Att ge encelliga känslighet, är realtid flödescytometri unikt lämpade att kvantifiera multimodala receptor funktioner levande kulturer. P2X7 receptor funktionen använder vuxen neurala stamceller, och bedömdes via kalcium tillströmning upptäcks av kalcium indikator dye, transmembrana pore bildandet av etidiumbromid bromid upptag och fagocytos med fluorescerande latex pärlor.
Live-cell flödescytometri används alltmer bland cellbiologer för att kvantifiera biologiska processer i en levande cell kultur. Det här protokollet beskriver en metod där live-cell flödescytometri förlängs vid att analysera flera funktioner P2X7 receptor activation i realtid. Använda en tid modul installerad på en flödescytometer, kan live-cell funktionalitet bedömas och ritade under en given tidsperiod att utforska kineticsen av kalcium tillströmning, transmembrana pore bildandet och fagocytos. Den här enkla metoden är fördelaktigt eftersom alla tre kanoniska funktioner av P2X7-receptorn kan bedömas med hjälp av en maskin, och insamlade data plottas över tid ger information på hela live-cell befolkningen snarare än encelliga inspelningar ofta erhållits med tekniskt utmanande patch-clamp metoder. Kalcium tillströmning experiment använder kalcium indikator färgämne, medan P2X7 pore bildandet analyser förlitar sig på etidiumbromid som tillåts passera genom det transmembrana pore bildas vid hög agonist koncentrationer. Gul-grön (YG) latex pärlor används för att mäta fagocytos. Specifika agonister och antagonister används för att undersöka effekterna av P2X7 receptor aktivitet. Dessa metoder kan individuellt, ändras för att ge kvantitativa data på valfritt antal kalciumkanaler och purinergic och scavenger-receptorer. Sammantaget belyser de hur användningen av realtid live-cell flödescytometri är en snabb, kostnadseffektiv, reproducerbar och kvantifierbar metod att undersöka P2X7 receptor funktion.
Studien av purinergic signalering är bred och mångfacetterad, cellulär fysiologi, biokemi och farmakologi. Purinergic signalering är involverad i ett oändligt antal cellulära och molekylära processer, från cancer och cellcykelns reglering till cell-cell kommunikation och stamcellsbiologi; som sådan, finns det ofta en potential att modulera purinergic signalering för en terapeutisk fördel. Av purinergic receptorer, har P2X7-receptorn fått betydande uppmärksamhet under de senaste åren på grund av dess potential som ett terapeutiskt mål för många inflammatoriska tillstånd1. Metoder för att studera receptorn har utvecklats och anpassats under åren för att underlätta denna forskning2,3,4,5. Här beskriver vi en live-cellen flöde flödescytometri metod för att undersöka P2X7-receptorer i vuxen neurala stamceller som härrör från den subventrikulära zonen (SVZ) och Hippocampus dentate gyrus flera funktioner.
P2X7 receptorn beskrevs först som P2Z receptorn eller ‘celldöd’ receptorn, som dess aktivering med höga koncentrationer av adenosintrifosfat (ATP) resulterar i bildandet av en stora transmembrana por genomsläppliga för molekyler upp till 900 Da6. Detta leder till cytoskeletal ombildning, transmembrana pore bildandet, och, eventuellt, apoptos eller nekros7. Traditionellt har kvantifieras denna funktion av P2X7 i upptaget av stor molekylvikt färgämnen som YO-PRO-1 eller etidiumbromid metylbromid, som fluorescerar när interkalenderat med DNA3,8. Plate reader metoder, som är snabb och möjliggöra uppskalning, generellt tillåter inte för observationen av kinetik. Den metod som beskrivs här baseras på etidiumbromid upptag och tillåter ökningen fluorescens observeras över tiden, ger ett större djup av information när det gäller hastigheten av pore bildande. P2X7-receptorer har sedan dess visat att underlätta ett antal nonimmune funktioner, med olika svar beroende på exponering tid och agonist koncentration9,10. Kort aktivering av lägre koncentrationer av ATP resulterar i ering inflödet för tillämpningen av signalsubstansen och signal transduktion11. Med hjälp av flödescytometri för att mäta kalcium tillströmning övervinner problemen med besvärliga och tekniskt utmanande metoder — särskilt patch fastspänning för att mäta inåtgående strömmar som ger ovärderlig information om förändringen i potential över ett cellmembran men inte tillåter för befolkningen analys2. Den tredje funktionen av P2X7-receptorer uppstår i avsaknad av ATP, där P2X7-receptorer har visat sig underlätta fagocytos i både immunförsvaret och nervsystemet9,12,13. Framsteg inom mikroskopi tekniker har låtit visualisering av cytoskeletal rearrangements under processen upptag även om kvantifiering och befolkningen analys kan fortfarande innebära en utmaning.
Live-cellen flöde flödescytometri metoden beskrivs här tillåter för utredning av alla tre huvudfunktioner av P2X7-receptorer i realtid. Införandet av en tid module enhet på flödescytometer tillåter temperaturkontroll och ständig omrörning av celler i suspension. Agonist och antagonist stimuli kan levereras inom en sekund, så att nära oavbruten mätning av cellulära svaret. Detta utgör en snabb och enkel metod för att kvantifiera reproducibly funktion samtidigt som man undviker användningen av flera test system. Det är viktigt att notera att detta protokoll kan enkelt anpassas för att passa vilken celltyp och kunde användas för att undersöka andra receptor subtyper med tanke på införandet av särskilda agonister eller -hämmare, beroende på deras egenskaper.
Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll för analys av P2X7 receptor funktion i neurala stamceller cellkulturer som härrör från de vuxna neurogena nischerna. De potentiella tillämpningarna för vuxna neurala stamceller celler sträcker sig från forskning till terapeutiska ändamål, och så metoden för kultur måste vara robust och reproducerbara. I området i närheten finns det flera viktiga aspekter i detta protokoll som kan påverka kvaliteten på den endpoint-kulturen. När bort från skallen, hjärnan bör inte tillåtas torka och dissektion bör utföras så snabbt som möjligt. Bestämt med hippocampus medför extra försiktighet vidtas för att ta bort blodkärl eller membranös vävnaden överlägsen progenitor cell avkastning. Processen dissociation och sönderdelning kan starkt påverka antalet kulor som erhållits i en kultur. agitera vävnaden under inkubationstiden med trypsin-EDTA kommer att resultera i en mer homogen lösning. Användning av en eld-polerat glas betesmark pipetten över en P1000 plast pipettspetsen rekommenderas att minska celldöd och förbättra den resulterande kulturen. Undvika overtriturating. Trots dessa försiktighetsåtgärder, förfarandet kan skapa en massa skräp i P0 kulturen, och för att undvika att förlora progenitorceller, tvätt eller utfodring kulturen bör undvikas tills kulorna har bildats.
Ett antal skillnader mellan den hippocampus och SVZ kulturer kommer att vara uppenbart på P0. Hippocampus kulturer ger färre sfärer, och dessa generellt följer. Använd en pipettspetsen att försiktigt lyfta av sfärernas för inledande passagen. Vidhäftande sfärer observerades inte i efterföljande passager. Olika märken av vävnadsodling kolvar kan orsaka sfärernas, speciellt Hippocampus sfärer, att följa och växa som kolonier på botten av skålen. Detta konstaterades för att förändra några nedströms resultat för detta protokoll inte men bör övervakas och konsekvens bör bibehållas där så är möjligt.
Tidigare metoder används för att mäta P2X7 receptor funktion, till exempel patch fastspänning för att spela in kalcium tillströmning, är tidskrävande och mödosam och kan endast ge information om en enskild cell. Detta protokoll presenterar en snabb och reproducerbar metod för att analysera alla tre huvudfunktioner av P2X7-receptorer med hjälp av en maskin. Tid-löst live-cell flödescytometri möjliggör analys av hela populationen och ger forskaren med information om kinetiken för kalcium tillströmning, pore bildandet eller fagocytisk funktion. Utöver detta kan flödescytometri enkelt användas som en metod för att bedöma markör uttrycksmönster och befolkningen analys baserat på cell storlek eller protein uttryck nivåer.
När de utför dessa experiment, kan i maximal kalcium tillströmning, etidiumbromid upptag eller fagocytos priser skillnader mellan repetitioner. För att minimera detta, sfär storlek, odlingsbetingelser och utfodring regim måste vara konsekvent som hälsan hos cellerna kommer att ha en betydande inverkan på resultaten. Tiden på is kan också påverka data, så se till att allt är beredda i förväg så att tiden på isen är minimal. Se till att kalcium indikator färgen laddningstid är konsekvent. En annan faktor som kan leda till stora inkonsekvenser i maximal kalcium inspelningar är variationen mellan ATP batchar. Beredning av ATP bestånd är avgörande, och användningen av olika satser för samma experiment bör undvikas. Det rekommenderas också att jämföra gamla och nya partier för att säkerställa ATP är konsekvent. Effektiviteten av P2X7-antagonister kan även cell-linje – och batch-beroende, så optimering av inkubationstider och koncentrationer kan krävas.
Det är värt att notera att kalcium tillströmning/efflux är en av de mest grundläggande och komplexa cellulära funktionerna och kan medlas av många receptorer. ATP-inducerad kalcium inflödet, som en klassisk mätning för P2X7 kanal/pore funktion, inte kanske exakt återger funktionen sant av P2X7-receptorer, som ATP kan också aktivera P2Y receptorer att släppa intracellulära kalcium. I det här fallet kanske barium en bättre cation att använda istället för kalcium som dess inflödet är enkelriktad16. För att särskilja bidraget från P2Y receptorer i kalcium tillströmning, kan förhållanden där 1 mM EDTA eller etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-tetraacetic acid (EGTA) läggs till K+ medium istället för CaCl2 användas i denna assay.
Detta protokoll kan också enkelt anpassas för att passa andra celltyper och kan vara användbar för att undersöka funktionen av alternativa ion kanal receptorer eller receptorer som deltar i fagocytos. Denna metod kan också anpassas till ett flöde flödescytometri maskin utan en tid modul. Som ett exempel, kan fagocytos analyser utföras där YG pärlor läggs 7 – 8 min före analysen av konventionell flödescytometri. Hålla cellerna vid 37 ° C och snurra dem kontinuerligt. Detta kommer inte att ge information i realtid men skillnader i den genomsnittliga slutliga fluorescensen kommer fortfarande informera forskaren angående funktionaliteten i P2X7-receptorer.
Intresset för P2X7-receptorer som en drog rikta21,22 eller även som en drog leverans route23,24 växer snabbt, och metoder för att studera denna gåtfulla receptor måste vara kontinuerligt anpassas och förbättras till underlätta dessa studier. Detta protokoll beskriver metoder som kan användas för att utforska P2X7 funktion i vuxen neurala stamceller, och förhoppningen är att uppnå en större förståelse av P2X7-receptorer i neurogen nischer kan leda till framsteg inom behandling av stroke och andra ischemiska skador.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Maria Kasherman och Xin Huang för deras bidrag till denna forskning. Detta arbete stöds av bidrag från Rebecca L. Cooper medicinsk forskningsstiftelsen att M.W., T.C.L. och M.L., och T.C.L. från de nationella hälso- och medicinsk forskning rådet (NHMRC) Australien (571100 och 1048082) och på Baxter Charitable Foundation ( Sydney, Australien). B.G. stöddes av den australiska Research Council (ARC) framtid Fellowship (FT120100581), NHMRC projektbidrag (1048082, 1061419 och 1120095) och den viktorianska regeringens operativa infrastrukturen stöd bidrag till Florey Institute. M.L. stöddes av en Charles D. Kelman, M.D. postdoktorala Award (2010) från internationella Retinal Research Foundation (USA).
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |