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Neuroscience

Valutazione della lateralizzazione dell'emisfero con la registrazione del potenziale sul campo locale bilaterale nella corteccia motoria secondaria dei topi

Published: July 31, 2019 doi: 10.3791/59310

Summary

Presentiamo la registrazione elettrofisiologica in vivo del potenziale di campo locale (LFP) nella corteccia motoria secondaria bilaterale (M2) dei topi, che può essere applicata per valutare la lateralizzazione dell'emisfero. Lo studio ha rivelato livelli alterati di sincronizzazione tra l'M2 sinistro e destro nei topi APP/PS1 rispetto ai controlli WT.

Abstract

Questo articolo illustra procedure complete e dettagliate sia per la registrazione bilaterale in vivo che l'analisi del potenziale sul campo locale (LFP) nelle aree corticali dei topi, utili per valutare possibili deficit di lateralità, nonché per la valutazione della connettività cerebrale e l'accoppiamento delle attività di rete neurale nei roditori. I meccanismi patologici alla base del morbo di Alzheimer (AD), una malattia neurodegenerativa comune, rimangono in gran parte sconosciuti. Alterato lateralità cerebrale è stato dimostrato in persone di invecchiamento, ma se la lateralizzazione anormale è uno dei primi segni di AD non è stato determinato. Per indagare su questo, abbiamo registrato l'LFP bilaterale in topi modello AD di 3-5 mesi, APP/PS1, insieme acontrolli di tipo selvaggio (WT) di littermate. Gli LFP della corteccia motoria secondaria sinistra e destra (M2), in particolare nella banda gamma, erano più sincronizzati nei topi APP/PS1 che nei controlli WT, suggerendo una declineta asimmetria emisferica dell'M2 bilaterale in questo modello murino AD. In particolare, i processi di registrazione e analisi dei dati sono flessibili e facili da eseguire, e possono anche essere applicati ad altri percorsi cerebrali quando conducono esperimenti che si concentrano sui circuiti neuronali.

Introduction

Il morbo di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza1,2. La deposizione extracellulare di beta amiloide (proteina amiloide, amiloide, az) deposizione e i grovigli neurofibrillari intracellulari (NFT) sono le principali caratteristiche patologiche di AD3,4,5, ma i meccanismi alla base di AD patogenesi rimangono in gran parte poco chiare. La corteccia cerebrale, una struttura chiave nella cognizione e nella memoria, è compromessa nel6adD e i deficit motori come la camminata lenta, la difficoltà di navigazione nell'ambiente e i disturbi dell'andatura si verificano con l'avanzare dell'etàdi 7anni. La deposizione di aecuzazione e i grovigli neurofibrillari sono stati osservati anche nella corteccia premotoria (PMC) e nell'area motoria supplementare (SMA) nei pazienti affetti da AD8 e negli adulti anziani con impatto cognitivo9, indicando il coinvolgimento di un nella patogenesi AD.

Il cervello è formato da due distinti emisferi cerebrali che sono divisi da una fessura longitudinale. Un cervello sano presenta asimmetrie strutturali e funzionali10, che si chiama "lateralizzazione", permettendo al cervello di affrontare in modo efficiente più attività e attività. L'invecchiamento si traduce in un deterioramento della cognizione e della locomozione, insieme a una riduzione della lateralità cerebrale11,12. Le capacità motorie dell'emisfero sinistro sono immediatamente evidenti nel cervello sano13, ma nel cervello AD lalateralità aberrone si verifica come conseguenza del fallimento del dominio dell'emisfero sinistro associato all'atrofia corticale sinistra14, 15,16. Pertanto, la comprensione di una possibile alterazione della lateralizzazione cerebrale nella patogenesi delle AD e dei meccanismi sottostanti può fornire nuove informazioni sulla patogenesi dell'AD e portare all'identificazione di potenziali biomarcatori per il trattamento.

La misurazione elettrofisiologica è un metodo sensibile ed efficace per valutare i cambiamenti nelle attività neuronali degli animali. La riduzione dell'asimmetria emisferica negli anziani (HAROLD)17 è stata documentata dalla ricerca elettrofisiologica con il tempo di trasferimento interhemispheric sincronizzato, che mostra l'indebolimento o l'assenza di asimmetria emisferica a presentata mostaucolorata stimoli vocali negli anziani18. Utilizzando APP/PS1, uno dei modelli murini AD più comunemente utilizzati19,20,21,22, in combinazione con la registrazione extracellulare bilaterale in vivo di LFP in entrambi i M2 sinistro e destro, abbiamo ha valutato i possibili deficit di lateralità in AD. Inoltre, con semplici impostazioni dei parametri, la funzione integrata del software di analisi dei dati (vedi Tabella dei materiali) fornisce un modo più veloce e più semplice per analizzare la sincronizzazione dei segnali elettrici rispetto matematicamente complesso linguaggio di programmazione, che è amichevole per i principianti con elettrofisiologia in vivo.

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Protocol

Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni standard (12 h ambiente chiaro/scuro, a temperatura costante, libero accesso al cibo e all'acqua) secondo il Laboratorio cinese del Ministero della Scienza e della Tecnologia dal comitato etico locale dell'Università di Guangzhou. Questa è una procedura di non sopravvivenza.

NOTA: per i dati riportati nei risultati rappresentativi, per i dati APP/PS1 (B6C3-Tg (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J) sono stati utilizzati per le registrazioni (n - 10, per gruppo) i controlli di tipo selvaggio (WT) a 3-5 mesi di età, sono stati utilizzati per le registrazioni (n - 10, per gruppo).

1. Anestesia animale e chirurgia

  1. Pesare e anetizzare il topo dal vostro regime di anestesia approvato dal vostro comitato locale per la cura degli animali.
  2. Eseguire un pizzico di coda o di dita con pinze per confermare l'anestesia profonda prima dell'intervento chirurgico.
  3. Posizionare il mouse in un apparato stereotassico e fissare la testa.
  4. Applicare unguento per gli occhi su entrambi gli occhi per mantenere umido. Segui le tue linee guida locali per la cura degli animali per quanto riguarda l'analgesia pre e postoperatoria.
  5. Rasare i capelli con clipper chirurgici. Fare una piccola incisione (12-15 mm) nel mezzo dell'area chirurgica esposta con le forbici. Utilizzando pinze, tirare delicatamente il cuoio capelluto lontano dalla linea mediana.
  6. Separare delicatamente la pelle e rimuovere il tessuto residuo. Pulire il cranio utilizzando cotton fioc ricoperti di perossido di idrogeno.
  7. Forare due piccoli fori di radii 1,0-1,5 mm su entrambi i lati sinistro e destro del cranio per consentire l'inserimento dei microelettrodi di registrazione nelle regioni M2 sotto uno stereomicroscopio (Figura 1A).
    NOTA: Posizioni stereotaxiche di M2 bilaterale: 1,94 mm anteriore al bregma, 1,0 mm laterale alla linea mediana e 0,8-1,1 mm ventrale alla dura.
  8. Rimuovere con attenzione la dura mater con un ago di tungsteno.
  9. Tirare micropipette di borosilicate in vetro (diametro esterno: 1,0 mm) come microelettrodi di registrazione con resistenza di 1-2 M.
  10. Inserire due microelettrodi di registrazione separati riempiti con NaCl 0,5 M nei fori utilizzando micromanipolatori meccanici (a 60 , Figura 1B).

2. Registrazioni LFP in M2 bilaterale di topi

  1. Abbassare lentamente gli elettrodi di vetro sinistro e destro nelle coordinate appropriate del F2 bilaterale (Figura 1C).
  2. Per il controllo della qualità, verificare la resistenza di ogni elettrodo utilizzando l'amplificatore differenziale prima di catturare LFP.
  3. Impostare il processo di registrazione a passate alte da 0,1 hz e a passaggi bassi da 1.000 Hz con un'amplificazione di 1.000x.
  4. Raccogliere i dati LFP grezzi digitalizzati di almeno 60 s attività s s in stato stabile, con i topi che respirano in modo uniforme ad una velocità respiratoria di 2 respiri al secondo in anestesia.
  5. Dopo la registrazione, sollevare lentamente gli elettrodi dal cervello, quindi eutanasia i topi da una rapida lussazione cervicale.
  6. Salvare i dati e analizzare offline.

3. Analisi incrociata

  1. Fare clic su Analisi - Correlazione forma d'onda nel software di analisi e importare i dati.
  2. Impostazioni dei parametri
    1. Definire un segnale di forma d'onda come primo canale e l'altro come riferimento. Impostare la larghezza su 2 e l'offset su 1 (Figura 2A).
    2. Impostare la durata di entrambi gli LFP per 100 s selezionando l'ora di inizio e l'ora di fine. Premere il pulsante Elabora per eseguire l'analisi di correlazione incrociata (Figura 2B).
      NOTA: I segnali bilaterali simultanei con tali durate sarebbero abbastanza lunghi da mostrare attività spontanee neuronali, rivelando così le proprietà di base della sincronizzazione.
  3. Fare clic su File - Esporta con nome, quindi salvare i risultati della correlazione incrociata corrispondenti al grafico popup risultante in formato .txt.
  4. Aprire il file .txt (Figura 2C), rimuovere i valori di correlazione al tempo di ritardo compresi 0 - 0,01 s (poiché due onde gamma continue hanno almeno 0,01 s intervallo), quindi calcolare la media del resto dei dati di correlazione incrociata nella parte o nella media del ritardo temporale negativo il resto dei dati di correlazione incrociata nella parte positivo del ritardo temporale.

4. Analisi della coerenza

  1. Importare ed eseguire i dati nel software di analisi.
  2. Assegnare i due segnali LFP per essere il primo e il secondo canale di forma d'onda separatamente. Impostare quindi il valore della dimensione del blocco (Figura 3A).
    NOTA: Dimensione blocco indica il numero di punti dati utilizzati nell'FFT. Maggiore è la dimensione del blocco, migliore è la risoluzione della frequenza. Qui si consiglia di impostarlo come 4096.
  3. Spostare manualmente le linee tratteggiate per garantire che l'accuratezza temporale dei segnali in entrambi i canali venga impostata come lo stesso periodo (Figura 3B). Premere il pulsante Aggiungi area per caricare l'area ed eseguire l'analisi della coerenza.
  4. Fare clic su File - Salva con nome per salvare i risultati della coerenza corrispondenti al grafico popup risultante in formato .txt ( Figura3B).

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Representative Results

Per vedere se la patologia precoce dell'AD compromette la capacità della lateralizzazione dell'emisfero, abbiamo condotto registrazioni LFP extracellulari bilaterali nel M2 sinistro e destro dei topi APP/PS1 e controlli WT (di età compresa tra 3-5 mesi) e analizzato la correlazione incrociata di questi controlli sinistro e sinistro LFP destro. Nei topi WT, i risultati hanno dimostrato che la correlazione media tra LFP sinistro e destro in tempi positivi ritardi differiva in modo significativo da quello in tempi negativi, implicando l'esistenza di asimmetrie emisferiche nelle aree M2 dei controlli WT (Figura4 C; WT-positivo, 0.08161 - 0.01246; Negativo WT, 0,0206 - 0,01218; p - 4,74531E-4 < 0.001 da un campione t-test). In confronto, i LFP sinistro e destro dei topi APP/PS1 hanno mostrato una maggiore sincronizzazione nel dominio temporale, suggerendo una riduzione dell'asimmetria tra l'M2 sinistro e quello destro (Figura 4C; APP/PS1-positivo, 0.13336 - 0.0105 APP/PS1-negativo, 0.12635 - 0.01066; p - 0,64157 > 0,05 da un campione di due campioni t-test).

Abbiamo quindi filtrato le oscillazioni gamma dagli LFP (Figura 5A) ed eseguito un'analisi di coerenza come descritto nel protocollo per misurare la somiglianza dei segnali elettrici nella gamma di frequenza gamma. Il risultato ha mostrato che la coerenza gamma tra l'M2 sinistro e quello destro nell'APP/PS1 era significativamente superiore a quella dei topi WT (Figura 5B,C; WT, 0.13267 - 0.00598; APP/PS1, 0.17078 - 0.0072; p - 0,00550 < 0.01 da due test tdel campione), che indica una maggiore sincronizzazione e di conseguenza una lateralizzazione ridotta, tra sinistra e destra M2 nei mouse APP/PS1.

Figure 1
Figura 1 : diagramma della procedura di registrazione LFP simultanea. (A) Topo stereotassico con teschio esposto e dura mater rimosso per la registrazione bilaterale in vivo di LFP in M2 sinistro e destro. (B) Due microelettrodi di vetro in contatto con la superficie corticale nel foro perforato simultaneamente. (C) Registrazione dei microelettrodi insieme ai fili Ag/AgCl come elettrodi di riferimento posizionati nei siti appropriati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Illustrazione dell'analisi di correlazione incrociata. (A) Impostazioni per la finestra di dialogo di correlazione della forma d'onda. Ciò fornisce opzioni per scegliere quale canale di forma d'onda è il riferimento e per analizzare la correlazione di due segnali. (B) La finestra di dialogo del processo. Fornisce opzioni per impostare la durata della forma d'onda di riferimento e la durata di un'altra forma d'onda verrà aggiunta. L'analisi viene eseguita solo per le regioni di dati in cui esistono entrambi i canali di forma d'onda. (C) Esempio di file .txt con valori di correlazione incrociata a intervalli di ritardo temporale negativi e positivi separatamente per le statistiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Illustrazione dell'analisi della coerenza. (A) Impostazioni dei parametri per la finestra di dialogo di coerenza. La dimensione del blocco determina il numero di punti dati utilizzati nell'analisi e la risoluzione della frequenza. (B) Le linee tratteggiate sono regolabili per l'operatore di muoversi manualmente al fine di impostare la durata dei segnali per l'analisi. (C) Dopo che il software ha creato un grafico, fare clic su File - Salva con nome per salvare i risultati della coerenza come file con estensione .txt . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : la correlazione incrociata indica la lateralizzazione dell'emisfero declinato tra l'M2 sinistro e quello destro dei topi APP/PS1. (A) Tracce grezze rappresentative di LFP registrate simultaneamente nei topi bilaterali M2 di WT e APP/PS1 utilizzando il metodo di registrazione extracellulare (L: ha lasciato M2; R: destra M2). (B) La curva di correlazione incrociata mostra la correlazione dei segnali LFP bilaterali a diversi ritardi temporali. (C) Tra sinistra e destra M2, i controlli WT hanno mostrato un valore di correlazione incrociata significativamente più elevato a intervalli di ritardi temporali positivi rispetto a quelli negativi. Al contrario, il valore di correlazione incrociata dei topi APP/PS1 ha una somiglianza, che indica un declino dell'asimmetria (n x 10, per gruppo). Il valore rappresenta l'errore medio e standard della media. p < 0.001; due campioni t-test. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : coerenza delle oscillazioni gamma tra i topi WT e destro e sinistro del mouse WT e APP/PS1. (A) Tracce rappresentative delle oscillazioni gamma filtrate dagli LFP nell'M2 sinistro e destro. (B) Distribuzione di coerenza tra LFP registrata simultaneamente nella M2 bilaterale. I topi APP/PS1 differiscono in gran parte dai controlli WT nella gamma di frequenze gamma. (C) La coerenza tra oscillazioni gamma di M2 bilaterali in
I mouse APP/PS1 sono significativamente più alti dei controlli WT (n - 10, per gruppo). Il valore rappresenta l'errore medio e standard della media. p < 0,01; due campioni t-test. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Riportiamo qui la procedura per la registrazione extracellulare bilaterale in vivo, insieme all'analisi della sincronizzazione dei segnali LFP a doppia area, che è flessibile e facile da condurre per stimare la lateralizzazione dell'emisfero cerebrale, così come connettività, direzionalità o accoppiamento tra attività neurali di due aree cerebrali. Questo può essere ampiamente utilizzato per rivelare non solo attività neuronali di gruppo, ma anche alcune proprietà di base dell'elettrofisiologia interregionale, in particolare per i laboratori che sono interessati a screening di attività oscillatorie o laboratori che non hanno sistemi per registrazione multicanale nel comportarsi animali23.

In generale, sono disponibili una serie di tecniche per monitorare le attività cerebrali, tra cui l'elettroencefalografia (EEG), la magnetoencefalografia (MEG) e la risonanza magnetica funzionale (fMRI). Tali metodi hanno una risoluzione temporale e spaziale relativamente inferiore rispetto alle nostre registrazioni presentate. Ad esempio, l'EEG è uno degli strumenti più antichi e disponibili in commercio per studiare l'attività extracellulare del cervello. Anche se ci sono studi che utilizzano EEG ad "alta densità" in roditori liberamente in movimento per migliorare l'insufficiente risoluzione spaziale24,25,26, il cranio genera sempre più rumore e quindi riduce il segnale-rumore rapporto di oscillazione gamma corticale, soprattutto per topi di piccole dimensioni. Il nostro metodo con microelettrodi di vetro sarebbe una buona scelta per evitare che i ricercatori da quel "rumore distorcente" dal momento che i microelettrodi potrebbero essere inseriti direttamente nella struttura cerebrale. Inoltre, le pipette di vetro di registrazione utilizzate qui sono poco costose, altamente manovrabili e possono essere applicate per esplorare aree cerebrali più profonde non limitate alle aree corticali.

Prestare molta attenzione a quanto segue. In primo luogo, è obbligatorio eseguire l'anestesia rigorosamente basata sul peso corporeo e testare la profondità dell'anestesia ogni ora. Questo perché lo stato fisiologico del topo svolge un ruolo importante nella qualità della LFP registrata, e qualsiasi movimento dei siti di riferimento causato, ad esempio, improvviso risveglio dell'animale, potrebbe generare rumore elettrofisiologico di fondo che ammortizzare la disponibilità. In secondo luogo, poiché la resistenza ai microelettrodi varia a seconda della forma e del diametro della punta della pipetta di vetro, il riscaldamento deve essere regolato con attenzione all'interno della gamma per un'impedimento appropriato quando si tirano i microelettrodi. Come descritto in precedenza nella sezione protocollo, abbiamo scoperto che gli elettrodi con impediva vanno da 1 a 2 M, catturavano attività oscillatorie corticali ad alta qualità.

Le oscillazioni gamma riflettono la sincronizzazione neuronale di diverse regioni del cervello quando gli animali sono impegnati in attività di apprendimento o di stimolazione27,28,29. La sincronizzazione della banda gamma modula rapidamente l'eccitazione per attivare i neuroni post-sinaptici in modo efficace30. Vale la pena notare che, anche se l'oscillazione gamma è stata definita nel presente studio come attività oscillatoria con frequenza nell'intervallo 25-80 Hz come mostrato da diversi gruppi28,31,32, ci sono studi che descrivere 30-70 Hz come gamma bassa e 70-100 Hz come gamma alta33,34,35. Indipendentemente dalla definizione, i principi per l'analisi dei dati rimangono simili. Nell'elaborazione del segnale, la correlazione incrociata viene utilizzata per determinare il ritardo tra i segnali elettrici di due regioni cerebrali36. Per i segnali in condizioni di stimolazione, le durate selezionate per l'analisi incrociata potrebbero essere più brevi di37.

Anche se ci sono limitazioni nell'uso della registrazione LFP per la valutazione delle attività neurali; per esempio, non può distinguere tra attività pre e post-sinaptiche né rilevare i potenziali di membrana a riposo dei neuroni registrati23, l'approccio qui introdotto serve come utile strumento per la misurazione delle attività di un gruppo di neuroni provenienti da diverse aree cerebrali di topi, consentendo lo studio della connettività funzionale cervello-area e l'accoppiamento dei segnali elettrici prima e dopo l'infusione di droga.

Sono state proposte diverse spiegazioni per l'emergere di asimmetria emisferica, ad esempio l'asimmetria migliora la capacità di un individuo di svolgere due compiti diversi contemporaneamente38; o l'asimmetria aumenta la capacità neurale, evitando inutili duplicazioni di reti neurali39; o due diversi processi cognitivi possono essere eseguiti più facilmente contemporaneamente se sono lateralizzati a diversi emisferi40. Si presume che la lateralizzazione dell'emisfero fornisca vantaggi cognitivi, ma cambia con l'etàdi 12,41. Studi di neuroimaging hanno dimostrato costantemente che l'attivazione prefrontale tende ad essere meno lateralizzata negli adulti più anziani che negli individui più giovani42,43. I pazienti affetti da AD con primi cambiamenti patologici unilaterali o bilaterali sviluppano anomalie cerebrali, tra cui lateralizzazione associandosi all'oblio, risposte lente alla stimolazione sonora e declino cognitivo11,44. Abbiamo osservato, nel presente studio, un livello interrotto di lateralizzazione dell'emisfero tra metà e destra dei topi APP/PS1 a 3-5 mesi, che è il periodo in cui tali topi non aggregano la deposizione apparente delle placche beta amiloidi45, 46, il che implica che la tossicità indotta da oligomeri amiloidi beta solubili può contribuire, almeno in parte, alla lateralizzazione aberrale dell'emisfero corticale, che potrebbe accelerare il deterioramento cerebrale della patogenesi adAd 16, 47.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31771219, 31871170), della Divisione Scienza e Tecnologia del Guangdong (2013KJCX0054) e della Fondazione di Scienze Naturali della Provincia di Guangdong (2014A030313418, 2014A030313440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AC/DC Differential Amplifier A-M Systems Model 3000
Analog Digital converter Cambridge Electronic Design Ltd. Micro1401
Glass borosilicate micropipettes Nanjing spring teaching experimental equipment company 161230 Outer diameter: 1.0mm
Microelectrode puller Narishige PC-10
NaCl Guangzhou Chemical Reagent Factory 7647-14-5
Pin microelectrode holder World Precision Instruments, INC. MEH3SW10
Spike2  Cambridge Electronic Design Ltd.
Stereomicroscope Zeiss 435064-9020-000
Stereotaxic apparatus  RWD Life Science 68045
Urethane Sigma-Aldrich 94300

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Neuroscienze numero 149 Morbo di Alzheimer lateralizzazione elettrofisiologia in vivo corteccia motoria secondaria potenziale sul campo locale sincronizzazione
Valutazione della lateralizzazione dell'emisfero con la registrazione del potenziale sul campo locale bilaterale nella corteccia motoria secondaria dei topi
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Chen, Y., Li, M., Zheng, Y., Yang,More

Chen, Y., Li, M., Zheng, Y., Yang, L. Evaluation of Hemisphere Lateralization with Bilateral Local Field Potential Recording in Secondary Motor Cortex of Mice. J. Vis. Exp. (149), e59310, doi:10.3791/59310 (2019).

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