Summary
Bereitstellung von einzelligen Empfindlichkeit, eignet sich in Echtzeit Durchflusszytometrie einzigartig, multimodale Rezeptor Funktionen von lebenden Kulturen zu quantifizieren. Mit Erwachsenen neurale Vorläuferzellen, wurde die P2X7-Rezeptor-Funktion über Kalzium Zustrom von Kalzium Indikatorfarbstoff transmembranen Porenbildung durch Interkalation Bromid Aufnahme und Verwendung von fluoreszierenden Latex-Kügelchen Phagozytose erkannt bewertet.
Abstract
Leben-Zelle Durchflusszytometrie wird zunehmend unter Zellbiologen verwendet, um biologische Prozesse in einer lebendigen quantifizieren Zellkultur. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, wobei live-Zelle Durchflusszytometrie nach erweitert wird, um die vielfältigen Funktionen der P2X7-Rezeptor-Aktivierung in Echtzeit zu analysieren. Mit einem Zeit-Modul installiert auf einem Durchflusszytometer, werden Leben Zellfunktionalität bewertet und über einen bestimmten Zeitraum die Kinetik der Kalzium-Zustrom, transmembranen Porenbildung und Phagozytose erkunden aufgetragen. Diese einfache Methode ist vorteilhaft, da alle drei kanonische Funktionen des P2X7-Rezeptors mit einer Maschine beurteilt werden können, und die gesammelten Daten, die im Laufe der Zeit aufgetragen Informationen über die gesamte live-Zell-Population als einzellige Aufnahmen oft bietet mit technisch anspruchsvollen Patch-Clamp-Verfahren erzielt. Calcium Zustrom Experimente verwenden ein Kalzium-Indikatorfarbstoff, P2X7 Pore Formation Assays basieren zwar auf Interkalation Bromid durfte passieren die transmembranen pore auf hohe Agonist Konzentrationen gebildet. Gelb-grün (YG) Latex Perlen werden genutzt, um die Phagozytose zu messen. Spezifische Agonisten und Antagonisten werden angewendet, um die Auswirkungen der P2X7-Rezeptor-Aktivität zu untersuchen. Individuell, können diese Methoden geändert werden, um quantitative Daten auf beliebig vielen Calciumkanäle und Purinergic und Scavenger-Rezeptoren zur Verfügung zu stellen. Zusammengenommen, heben sie hervor, wie die Verwendung von Echtzeit-live-Cell-Durchflusszytometrie ist eine schnelle, kostengünstige, reproduzierbare und quantifizierbare Methode, P2X7-Rezeptor-Funktion zu untersuchen.
Introduction
Das Studium der Purinergic signalisieren ist breit und vielfältig, mit zellulären Physiologie, Biochemie und Pharmakologie. Purinergic signalisieren engagiert sich in einer unendlichen Anzahl von zellulären und molekularen Prozesse, die von Krebs und Zellzyklus-Regulation, Zell-Zell-Kommunikation und Stammzellbiologie; als solche, gibt oft es ein Potenzial zu modulieren, Purinergic signalisieren für einen therapeutischen Nutzen. Der Purinergic Rezeptoren erhielt P2X7 Rezeptor erhebliche Aufmerksamkeit in den letzten Jahren aufgrund seines Potentials als ein therapeutisches Ziel für zahlreiche entzündliche Bedingungen1. Methoden für den Rezeptor zu studieren haben sich entwickelt und angepasst worden, im Laufe der Jahre um diese Forschung2,3,4,5zu erleichtern. Hier beschreiben wir eine Leben-Zelle Flow Cytometry Methode um die vielfältigen Funktionen von P2X7-Rezeptoren im Erwachsenen neurale Vorläuferzellen aus der subventricular Zone (SVZ) und der hippocampalen dentate Gyrus abgeleitet zu untersuchen.
Die P2X7-Rezeptoren wurde zuerst als P2Z Rezeptor oder der "Zelltod"-Rezeptor, als seine Aktivierung mit hohen Konzentrationen von Adenosintriphosphat (ATP) führt zur Bildung eines großen transmembrane Pore durchlässig für Moleküle bis zu 900 Da6beschrieben. Dies führt zu Zellskelett Neuordnung transmembranen Porenbildung und potenziell, Apoptose und Nekrose7. Traditionell wird diese Funktion des P2X7 durch die Aufnahme von hohem Molekulargewicht Farbstoffe wie YO-PRO-1 oder Interkalation Bromid, quantifiziert, die fluoreszieren, wenn mit DNA-3,8eingelagert. Platte Leser Methoden, die rasche und upscaling ermöglichen, erlauben in der Regel nicht für die Beobachtung der Kinetik. Die hier beschriebene Methode basiert auf Interkalation Aufnahme und ermöglicht die Erhöhung der Fluoreszenz, im Laufe der Zeit bietet eine größere Tiefe der Informationen in Bezug auf die Geschwindigkeit der Porenbildung zu beachten gilt. P2X7-Rezeptoren wurden da gezeigt, um eine Reihe von Ergebnis Funktionen mit unterschiedlichen Antworten je nach Belichtung Zeit und Agonist Konzentration9,10zu erleichtern. Kurze Aktivierung durch geringere Konzentrationen von ATP führt für die Zwecke der Neurotransmitter und Signal Transduction11kation Zustrom. Mit Durchflusszytometrie um zu messen, Kalzium Zustrom überwindet die Probleme im Zusammenhang mit schwerfällig und technisch anspruchsvolle Methoden – insbesondere patch Spannen um nach innen Ströme zu messen, die wertvolle über die Veränderung der Potenziale in Angaben eine Zellmembran erlauben jedoch nicht für die Bevölkerung Analyse2. Die dritte Funktion des P2X7-Rezeptoren tritt in der Abwesenheit von ATP, wo P2X7-Rezeptoren, zur Erleichterung der Phagozytose in das Immunsystem und das Nervensystem9,12,13 nachgewiesen haben. Fortschritte in der Mikroskopiertechniken haben die Visualisierung des Zytoskeletts Umstellungen während der Aufnahme-Prozess erlaubt, obwohl Quantifizierung und Bevölkerung Analyse nach wie vor eine Herausforderung darstellen kann.
Die live-Zelle Flow-Zytometrie-Methode hier ermöglicht die Untersuchung alle drei Hauptfunktionen des P2X7-Rezeptoren in Echtzeit. Die Einbeziehung eines Zeit-Modul-Geräts auf das Durchflusszytometer ermöglicht Temperatur-Kontrolle und ständige rühren von Zellen in Suspension. Agonisten und Antagonisten Reize können innerhalb einer Sekunde, so dass die in der Nähe von unterbrechungsfreie Messung der zellulären Antwort geliefert werden. Dies stellt eine schnelle und einfache Methode, um reproduzierbar Funktion unter Vermeidung der Verwendung mehrerer Assay-Systeme zu quantifizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll kann problemlos an jeden Zelltyp angepasst werden und verwendet werden, könnte um andere Rezeptor-Subtypen, die angesichts der Aufnahme der spezifischen Agonisten oder Inhibitoren, je nach ihren Eigenschaften zu untersuchen.
Protocol
Tiere wurden gemäß der australischen Code of Practice für die Pflege und Nutzung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken behandelt und bei der Griffith University Tier Ethik-Kommission zugelassen.
1. Neurosphäre Kultur der neurale Vorläuferzellen aus dem Erwachsenen SVZ und Hippocampus
Hinweis: Der hier vorgestellten Dissektion-Protokoll basiert auf Arbeit von Walker und Kempermann, und ein detailliertes Protokoll für die Zerlegung des neuronalen Vorläuferzellen von Erwachsenen Mäusen gibt es an anderer Stelle14. Kulturbedingungen wurden von Babu und Kollegen15geändert. Erwachsenen weibliche C57BL/6 Mäusen im Alter von 8 – 12 Wochen dienten.
- Bereiten Sie in einer biologischen Sicherheitsschrank ergänzt mit neuronalen Stammzellen Verbreitung Ergänzung 2 mM Glutamin, 20 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 10 ng/mL grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und 2 µg/mL Kulturmedium (neuronale basal Medium vor) Heparin.
- Zwei Mäuse durch CO2 Inhalation einschläfern. Alternativ die Mäuse nach institutionellen Richtlinien zu betäuben und ihnen sofort durch zervikale Dislokation einschläfern. Sprühen Sie ihre Köpfe mit 70 % Ethanol und Enthaupten sie. Übertragen Sie jeder Kopf auf ein steriles Röhrchen mit Hank es ausgeglichene Salzlösung (HBSS) mit 1 X Penicillin/Streptomycin Lösung (P/S).
- Führen Sie Sezierungen in eine laminare Strömung Kapuze unter dem Mikroskop Dissektion.
- Mit Zange und Dissektion Schere, Gewebe und Knochen, das Gehirn aussetzen zu entfernen, und überträgt es auf eine sterile Schale mit HBSS mit P/S.
- Gehirn ventralen Seite oben und verwenden Sie einer Skalpellklinge einen komplette koronalen Einschnitt in die Optik Chiasmus zu machen. Halten Sie das Gehirn mit der Pinzette stabil zu und verwenden Sie eine schnelle, saubere und Abwärtsbewegung. Vermeiden Sie sägen, um Zelltod zu minimieren und zur Aufrechterhaltung der Gewebestruktur.
Hinweis: Wenn nicht sicher gehalten, kann das Gehirn nach vorne kippen während des Schnitts, Kompromisse bei der Anzahl der Vorläuferzellen aus der SVZ gewonnen. - Isolieren Sie die SVZ aus der rostral Hälfte des Gehirns.
- Suchen Sie beide Herzkammern, getrennt durch das Septum mit Corpus Callosum bildet eine weiße Brücke über ihnen.
- Verwenden Sie Zange zu entfernen das Septum trennt die beiden Herzkammern und die seitlichen Wände der vorderen seitlichen Ventrikel zu isolieren. Zu diesem Zweck oben, unten, seitlich und vorne mit feinen Dissektion Schere wegschneiden. Es bleibt nur eine kleine Tasse-ähnliche Form.
- Bereiten Sie einen saubere Petrischale Deckel mit ein paar Tropfen HBSS in der Mitte und übertragen Sie der SVZ auf die Flüssigkeit. Lassen Sie sich nicht das Gewebe zu trocknen oder auf eine trockene Oberfläche berühren. Stellen Sie sich seitlich beim sezieren die Hippocampi.
- Isolieren Sie die Hippocampi aus der caudale Hälfte des Gehirns.
- Machen Sie eine Mittellinie zwischen den Hemisphären, Corpus Callosum trennen schneiden. Verwenden Sie die seitlichen Ventrikel als Leitfaden und entfalten Sie sanft des Kortex, Hippocampus aussetzen. Sobald der Hirnrinde abgerollt wurde, kann im Hippocampus als einen dichten, weißen, geschwungene Struktur angesehen werden.
- Verwenden Sie feine Dissektion Schere oder Pinzette, um Hippocampus aus dem benachbarten Gewebe zu isolieren.
- Entfernen Sie mit der Pinzette überschüssigen weißen Substanz, Blutgefäße und häutigen Gewebe über den Hippocampus.
- Bereiten Sie einen saubere Petrischale Deckel mit ein paar Tropfen HBSS vorbereitet und übertragen Sie Hippocampus auf die Flüssigkeit. Wiederholen Sie für die andere Hemisphäre.
- Sobald dem Hippocampus und der SVZ von zwei Mäusen isoliert und auf ihre jeweiligen Petrischale Deckel übertragen wurden, mechanisch Würfeln Sie das Gewebe mit einem Skalpellklinge. Hacken das Gewebe in eine Petrischale Deckel für ca. 1 min, drehen alle 10 s bis das Gewebe glatt erscheint und nur feine Stücke bleiben. Nehmen Sie ein sauberes Skalpellklinge und für das andere Gericht, Würfeln das Gewebe für 1 min wiederholen.
- Mit einer 1-mL-Pipette übertragen Sie das Gewebe aus jeder Petrischale Deckel, Röhrchen mit 1 mL 0,25 % Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) zu trennen. Verwenden Sie eine Röhre für den SVZ und eine Röhre für den Hippocampus.
- Zu diesem Zweck erste pipettieren, etwa die Hälfte der Trypsin-EDTA, das Gewebe in der Schale, um Luftblasen zu minimieren und zu verhindern, dass das Gewebe in Kontakt mit der trockenen Pipettenspitze kommen, wie es auf das Rohr übertragen wird. Spülen Sie die Schale und die Skalpellklinge mit dem Rest der Trypsin-EDTA soviel Gewebe wie möglich zu sammeln und das Rohr hinzufügen.
- Inkubieren Sie das Gewebe mit Trypsin im Wasserbad 37 ° C für 30 min, rühren das Rohr alle 10 min, um das Gewebe richtig zu trennen.
- Das Gewebe mit einem feuerpolierte Glas Pasteurpipette, erstellen Sie eine einzelne Zelle Suspension genannte. Achten Sie darauf, nicht als übermäßige Zelle Lysis dadurch overtriturate. Dies ist ein entscheidender Schritt für optimale Gewebe Dissoziation.
- Beobachten der Rohr-Inhalt bei der Verreibung und halten an den frühesten Anzeichen dafür, dass die Mehrheit der Gewebe Klumpen entfernt wurden. Die Trypsin-Lösung sollte leicht trüb werden wenn die Zellen in Suspension einzellige, gegangen bin, auch wenn einige Klumpen bleiben.
Hinweis: Als Anhaltspunkt ist vorbei die Aussetzung nach oben und unten 10 x-15 x ausreichend. - Fügen Sie Kulturmedium bis 5 mL zu neutralisieren die Trypsin, und drehen sich mit 300 X g für 3 min. Waschen weitere 2 X mit HBSS und Pass das Medium durch ein 70 µm Zelle Sieb zu jedem möglichem Gewebe entfernen Klumpen.
- Übertragen Sie alle Zellen in 15 mL Medium auf einem T75 Zelle Kultur Kolben.
Hinweis: Kugeln in der Passage Null (P0) bilden sollte SVZ Kultur nach 7 – 10 Tagen und nach 15 – 20 Tagen in der hippocampal Kultur. Unterlassen Sie waschen oder füttern die Zellen während dieser Zeit die Zahl der neurale Vorläuferzellen in Kultur zu maximieren. Wenn weitere Vorfahren erforderlich sind, oder um die P0-Inkubationszeit zu verringern, es möglich ist, die Anzahl der Mäuse geopfert zu erhöhen. - Kultur bei 37 ° C mit 5 % CO2 und im Anschluss an der Anfangsphase der P0-Kultur zu erhalten, alle 7 – 10 Tage nach Bedarf, mit einer biologischen Sicherheitspraktiken Kabinett und standard Gewebekultur Durchlass.
Hinweis: Die P0 hippocampale Kultur sollte genug Kugeln Passage in einem T25 Kolben erzeugen; die SVZ Kultur generiert viele weitere Sphären und kann in einem T75 passagiert. Wenn die P0 hippocampalen Sphären eingehalten haben, verwenden einer 200 µL Pipette um zu heben Sie vorsichtig die Kugel. - Durchgang der Kugeln, wenn sie 150 bis 200 µm im Durchmesser erreichen. Sammeln Sie die Kugeln und Medium in einer 15 mL Tube und lassen Sie die Kugeln durch die Schwerkraft für ca. 5 min. Alternativ begleichen, bei niedriger Drehzahl (100 X g) für 2 min drehen.
- Entfernen Sie das Medium und distanzieren Sie die Zellen mit Dissoziation Reagenz für 7 – 10 min, abhängig von der Größe der Kugeln zu.
Hinweis: Die Dissoziation-Reagenz verwendet haben erhebliche Auswirkungen auf das Ergebnis der Kultur, so verweisen wir auf die Tabelle der Materialien für Besonderheiten. - Waschen Sie die Zellen, indem Sie die Zelle Lösung und Zentrifuge bei 300 X g für 3 min. 5 mL HBSS hinzufügen entfernen den Überstand, Aufschwemmen der Zellen in Kulturmedium und Saatgut bei etwa 150.000 Zellen in 5 mL Medium in ein T25 Zelle Kultur Kolben oder ähnlichem. Pflegen Sie die Kulturen bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Bestätigen Sie neurale Vorläuferzellen Status der Zelle durch den Ausdruck der Stammzell-Marker wie Sox2 und ASCL1 zu identifizieren, bevor Sie fortfahren, bis alle nachgelagerten Protokoll9.
Hinweis: Dies kann durch die Forscher bevorzugte Methode (z. B. Immunchemie von Mikroskopie, Durchflusszytometrie oder western-Blot oder mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)) erfolgen.
2. Vorbereitung einer einzelligen Suspension für die Analyse von Durchflusszytometrie
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Bereiten Sie die erforderlichen Medien. Dazu gehören die folgenden.
- Na+ Medium mit 145 mM NaCl 5 mM KOH, 10 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mM CaCl2vorbereiten. Dieses Medium dient auch ein Kalzium-Freiform mit 0,1 mM CaCl2 weggelassen.
- K+ Medium mit 145 mM KCl, 5 mM KOH 10 mM HEPES, 5 mM D-Glukose und 0,1 % BSA vorzubereiten.
Hinweis: Diese Medien wurden umfassend optimiert und sind detailliert in früheren Publikationen4,5. - Bereiten Sie Lager ATP durch Wiegen genügend ATP-Pulver für rund 20 mL einer 100 mM-Aktie. Lösen Sie des Pulvers in 17 mL KCl-Puffer (145 mM KCl, 5 mM KOH und 10 mM HEPES, pH 7,5 auf) und langsam, unter ständigem Rühren, 2 mL 18 % (w/V) Tetramethylammonium Hydroxid (TMA) zur Lösung den pH-Wert auf 6,8 – 7,0 zu bringen.
- Die letzte Lautstärke bis 20 mL. Überschwingen Sie den pH-Wert über 7,0 nicht. Speichern Sie die Aktie bei-80 ° C; Beachten Sie, dass die ATP-Aliquote für mindestens 6 Monate stabil sind.
Hinweis: Das kostenlose Molekulargewicht von wasserfreiem ATP ist 551.14 g/Mol, und dies beinhaltet nicht das Molekulargewicht der Wasser- und Binatrium Moleküle, die von Charge zu Charge variieren und sollte für die Berechnungen berücksichtigt werden. TMA ist giftig, und Vorsicht bei der Handhabung. Lesen Sie die Sicherheitsdaten Blatt und bereiten Sie die Bestände in einem Rauch-Schrank. - Bereiten Sie Lager BzATP durch Auflösen der BzATP in hochreinen H2O für eine Aktie Endkonzentration von 10 mM.
- Erstellen Sie eine einzellige Suspension, wie in den Schritten 1.16 und 1.17 beschrieben. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer oder automatische Zelle Zähler. Aufschwemmen der Zellen in das erforderliche Medium (z. B. Na+ Mittel, Kulturmedium) für das Experiment durchgeführt (wie unten beschrieben) und die Zellen in der Zwischenzeit auf Eis legen.
- Sicherzustellen Sie für jedes Experiment, dass genügend Blut, Steuerelemente für vorwärts- und seitliche Streuung sowie für die Kalibrierung von Spannung und Entschädigung Einstellungen enthalten. Beachten Sie als Indiz, dass Kugeln gewachsen in einem T75-Kolben in der Regel ca. 8 x 106 Zellen pro Flasche ergeben.
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Einstellen der Flow Cytometer mit Kontrollproben.
- Einsatz nach vorne und Seite streuen, selektiv Tor die lebenden Zellen.
Hinweis: Forward Scatter gibt Auskunft über Zellengröße basierend auf Lichtbeugung, während Side Scatter ein Maß für die interne Komplexität oder Granularität liefert. Flow-Ereignisse mit small Forward und Side Scatter können als abgestorbene Zellen betrachtet werden. - Passen Sie die Spannung und einen Gewinn von Durchflusszytometer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie eine Testversion Probe um die Erfassung von Daten auf die maximale Fluoreszenzintensität zu gewährleisten. Keine Entschädigung wird für Einkanal-Akquisitionen benötigt.
- Einsatz nach vorne und Seite streuen, selektiv Tor die lebenden Zellen.
3. Messung der Kalzium-Zustrom von Live-Zelle Flow Cytometry
- Nach der Vorbereitung einer einzelligen Suspension, Aufschwemmen der Zellen in 1 mL Kalzium-freie Na+ Medium und laden Sie sie mit 2 ng/mL von Kalzium Indikatorfarbstoff laut Protokoll des Herstellers (siehe die Tabelle der Materialien) mit 10 µL 5 % Pluronic Säure. Inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 37 ° c
- Waschen der Zellen durch Hinzufügen von 3 – 5 mL Kalzium-freie Na+ Medium und sanft Zentrifugieren (200 X g für 4 min). Entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen im Kalzium-freie Na+ Medium, ein zweites Mal waschen.
- Aufschwemmen der Zellen in 1 mL Kalzium-freie Na+ Medium, auf Eis legen und es ihnen ermöglichen, für 30 min de-esterify.
- Waschen Sie 1 X mehr durch Hinzufügen von 3 – 5 mL K+ Medium und Zentrifugieren (200 X g für 4 min); dann Aufschwemmen sie den Zellen in K+ Mittel- und aliquoten in Fluoreszenz assistierten Zelle sortieren (FACS) in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen pro 500 µL pro FACS Röhre Röhren.
Hinweis: Die Anzahl der FACS Rohre pro Probe richtet sich nach der Anzahl der Behandlungen und wiederholt, dass im Preis inbegriffen sind. - Legen Sie FACS-Röhren auf Eis, bis die Zellen analysiert werden können. Lassen Sie nicht die Zellen auf Eis für einen längeren Zeitraum, aber beginnen Sie den Test so bald wie möglich.
- Für einige Beispiele preincubate die Zellen mit P2X7-Rezeptor-spezifischen Inhibitor AZ10606120 (1 µM 10 – 15 min.) oder A438079 (10 µM für 30 min) bei 37 ° C vor der Analyse.
- Wenige Minuten vor dem Ausführen des ersten Beispiels, CaCl2 (um eine Endkonzentration von 1 mM in der FACS-Röhre) hinzufügen und platzieren Sie das Rohr in einem 37 ° C Wasserbad zu erholen.
- Legen Sie eine saubere, kleine Magnetrührer in der FACS-Rohr und Position das Rohr in das Zeit-Modul verknüpft zirkulierenden 37 ° C Wasserbad zur Kontrolle der Temperatur der Probe. Wählen Sie eine niedrige Rührgeschwindigkeit Bewegung der Probe zu gewährleisten, ohne die Einführung eines Vortex-Effekts. Der Wassermantel Rohradapter auf die Probe-Plattform und schließen Sie den Hebelarm der FACS-Maschine.
- Initiieren Sie Probe-Erwerb zu und führen Sie des Beispiels für 3 min bei rund 1.000 Veranstaltungen pro Sekunde aus.
- An der 40 s-Marke schnell das Rohr entfernen und Hinzufügen der P2X7-Agonist, 1 mM ATP oder 300 µM BzATP, und ersetzen Sie den Schlauch um den Erwerb fortzusetzen.
- Während die erste Probe aufgenommen wird, bereiten Sie die zweite Probe mit CaCl2 vor und in 37 ° C, damit genügend Zeit für die Zellen zum Aufwärmen vor der Analyse. Sobald die erste Probe beendet ist, reinigen Sie die Aufnahme durch Ausführen einer Wasserprobe und der Erwerb der zweiten Stichprobe kann beginnen wie 3.8 und 3.9 beschrieben. Reinigen Sie die Einnahme zwischen Proben.
4. Messung der Porenbildung durch Live-Zelle Durchflusszytometrie
- Erstellen Sie eine einzellige Suspension, wie in den Schritten 1.16 und 1.17 beschrieben. Speichern Sie wenige Milliliter das alte Medium zu, verwenden Sie, um die Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen pro 100 µL pro FACS Röhre Aufschwemmen und legen Sie ihn auf Eis, bis bereit.
- Vor dem Ausführen des Tests, 900 µL K+ Medium für ein Endvolumen von 1 mL und die Rohre im Wasserbad 37 ° C für 10 Minuten zu erholen.
- Falls zutreffend, preincubate Zellen mit Behandlungen, einschließlich der P2X7-spezifische Inhibitoren AZ10606120 (1 µM 10 – 15 min.) oder A438079 (10 µM für 30 min).
- Unmittelbar vor dem Ausführen des Tests, 25 µM Interkalation Bromid hinzufügen der FACS-Röhre; Fügen Sie dann den Magnetrührer, legen Sie es auf die FACS-Maschine nach Schritt 3,7, und beginnen Sie den Erwerb.
Hinweis: Interkalation Bromid ist giftig, und beim Umgang muss geachtet werden. Entsorgen Sie gebrauchte FACS Rohre entsprechend. - Um die Bildung von Poren in der Zellmembran zu induzieren, fügen Sie 1 mM ATP oder 100 µM BzATP 40 s nach dem Start der Akquisition.
- Laufen Sie die Proben bei rund 1.000 Veranstaltungen pro Sekunde für 6 min.
- Während die erste Probe läuft, nehmen Sie die zweite Probe aus dem Eis und legen Sie sie in das 37 ° C Wasserbad, damit genügend Zeit für die Zellen vor der Analyse zu erholen. Sobald die erste Probe mit dem Erwerb abgeschlossen ist, reinigen Sie die Aufnahme durch Ausführen einer Wasserprobe; Das zweite Beispiel ist dann auf dem Computer mit der Aufnahme beginnen, wie in den Schritten 3.8 und 3.9 beschrieben aufstellbar.
5. Messung der Phagozytose durch Live-Zelle Durchflusszytometrie
- Erstellen Sie eine einzellige Suspension, wie in den Schritten 1.16 und 1.17 beschrieben. Aufzuwirbeln Sie die Zellen im konditionierten Medium und Aliquot in FACS-Röhren in einer Konzentration von mindestens 1 x 106 Zellen pro 100 µL pro FACS Röhre. Verdünnen Sie die Zellen, eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/mL mit Na+ Medium (z. B. hinzufügen 900 µL Medium Na+ ) und die Zellen auf Eis legen, bis die Analyse durchgeführt wird.
- Verwenden Sie 1 µm YG Latex Perlen (Mikrokügelchen) als phagocytic Ziele für Echtzeit-Phagozytose Assays.
Hinweis: Andere Farben können auch ersetzt werden, aber unterschiedlich große Perlen erwiesen sich als unzureichend Ziele der Phagozytose4sein. - Vor dem Ausführen des ersten Beispiels, übertragen Sie die Zellen auf 37 ° C Wasserbad und inkubieren sie ca. 7 – 10 Minuten damit die Zellen erholen.
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Fügen Sie keine Behandlungen erfordern Vorinkubation zu ihren jeweiligen Röhren, einschließlich 1 mM ATP für 15 min, 300 µM oxidiert ATP (OxATP) für 40 min, 20 µM Cytochalasin D für 20 min und 4 % Paraformaldehyd (PFA) für 20 min.
- Keine Vorinkubation ist für 5 % Humanserum erforderlich. Wenn Behandlungen zur ungefähr gleichen Zeit hinzugefügt werden, können die Proben in umgekehrter Reihenfolge ausgeführt werden, während die andere weiterhin inkubieren. Beispielsweise führen Sie Kontrollen und Serum zunächst, dann die ATP-behandelten Probe, gefolgt von Cytochalasin D und PFA und OxATP zuletzt.
- Legen Sie die Probe auf die Cytometer mit den Magnetrührer, wie in den Schritten 3.8 und 3.9 beschrieben und dann initiieren Sie Probe Erwerb zu.
- Entfernen Sie dem Probenröhrchen aus der Maschine 15 – 20 s nach dem Start der Akquisition und fügen Sie 5 µL unverdünnte YG Perlen hinzu. Das Probenröhrchen FACS und fortfahren Sie den Erwerb. Laufen Sie die Proben für 7 – 8 min bei rund 1.000 Veranstaltungen/s.
- Während die erste Probe läuft, nehmen Sie die zweite Probe aus dem Eis und legen Sie sie in einem 37 ° C-Wasserbad, damit genügend Zeit für die Zellen vor der Analyse zu erholen. Nach Abschluss die ersten Probe reinigen Sie die Einnahme durch Ausführen einer Wasserprobe zu und dann beginnen Sie Erwerb auf das zweite Beispiel, wie in den Schritten 3.8 und 3.9 beschrieben.
(6) Datenanalyse
- Exportieren Sie die Daten in eine Tabellenkalkulation. Die Datenanalyse wird die experimentelle Frage abhängen.
Hinweis: Beachten Sie, dass die verschiedene Läufen verschiedene Grundlinie Intensitäten, haben können, so ist es wichtig, zu Beginn den Test für eine bestimmte Zeit laufen (ca. 40 s) vor jedem Agonisten hinzufügen und die Daten zu normieren, durch die Berechnung der Veränderung im Fluoreszenz (die Fluoreszenz zu einem beliebigen Zeitpunkt [F] dividiert durch die Fluoreszenz zum Zeitpunkt Null [F0] oder F/F0). - Zur Quantifizierung der Rate oder die Kinetik der fraglichen P2X7-Funktion berechnen Sie die Fläche unter der Kurve oder die Summe der Trapeze erstellt unter der Kurve für jede 10 s Zeit Periode16.
- Um die Auswirkungen der Behandlungen zu bestimmen, im Durchschnitt der Fluoreszenzintensität über die letzten 10 – 20 s Aufnahme und die Behandlungen zu vergleichen. Bestimmen Sie die Bedeutung von t-Test oder Varianzanalyse.
Representative Results
Neurale Vorläuferzellen Zellkulturen
Neurale Vorläuferzellen Kugel Kulturen abgeleitet, mit dieser Methode sollte Phase hell und haben eine glatte runde Kante (Abb. 1AB). In gesunden Kulturen können kleine Microspikes an den Rändern (Abbildung 1) beobachtet werden. Bei späten Passagen oder wenn nur unzureichend gefüttert, Kugeln bilden können, eine hohle Becherform (Abbildung 1) oder große längliche Formen (Abb. 1E, durch Pfeil gekennzeichnet). Diese Kulturen sollte nicht verwendet werden für Durchflusszytometrie oder downstream-Anwendungen, wie diese Funktionen möglicherweise bezeichnend für Differenzierung. Um den Status der neuronalen Vorläuferzellen zu bestätigen, wurden die Zellen auf Glasdeckgläser beschichtet mit Poly-L-Ornithin und Laminin für Immunocytochemistry vernickelt (Abb. 1F und bei höheren Konfluenz, Abbildung 1). Zellen waren voller Flecken für GFAP, nestin, Sox2, Vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1 und DCX, die Zellen als Typ-2-Vorläuferzellen (Hippocampus) oder Typ C Progenitor Zellen (SVZ)9zu identifizieren. Zellen sollten einen klar definierten Zellkern und erweiterte Prozesse haben.
Abbildung 1: repräsentative hippocampal neuronalen Vorläuferzellen Zellkultur. (A) Hippocampal neuronalen Vorläuferzellen sind von Erwachsenen Mäusen isoliert und kultiviert als Neurosphären bis ca. 100 bis 150 µm im Durchmesser. (B) Neurosphären sollte eine glatte Peripherie, (C) und kleine Microspikes können auf ihrer Oberfläche beobachtet. Wenn Kugeln zu lang in der Kultur sind, können sie (D)-Cup oder längliche Formen (E) bilden. Diese Kulturen sollte nicht für Experimente verwendet werden. Um den Status der neuronalen Vorläuferzellen der Zellen zu bestätigen, säen sie als einzellige Aufhebung auf Poly-L-Ornithin (PLO) und Laminin-beschichtete Glasdeckgläser für Immunchemie. Zellen sollten eine kleine Soma und verzweigte Prozesse, (F) bei niedrigen Konfluenz und bereit für Immunchemie (G) haben. Skalieren von Balken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Kalzium-Zustrom von Leben-Zelle Durchflusszytometrie
Dieses Protokoll ermöglicht für die Analyse von P2X7-Rezeptor-Funktion als ein Calcium-Kanal-in Echtzeit. Die Kinetik der Rezeptor-Funktion sowie die Auswirkungen der verschiedenen Agonisten und Antagonisten, können auch beurteilt werden. Beim Plotten über Zeit, Kalzium Zustrom in den hippocampal und SVZ neurale Vorläuferzellen im Allgemeinen ähnlich war (Abb. 2A und 2 b, beziehungsweise). Agonisten (ATP oder BzATP) wurden bei der 40 s-Markierung hinzugefügt, wie durch einen roten Pfeil gekennzeichnet. Für einen kurzen Moment wird das Rohr aus der Aufnahme Punkt hinzufügen der Agonist, wodurch Datenpunkte von Null entfernt. Dadurch werden für die Identifizierung der Zeit wenn der Agonist hinzugefügt wurde. BzATP aktiviert schnell P2X7-Rezeptoren, öffnen die Ionenkanal und Kalzium Zustrom, die bindet an Fluo-8 und fluoresziert. ATP-Anwendung führt im Allgemeinen zu einer schrittweisen Kalzium Zustrom. Es hat eine geringere Affinität zu P2X7 BzATP gegenüber und führen auch in G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Aktivierung, ein langsamer Signalweg die Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum frei. Die Einbeziehung von P2X7-Antagonisten, A438079 und AZ10606120 (Daten nicht gezeigt) reduziert die Kalzium-Zustrom auf Agonist Antrag.
Abbildung 2: Live-Zelle Kalzium Zustrom in neurale Vorläuferzellen aus dem Hippocampus und SVZ. P2X7-Rezeptor-Kalzium-Kanal-Funktion, zeigte sich in (A) Hippokampus und (B) SVZ abgeleitet Vorläuferzellen durch Veränderungen in Fluo-8 Fluoreszenz. Anwendung der allgemeinen P2X-Agonisten ATP und P2X7-Agonist BzATP führen P2X7 Ionenkanäle öffnen, so dass Kalzium Zustrom. Der Zustrom war mit der P2X7-spezifische Inhibitoren, A438079 oder AZ10606120 blockiert (Daten nicht gezeigt). F = Fluoreszenz; F0 = Fluoreszenz zum Zeitpunkt Null. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Porenbildung durch live-Zelle Durchflusszytometrie
Transmembranen Porenbildung ist eine kanonische Funktion des P2X7-Rezeptoren, Ergebnisse im Makromolekül Austausch und zum Zelltod führen kann. Interkalation+ ist ein großes Molekül (314 Da) von gesunden Zellen ausgeschlossen; seine Aufnahme und anschließenden Interkalation mit DNA führt zu fluoreszierenden Emissionen und kann zur Beurteilung der Fähigkeit des P2X7-Rezeptoren transmembrane Poren bilden. Nach der Anwendung des Agonisten ATP (1 mM ATP) und BzATP (100 μM) um die 40 s (Pfeilrichtung), zeitaufgelöste Durchflusszytometrie fängt die Interkalation Bromid in die Zellen eindringen, in Echtzeit (Abb. 3A). Dieser Effekt wurde von der P2X7-spezifischen Inhibitor AZ10606120 gedämpft. Die Interkalation Bromid Aufnahme Test zeigt einen funktionalen P2X7-Rezeptor C-Terminus17 und gute Hinweise für Full-length P2X7-Rezeptor-Expression. ATP-Konzentration-Wirkungs-Assays veranschaulichen die Auswirkungen der Agonist Konzentration auf P2X7 Porenbildung, anhand Veränderung Interkalation Bromid Fluoreszenz im Laufe der Zeit (Abb. 3 b). Agonist Dosis Konzentration Kurven zusammen mit Rezeptor-spezifische Inhibitoren bieten starke Beweise für die Rezeptor-Aktivierung.
Abbildung 3: P2X7 transmembranen Porenbildung durch Interkalation Aufnahme gemessen. Die Zugabe von Interkalation Bromid Momente vor dem Start der Akquisition wird verwendet, um die Bildung von P2X7 transmembranen Poren zu messen. Hohe Konzentrationen von ATP und BzATP führen (A) P2X7-Rezeptor pore Formation, so dass Interkalation Bromid in die Zelle eindringen. Die P2X7-Inhibitor AZ10606120 dämpft dieses Phänomen und liefert Beweise für funktionale P2X7-Rezeptoren. (B) ATP-Konzentration-Wirkungs-Assays zeigten signifikante Porenbildung bei 500 μm und 1 mM aber nicht bei niedrigeren Konzentrationen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Phagozytose durch live-Zelle Durchflusszytometrie
Unsere Gruppe hat bisher gezeigt, dass extrazelluläre ATP P2X7-vermittelten Phagozytose hemmt durch Wehre P2X7 C-Terminus aus dem Zytoskelett, insbesondere Nonmuscle Myosin IIA18,19. Diese Methode baut auf diesen Erkenntnissen P2X7 Rezeptor Beteiligung an Phagozytose von Hippokampus nachweisen und SVZ neuronalen Vorläuferzellen Zellen in Echtzeit (Abbildung 4, ein Beispiel der hippocampalen Phagozytose). Ungehemmt Phagozytose (Kontrolle) waren von 1 µm YG Latex Perlen als die positive Kontrolle festgelegt. ATP gehemmt die Phagozytose von YG Perlen im gleichen Umfang wie die unspezifischen Inhibitoren, nämlich PFA Fixierung und die Aktin-Polymerisation Inhibitor Cytochalasin D, während 5 % Serum alle angeborenen Phagozytose20abgeschafft.
Abbildung 4: YG Wulst Aufnahme zeigt die phagocytic Kapazität des neuronalen Vorläuferzellen über P2X7-Rezeptoren. YG-Perle-Aufnahme durch neurale Vorläuferzellen ist zu beobachten, die mit live-Zelle fließen Cytometry in Echtzeit. Gruppenstufen der Phagozytose sind zunächst eingerichtet und wenn die Anzahl der Zellen ermöglicht, bestätigt am Ende des Laufs. Einbeziehung der P2X7-Rezeptoren wird durch die Hemmung der Phagozytose in Anwesenheit von ATP, wie dies den C-Terminus aus dem Zytoskelett Membran verhindert P2X7-vermittelten Zellskelett Rearrangements distanziert. Die Anwendung von ATP blockiert Phagozytose im gleichen Umfang wie bei der Verwendung von unspezifische Inhibitoren der Phagozytose, einschließlich Paraformaldehyd (PFA) und Cytochalasin D (CytD). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Dieser Beitrag stellt ein detailliertes Protokoll zur Analyse von P2X7-Rezeptor-Funktion in neuronalen Vorläuferzellen Zellkulturen von den Erwachsenen neurogenen Nischen abgeleitet. Die Einsatzmöglichkeiten für Erwachsene neuronalen Vorläuferzellen Zellen reichen von Forschung zu therapeutischen Zwecken, und die Methode der Kultur muss also robust und reproduzierbar. Es gibt eine Reihe der wichtigsten Aspekte dieses Protokolls, die die Qualität der Endpunkt Kultur auswirken können. Nach dem Entfernen aus dem Schädel, Gehirn darf nicht zum Trocknen und die Dissektion sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Besonders mit dem Hippocampus führt überlegen Stammvater Zelle Erträge zusätzliche Sorgfalt, Blutgefäße oder häutigen Gewebe zu entfernen. Die Dissoziation und Zerreibung Prozess kann die Anzahl der Kugeln in einer Kultur erhalten stark auswirken; rühren das Gewebe während der Inkubation mit Trypsin-EDTA wird eine homogenere Lösung führen. Die Verwendung eines Glases feuerpolierte Weide Pipette über ein P1000 Kunststoff Pipettenspitze sehr empfehlenswert, um Zelltod zu reduzieren und verbessern die resultierende Kultur. Vermeiden Sie overtriturating. Trotz dieser Vorkehrungen erstellen der Prozedur eine Menge Trümmer in der P0-Kultur, und zur Vermeidung von Vorläuferzellen zu verlieren, waschen oder füttern die Kultur sollte vermieden werden, bis Kugeln gebildet haben.
Eine Reihe von Unterschieden zwischen der Hippokampus und SVZ Kulturen werden offensichtlich an P0. Hippocampale Kulturen ergeben weniger Kugeln, und diese in der Regel einzuhalten. Verwenden Sie eine Pipettenspitze vorsichtig abheben die Kugeln für den ersten Durchgang. Anhaftende Kugeln wurden in nachfolgenden Passagen nicht beobachtet. Verschiedene Marken von Gewebe Kulturflaschen können dazu führen, dass die Sphären besonders hippocampal Sphären zu halten und zu wachsen als Kolonien auf der Unterseite der Schale. Dies konnte nicht gefunden werden, um keine nachgeschalteten Ergebnisse für dieses Protokoll zu ändern aber sollten überwacht werden, und Konsistenz beibehalten werden sollte, wenn möglich.
Bisherige Methoden zur Messung der P2X7-Rezeptor-Funktion, wie z. B. Patch Spannen um Kalzium Zustrom aufzuzeichnen sind zeitaufwändig und mühsam und können nur auf eine einzelne Zelle Informationen. Dieses Protokoll stellt eine schnelle und reproduzierbare Methode, um alle drei Hauptfunktionen des P2X7-Rezeptoren mit einer Maschine zu analysieren. Zeitaufgelöste Leben-Zelle Durchflusszytometrie für die gesamte Bevölkerung Analyse ermöglicht und bietet den Forscher mit Informationen über die Kinetik der Kalzium-Zustrom, Porenbildung und/oder phagocytic Funktion. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie leicht als eine Methode zur Bewertung von Marker Expressionsmuster und Bevölkerung Analyse basierend auf Größe oder Protein Ausdruck Zelle verwendet werden.
Wenn Sie diese Experimente durchführen, können Unterschiede in der maximalen Kalzium Zustrom, Interkalation Aufnahme oder Phagozytose Preise zwischen Wiederholungen beobachtet werden. Um hierzu die Kugelgröße zu minimieren müssen Kulturbedingungen und Futterregime konsistent sein wie die Gesundheit der Zellen einen erheblichen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Die Zeit auf Eis kann auch Einfluss auf die Daten, also stellen Sie sicher, alles ist vor der Zeit vorbereitet, so dass die Zeit auf dem Eis minimal ist. Sicherzustellen Sie, dass die Kalzium-Indikatorfarbstoff Ladezeit entspricht. Ein weiterer Faktor, der zu großen Unstimmigkeiten bei der maximalen Kalzium Aufnahmen führen kann ist die Variation zwischen ATP Chargen. Die Vorbereitung der ATP-Vorrat ist entscheidend, und die Verwendung verschiedener Chargen für die gleichen Experimente vermieden werden. Vergleich von alten und neuen Chargen um sicherzustellen, dass die ATP im Einklang steht, wird auch empfohlen. Die Wirksamkeit von P2X7-Antagonisten möglicherweise auch Zelllinie und Batch-abhängige, also Optimierung der Inkubationszeiten und Konzentrationen erforderlich sind.
Es ist erwähnenswert, dass Kalzium Zustrom/Ausfluss ist eines der grundlegendsten und komplexen zellulären Funktionen und kann durch viele Rezeptoren vermittelt werden. Der ATP-induzierte Kalzium-Zustrom, wie ein klassisches Maß für P2X7-Kanal/Pore-Funktion, kann nicht genau wiedergeben, die wahre Funktion der P2X7-Rezeptoren kann als ATP auch P2Y Rezeptoren freizugebende intrazellulären Calcium aktivieren. In diesem Fall möglicherweise Barium ein besseres kation, anstelle von Calcium zu verwenden, da der Zustrom unidirektional16ist. Um den Beitrag von P2Y Rezeptoren im Kalzium Zustrom zu unterscheiden, können Bedingungen wo 1 mM EDTA oder Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-Tetraacetic Säure (EGTA) K+ Mediums anstelle von CaCl2 hinzugefügt wird in diesem verwendet werden Assay.
Dieses Protokoll kann auch leicht andere Zelltypen angepasst angepasst werden und kann für die Untersuchung der Funktionalität der Alternative Ionen-Kanal Rezeptoren oder Rezeptoren, die Teilnahme an Phagozytose nützlich sein. Diese Methode kann auch zu einer Flow Cytometry Maschine ohne ein Zeit-Modul angepasst werden. Als Beispiel können Phagozytose Assays erfolgen, wo YG Perlen 7 – 8 min. vor der Analyse von konventionellen Durchflusszytometrie hinzugefügt werden. Halten Sie die Zellen bei 37 ° C zu und kontinuierlich wirbeln sie. Dies wird nicht in Echtzeit Informationen aber Unterschiede in die mittlere endgültige Fluoreszenz werden noch informieren, des Forschers über die Funktionalität des P2X7-Rezeptoren.
Interesse an P2X7-Rezeptoren wie ein Medikament Ziel21,22 oder sogar als ein Drug-Delivery route23,24 wächst rasant und so Methoden, um dieses rätselhafte Rezeptor studieren müssen kontinuierlich angepasst und verbessert werden erleichtern Sie diese Studien. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die verwendet werden, um Erwachsenen neurale Vorläuferzellen P2X7 Funktion zu untersuchen, und es ist zu hoffen, dass erreichen ein besseres Verständnis des P2X7-Rezeptoren in den neurogenen Nischen zu Fortschritte in der Behandlung des Schlaganfalls führen kann und andere ischämischen Verletzungen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten danken Maria Kasherman und Xin Huang für ihre Beiträge zu dieser Forschung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation, M.W., T.C.L. und m.l. und T.C.L. aus der National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australien (571100 und 1048082) und die gemeinnützige Stiftung Baxter (unterstützt. Sydney, Australien). B.g. wurde von der Australian Research Council (ARC) Zukunft Fellowship (FT120100581), NHMRC Projektzuschüsse (1048082, 1061419 und 1120095) und der Staatsregierung betriebliche Infrastruktur Support Grant Florey Institute unterstützt. M.l. wurde durch einen Charles D. Kelman, M.D. Postdoctoral Award (2010) von internationalen Retinal Research Foundation (USA) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A438079 | Tocris | 2972/10 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
| bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
| Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
| NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
| Oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
| Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
| Tetramethylammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
| Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
| Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
| TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
| UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
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