Summary
Giver én celle følsomhed, er real-time flowcytometri unikt tilpasset til at kvantificere multimodale receptor funktioner af levende kulturer. Ved hjælp af voksne neurale stamceller, blev P2X7 receptor funktionen vurderet via calcium tilstrømning registreres af calcium indikator farvestof, transmembrane pore dannelsen af ethidium bromid optagelse og fagocytose ved hjælp af fluorescerende latex perler.
Abstract
Live-celle flowcytometri bruges i stigende grad blandt celle biologer for at kvantificere biologiske processer i en levende celle kultur. Denne protokol beskriver en metode, hvorved live-celle flowcytometri er udvidet ved for at analysere den mangfoldig funktioner af P2X7 receptor aktivering i realtid. Ved hjælp af en tid modul installeret på en flow forskellige kan live-celle funktionalitet vurderes og afbildet i en given periode at udforske kinetik af calcium tilstrømning, transmembrane pore dannelse og fagocytose. Denne simple metode er fordelagtig, da alle tre kanoniske funktioner af P2X7 receptoren kan vurderes ved hjælp af én maskine, og de indsamlede data afbildes over tid giver oplysninger på hele live-celle population i stedet for én celle optagelser ofte fremstillet ved hjælp af teknisk udfordrende patch-clamp metoder. Calcium tilstrømning eksperimenter bruger en calcium indikator farvestof, mens P2X7 pore dannelse assays afhængige ethidiumbromid får lov til at passere gennem den transmembrane pore dannet ved høj agonist koncentrationer. Gul-grøn (YG) latex perler er udnyttet til at måle fagocytose. Specifikke agonister og antagonister anvendes til at undersøge virkningerne af P2X7 receptor aktivitet. Disse metoder kan individuelt, ændres for at tilvejebringe kvantitative data på et vilkårligt antal calcium kanaler og purinergic og skyllevæske receptorer. Taget sammen, fremhæver de, hvordan brugen af real-time live-celle flowcytometri er en hurtig, omkostningseffektiv, reproducerbare og kvantificerbare metode til at undersøge P2X7 receptor funktion.
Introduction
Studiet af purinergic signalering er bred og mangesidet, der involverer cellulær fysiologi, biokemi og farmakologi. Purinergic signalering er involveret i en uendelig række af cellulære og molekylære processer, fra kræft og celle cyklus regulering til celle-celle kommunikation og stamceller biologi; som sådan, findes der ofte et potentiale til at modulere purinergic signalering for en terapeutisk effekt. Purinergic-receptorer, har P2X7 receptor modtaget betydelig opmærksomhed i de seneste år på grund af sit potentiale som en terapeutisk destination for mange inflammatoriske tilstande1. Metoder til at studere receptoren har udviklet sig og blevet tilpasset årenes løb for at lette denne forskning2,3,4,5. Her, beskriver vi en live-celle flow flowcytometri metode til at undersøge den mangfoldig funktioner af P2X7 receptorer i voksne neurale stamceller afledt fra den subventricular zone (SVZ) og den hippocampus dentate gyrus.
P2X7 receptoren blev første gang beskrevet som P2Z receptoren, eller 'celledød' receptor, som dens aktivering med høje koncentrationer af adenosin trifosfat (ATP) resulterer i dannelsen af en stor transmembrane pore gennemtrængelig for molekyler op til 900 Da6. Dette fører til cytoskeletal omlejring, transmembrane pore dannelse og potentielt, apoptose og/eller nekrose7. Traditionelt, er denne funktion i P2X7 kvantificeret ved optagelsen af store molekylvægt farvestoffer såsom YO-PRO-1 eller ethidium methylbromid, der fluorescerer når imidlerid med DNA3,8. Plade læser metoder, som er hurtig og lader upscaling, generelt tillader ikke for observation af kinetik. Metoden beskrevet her er baseret på ethidium udbredelse og tillader fluorescens stigning skal følges over tid, giver en større dybde af oplysninger med hensyn til hastigheden af pore dannelse. P2X7 receptorer har siden vist sig at fremme en række nonimmune funktioner, med forskellige svar alt efter eksponering tid og agonist koncentration9,10. Kort aktivering af lavere koncentrationer af ATP resultater i kation tilstrømningen til formål af neurotransmitter og signal transduktion11. Ved hjælp af flowcytometri for at måle calcium tilstrømning overvinder problemerne med besværlige og teknisk udfordrende metoder — især patch fastspænding for at måle indad strømninger, som give uvurderlige oplysninger om ændringen i potentiale på tværs af en cellemembran, men tillader ikke for befolkningen analyse2. Den tredje funktion af P2X7 receptorer opstår i mangel af ATP, hvor P2X7 receptorer er blevet påvist for at lette fagocytose i både immunforsvaret og nervesystemet9,12,13. Fremskridt i mikroskopi-teknikker har tilladt visualisering af cytoskeletal rearrangementer under optagelsen processen, selvom kvantificering og befolkningen analyse kan stadig udgør en udfordring.
Metoden live-celle flow flowcytometri detaljeret her giver mulighed for undersøgelse af alle tre hovedfunktioner P2X7 receptorer i realtid. Medtagelsen af en tid modul enhed på flow forskellige tillader temperaturkontrol og løbende omrøring af celler i suspension. Agonist og antagonist stimuli kan leveres inden for et sekund, så i nærheden af uafbrudt måling af den cellulære reaktion. Dette giver en hurtig og enkel metode til reproducerbar kvantificere funktion samtidig undgå brugen af flere assay systemer. Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol kan nemt tilpasses passer til enhver celletype og kunne bruges til at undersøge andre receptor subtype givet medtagelsen af specifikke agonister eller hæmmere, alt efter deres egenskaber.
Protocol
Dyrene blev behandlet i overensstemmelse med de australske adfærdskodeksen for pasning og brug af dyr til videnskabelige formål og godkendt til brug ved den Griffith Universitet dyr etiske komité.
1. Neurosphere kultur af neurale stamceller fra voksne SVZ og Hippocampus
Bemærk: Dissektion protokollen præsenteres her er baseret på arbejde af Walker og Kempermann, og en detaljeret protokol til dissektion af neurale stamceller fra voksne mus er tilgængelig andetsteds14. Dyrkningsbetingelser er blevet ændret fra Babu og kolleger15. Voksne kvindelige C57BL/6 mus i alderen 8-12 uger blev brugt.
- I en biologisk sikkerhed kabinet, forberede næringssubstratet (neurale basal medium) suppleret med neurale stamceller spredning supplement, 2 mM glutamin, 20 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF), 10 ng/mL basic fibroblast vækstfaktor (bFGF) og 2 µg/mL heparin.
- Aflive to mus af CO2 indånding. Alternativt, bedøver mus efter institutionelle retningslinjer og straks aflive dem af cervikal dislokation. Spray hovedet med 70% ethanol og Hug hovedet af dem. Overføre hver leder til en steril rør indeholdende Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS) med 1 x penicillin/streptomycin løsning (P/S).
- Udføre dissektioner i en laminar flow hood under et mikroskop for dissektion.
- Brug af pincet og dissektion saks, fjerne væv og knogler til at eksponere hjernen, og overføre det til en steril skål indeholdende HBSS med P/S.
- Placer den hjerne ventrale side op og bruge en skalpel blade til at lave en komplet koronale snit på tværs af den optiske chiasm. Hold hjernen stabil med pincet og bruge en swift, ren, nedadgående bevægelse. Undgå savning minimere celledød og hjælpe med at opretholde væv struktur.
Bemærk: Hvis ikke holdes sikkert, hjernen kan vippe frem under cut, at antallet af stamceller udvundet SVZ. - Isolere SVZ fra den rostralt halvdel af hjernen.
- Find begge ventrikler, adskilt af septum, med corpus callosum udgør en hvid bro over dem.
- Bruge pincet til at fjerne den septum, adskiller de to hjertekamre og isolere de laterale vægge af de anteriore laterale ventrikler. Gøre dette ved at skære væk over, under, til siderne og foran med fine dissektion saks. Der vil fortsat være bare en lille kop-lignende form.
- Forberede en ren petriskål låg med et par dråber af HBSS i midten og overføre SVZ til væsken. Tillad ikke væv til tørre eller at røre en tør overflade. Stå til side mens dissekere hippocampi.
- Isolere hippocampi fra den caudale halvdel af hjernen.
- Gøre en midterlinjen skåret mellem hjernehalvdele til sever hjernebjælken. Brug de laterale hjertekamrene som en guide og forsigtigt fold cortex at eksponere hippocampus. Når cortex er blevet rullede, kan hippocampus ses som et tæt, hvide, buede struktur.
- Brug fine dissektion saks eller pincet til at isolerer hippocampus fra det omkringliggende væv.
- Med pincet, fjerne overskydende hvide substans, blodkar, og hindeagtige væv der dækker hippocampus.
- Forberede en ren petriskål låg parat med et par dråber af HBSS og overføre hippocampus til væsken. Gentag for de andre halvkugle.
- Når hippocampus og SVZ fra to mus har været isoleret og overført til deres respektive petriskål låg, mekanisk terning væv ved hjælp af en skalpel klinge. Hak vævet i en petriskål låg for ca. 1 min., roterende hver 10 s indtil vævet vises glat og kun fine stykker forblive. Tage en ren skalpel klinge og gentage for andre skålen, terninger vævet i 1 minut.
- Brug 1 mL pipette, overførsel alle væv fra hver petriskål låg til at adskille rør indeholdende 1 mL 0,25% trypsin-ethylendiamintetra syre (EDTA). Bruge en tube for SVZ og en slange i hippocampus.
- Gøre dette ved første pipettering omkring halvdelen af trypsin-EDTA til væv i fadet til at minimere luftbobler og forhindre det væv, der kommer i kontakt med tørt pipette tip, som overføres til røret. Skyl skålen og skalpel klinge med resten af trypsin-EDTA indsamle så meget væv som muligt og føje det til røret.
- Inkuber væv med trypsin i et 37 ° C vandbad i 30 min, agiterer tube hver 10 min at korrekt adskille væv.
- Hakkede væv ved hjælp af en brand-poleret glas Pasteur pipette til at oprette en enkelt cellesuspension. Passe på ikke for at overtriturate da dette vil medføre uforholdsmæssigt store celle lysering. Dette er et afgørende skridt for optimal væv dissociation.
- Observere tube indholdet under ændring proces og stoppe på de tidligste tegn, fleste af væv klumper er fjernet. Trypsin løsning skulle blive lidt overskyet når cellerne er gået ind i én celle suspension, selvom nogle klumper kan forblive.
Bemærk: Som en indikation er passerer suspension op og ned 10 x-15 x passende. - Tilføje næringssubstratet op til 5 mL til at neutralisere trypsin og spin på 300 x g til 3 min. vask yderligere 2 x med HBSS og pass medium gennem en 70 µm celle si til at fjerne enhver væv klumper.
- Overføre alle celler i 15 mL af medium til en T75 celle kultur kolbe.
Bemærk: Kugler skal danne i passagen nul (P0) SVZ kultur efter 7-10 dage og efter 15-20 dage i hippocampus kultur. Undlade at vaske eller fodring celler i løbet af denne tid til at maksimere antallet af neurale stamceller i kultur. Hvis flere ophav er påkrævet, eller for at formindske P0 inkubationstiden, er det muligt at øge antallet af mus ofret. - Vedligeholde kulturer ved 37 ° C med 5% CO2 , og efter den indledende P0 kultur fase, passage hver 7-10 dage efter behov, ved hjælp af en biologisk sikkerhed kabinet og standard vævskultur praksis.
Bemærk: P0 hippocampus kultur skal generere nok kugler til passage til en T25 målekolbe; SVZ kultur vil generere mange flere områder og kan være passaged i en T75. Hvis områderne P0 hippocampus har overholdt, skal du bruge 200 µL pipette til forsigtigt løfte kuglen. - Passage af kugler, når de når 150 til 200 µm i diameter. Indsamle de kugler og medium i en 15 mL tube og tillade kugler til at afregne ved tyngdekraft i ca 5 min. Alternativt, spin på en lav hastighed (100 x g) for 2 min.
- Fjern mediet og adskille celler med dissociation reagens for 7-10 min, afhængig af størrelsen af kugler.
Bemærk: Dissociation reagens anvendes vil få væsentlig indvirkning på resultatet af kulturen, så henvises til Tabel af materialer for detaljerne. - Vask celler ved at tilføje 5 mL af HBSS til celle løsning og centrifugeres ved 300 x g i 3 min. Fjern supernatanten, resuspend celler dyrkningsmedium og frø på ca 150.000 celler i 5 mL medium i en T25 celle kultur kolbe eller tilsvarende. Vedligeholde kulturer på 37 ° C og 5% CO2.
- Bekræfte neurale stamceller celle status ved at identificere udtryk af stamceller markører som Sox2 og ASCL1, før du fortsætter til enhver downstream protokol9.
Bemærk: Dette kan gøres ved forskerens foretrukne metode (f.eks. immunochemistry af mikroskopi, flowcytometri eller vestlige skamplet, eller ved hjælp af kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR)).
2. forberedelse af en enkelt celle Suspension til analyse ved flowcytometri
-
Forbered den nødvendige medier. Disse omfatter følgende.
- Forberede Na+ medium indeholdende 145 mM NaCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glucose, 0,1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,1 mM CaCl2. Dette medie er også brugt i en calcium-fri form, med 0,1 mM CaCl2 udeladt.
- Forberede K+ medium indeholdende 145 mM KCl, 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-glucose og 0,1% BSA.
Bemærk: Disse medier blev grundigt optimeret og er nærmere beskrevet i tidligere publikationer4,5. - Forberede Lager ATP ved vejning nok ATP pulver til ca 20 mL af en 100 mM bestand. Opløse pulveret i 17 mL af KCl buffer (145 mM KCl, 5 mM KOH og 10 mM HEPES, pH 7,5) og langsomt, under omrøring, tilsættes 2 mL 18% (w/v) tetramethylammonium hydroxid (TMA) til løsning at bringe pH 6,8-7,0.
- Justere den endelige mængden til 20 mL. Overskridelse ikke pH forbi 7.0. Butik lager ved-80 ° C; Bemærk, at ATP delprøver er stabil i mindst 6 måneder.
Bemærk: Den gratis molekylvægt af vandfri ATP er 551.14 g/mol, og dette omfatter ikke molekylevægt af vand og dinatrium molekyler, som kan variere fra batch til batch og bør tages i betragtning ved beregningerne. TMA er giftige, og skal udvises forsigtighed ved håndtering. Læs safety data sheet og forberede bestande i en røg kabinet. - Forberede lager BzATP ved at opløse BzATP i ultrarent H2O for en bestand slutkoncentration på 10 mM.
- Oprette en enkelt celle suspension, som beskrevet i trin 1.16 og 1,17. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer eller automatiske celle counter. Resuspend celler i den krævede medium (f.eks, Na+ medium, næringssubstrat) for eksperimentet udføres (som beskrevet nedenfor) og placere celler på is i mellemtiden.
- Til hvert eksperiment, sikre, at der er nok prøve at medtage kontrolelementer for frem og side scatter samt for kalibrering af spænding og udligning indstillinger. Bemærk, som et tegn på, at kugler dyrkes i en T75 kolben typisk udbytte omkring 8 x 106 celler pr. flaske.
-
Sæt strømmen forskellige indstillinger ved hjælp af kontrolprøver.
- Brug frem og side scatter til selektivt gate levende celler.
Bemærk: Forward scatter giver oplysninger om Cellestørrelse baseret på lys diffraktion, mens side scatter giver et mål for interne kompleksitet eller granularitet. Flow begivenheder med små frem og side scatter kan betragtes som døde celler. - Justere spændingen og vinde af flow forskellige ifølge producentens anvisninger. Køre en prøveversion prøve for opsamling af data på den maksimale fluorescens intensitet. Ingen kompensation kræves til single channel-opkøb.
- Brug frem og side scatter til selektivt gate levende celler.
3. måling af Calcium tilstrømning af Live-celle flow flowcytometri
- Efter udarbejdelsen af en enkelt celle suspension resuspend celler i 1 mL af calcium-fri Na+ medium og indlæse dem med 2 ng/mL af calcium indikator farvestof efter producentens protokol (Se Tabel af materialer) med 10 µL 5% pluronic syre. Inkuber celler i 30 minutter ved 37 ° C.
- Cellerne vaskes ved at tilføje 3 – 5 mL af calcium-fri Na+ medium og centrifugering forsigtigt (200 x g i 4 min). Fjern supernatanten og resuspend celler i calcium-fri Na+ medium, vask en anden gang.
- Resuspend celler i 1 mL af calcium-fri Na+ medium, placere dem på is, og give dem til de-esterify i 30 min.
- Vask 1 x mere ved at tilføje 3 – 5 mL af K+ medium og centrifugering (200 x g i 4 min); derefter resuspend celler i K+ medium og alikvot dem til fluorescens assisteret celle sortering (FACS) rør ved en koncentration på 1 x 106 celler pr. 500 µL pr. FACS tube.
Bemærk: Antallet af FACS reagensglas pr. prøve vil afhænge af antallet af behandlinger og gentager, der er inkluderet. - Placer FACS rør på is, indtil cellerne er klar til at blive analyseret. Efterlad ikke cellerne på is i en længere periode, men begynde analysen hurtigst muligt.
- For nogle prøver, preincubate celler med P2X7 receptor-specifik hæmmer AZ10606120 (1 µM i 10-15 min) eller A438079 (10 µM i 30 min) ved 37 ° C inden analyse.
- Et par minutter, inden du kører den første prøve, tilføje CaCl2 (til en endelig koncentration på 1 mM i FACS tube) og placere røret i et 37 ° C vandbad til at inddrive.
- Drop en ren, lille magnetomrører ind i FACS tube og holdning røret i modulet tid knyttet til en cirkulerende 37 ° C vandbad til kontrol prøve temperatur. Vælg en lav omrøring hastighed til at sikre udveksling af prøven uden at indføre en vortex effekt. Læg vand jakke tube adapter på prøve platform og luk løftestang arm af FACS maskine.
- Indlede prøven erhvervelse og køre prøve i 3 min på ca. 1.000 arrangementer pr. sekund.
- På de 40 s mark, hurtigt fjerne røret og tilføje P2X7 agonist, enten 1 mM ATP eller 300 µM BzATP, og erstatte røret for at fortsætte erhvervelse.
- Mens den første prøve optagelse, forberede den anden prøve med CaCl2 og placere den i 37 ° C at give tilstrækkelig tid for cellerne til at varme op før analyse. Når den første prøve er færdig, rense indtaget ved at køre en vandprøve, og derefter erhvervelse af den anden prøve kan begynde som beskrevet i trin 3.8 og 3.9. Ren altid indtaget mellem prøver.
4. måling af Pore dannelsen af Live-celle flowcytometri
- Oprette en enkelt celle suspension, som beskrevet i trin 1.16 og 1,17. Gemme et par milliliter af den gamle medium, bruge det til resuspend celler i en koncentration på 1 x 106 celler pr. 100 µL pr. FACS tube og placere den på køl indtil klar.
- Inden du kører analysen, tilføje 900 µL af K+ medium for en endelige mængden af 1 mL og placere rør i et 37 ° C vandbad i 10 min at inddrive.
- Hvis det er relevant, preincubate celler med behandlinger, herunder P2X7-specifikke hæmmere AZ10606120 (1 µM i 10-15 min) eller A438079 (10 µM i 30 min).
- Umiddelbart inden du kører analysen, tilføje 25 µM ethidiumbromid til FACS røret; derefter tilsættes magnetomrører, placere den på FACS maskinen efter trin 3.7, og begynde erhvervelse.
Bemærk: Ethidiumbromid er giftige, og skal udvises forsigtighed ved håndtering af det. Bortskaf anvendte FACS rør passende. - For at fremkalde dannelse af porer i cellemembranen, tilføje 1 mM ATP eller 100 µM BzATP 40 s efter indledningen af overtagelse.
- Køre prøverne på omkring 1.000 arrangementer pr. sekund for 6 min.
- Mens den første prøve der kører, tage den anden prøve fra isen og placere den i et 37 ° C vandbad at give tilstrækkelig tid for cellerne til at inddrive inden analysen. Når den første prøve er færdig med erhvervelse, rense indtaget ved at køre en vandprøve; derefter, kan den anden prøve anbringes på maskinen for at begynde optagelse som beskrevet i trin 3.8 og 3.9.
5. måling fagocytose af Live-celle flowcytometri
- Oprette en enkelt celle suspension, som beskrevet i trin 1.16 og 1,17. Resuspend celler i konditioneret medium og prøve dem i FACS rør ved en koncentration på mindst 1 x 106 celler pr. 100 µL pr. FACS tube. Fortynd celler til en endelig koncentration på 1 x 106 celler/mL med Na+ medium (f.eks. tilføje 900 µL af Na+ medium) og placere celler på is, indtil analysen udføres.
- Brug 1 µm af YG latex perler (mikrokugler) som fagocyterende mål for real-time fagocytose assays.
Bemærk: Andre farver kan også erstattes, men forskellige størrelser perler blev konstateret for at være utilstrækkelige mål af fagocytose4. - Inden du kører den første prøve, overføre cellerne til en 37 ° C vandbad og inkuberes dem for ca 7-10 min at tillade cellerne til at inddrive.
-
Tilføj eventuelle behandlinger, der kræver preincubation til deres respektive rør, herunder 1 mM ATP for 15 min, 300 µM oxideret ATP (oxATP) for 40 min, 20 µM cytochalasin D for 20 min, og 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 20 min.
- Der kræves ingen preincubation for 5% human serum. Hvis behandlinger er tilføjet på omtrent samme tid, kan prøverne køres i omvendt rækkefølge mens de andre fortsat at udruge. For eksempel køre kontrol og serum først, derefter eksemplet ATP-behandlet, efterfulgt af cytochalasin D og PFA og oxATP sidst.
- Prøven anbringes på forskellige med magnetomrøreren som beskrevet i trin 3.8 og 3.9, og derefter indlede prøven erhvervelse.
- Fjern prøveglas fra maskinen 15 – 20 s efter indledningen af overtagelse, og tilsæt 5 µL af ufortyndet YG perler. Returnere FACS prøveglas og fortsætte erhvervelse. Køre prøver for 7-8 min på ca. 1.000 arrangementer/s.
- Mens den første prøve der kører, tage den anden prøve fra isen og placere den i et 37 ° C vandbad at give tilstrækkelig tid for cellerne til at inddrive inden analyse. Når den første prøve er færdig, rense indtaget ved at køre en vandprøve, og derefter begynde erhvervelse på den anden prøve, som beskrevet i trin 3.8 og 3.9.
6. dataanalyse
- Eksportere data til et regneark. Data analysen vil afhænge af den eksperimentelle spørgsmål.
Bemærk: Vær opmærksom på at forskellige kørsler kan have forskellige baseline intensiteter, så det er vigtigt at køre analysen i udpegede tid i starten (omkring 40 s) før tilføje enhver agonister og til at normalisere dataene ved at beregne ændringen i fluorescens (Fluorescens på ethvert givet tidspunkt [F] divideret med fluorescens for tidspunkt nul [F0], eller F/F0). - For at kvantificere sats eller kinetik af den pågældende P2X7 funktion, Beregn arealet under kurven eller summen af de trapezformede oprettet under kurve for hver 10 s tid perioden16.
- At fastslå virkningerne af behandlinger, fluorescens-intensiteten i gennemsnit over de sidste 10-20 s af optagelse og sammenligne behandlingerne. Bestemme betydningen af t-test eller variansanalyse.
Representative Results
Neurale stamfader cellekulturer
Neurale stamfader sfære kulturer afledt ved hjælp af denne metode bør være fase lyse og har en glat rund kant (figur 1AB). I sund kulturer, kan små microspikes observeres på kanterne (figur 1 c). På afdøde passager, eller hvis fodret med utilstrækkeligt, kugler kan danne en hule cup figur (figur 1 d) eller store aflange figurer (figur 1E, angivet med pil). Disse kulturer bør ikke anvendes til flowcytometri eller andre downstream applikationer, som disse funktioner kan det vejledende af differentiering. For at bekræfte statussen neurale stamfader, cellerne var belagt på glas coverslips belagt med poly-L-ornithin og laminin for immuncytokemi (figur 1F og på højere confluency, figur 1 g). Celler var farvet for GFAP, nestin, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1 og DCX for at identificere cellerne som Type 2 stamceller (hippocampus) eller Type C stamfader celler (SVZ)9. Celler skal have en veldefineret cellekerne og udvidede processer.
Figur 1: repræsentative hippocampus neurale stamfader cellekultur. (A) hippocampus neurale stamceller er isoleret fra voksne mus og kulturperler som neurospheres indtil ca 100 til 150 µm i diameter. (B) Neurospheres skal have en glat periferien, (C) og små microspikes kan være observeret på deres overflade. Når kugler er for lange i kultur, kan de danne (D) cup eller (E) aflange figurer. Disse kulturer bør ikke anvendes til forsøg. For at bekræfte den neurale stamfader status af cellerne, seed dem som en enkelt celle suspension på poly-L-ornithin (PLO) og laminin-belagt glas coverslips for immunochemistry. Celler skal have en lille soma og forgrening processer, (F) på lavt confluency og (G) klar til immunochemistry. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Calcium tilstrømning af live-celle flowcytometri
Denne protokol giver mulighed for analyse af P2X7 receptor funktion som calcium kanal i realtid. Kinetik af receptor funktion, samt virkningerne af forskellige agonister og antagonister, kan også blive vurderet. Når plottet tid, calcium tilstrømning i den hippocampus og SVZ neurale stamceller var generelt tilsvarende (figur 2A og figur 2B, henholdsvis). Agonister (enten ATP eller BzATP) blev tilføjet på 40 s varemærke, som er angivet med den røde pil. For et kort øjeblik, er røret fjernet fra punktet optagelse tilføje agonist, hvilket resulterer i datapunkter på nul. Dette vil give mulighed for identifikation af tiden når agonist blev tilføjet. BzATP aktiveres hurtigt P2X7 receptorer, åbne ion-kanal og at tillade calcium tilstrømning, som binder sig til Fluo-8 og fluorescerer. ATP program generelt resulterer i en mere gradvis calcium tilstrømning. Det har en lavere affinitet til P2X7 i forhold til BzATP og vil også resultere i G-protein-koblet receptor aktivering, en langsommere signalvejen, som frigiver calcium fra det endoplasmatiske reticulum. Inddragelse af P2X7 antagonister A438079 og AZ10606120 (data ikke vist) reduceret calcium tilstrømning svar på agonist ansøgning.
Figur 2: Live-celle calcium tilstrømning i neurale stamceller fra hippocampus og SVZ. P2X7 receptor calcium kanal funktion blev demonstreret i (A) hippocampus og (B) SVZ-afledte stamceller af ændringer i Fluo-8 fluorescens. Anvendelsen af den generelle P2X agonist ATP og P2X7 agonist BzATP resultat i P2X7 ion-kanaler åbner, så calcium tilstrømning. Tilstrømningen blev blokeret med P2X7-specifikke hæmmere A438079 eller AZ10606120 (data ikke vist). F = fluorescens; F0 = fluorescens for tidspunkt nul. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Pore dannelsen af live-celle flowcytometri
Transmembrane pore dannelse er en kanonisk funktion af P2X7 receptorer, resultater i makromolekyle exchange, og kan føre til celledød. Ethidium+ er et stort molekyle (314 Da) udelukket fra raske celler; dens udbredelse og efterfølgende intercalation med DNA resulterer i fluorescerende emissioner og kan bruges til at vurdere P2X7 receptorer evne til at danne transmembrane porer. Efter anvendelse af agonister ATP (1 mM ATP) og BzATP (100 μM) på 40 s (angivet med pilen), tidsopløst flowcytometri indfanger ethidiumbromid indtastning celler i realtid (figur 3A). Denne effekt blev svækket af P2X7-specifik hæmmer AZ10606120. Ethidium bromid optagelse assay viser en funktionel P2X7 receptor C-terminus17 og er god dokumentation for fuld længde P2X7 receptor udtryk. ATP koncentration / respons assays illustrere virkningerne af agonist koncentration på P2X7 pore dannelse, ved hjælp af ændring i ethidium bromid fluorescens over tid (figur 3B). Agonist dosis koncentration kurver sammen med receptor-specifikke hæmmere giver stærke beviser for receptor aktivering.
Figur 3: P2X7 transmembrane pore dannelse målt ved ethidium optagelse. Tilsætning af ethidium bromid øjeblikke før indledningen af overtagelse bruges til at måle dannelsen af P2X7 transmembrane porer. Høje koncentrationer af ATP og BzATP resultat i (A) P2X7 receptor pore dannelse, så ethidiumbromid at komme ind i cellen. P2X7 hæmmer AZ10606120 dæmper fænomenet og fremlægger bevis for funktionelle P2X7 receptorer. (B) ATP koncentration / respons assays demonstreret betydelige pore dannelse på 500 μM og 1 mM, men ikke ved lavere koncentrationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Fagocytose af live-celle flowcytometri
Vores gruppe har tidligere vist, at ekstracellulære ATP hæmmer P2X7-medieret fagocytose af miljøomkostningerne P2X7 C-terminus fra cytoskeleton, specifikt, nonmuscle myosin IIA18,19. Denne metode udvider på disse resultater at vise P2X7 receptor inddragelse i fagocytose af hippocampus og SVZ neurale stamceller-celler i realtid (figur 4, et eksempel på Hippocampus fagocytose). Uhæmmet fagocytose (kontrol) niveauer af 1 µm YG latex perler blev etableret som den positive kontrol. ATP hæmmede fagocytose af YG perler i samme omfang som de uspecifikke inhibitorer, nemlig PFA fiksering og aktin polymerisering hæmmer cytochalasin D, mens 5% serum afskaffet alle medfødte fagocytose20.
Figur 4: YG perle optagelse demonstrerer fagocyterende kapacitet af neurale stamceller via P2X7 receptorer. YG perle optagelsen af neurale stamceller er observerbare ved hjælp af live-celle flow flowcytometri i realtid. Kontrolniveauer af fagocytose er etableret i første omgang, og hvis antallet af celler giver mulighed for, bekræftet i slutningen af flugt. Inddragelse af P2X7 receptorer er indiceret ved hæmning af fagocytose tilstedeværelse af ATP, som det tager den C-terminus fra membran cytoskeleton, forebyggelse af P2X7-medieret cytoskeletal rearrangementer. Anvendelsen af ATP blokeret fagocytose i samme omfang som brugen af uspecifikke inhibitorer af fagocytose, herunder PARAFORMALDEHYD (PFA) og cytochalasin D (CytD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Dette paper præsenterer en detaljeret protokol til analyse af P2X7 receptor funktion i neurale stamfader cellekulturer stammer fra de voksne neurogen nicher. De potentielle anvendelser for voksne neurale stamceller celler spænder fra forskning til behandlingsformål, og så metoden for kultur skal være robust og reproducerbar. Der er en række vigtige aspekter til denne protokol, der kan påvirke kvaliteten af slutpunkt kultur. Når fjernet fra kraniet, hjernen må ikke tørre og dissektion bør udføres så hurtigt som muligt. Især med hippocampus medfører ekstra omhu at fjerne enhver blodkar eller hindeagtig væv superior stamfader celle udbytter. Dissociation og ændring processen kan stærkt påvirke antallet af kugler fremstillet i en kultur; agiterer vævet under inkubation med trypsin-EDTA vil resultere i en mere homogen opløsning. Brugen af en brand-poleret glas græs pipette over en P1000 plast pipette tip er stærkt anbefales at reducere celledød og forbedre den resulterende kultur. Undgå overtriturating. På trods af disse forholdsregler, at proceduren kan oprette en masse snavs i P0 kultur og for at undgå at miste stamceller, vask eller fodring kultur bør undgås indtil kugler har dannet.
En række forskelle mellem den hippocampus og SVZ kulturer vil være indlysende på P0. Hippocampus kulturer give færre områder, og disse generelt overholder. Bruge en pipette tip til forsigtigt løfte områderne for den første passage. Vedhængende kugler blev ikke observeret i efterfølgende passager. Forskellige mærker af vævskultur flasker kan forårsage sfærer, især hippocampus sfærer, at overholde og vokse som kolonier i bunden af fadet. Dette blev ikke fundet for at ændre enhver downstream resultater for denne protokol, men bør overvåges, og ensartethed kan opretholdes, hvor det er muligt.
Tidligere metoder, der anvendes til at måle P2X7 receptor funktion som patch fastspænding for at optage calcium tilstrømning, er tidskrævende og besværlig og kan kun give oplysninger om en enkelt celle. Denne protokol udgør en hurtig og reproducerbar metode til at analysere alle tre hovedfunktioner P2X7 receptorer ved hjælp af én maskine. Tidsopløst live-celle flowcytometri giver mulighed for hele befolkningen analyse og giver forskeren med oplysninger om kinetik af calcium tilstrømning, pore dannelse og/eller fagocyterende funktion. Ud over dette, kan flowcytometri nemt bruges som en metode til vurdering af markør udtryk mønstre og befolkningen analyse baseret på celle størrelse eller protein udtryk niveauer.
Når der udføres disse eksperimenter, kan forskelle i maksimal calcium tilstrømning, ethidium optagelse eller fagocytose satser iagttages mellem gentagelser. For at minimere dette, kugle-størrelse, skal dyrkningsbetingelserne og fodring regime konsekvent som sundheden for cellerne vil have en betydelig indvirkning på de opnåede resultater. Tid på is kan også påvirke dataene, så sikre, at alt er forberedt i god tid så der minimal tid på isen. Sikre, at calcium indikator farvestof loading tid er konsekvent. En anden faktor, der kan føre til store uoverensstemmelser i maksimal calcium optagelser er variation mellem ATP partier. Forberedelse af ATP bestande er afgørende, og brugen af forskellige partier til de samme forsøg bør undgås. Sammenligning af gamle og nye partier for at sikre ATP er konsekvent anbefales også. Effektiviteten af P2X7 antagonister kan også være celle-linje - og batch-afhængige, så optimering af inkuberingstider og koncentrationer kan være påkrævet.
Det er værd at bemærke, at calcium tilstrømning/udstrømning er en af de mest grundlæggende og komplekse cellulære funktioner og kan være medieret af mange receptorer. ATP-induceret calcium tilstrømning, som en klassisk måling for P2X7 kanal/pore funktion, ikke muligvis præcist afspejler den sande funktion af P2X7 receptorer, som ATP kan også aktivere P2Y receptorer at frigive intracellulære calcium. I dette tilfælde kan barium være en bedre kation at bruge i stedet for calcium som sin tilstrømning er envejs16. For at differentiere bidrag fra P2Y receptorer i calcium tilstrømning, kan betingelser hvor 1 mM EDTA eller ethylenglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-tetraacetic syre (EGTA) er føjet til K+ medium i stedet for CaCl2 anvendes i dette assay.
Denne protokol kan også let tilpasses for at passe til andre celletyper og kan være nyttige for at undersøge funktionaliteten af alternative ion-kanal receptorer eller receptorer, der deltager i fagocytose. Denne metode kan også tilpasses til en flow flowcytometri maskine uden en gang modul. Som et eksempel, kan fagocytose assays udføres hvor YG perler er tilføjet 7-8 min. før analysen af konventionelle flowcytometri. Holde cellerne ved 37 ° C og konstant swirl dem. Dette vil ikke give real-time information, men forskelle i den gennemsnitlige endelige fluorescens informerer stadig forsker om funktionaliteten af P2X7 receptorer.
Interesse i P2X7 receptorer som en drug target21,22 eller selv som en medicinafgivelse rute23,24 vokser hurtigt, og så metoder til at studere denne gådefulde receptor skal løbende tilpasses og forbedres til lette disse undersøgelser. Denne protokol beskriver metoder, der kan bruges til at udforske P2X7 funktion i voksne neurale stamceller, og det er håbet at opnå en større forståelse for P2X7 receptorer i de neurogen nicher kan føre til fremskridt i behandling af apopleksi og andre iskæmiske skader.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Maria Kasherman og Xin Huang for deres bidrag til denne forskning. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation M.W., T.C.L. og M.L. og T.C.L. fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) i Australien (571100 og 1048082) og Baxter velgørenhedsfond ( Sydney, Australien). B.G. blev støttet af den australske Research Council (ARC) fremtid Fellowship (FT120100581), NHMRC projektstøtte (1048082, 1061419 og 1120095) og Victorias regering operationelle infrastruktur støtte Grant Florey Institute. M.L. blev støttet af en Charles D. Kelman, MD postdoc Award (2010) fra internationale Retinal Research Foundation (USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A438079 | Tocris | 2972/10 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
| bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
| Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
| NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
| Oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
| Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
| Tetramethylammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
| Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
| Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
| TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
| UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
References
- Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
- Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
- Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64 (2017).
- Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
- Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
- Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
- Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
- Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
- Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281 (2014).
- Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
- Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
- Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89 (2011).
- Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry - Recent Perspectives. , (2012).
- Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
- Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
- Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
- Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
- Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
- Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
- Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
- Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).
