm) comme microélectrodes d'enregistrement avec une résistance de 1-2 M.
  10. Insérer deux microélectrodes d'enregistrement séparées remplies de 0,5 M DeNcl dans les trous à l'aide de micromanipulateurs mécaniques (à 60 degrés, figure 1B).

2. Enregistrements LFP dans des M2 bilatéraux de souris

  1. Abaissez lentement les électrodes de verre gauche et droite dans les coordonnées appropriées de M2 bilatérale (figure1C).
  2. Pour le contrôle de la qualité, testez la résistance de chaque électrode à l'aide de l'amplificateur différentiel avant de capturer les LFP.
  3. Définir le processus d'enregistrement à 0,1 Hz haute passe et 1000 Hz low-pass avec 1000x amplification.
  4. Recueillir des données lFP brutes numérisées d'au moins 60 activités spontanées dans un état stable, avec des souris respirant uniformément à un taux respiratoire de 2 respirations par seconde sous anesthésie.
  5. Après l'enregistrement, soulevez lentement les électrodes hors du cerveau, puis euthanasiez les souris par dislocation cervicale rapide.
  6. Enregistrez les données et analysez hors connexion.

3. Analyse de corrélation croisée

  1. Analyse de clic - corrélation de forme d'onde dans le logiciel d'analyse et importer les données.
  2. Paramètres
    1. Définissez un signal de canal de forme d'onde comme le premier canal et l'autre comme référence. Définir la largeur comme 2 et décalée comme 1 (Figure 2A).
    2. Définir la durée des deux LFP pour 100 s en sélectionnant l'heure de début et l'heure de fin. Appuyez sur le bouton Processus pour effectuer une analyse de corrélation croisée (Figure 2B).
      REMARQUE : Les signaux bilatéraux simultanés avec de telles durées seraient assez longs pour montrer des activités spontanées neuronales, révélant ainsi les propriétés de base de la synchronisation.
  3. Cliquez sur Fichier - Export As, puis enregistrez les résultats de corrélation croisée correspondant au graphique pop-up résultant dans le format .txt.
  4. Ouvrez le fichier .txt (Figure 2C), supprimez les valeurs de corrélation au moment où les décalages variaient de 0 à 0,01 s (puisque deux ondes gamma continues ont un intervalle d'au moins 0,01 s), puis faites la moyenne du reste des données de corrélation croisée dans la partie ou la moyenne du décalage négatif. le reste des données de corrélation croisée dans la partie de décalage positif.

4. Analyse de cohérence

  1. Importer et exécuter les données dans le logiciel d'analyse.
  2. Attribuer les deux signaux LFP pour être les canaux de première et deuxième forme d'onde séparément. Définir ensuite la valeur de taille du bloc (Figure 3A).
    REMARQUE : La taille du bloc désigne le nombre de points de données utilisés dans la FFT. Plus la taille du bloc est grande, meilleure est la résolution de fréquence. Ici, nous vous recommandons de le définir comme 4096.
  3. Déplacez manuellement les lignes pointillées pour s'assurer que la précision du temps pour les signaux dans les deux canaux est réglée comme la même période (figure 3B). Appuyez sur le bouton Ajouter zone pour charger la zone et effectuer une analyse de cohérence.
  4. Cliquez sur Fichier - Enregistrer pour enregistrer les résultats de cohérence correspondant au graphique pop-up résultant dans le format .txt ( Figure3B).

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Representative Results

Pour voir si la pathologie précoce de la MA altère la capacité de la latéralisation de l'hémisphère, nous avons effectué des enregistrements bilatéraux de LFP extracellulaires dans le M2 gauche et droit des souris APP/PS1 et des contrôles de WT (âgés 3-5 mois), et avons analysé la corrélation croisée de ces gauches et lFP de droite. Chez les souris WT, les résultats ont démontré que la corrélation moyenne entre les LPF gauche s'agità droite à des décalages positifs différait considérablement de celle des décalages temporels négatifs, impliquant l'existence d'asymétries hémisphériques dans les zones M2 des contrôles WT (figure4 C; WT-positif, 0,08161 0,01246; WT-négatif, 0,0206 à 0,01218; p - 4.74531E-4 -lt; 0.001 par un t-test de deux échantillons). En comparaison, les LPF gauche et droite des souris APP/PS1 ont montré une synchronisation plus élevée dans le domaine temporel, suggérant une réduction de l'asymétrie entre le M2 gauche et droit (figure4C; APP/PS1-positif, 0.13336 - 0.0105 APP/PS1-négatif, 0.12635 '0.01066; p 0.64157 'gt; 0.05 par un t-test de deux échantillons).

Nous avons ensuite filtré les oscillations gamma des LFP (figure5A) et effectué une analyse de cohérence telle que décrite dans le protocole pour mesurer la similitude des signaux électriques dans la plage de fréquences gamma. Le résultat a montré que la cohérence gamma entre la gauche et la droite M2 dans APP/PS1 était significativement plus élevée que celle des souris WT (figure5B,C; WT, 0,13267 à 0,00598; APP/PS1, 0,17078 - 0,0072; p - 0,00550 lt; 0,01 par deux t-test d'échantillon), indiquant une synchronisation plus élevée, et par conséquent la latéralisation réduite, entre la gauche et la droite M2 chez les souris APP/PS1.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme de la procédure d'enregistrement simultanée de LaFP. (A) Souris stéréotaxique avec crâne exposé et dura mater enlevé pour l'enregistrement bilatéral in vivo des LFP dans le M2 gauche et droit. (B) Deux microélectrodes en verre en contact avec la surface corticale dans le trou foré simultanément. (C) Enregistrement des microélectrodes avec les fils Ag/AgCl comme électrodes de référence positionnés à des sites appropriés. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Illustration de l'analyse de corrélation croisée. (A) Paramètres de la boîte de dialogue de corrélation de forme d'onde. Cela offre des options pour choisir quel canal de forme d'onde est la référence et pour analyser la corrélation de deux signaux. (B) La boîte de dialogue de processus. Cela offre des options pour définir la durée de la forme d'onde de référence et la durée d'une autre forme d'onde sera annexée. L'analyse n'est effectuée que pour les régions de données dans lesquelles les deux canaux de forme d'onde existent. (C) Exemple de fichier .txt avec des valeurs de corrélation croisée à des plages de décalage négatif et positif séparément pour les statistiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Illustration de l'analyse de cohérence. (A) Paramètres de paramètre pour la boîte de dialogue de cohérence. La taille du bloc détermine le nombre de points de données utilisés dans l'analyse et la résolution de fréquence. (B) Les lignes pointillées sont réglables pour que l'opérateur puisse se déplacer manuellement afin de définir la durée des signaux à analyser. (C) Après que le logiciel a créé un graphique, cliquez sur Fichier - Enregistrer pour enregistrer les résultats de cohérence comme un fichier avec une extension de nom de fichier .txt . Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : La corrélation croisée indique la latéralisation de l'hémisphère déclinée entre la gauche et la droite M2 des souris APP/PS1. (A) Traces brutes représentatives de LFP enregistrées simultanément chez des souris Bilatérales M2 de WT et APP/PS1 utilisant la méthode d'enregistrement extracellulaire (L : Gauche M2 ; R: droite M2). (B) La courbe de corrélation croisée montre la corrélation des signaux bilatéraux de LFP à différents décalages temporels. (C) Entre la gauche et la droite M2, les contrôles WT ont montré une valeur de corrélation croisée significativement plus élevée à des plages de décalage positif que les plages négatives. En revanche, la valeur de corrélation croisée des souris APP/PS1 a une similitude, ce qui indique un déclin de l'asymétrie (n - 10, par groupe). La valeur représente l'erreur moyenne et standard de la moyenne. p lt; 0,001; deux échantillons t-test. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Cohérence des oscillations gamma entre les souris M2 gauche et droite des souris WT et APP/PS1. (A) Des traces représentatives d'oscillations gamma filtrées à partir de LFP dans le M2 gauche et droit. (B) Répartition de la cohérence entre les LPF enregistrée simultanément dans le M2 bilatéral. Les souris APP/PS1 diffèrent en grande partie des contrôles WT dans la gamme de fréquence gamma. (C) La cohérence entre les oscillations gamma de M2 bilatérale en
Les souris APP/PS1 sont significativement plus élevées que les témoins WT (n ' 10, par groupe). La valeur représente l'erreur moyenne et standard de la moyenne. p 'lt; 0.01; deux échantillons t-test. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous rapportons ici la procédure pour l'enregistrement extracellulaire bilatéral in vivo, avec l'analyse de la synchronisation des signaux lFP de double région, qui est flexible et facile à conduire pour estimer la latéralisation de l'hémisphère cérébral, aussi bien que le la connectivité, la directionnalité ou le couplage entre les activités neuronales de deux zones du cerveau. Cela peut être largement utilisé pour révéler non seulement les activités de groupe-neuronal, mais aussi certaines propriétés de base de l'électrophysiologie interrégionale, en particulier pour les laboratoires qui sont intéressés par le dépistage des activités oscillatoires ou des laboratoires qui n'ont pas de systèmes pour enregistrement multicanal chez les animaux qui se comportent23.

En général, une série de techniques sont disponibles pour surveiller les activités cérébrales, y compris l'électroencéphalographie (EEG), la magnétoencéphalographie (MEG) et l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf). Ces méthodes ont une résolution temporelle et spatiale relativement plus faible par rapport à nos enregistrements présentés. Par exemple, l'EEG est l'un des instruments les plus anciens et les plus disponibles dans le commerce pour étudier l'activité extracellulaire du cerveau. Bien qu'il existe des études utilisant "haute densité" EEG chez les rongeurs en mouvement libre pour améliorer la résolution spatiale insuffisante24,25,26, le crâne génère toujours plus de bruit et réduit ainsi le signal au bruit d'oscillation gamma corticale, en particulier pour les souris de petite taille. Notre méthode avec des microélectrodes en verre serait un bon choix pour empêcher les chercheurs de ce «bruit de distorsion» puisque les microélectrodes pourraient être insérés dans la structure du cerveau directement. En outre, les pipettes en verre d'enregistrement utilisées ici sont peu coûteuses, très maniables, et peuvent être appliquées pour explorer des zones cérébrales plus profondes non limitées aux zones corticales.

Une attention particulière doit être accordée à ce qui suit. Tout d'abord, il est obligatoire d'effectuer une anesthésie strictement basée sur le poids corporel, et de tester la profondeur de l'anesthésie toutes les heures. C'est parce que l'état physiologique de la souris joue un rôle important dans la qualité de la LFP enregistrée, et tout mouvement des sites de référencement causé par, par exemple, l'éveil soudain de l'animal, pourrait générer un bruit électrophysiologique de fond qui déprécierait la disponibilité. Deuxièmement, parce que la résistance aux microélectrodes varie en fonction de la forme et du diamètre de la pointe de la pipette en verre, le chauffage doit être soigneusement ajusté dans la plage pour une impédance appropriée lors de la traction des microélectrodes. Comme décrit précédemment dans la section de protocole, nous avons constaté que les électrodes avec l'impédance s'étendant de 1 à 2 M 'ont capturé les activités corticales corticales élevées.

Les oscillations gamma reflètent la synchronisation neuronale de différentes régions du cerveau lorsque les animaux sont engagés dans des tâches d'apprentissage ou de stimulation27,28,29. La synchronisation de la bande gamma module l'excitation rapidement pour activer les neurones postsynaptiques efficacement30. Il est à noter que bien que l'oscillation gamma ait été définie dans la présente étude comme activité oscillatoire avec la fréquence dans la gamme 25-80 Hz comme le montrent plusieurs groupes28,31,32, il existe des études qui décrire 30-70 Hz comme gamma bas et 70-100 Hz comme gamma élevé33,34,35. Quelle que soit la définition, les principes d'analyse des données demeurent similaires. Dans le traitement du signal, la corrélation croisée est utilisée pour déterminer le délai entre les signaux électriques de deux régions du cerveau36. Pour les signaux dans des conditions de stimulation, les durées sélectionnées pour l'analyse de corrélation croisée pourraient être plus courtes37.

Bien qu'il existe des limites dans l'utilisation de l'enregistrement LFP pour l'évaluation des activités neuronales; par exemple, il ne peut ni distinguer entre les activités pré- et post-synaptiques ni détecter les potentiels de membrane au repos des neurones enregistrés23, l'approche introduite ici sert d'outil utile pour la mesure des activités d'un groupe de neurones de différentes zones du cerveau des souris, permettant l'étude de la connectivité fonctionnelle de cerveau-zone et le couplage des signaux électriques avant et après l'infusion de drogue.

Plusieurs explications ont été proposées pour l'émergence de l'asymétrie hémisphérique, par exemple, l'asymétrie améliore la capacité d'un individu à effectuer deux tâches différentes en même temps38; ou l'asymétrie augmente la capacité neuronale, évitant la duplication inutile des réseaux neuronaux39; ou deux processus cognitifs différents peuvent être plus facilement exécutés simultanément s'ils sont latéraux à différents hémisphères40. La latéralisation de l'hémisphère est supposée fournir des avantages cognitifs, mais elle change avec l'âge12,41. Les études de neuroimagerie ont montré uniformément que l'activation préfrontale tend à être moins latéralisée chez les adultes plus âgés que chez les personnes plus jeunes42,43. Les patients atteints de LA avec des changements pathologiques uniaux ou bilatéraux précoces développent des anomalies cérébrales, y compris la latéralisation s'associant à l'oubli, aux réponses lentes à la stimulation sonore et au déclin cognitif11,44. Nous avons observé, dans la présente étude, un niveau perturbé de latéralisation d'hémisphère entre la gauche et la droite M2 des souris APP/PS1 à 3-5 mois, qui est la période où de telles souris n'agrégent pas le dépôt apparent des plaques bêta-amyloïdes45, 46, ce qui implique que la toxicité induite par les oligomères bêta-amyloïdes solubles peut contribuer, au moins en partie, à la latéralisation aberrante de l'hémisphère cortical, ce qui pourrait accélérer la détérioration du cerveau dans la pathogénie aD16, 47.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (31771219, 31871170), de la Division des sciences et de la technologie du Guangdong (2013KJCX0054) et de la Natural Science Foundation of Guangdong Province (2014A030313418, 2014A030313440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC/DC Differential Amplifier A-M Systems Model 3000
Analog Digital converter Cambridge Electronic Design Ltd. Micro1401
Glass borosilicate micropipettes Nanjing spring teaching experimental equipment company 161230 Outer diameter: 1.0mm
Microelectrode puller Narishige PC-10
NaCl Guangzhou Chemical Reagent Factory 7647-14-5
Pin microelectrode holder World Precision Instruments, INC. MEH3SW10
Spike2  Cambridge Electronic Design Ltd.
Stereomicroscope Zeiss 435064-9020-000
Stereotaxic apparatus  RWD Life Science 68045
Urethane Sigma-Aldrich 94300

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Neurosciences Numéro 149 Maladie d'Alzheimer latéralisation électrophysiologie in vivo cortex moteur secondaire potentiel de terrain local synchronisation
Évaluation de la latéralisation de l'hémisphère avec enregistrement potentiel de terrain local bilatéral dans le cortex moteur secondaire des souris
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Chen, Y., Li, M., Zheng, Y., Yang, L. Evaluation of Hemisphere Lateralization with Bilateral Local Field Potential Recording in Secondary Motor Cortex of Mice. J. Vis. Exp. (149), e59310, doi:10.3791/59310 (2019).

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