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Developmental Biology

वास्तविक समय लाइव सेल फ्लो Cytometry कैल्शियम का तांता, ताकना गठन की जांच करने के लिए, और P2X7 रिसेप्टर्स द्वारा वयस्क तंत्रिका प्रजनक कोशिकाओं में Phagocytosis

Published: April 3, 2019 doi: 10.3791/59313
Automatic Translation
1,2, 3,4, 3,5,6, 7, *1,4,7, *8
1Griffith Institute for Drug Discovery, Griffith University, 2Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, University of Queensland, 3Discipline of Anatomy and Histology, School of Medical Science, University of Sydney, 4Bosch Institute, University of Sydney, 5Applied Neurosciences Program, Peter Duncan Neurosciences Research Unit, St. Vincent's Centre for Applied Medical Research, 6School of Medical Sciences, The University of New South Wales (UNSW) Medicine, Sydney, New South Wales, 7School of Environment and Science, Griffith University, Brisbane, Queensland, 8Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

एकल कोशिका संवेदनशीलता प्रदान करना, वास्तविक समय प्रवाह cytometry अद्वितीय है जीने संस्कृतियों के मल्टीमॉडल रिसेप्टर कार्यों यों तो करने के लिए अनुकूल है । वयस्क तंत्रिका संतान कोशिकाओं का उपयोग कर, P2X7 रिसेप्टर समारोह कैल्शियम सूचक डाई द्वारा पता लगाया गया था के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था, इथिडियम ब्रोमाइड ऊपर से transmembrane छिद्र गठन, और फ्लोरोसेंट लेटेक्स मोती का उपयोग कर phagocytosis.

Abstract

जीवित कोशिका प्रवाह कोशिकामिति का प्रयोग कोशिका जीवविज्ञानी में जैविक प्रक्रियाओं को परिमाणित करने के लिए किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि जिससे लाइव सेल फ्लो cytometry पर विस्तारित करने के लिए वास्तविक समय में P2X7 रिसेप्टर सक्रियण के कई कार्यों का विश्लेषण है । एक समय मॉड्यूल एक प्रवाह cytometer पर स्थापित का उपयोग करना, लाइव सेल कार्यशीलता का आकलन किया जा सकता है और एक निश्चित समय अवधि में प्लॉट करने के लिए कैल्शियम की आमद की कैनेटीक्स का पता लगाने, transmembrane रंध्र गठन, और phagocytosis । इस सरल विधि P2X7 रिसेप्टर के सभी तीन विहित कार्यों के रूप में लाभप्रद है एक मशीन का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, और इकट्ठा डेटा समय पर प्लॉट पूरे रहते सेल जनसंख्या के बजाय एकल सेल रिकॉर्डिंग अक्सर पर जानकारी प्रदान करता है तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण पैच-दबाना तरीकों का उपयोग कर प्राप्त की । कैल्शियम का तांता प्रयोग एक कैल्शियम संकेतक डाई का उपयोग करें, जबकि P2X7 pore गठन assays इथियोडियम ब्रोमाइड पर निर्भर करने के लिए उच्च एगोनिस्ट सांद्रता पर गठित transmembrane छिद्र के माध्यम से पारित करने की अनुमति दी जा रही है । पीला-हरा (YG) लेटेक्स मोती का उपयोग करने के लिए phagocytosis उपाय कर रहे हैं । विशिष्ट एगोनिस्ट और विरोधी P2X7 रिसेप्टर गतिविधि के प्रभाव की जांच करने के लिए लागू कर रहे हैं । व्यक्तिगत रूप से, इन विधियों को कैल्शियम चैनल और प्रिन्जिक और मेहतर रिसेप्टर्स की किसी भी संख्या पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । एक साथ लिया, वे कैसे वास्तविक समय लाइव सेल फ्लो cytometry का उपयोग एक तेजी से, लागत प्रभावी, reproducible, और quantifiable विधि P2X7 रिसेप्टर समारोह की जांच करने के लिए है पर प्रकाश डाला ।

Introduction

प्रिन्जिक सिग्नलिंग का अध्ययन व्यापक और बहुमुखी है, जिसमें सेलुलर फिजियोलॉजी, जैव रसायन और भेषजगुण शामिल हैं । प्रिन्जिक सिग्नलिंग सेलुलर और आण्विक प्रक्रियाओं की एक अनंत संख्या में शामिल है, कैंसर और सेल चक्र विनियमन सेल सेल संचार और स्टेम सेल जीव विज्ञान से; इस तरह के रूप में, वहां अक्सर एक चिकित्सकीय लाभ के लिए प्रिन्जिक सिग्नलिंग मिलाना क्षमता मौजूद है । प्रिन्जिक रिसेप्टर्स के, P2X7 रिसेप्टर कई भड़काऊ शर्तों1के लिए एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में अपनी क्षमता के कारण हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण ध्यान प्राप्त हुआ है. विधियों का अध्ययन करने के लिए रिसेप्टर विकसित किया है और वर्षों में अनुकूलित किया गया है इस अनुसंधान की सुविधा2,3,4,5। यहां, हम एक जीवित कोशिका प्रवाह cytometry विधि का वर्णन करने के लिए वयस्क तंत्रिका उपवेंट्रिकुलर क्षेत्र (SVZ) और हिप्पोकैम्पल डेंटेट gyrus से व्युत्पन्न कोशिकाओं में P2X7 रिसेप्टर्स के कई कार्यों की जांच ।

P2X7 रिसेप्टर पहले P2Z रिसेप्टर, या ' सेल ' मौत रिसेप्टर के रूप में वर्णित किया गया था, adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के उच्च सांद्रता के साथ अपने सक्रियण के रूप में एक बड़े ट्रांझिल् स के गठन में परिणाम ९०० दा6तक अणुओं के लिए पारगम्य । यह साइटोस्केलेटल पुनर्विन्यास, ट्रांसझिल्ली छिद्र गठन, और, संभावित, अपोप्टोसिस और/ परंपरागत रूप से, P2X7 के इस समारोह में बड़े आणविक वजन रंजक जैसे यो प्रो-1 या इथियोडियम bromide, जो fluoresce जब डीएनए3,8के साथ अंतर्विष् ट द्वारा मात्रा निर्धारित है । थाली पाठक तरीके, जो तेजी से कर रहे है और upscaling के लिए अनुमति देते हैं, आम तौर पर कैनेटीक्स के अवलोकन के लिए अनुमति नहीं है । यहां वर्णित विधि इथियोडियम तेज पर आधारित है और प्रतिदीप्ति वृद्धि समय के साथ मनाया जा करने के लिए अनुमति देता है, ताकना गठन की गति के संबंध में जानकारी की एक बड़ी गहराई प्रदान । P2X7 रिसेप्टर्स के बाद से गैर प्रतिरक्षा कार्यों की एक संख्या की सुविधा के लिए दिखाया गया है, अलग जोखिम समय और एगोनिस्ट एकाग्रता9,10के आधार पर प्रतिक्रियाओं के साथ. न्यूरोट्रांसमीटर और सिग्नल पारक्रमण के प्रयोजनों के लिए धनायन आमद में एटीपी परिणामों की कम सांद्रता द्वारा संक्षिप्त सक्रियण11. कैल्शियम की आमद को मापने के लिए प्रवाह cytometry का उपयोग बोझिल और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण तरीकों से जुड़ी समस्याओं पर काबू पाता है-विशेष रूप से, पैच clamping आवक धाराओं को मापने के लिए जो में क्षमता परिवर्तन के रूप में अमूल्य विवरण प्रदान एक कोशिका झिल्ली लेकिन जनसंख्या विश्लेषण2के लिए अनुमति नहीं है । P2X7 रिसेप्टर्स के तीसरे समारोह एटीपी, जहां P2X7 रिसेप्टर्स दोनों प्रतिरक्षा प्रणाली और तंत्रिका तंत्र9,12,13में phagocytosis की सुविधा के लिए प्रदर्शन किया गया है के अभाव में होता है । माइक्रोस्कोपी तकनीकों में प्रगति, हालांकि परिमाणन और जनसंख्या विश्लेषण अभी भी एक चुनौती पेश कर सकते हैं, फिर से शुरू करने की प्रक्रिया के दौरान साइटोस्केलेटल पुनर्व्यवस्था के दृश्य की अनुमति दी है ।

लाइव सेल फ्लो cytometry विधि यहां विस्तृत वास्तविक समय में P2X7 रिसेप्टर्स के सभी तीन मुख्य कार्यों की जांच के लिए अनुमति देता है । प्रवाह cytometer पर एक समय मॉड्यूल डिवाइस का समावेश तापमान नियंत्रण और निलंबन में कोशिकाओं के नित्य सरगर्मी की अनुमति देता है । एगोनिस्ट और विरोधी उत्तेगनी एक दूसरे के भीतर दिया जा सकता है, सेलुलर प्रतिक्रिया के निकट निर्बाध माप की अनुमति । यह प्रस्तुत करता है एक तेजी से और सरल विधि को reproducibly जबकि कई परख प्रणालियों के उपयोग से परहेज समारोह यों तो । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल आसानी से किसी भी कोशिका प्रकार के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है और विशिष्ट एगोनिस्ट या inhibitors के शामिल किए जाने को देखते हुए अंय रिसेप्टर उपप्रकारों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उनके गुणों पर निर्भर करता है ।

Protocol

पशुओं की देखभाल और वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए पशुओं के उपयोग के लिए ऑस्ट्रेलियाई अभ्यास संहिता के अनुसार इलाज किया गया और ग्रिफ़िथ विश्वविद्यालय पशु नैतिकता समिति द्वारा उपयोग के लिए मंजूरी दे दी ।

1. वयस्क SVZ और हिप्पोकैम्पस से तंत्रिका संतान कोशिकाओं के Neurosphere संस्कृति

नोट: विच्छेदन यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल वॉकर और केपरमांन द्वारा काम पर आधारित है, और वयस्क चूहों से तंत्रिका संतती कोशिकाओं के विच्छेदन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल अन्यत्र उपलब्ध है14। 15बाबू और उनके सहयोगियों से संस्कृति की स्थिति में परिवर्तन किया गया है । वयस्क female C57BL/6 चूहों आयु वर्ग के 8 – 12 सप्ताह का उपयोग किया गया ।

  1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, संस्कृति मध्यम (तंत्रिका बेसल मध्यम) तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार अनुपूरक के साथ पूरक तैयार, 2 मिमी glutamine, 20 एनजी/मिलीलीटर एपिडर्मल वृद्धि कारक (EGF), 10 एनजी/एमएल बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (bFGF), और 2 μg/ हेपरिन.
  2. दो चूहों को सह कर2 साँस लेना । वैकल्पिक रूप से, संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों anesthetize और तुरंत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से उंहें euthanize । ७०% इथेनॉल के साथ उनके सिर स्प्रे और उंहें सिर काटना । 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन सॉल्यूशन (P/S) के साथ हैंक के संतुलित लवण विलयन (HBSS) वाले नली में प्रत्येक सिर को स्थानांतरित करें ।
  3. एक विच्छेदन खुर्दबीन के तहत एक लमिनार प्रवाह हुड में विच्छेदों प्रदर्शन ।
  4. संदंश और विच्छेदन कैंची का प्रयोग, ऊतक और हड्डी को हटाने के लिए मस्तिष्क का पर्दाफाश, और यह एक बाँझ के साथ hbss युक्त पकवान स्थानांतरण/
  5. मस्तिष्क अधर पक्ष ऊपर की स्थिति और एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए ऑप्टिक chiasm भर में एक पूर्ण कोरोनल चीरा बनाने के लिए । मस्तिष्क को संदंश से स्थिर रखें और एक स्विफ्ट, स्वच्छ, अधोमुखी गति का उपयोग करें । सेल मौत को कम करने और ऊतक संरचना को बनाए रखने में मदद करने के लिए चीटिंग से बचें ।
    नोट: यदि सुरक्षित रूप से आयोजित नहीं, मस्तिष्क में कटौती के दौरान आगे झुकाव हो सकता है, संतत्र कोशिकाओं SVZ से प्राप्त की संख्या समझौता ।
  6. मस्तिष्क के रोस्ट्रल आधे से SVZ को अलग ।
    1. दोनों ventricles की स्थिति जानें, septum द्वारा अलग, कोष callosum उनके ऊपर एक सफेद पुल बनाने के साथ ।
    2. दो निलय अलग पट हटाने और पूर्वकाल पार्श्व निलय के पार्श्व दीवारों को अलग करने के लिए संदंश का प्रयोग करें । ऊपर दूर, नीचे, पक्षों के लिए, और ठीक विच्छेदन कैंची के साथ मोर्चे पर काटने से यह मत करो । वहां सिर्फ एक छोटे कप की तरह आकार रहेगा ।
    3. बीच में HBSS की कुछ बूंदों के साथ एक साफ पेट्री डिश ढक्कन तैयार करने और तरल करने के लिए SVZ हस्तांतरण । ऊतक सूखी या एक सूखी सतह को छूने के लिए अनुमति नहीं है । हिप्पोकैम्पी को विदारक बनाते समय पक्ष में खड़े हो जाएँ.
  7. हिप्पोकैम्पी को मस्तिष्क के पुच्छ अर्ध से अलग कर दीजिये ।
    1. कॉर्पस कैललोसम को विच्छेद करने के लिए गोलार्द्धों के बीच एक मिडलाइन कट बनाएं । एक गाइड के रूप में पार्श्व निलय का प्रयोग करें और धीरे से प्रांतस्था प्रकट हिप्पोकैम्पस बेनकाब । एक बार प्रांतस्था को अनवेल्लित किया जा चुका है, हिप्पोकैम्पस एक घने, सफेद, घुमावदार संरचना के रूप में देखा जा सकता है ।
    2. ठीक विच्छेदन कैंची या संदंश का उपयोग करने के लिए पड़ोसी ऊतक से हिप्पोकैम्पस अलग ।
    3. संदंश के साथ, अतिरिक्त सफेद पदार्थ, रक्त वाहिकाओं, और हिप्पोकैम्पस को कवर किसी भी झिल्ली ऊतक को हटा दें ।
    4. HBSS की कुछ बूंदों के साथ तैयार एक साफ पेट्री डिश ढक्कन तैयार करें और हिप्पोकैंपस को लिक्विड में ट्रांसफर करें । अंय गोलार्द्ध के लिए दोहराएं ।
  8. एक बार हिप्पोकैम्पस और दो चूहों से SVZ अलग किया गया है और उनके संबंधित पेट्री डिश lids को हस्तांतरित, यंत्रवत् एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर ऊतक पासा । लगभग 1 मिनट के लिए एक पेट्री डिश ढक्कन में ऊतक काटना, हर 10 s घूर्णन जब तक ऊतक चिकनी और केवल ठीक टुकड़े दिखाई देते हैं । एक साफ स्केलपेल ब्लेड ले लो और अंय पकवान के लिए दोहराएं, 1 मिनट के लिए ऊतक dicing ।
  9. एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करना, एक पेट्री डिश ढक्कन से सभी ऊतक ०.२५% trypsin के 1 मिलीलीटर से युक्त अलग ट्यूबों के हस्तांतरण-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA). SVZ और हिप्पोकैम्पस के लिए एक ट्यूब के लिए एक ट्यूब का प्रयोग करें ।
    1. यह पहली बार के बारे में trypsin के आधे के बारे में-EDTA पकवान में ऊतक के लिए हवा के बुलबुले को कम करने के लिए और यह ट्यूब को हस्तांतरित के रूप में सूखी पिपेट टिप के साथ संपर्क में आने वाले ऊतक को रोकने के लिए । डिश और trypsin के बाकी के साथ स्केलपेल ब्लेड-EDTA कुल्ला संभव के रूप में ज्यादा ऊतक के रूप में इकट्ठा और यह ट्यूब के लिए जोड़ ।
  10. 30 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी स्नान में ट्रिप् सिन के साथ ऊतक सेते, ट्यूब हर 10 मिनट के लिए ठीक से उच्छेदन उत्तेजित ऊतक ।
  11. एक एकल कोशिका निलंबन बनाने के लिए एक आग पॉलिश गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग ऊतक Trत्रात । यह अत्यधिक सेल lysis का कारण होगा के रूप में overtrate करने के लिए नहीं ध्यान रखना । यह इष्टतम ऊतक पृथक्करण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है ।
  12. संपेषण प्रक्रिया के दौरान ट्यूब सामग्री का निरीक्षण करें और जल्दी से संकेत है कि ऊतक clumps के बहुमत हटा दिया गया है पर रोक । ट्रिप् सिन समाधान थोड़ा बादल जब कोशिकाओं एकल सेल निलंबन में चला गया है होना चाहिए, हालांकि कुछ clumps रह सकते हैं ।
    नोट: एक संकेत के रूप में, निलंबन ऊपर और नीचे 10x-15x पास पर्याप्त है ।
  13. संस्कृति मध्यम जोड़ें 5 मिलीलीटर trypsin को बेअसर करने के लिए, और 3 मिनट के लिए ३०० x g पर स्पिन । HBSS के साथ एक आगे 2X धोने और किसी भी ऊतक clumps हटाने के लिए एक ७० μm सेल छलनी के माध्यम से माध्यम से गुजारें ।
  14. एक T75 सेल संस्कृति फ्लास्क करने के लिए मध्यम के 15 मिलीलीटर में सभी कोशिकाओं का स्थानांतरण ।
    नोट: क्षेत्रों में पारित होना चाहिए शूंय (P0) SVZ संस्कृति के बाद 7-10 दिन और 15 के बाद-हिप्पोकैम्पल संस्कृति में 20 दिन । धोने या इस समय के दौरान कोशिकाओं को खिलाने से बचना संस्कृति में तंत्रिका प्रजनक कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए । अधिक progenitors की आवश्यकता है, या P0 ऊष्मायन समय को कम करने के लिए, यह बलिदान चूहों की संख्या में वृद्धि करने के लिए संभव है ।
  15. 5% CO2 के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को बनाए रखने और, प्रारंभिक P0 संस्कृति चरण के बाद, हर 7-10 दिन बीतने के रूप में आवश्यक, एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट और मानक ऊतक संस्कृति प्रथाओं का उपयोग ।
    नोट: P0 हिप्पोकैम्पल संस्कृति एक T25 flask में पारित करने के लिए पर्याप्त क्षेत्रों उत्पन्न करना चाहिए; SVZ संस्कृति कई और अधिक क्षेत्रों उत्पंन होगा और एक T75 में passaged जा सकता है । यदि P0 हिप्पोकैम्पल क्षेत्रों का पालन किया है, एक २०० μL पिपेट का उपयोग करने के लिए धीरे से क्षेत्र लिफ्ट ।
  16. जब वे व्यास में १५० से २०० μm तक पहुंच क्षेत्रों बीतने । एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में क्षेत्रों और मध्यम ले लीजिए और क्षेत्रों लगभग 5 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसने के लिए अनुमति देते हैं । वैकल्पिक रूप से, एक कम गति (१०० x g) पर 2 मिनट के लिए स्पिन ।
  17. मध्यम निकालें और वियोजन अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं को 7 के लिए-10 मिनट, क्षेत्रों के आकार पर निर्भर करता है ।
    नोट: वियोजन अभिकर्मक संस्कृति के परिणाम पर महत्वपूर्ण प्रभाव होगा इस्तेमाल किया है, तो कृपया विशेष के लिए सामग्री की मेज को देखें ।
  18. सेल समाधान के लिए HBSS के 5 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धोने और 3 मिनट के लिए ३०० x g पर सेंट्रीफ्यूज. supernatant निकालें, संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं resuspend, और बीज के लगभग १५०,००० कोशिकाओं में मध्यम के 5 मिलीलीटर में एक T25 सेल संस्कृति फ्लास्क या समकक्ष । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर संस्कृतियों बनाए रखें ।
  19. किसी भी डाउनस्ट्रीम प्रोटोकॉल9पर आगे बढ़ने से पहले स्टेम सेल मार्कर जैसे SOX2 और ASCL1 की अभिव्यक्ति की पहचान करके तंत्रिका संतान कोशिका स्थिति की पुष्टि करें ।
    नोट: यह शोधकर्ता की पसंदीदा विधि (जैसे माइक्रोस्कोपी द्वारा immunochemistry, प्रवाह cytometry या वेस्टर्न ब्लॉट, या मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qpcr) का उपयोग करके) किया जा सकता है ।

2. प्रवाह Cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए एक एकल सेल निलंबन की तैयारी

  1. आवश्यक मीडिया तैयार करें । इनमें निम्न शामिल हैं ।
    1. तैयार करें+ मध्यम १४५ मिमी NACL, 5 मिमी KOH, 10 मिमी Hepes, 5 मिमी डी-ग्लूकोज, ०.१% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिं (bsa), और ०.१ मिमी cacl2से युक्त. इस माध्यम भी एक कैल्शियम मुक्त रूप में प्रयोग किया जाता है, ०.१ मिमी CaCl2 लोप के साथ.
    2. K+ १४५ मिमी KCL, 5 मिमी KOH, 10 मिमी Hepes, 5 मिमी डी-ग्लूकोज, और ०.१% Bsa युक्त मध्यम तैयार करें ।
      नोट: इन मीडिया बड़े पैमाने पर अनुकूलित किया गया और पिछले प्रकाशनों4,5में विस्तृत कर रहे हैं ।
    3. एक १०० मिमी स्टॉक के लगभग 20 मिलीलीटर के लिए पर्याप्त एटीपी पाउडर वजन द्वारा स्टॉक एटीपी तैयार करें । KCl बफर के 17 मिलीलीटर में पाउडर भंग (१४५ मिमी KCl, 5 मिमी कोह, और 10 मिमी HEPES, पीएच ७.५) और धीरे, जबकि क्रियाशीलता, 18% की 2 मिलीलीटर जोड़ने (डब्ल्यू/वी) tetrके लिए एक समाधान करने के लिए पीएच को 6.8-7.0 लाने के लिए ।
    4. 20 मिलीलीटर के लिए अंतिम खंड समायोजित करें । पीएच पिछले ७.० overshoot मत करो । स्टॉक-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर; नोट करें कि ATP aliquots के लिए ंयूनतम 6 महीने स्थिर हैं ।
      नोट: एनहाइड्रोस एटीपी का नि: शुल्क आण्विक वजन ५५१.१४ ग्राम/मोल है, और यह पानी और डायसोडियम अणुओं, जो बैच से बैच के लिए भिंन हो सकते है और गणना के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए के आणविक वजन शामिल नहीं है । TMA विषाक्त है, और देखभाल जब हैंडलिंग लिया जाना चाहिए । सुरक्षा डेटा शीट पढ़ें और एक धूआं कैबिनेट में शेयर तैयार करते हैं ।
    5. 10 मिमी की एक अंतिम स्टॉक एकाग्रता के लिए ultrapure एच2ओ में bzatp को भंग करके शेयर Bzatp तैयार करें ।
  2. चरण १.१६ और १.१७ में वर्णित के रूप में एक एकल-कक्ष निलंबन बनाएँ । एक हीमोसिटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना. परीक्षण किए जा रहे प्रयोग के लिए आवश्यक माध्यम (उदा., ना+ मध्यम, संस्कृति माध्यम) में कक्षों को पुनः भेजें (जैसा कि नीचे वर्णित है) और इस बीच में बर्फ पर कक्ष रखें ।
  3. प्रत्येक प्रयोग के लिए, सुनिश्चित करें कि आगे और साइड स्कैटर के लिए नियंत्रण शामिल करने के लिए पर्याप्त नमूना है, साथ ही वोल्टेज और क्षतिपूर्ति सेटिंग्स के अंशांकन के लिए । ध्यान दें, एक संकेत के रूप में, कि एक T75 कुप्पी में उगाया क्षेत्रों आमतौर पर 8 x 10 कुप्पी प्रति6 कोशिकाओं के आसपास उपज ।
  4. नियंत्रण नमूनों का उपयोग कर प्रवाह cytometer सेटिंग्स सेट करें ।
    1. जीवित कोशिकाओं को चुनिंदा गेट के लिए आगे और साइड स्कैटर का उपयोग करें ।
      नोट: आगे तितर बितर करने के लिए प्रकाश diffraction के आधार पर सेल आकार के बारे में जानकारी प्रदान करता है, जबकि ओर बिखराव आंतरिक जटिलता या ग्रैनुलैरिटी का एक उपाय प्रदान करता है । छोटे आगे और ओर बिखराव के साथ प्रवाह घटनाओं मृत कोशिकाओं के रूप में माना जा सकता है ।
    2. वोल्टेज और प्रवाह cytometer के लाभ के निर्माता के निर्देशों के अनुसार समायोजित करें । अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता पर डेटा का कब्जा सुनिश्चित करने के लिए एक परीक्षण नमूना चलाएँ. सिंगल चैनल अधिग्रहण के लिए कोई मुआवजा जरूरी नहीं है ।

3. कैल्शियम का तांता लाइव सेल फ्लो Cytometry द्वारा मापने

  1. एक एकल सेल निलंबन की तैयारी के बाद, कैल्शियम मुक्त Na+ माध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और उंहें 2 एनजी/के साथ लोड कैल्शियम संकेतक डाई निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ( सामग्री की तालिकाको देखें) 10 μl के साथ 5% बहुलनिक अम्ल का । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते ।
  2. 3-5 मिलीलीटर कैल्शियम मुक्त Na+ मध्यम और सेंट्रीफ्यूज धीरे (२०० x g 4 मिनट के लिए) जोड़कर कोशिकाओं को धो लें । Supernatant निकालें और कोशिकाओं को कैल्शियम मुक्त ना+ माध्यम में resuspend, एक दूसरी बार धोने ।
  3. कैल्शियम की 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend-मुक्त Na+ मध्यम, उंहें बर्फ पर जगह है, और उंहें डी के लिए अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए esterify ।
  4. 3-कश्मीर के 5 मिलीलीटर+ मध्यम और सेंट्रीफ्यूज (4 मिनट के लिए २०० x जी ) जोड़कर 1x अधिक धो लें; फिर, K+ मध्यम में कोशिकाओं resuspend और उंहें प्रतिदीप्ति सहायता सेल छंटाई (facs) ट्यूबों में 1 x 106 कोशिकाओं प्रति facs ट्यूब प्रति ५०० μl की एकाग्रता में aliquot ।
    नोट: नमूना प्रति FACS ट्यूबों की संख्या उपचार और दोहराता है कि शामिल हैं की संख्या पर निर्भर करेगा ।
  5. जब तक कोशिकाओं को विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं बर्फ पर FACS ट्यूबों प्लेस. एक विस्तारित अवधि के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को छोड़ नहीं है, लेकिन जितनी जल्दी हो सके परख शुरू करते हैं ।
  6. कुछ नमूनों के लिए, विश्लेषण करने से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर P2X7 रिसेप्टर-विशिष्ट अवरोध करनेवाला AZ10606120 (10-15 मिनट के लिए 1 μM) या A438079 (30 मिनट के लिए 10 μM) के साथ कोशिकाओं preincubate ।
  7. पहले नमूने को चलाने के लिए कुछ मिनट पूर्व, (FACS ट्यूब में 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए) CaCl2 जोड़ने के लिए और एक ३७ ° c पानी स्नान में ट्यूब जगह ठीक करने के लिए.
  8. FACS ट्यूब में एक साफ, छोटे चुंबकीय विलोडक ड्रॉप और नमूना तापमान को नियंत्रित करने के लिए एक परिसंचारी ३७ ° c पानी स्नान से जुड़े समय मॉड्यूल में ट्यूब स्थिति. एक भंवर प्रभाव शुरू करने के बिना नमूना के आंदोलन को सुनिश्चित करने के लिए एक कम सरगर्मी गति का चयन करें । पानी जैकेट ट्यूब अनुकूलक नमूना मंच पर प्लेस और FACS मशीन के लीवर हाथ बंद करो ।
  9. नमूना अधिग्रहण शुरू करने और प्रति सेकंड लगभग १,००० घटनाओं पर 3 मिनट के लिए नमूना चलाते हैं ।
  10. ४० s मार्क पर, जल्दी से ट्यूब को हटाने और P2X7 agonist जोड़ने के लिए, या तो 1 मिमी एटीपी या ३०० μM BzATP, और ट्यूब की जगह अधिग्रहण जारी रखने के लिए ।
  11. जबकि पहले नमूना रिकॉर्डिंग है, CaCl2 के साथ दूसरा नमूना तैयार है और यह ३७ डिग्री सेल्सियस में जगह कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए विश्लेषण से पहले गर्म करने के लिए. एक बार पहले नमूना समाप्त हो गया है, एक पानी के नमूने चलाकर सेवन साफ है, और फिर दूसरा नमूना के अधिग्रहण के रूप में कदम ३.८ और ३.९ में वर्णित शुरू कर सकते हैं । हमेशा नमूनों के बीच का सेवन साफ करें ।

4. मापने ताकना निर्माण लाइव सेल फ्लो Cytometry द्वारा

  1. चरण १.१६ और १.१७ में वर्णित के रूप में एक एकल-कक्ष निलंबन बनाएँ । पुराने माध्यम के कुछ मिलीलीटर सहेजें, इसका इस्तेमाल 1 x 106 कोशिकाओं प्रति facs ट्यूब प्रति १०० μl की एकाग्रता पर कोशिकाओं resuspend करने के लिए, और तैयार जब तक यह बर्फ पर जगह है ।
  2. परख चलाने से पहले, 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए कश्मीर के+ मध्यम के ९०० μl जोड़ें और 10 मिनट के लिए एक ३७ ° c पानी स्नान में ट्यूबों जगह ठीक करने के लिए ।
  3. यदि लागू हो, तो P2X7-विशिष्ट अवरोधकों AZ10606120 (10-15 मिनट के लिए 1 μM) या A438079 (30 मिनट के लिए 10 μM) सहित, उपचारों के साथ कक्षों को प्रीइनसेबेट करें ।
  4. तुरंत परख चलाने के लिए पहले, FACS ट्यूब के लिए 25 μM इथियोडियम ब्रोमाइड जोड़ें; फिर, चुंबकीय विलोडक जोड़ें, यह कदम ३.७ के अनुसार FACS मशीन पर जगह है, और अधिग्रहण शुरू करते हैं ।
    नोट: इथियोडियम ब्रोमाइड विषाक्त है, और देखभाल जब यह हैंडलिंग लिया जाना चाहिए । इस्तेमाल किया FACS ट्यूबों के उचित निपटान ।
  5. कोशिका झिल्ली में pores के गठन को प्रेरित करने के लिए, अधिग्रहण की शुरुआत के बाद 1 मिमी एटीपी या १०० μM BzATP ४० s जोड़ें ।
  6. 6 मिनट के लिए प्रति सेकंड के आसपास १,००० घटनाओं पर नमूने चलाते हैं ।
  7. जबकि पहले नमूना चल रहा है, बर्फ से दूसरा नमूना ले लो और यह ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में जगह कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए विश्लेषण से पहले ठीक हो । एक बार पहले नमूना अधिग्रहण के साथ समाप्त हो गया है, एक पानी के नमूने चलाकर सेवन साफ; उसके बाद, दूसरा नमूना चरण ३.८ और ३.९ में वर्णित के रूप में रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए मशीन पर रखा जा सकता है ।

5. लाइव सेल फ्लो Cytमिति द्वारा Phagocytosis को मापने

  1. चरण १.१६ और १.१७ में वर्णित के रूप में एक एकल-कक्ष निलंबन बनाएँ । वातानुकूलित माध्यम में कोशिकाओं Resuspend और उन्हें FACS ट्यूबों में कम से कम 1 x 106 कोशिकाओं प्रति facs ट्यूब प्रति १०० μl की एकाग्रता पर aliquot. कोशिकाओं को पतला करने के लिए 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के साथ (उदाहरण के लिए, na + मध्यम की ९०० μl जोड़ें) और बर्फ पर कोशिकाओं जगह जब तक विश्लेषण किया जाता है ।
  2. का प्रयोग करें 1 μm yg लेटेक्स मोती (microspheres) के रूप में वास्तविक समय भगोसाइटोसिस assays के लिए भक्षकाण्विक लक्ष्य ।
    नोट: अंय रंग भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन अलग आकार के मोती के लिए4phagocytosis के अपर्याप्त लक्ष्य पाए गए ।
  3. पहले नमूने को चलाने के लिए, एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और उंहें लगभग 7-10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करने की अनुमति के लिए सेटे ।
  4. किसी भी अपने संबंधित ट्यूबों के लिए preincubation की आवश्यकता उपचार जोड़ें, सहित 15 मिनट के लिए 1 मिमी एटीपी, ३०० μm ऑक्सीकरण एटीपी (oxatp) के लिए ४० मिनट, 20 के लिए 200 μm cytochalasin डी 20 मिनट के लिए, और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) 20 मिनट के लिए ।
    1. 5% मानव सीरम के लिए कोई पूर्वऊष्मायन आवश्यक नहीं है । यदि उपचार लगभग एक ही समय में जोड़ रहे हैं, नमूनों रिवर्स क्रम में चला जा सकता है, जबकि दूसरों को सेते जारी है । उदाहरण के लिए, नियंत्रण और सीरम पहले चलाने के लिए, फिर एटीपी-इलाज नमूना, cytochalasin डी और पीएफए द्वारा पीछा किया, और oxATP पिछले ।
  5. चुंबकीय विलोडक के साथ cytometer पर नमूना प्लेस के रूप में कदम ३.८ और ३.९ में वर्णित है और, तो, नमूना अधिग्रहण शुरू ।
  6. अधिग्रहण की शुरुआत के बाद 15-20 s मशीन से नमूना ट्यूब निकालें, और undiluted YG मोती के 5 μL जोड़ें । नमूना FACS ट्यूब वापस और अधिग्रहण जारी है । 7 के लिए नमूने भागो-8 मिनट के आसपास १,००० घटनाओं/
  7. जबकि पहले नमूना चल रहा है, बर्फ से दूसरा नमूना ले लो और यह एक ३७ ° c पानी स्नान में जगह कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए विश्लेषण से पहले ठीक हो । एक बार पहली नमूना समाप्त हो गया है, एक पानी के नमूने चलाकर सेवन साफ है और फिर, कदम ३.८ और ३.९ में वर्णित के रूप में दूसरे नमूने पर अधिग्रहण शुरू करते हैं ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा को स्प्रेडशीट में निर्यात करें । डेटा विश्लेषण प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर करेगा ।
    नोट: ध्यान रखें कि विभिंन रन अलग आधारभूत तीव्रता हो सकता है, तो यह महत्वपूर्ण है के लिए शुरू में एक निर्दिष्ट समय के लिए परख चलाने (लगभग ४० s) से पहले किसी भी एगोनिस्ट जोड़ने के लिए और प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की गणना से डेटा को सामान्य (प्रतिदीप्ति किसी भी समय बिंदु पर [F] समय बिंदु शूंय पर प्रतिदीप्ति द्वारा विभाजित [F0], या F/F0) ।
  2. प्रश्न में P2X7 फ़ंक्शन की दर या गतिकी को निर्धारित करने के लिए, वक्र के अंतर्गत क्षेत्र या प्रत्येक 10 s समयावधि16के लिए वक्र के अंतर्गत बनाए गए trapezoids का योग परिकलित करें ।
  3. उपचार के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, रिकॉर्डिंग के अंतिम 10-20 s पर प्रतिदीप्ति तीव्रता औसत और उपचार की तुलना करें । टीपरीक्षण या विचरण के विश्लेषण के द्वारा महत्व का निर्धारण ।

Representative Results

तंत्रिका संतत्र कोशिका संस्कृतियां

तंत्रिका संतति क्षेत्र इस विधि का उपयोग कर व्युत्पंन संस्कृतियों चरण उज्ज्वल होना चाहिए और एक चिकनी दौर एज (चित्रा 1a, बी) । स्वस्थ संस्कृतियों में, छोटे माइक्रोस्पाइक्स किनारों पर मनाया जा सकता है (चित्रा 1C) । देर से मार्ग पर, या यदि अपर्याप्त खिलाया, क्षेत्रों एक खोखले कप आकार (चित्रा 1 डी) या बड़े आयताकार आकार फार्म कर सकते है (चित्रा 1d, तीर से संकेत) । इन संस्कृतियों प्रवाह cytometry या किसी अंय अनुप्रवाह अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए, इन सुविधाओं के रूप में यह भेदभाव का संकेत हो सकता है । तंत्रिका प्रजनक स्थिति की पुष्टि करने के लिए, कोशिकाओं को कांच की पाली-एल के साथ लेपित coverslips पर चढ़ाया गया था और प्रतिरक्षा के लिए laminin (चित्रा 1F और, उच्च कन्फ्लुएंसी, चित्रा 1fपर) । कोशिकाओं GFAP, नेस्टिन, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1 के लिए दाग रहे थे, और DCX प्रकार के रूप में कोशिकाओं की पहचान करने के लिए 2 प्रजनक कोशिकाओं (हिप्पोकैम्पस) या प्रकार सी प्रजनक कोशिकाओं (SVZ)9। कोशिकाओं में एक सुपरिभाषित नाभिक और विस्तारित प्रक्रियाएं होनी चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि हिप्पोकैम्पल तंत्रिका संतत्र कोशिका संस्कृति । (क) हिप्पोकैम्पल तंत्रिका संतत्र कोशिकाएं वयस्क चूहों से पृथक होती हैं और लगभग १०० से १५० μm तक व्यास में तंत्रिका-क्षेत्रों के रूप में सुसंस्कृत होती हैं । (ख) तंत्रिका-क्षेत्रों में एक चिकनी परिधि होनी चाहिए, (ग) और उनकी सतह पर छोटे सूक्ष्मजीवों को देखा जा सकता है । जब क्षेत्रों संस्कृति में बहुत लंबे होते हैं, वे फार्म कर सकते है (डी) कप या (ई) आयताकार आकार । इन संस्कृतियों प्रयोगों के लिए नहीं किया जाना चाहिए । कोशिकाओं की तंत्रिका प्रजनक स्थिति की पुष्टि करने के लिए, उन्हें पॉली-एल-ऑर्निथिन (पीएलओ) पर सिंगल सेल सस्पेंशन के रूप में और इमयूनोरसायन के लिए लैमिनॉन-लेपित कांच के coverslips के रूप में बीज । कोशिकाओं एक छोटे से सोमा और शाखाओं में बंटी होना चाहिए, (च) कम कन्फ्लुएंसी और (छ) immunochemistry के लिए तैयार है । स्केल पट्टियां = १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लाइव सेल फ्लो cytometry द्वारा कैल्शियम का तांता

इस प्रोटोकॉल वास्तविक समय में एक कैल्शियम चैनल के रूप में P2X7 रिसेप्टर समारोह के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । रिसेप्टर फलन की गतिकी के साथ-साथ विभिन्न अगोरों और विरोधी के प्रभावों का भी मूल्यांकन किया जा सकता है । जब समय के साथ प्लॉट किया, कैल्शियम का तांता हिप्पोकैम्पल और SVZ तंत्रिका संतान कोशिकाओं में आम तौर पर समान था (चित्रा 2A और चित्रा 2a, क्रमशः) । Agonists (या तो एटीपी या BzATP) ४० एस निशान पर जोड़ा गया, के रूप में लाल तीर से संकेत दिया । एक संक्षिप्त क्षण के लिए, ट्यूब रिकॉर्डिंग बिंदु से एगोनिस्ट जोड़ने के लिए हटा दिया जाता है, शून्य के डेटा बिंदुओं में जिसके परिणामस्वरूप. यह उस समय की पहचान के लिए अनुमति देगा जब एगोनिस्ट जोड़ा गया था । BzATP तेजी से P2X7 रिसेप्टर्स को सक्रिय करता है, आयन चैनल खोलने और कैल्शियम का तांता है, जो Fluo-8 और फ्लोरेसेस को बांधता है की अनुमति. एटीपी आवेदन आम तौर पर एक अधिक क्रमिक कैल्शियम आमद में परिणाम है । यह P2X7 करने के लिए एक कम संबध है जब bzatp की तुलना में और भी जी में परिणाम होगा-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर सक्रियण, एक धीमी संकेतन मार्ग जो अंतर्द्रव्यी जालिका से कैल्शियम विज्ञप्ति । P2X7 विरोधी A438079 और AZ10606120 के शामिल किए जाने (नहीं दिखाया डेटा) एगोनिस्ट आवेदन के जवाब में कैल्शियम की आमद कम ।

Figure 2
चित्रा 2: लाइव सेल कैल्शियम हिप्पोकैम्पस और SVZ से तंत्रिका संतत्र कोशिकाओं में आमद । P2X7 रिसेप्टर कैल्शियम चैनल समारोह में प्रदर्शन किया गया था (A) हिप्पोकैम्पल और (ख) Svz-fluo-8 प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के द्वारा संतति कोशिकाओं व्युत्पंन । सामान्य P2X एगोनिस्ट एटीपी और P2X7 आयन चैनल खोलने में P2X7 एगोनिस्ट bzatp परिणाम के आवेदन, कैल्शियम की आमद की अनुमति. आमद P2X7-विशिष्ट inhibitors A438079 या AZ10606120 (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ अवरोधित किया गया था । F = प्रतिदीप्ति; F0 = समय बिंदु शूंय पर प्रतिदीप्ति । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लाइव सेल फ्लो cytometry द्वारा ताकना गठन

ट्रांसझिल्ली छिद्र गठन P2X7 रिसेप्टर्स की एक विहित सुविधा है, macromolecule मुद्रा में परिणाम है, और कोशिका मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इथियोडियम+ एक बड़ा अणु (३१४ डीए) स्वस्थ कोशिकाओं से बाहर रखा गया है; इसके ऊपर और प्रतिदीप्त उत्सर्जन में डीएनए परिणामों के साथ बाद अंतर्निवेशन और P2X7 रिसेप्टर्स की क्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है transmembrane pores के रूप में । एगोनिस्टों एटीपी के आवेदन के बाद (1 मिमी एटीपी) और bzatp (१०० μm) पर ४० एस (तीर द्वारा संकेत), समय का हल प्रवाह cytometry इथियोडियम ब्रोमाइड वास्तविक समय में कोशिकाओं में प्रवेश (चित्रा 3a) कब्जा. इस प्रभाव P2X7-विशिष्ट अवरोध करनेवाला AZ10606120 द्वारा तनु किया गया था । इथियोडियम ब्रोमाइड तेज परख दर्शाता है एक कार्यात्मक P2X7 रिसेप्टर सी-17 टर्मिनस और पूर्ण लंबाई P2X7 रिसेप्टर अभिव्यक्ति के लिए अच्छा सबूत है । एटीपी एकाग्रता-प्रतिक्रिया assays स्पष्ट P2X7 pore गठन पर एगोनिस्ट एकाग्रता के प्रभाव, समय के साथ इथियोडियम ब्रोमाइड प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का उपयोग (चित्रा 3b) । एक साथ ग्राही-विशिष्ट अवरोधकों के साथ एगोनिस्ट खुराक एकाग्रता घटता रिसेप्टर सक्रियण के लिए मजबूत सबूत प्रदान करते हैं ।

Figure 3
चित्रा 3: P2X7 के transmembrane ताकना गठन के द्वारा मापा जाता है इथियोडियम ऊपर उठाना. अधिग्रहण के शुरू होने से पहले इथियोडियम ब्रोमाइड क्षणों के अलावा P2X7 transmembrane pores के गठन को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है । (क) P2X7 रिसेप्टर ताकना गठन में एटीपी और BzATP परिणाम के उच्च सांद्रता, इथियोडियम ब्रोमाइड सेल में प्रवेश करने की अनुमति । P2X7 अवरोध करनेवाला AZ10606120 इस घटना attenuates और कार्यात्मक P2X7 रिसेप्टर्स के लिए सबूत प्रदान करता है. (ख) एटीपी सांद्रण-अनुक्रिया एएसएचए ने ५०० μm और 1 मिमी पर महत्वपूर्ण ताकना के गठन का प्रदर्शन किया लेकिन कम सांद्रता पर नहीं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

लाइव सेल फ्लो साइटोमेट्री द्वारा Phagocytosis

हमारे समूह ने पहले का प्रदर्शन किया है कि extracellular एटीपी रोकता P2X7-mediated phagocytosis से अलग करना P2X7 सी cytoकंकाल से टर्मिनस, विशेष रूप से, nonmuscle मायोसिन iia18,19। इस विधि इन निष्कर्षों पर विस्तारित करने के लिए हिप्पोकैम्पाल और SVZ तंत्रिका संतति कोशिकाओं द्वारा वास्तविक समय में P2X7 रिसेप्टर भागीदारी को प्रदर्शित करता है (चित्रा 4, हिप्पोकैम्पल phagocytosis का एक उदाहरण) । अबाधित फेगोसाइटोसिस (नियंत्रण) के स्तर 1 μm YG लेटेक्स मोती के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में स्थापित किया गया । एटीपी अविशिष्ट inhibitors, अर्थात् पीएफए निर्धारण और ऐक्टिन बहुलकीकरण अवरोध करनेवाला cytochalasin डी के रूप में एक ही हद तक yg मोती की phagocytosis हिचकते हैं, जबकि 5% सीरम सभी जन्मजात phagocytosis समाप्त20।

Figure 4
चित्रा 4: P2X7 रिसेप्टर्स के माध्यम से तंत्रिका progenitors की भक्षिक क्षमता का प्रदर्शन yg मनका तेज । तंत्रिका प्रजनक कोशिकाओं द्वारा YG मनका उत्साहित वास्तविक समय में लाइव सेल प्रवाह cytometry का उपयोग कर नमूदार है । फेगोसाइटोसिस के नियंत्रण के स्तर शुरू में स्थापित कर रहे हैं, और यदि कोशिकाओं की संख्या की अनुमति देता है, रन के अंत में पुन: पुष्टि । P2X7 रिसेप्टर्स की भागीदारी एटीपी की उपस्थिति में भगोसाइटोसिस के निषेध द्वारा संकेत दिया है, के रूप में इस झिल्ली cytoकंकाल से सी-टर्मिनस dissociates, P2X7-mediated cytoकंकाल पुनर्व्यवस्था को रोकने. एटीपी के आवेदन को एक ही हद तक फैगोसाइटोसिस के उपयोग के रूप में, पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) और साइटोचालसिन डी (CytD) सहित भगोसाइटोसिस के लिए बंद कर दिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस पत्र के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत तंत्रिका संतान कोशिका संस्कृतियों में P2X7 रिसेप्टर समारोह के वयस्क न्यूरोजेनिक niches से व्युत्पंन । वयस्क तंत्रिका संतति कोशिकाओं के लिए संभावित अनुप्रयोगों के अनुसंधान से चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए सीमा है, और इसलिए संस्कृति की विधि मजबूत और reproducible होना चाहिए । समापन बिंदु culture की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते है जो इस प्रोटोकॉल के लिए कुंजी पहलुओं की एक संख्या है । एक बार खोपड़ी से हटा दिया, मस्तिष्क सूखी और विच्छेदन के रूप में संभव के रूप में जल्दी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए । विशेष रूप से हिप्पोकैंपस के साथ, अतिरिक्त देखभाल के लिए किसी भी रक्त वाहिकाओं या झिल्ली ऊतक हटाने के लिए बेहतर संतान कोशिका पैदावार में परिणाम होगा लिया । वियोजन और tration प्रक्रिया भारी एक संस्कृति में प्राप्त क्षेत्रों की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं; trypsin के साथ ऊष्मायन के दौरान ऊतक आंदोलन-EDTA अधिक सजातीय समाधान में परिणाम होगा । एक P1000 प्लास्टिक पिपेट टिप पर एक आग पॉलिश ग्लास चारागाह पिपेट का उपयोग अत्यधिक सेल मौत को कम करने और परिणामस्वरूप संस्कृति में सुधार की सिफारिश की है । ओवरट्रिटिंग से बचें । इन सावधानियों के बावजूद, प्रक्रिया P0 संस्कृति में मलबे का एक बहुत बना सकते हैं, और संतती कोशिकाओं को खोने से बचने के लिए, धोने या संस्कृति को खिलाने के क्षेत्रों का गठन किया है जब तक बचा जाना चाहिए ।

हिप्पोकैम्पल और SVZ संस्कृतियों के बीच मतभेद की एक संख्या P0 पर स्पष्ट हो जाएगा । हिप्पोकैम्पल संस्कृतियों कम क्षेत्रों उपज, और इन आम तौर पर पालन । एक पिपेट टिप का प्रयोग करें धीरे से प्रारंभिक बीतने के लिए क्षेत्रों को लिफ्ट । अनुवर्ती अंश में अनुगामी गोले नहीं देखे गए । ऊतक संस्कृति बोतल के विभिंन ब्रांडों के क्षेत्रों, विशेष रूप से हिप्पोकैम्पल क्षेत्रों का कारण हो सकता है, पालन करने के लिए और पकवान के तल पर कालोनियों के रूप में विकसित । यह इस प्रोटोकॉल के लिए किसी भी डाउनस्ट्रीम परिणाम में परिवर्तन नहीं पाया गया था, लेकिन निगरानी की जानी चाहिए, और निरंतरता जहां संभव बनाए रखा जाना चाहिए ।

पिछले तरीकों को मापने के लिए इस्तेमाल किया P2X7 रिसेप्टर समारोह, ऐसे पैच clamping के रूप में कैल्शियम तांता रिकॉर्ड करने के लिए, समय लेने वाली और श्रमसाध्य कर रहे है और केवल एक ही सेल के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । यह प्रोटोकॉल एक मशीन का उपयोग कर P2X7 रिसेप्टर्स के सभी तीन मुख्य कार्यों का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से और reproducible विधि प्रस्तुत करता है । समय-हल रहते सेल प्रवाह cytometry पूरी जनसंख्या विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और कैल्शियम की आमद की कैनेटीक्स के बारे में जानकारी के साथ शोधकर्ता प्रदान करता है, ताकना गठन, और/ इस के अलावा, प्रवाह cytometry आसानी से मार्कर अभिव्यक्ति पैटर्न और जनसंख्या विश्लेषण सेल आकार या प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर आकलन करने के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इन प्रयोगों का आयोजन करते समय, अधिक से अधिक कैल्शियम की आमद में अंतर, एथिडियम ऊपर उठाना, या phagocytosis दरों दोहराता के बीच देखा जा सकता है. इस को कम करने के लिए, क्षेत्र आकार, संस्कृति की स्थिति, और खिला शासन अनुरूप होना चाहिए के रूप में कोशिकाओं के स्वास्थ्य प्राप्त परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा । बर्फ पर समय भी डेटा को प्रभावित कर सकते हैं, तो यह सुनिश्चित करें कि सब कुछ समय से आगे तैयार है ताकि बर्फ पर समय कम है । सुनिश्चित करें कि कैल्शियम संकेतक डाई लोडिंग समय के अनुरूप है । एक अंय कारक है कि अधिक से अधिक कैल्शियम रिकॉर्डिंग में बड़ी असंगतताओं के लिए नेतृत्व कर सकते है एटीपी बैचेस के बीच भिन्नता है । एटीपी स्टॉक्स की तैयारी महत्वपूर्ण है, और एक ही प्रयोग के लिए अलग बैच के उपयोग से बचना चाहिए । ATP संगत है सुनिश्चित करने के लिए पुराने और नए बैचेस की तुलना भी अनुशंसित है । P2X7 विरोधी की प्रभावशीलता भी हो सकता है सेल लाइन-और बैच निर्भर है, तो ऊष्मायन बार और सांद्रता के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।

यह ध्यान देने योग्य बात है कि कैल्शियम की आमद/एफलक्स सबसे मौलिक और जटिल सेलुलर कार्यों में से एक है और कई रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है । एटीपी प्रेरित कैल्शियम का तांता, P2X7 चैनल के लिए एक क्लासिक माप के रूप में/ताकना समारोह, P2X7 रिसेप्टर्स के सही समारोह को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं, के रूप में एटीपी भी P2Y रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए intracellular कैल्शियम जारी कर सकते हैं. इस मामले में, बेरियम के बजाय कैल्शियम का उपयोग करने के लिए एक बेहतर धनायन हो सकता है के रूप में अपनी आमद यूनिडायरेक्शनल16है । कैल्शियम की आमद में P2Y रिसेप्टर्स से योगदान को अंतर करने के लिए, जहां 1 मिमी EDTA या एथिलीन ग्लाइकोल-बीआईएस (β-aminoethyl ईथर)-N, n, N ′, N′-tetraacetic एसिड (EGTA) के बजाय केसीएल2 के माध्यम से कश्मीर में जोड़ा जाता है इस में इस्तेमाल किया जा सकता परख.

इस प्रोटोकॉल को भी आसानी से अंय सेल प्रकार के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है और वैकल्पिक आयन चैनल रिसेप्टर्स या रिसेप्टर्स की कार्यक्षमता की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है कि phagocytosis में भाग लेते हैं । इस विधि भी एक समय मॉड्यूल के बिना एक प्रवाह cytometry मशीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, फैगोसाइटोसिस assays प्रदर्शन किया जा सकता है जहां YG मोती जोड़ रहे है 7-8 मिनट पारंपरिक प्रवाह cytमिति द्वारा विश्लेषण से पहले । ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं रखो और लगातार उंहें घूमता । यह वास्तविक समय जानकारी प्रदान नहीं करेगा, लेकिन मतलब अंतिम प्रतिदीप्ति में अंतर अभी भी P2X7 रिसेप्टर्स की कार्यक्षमता के बारे में शोधकर्ता को सूचित करेंगे ।

एक दवा लक्ष्य21,22 के रूप में या यहां तक कि एक दवा वितरण मार्ग के रूप में P2X7 रिसेप्टर्स में ब्याज23,24 तेजी से बढ़ रहा है, और इस रहस्यमय रिसेप्टर का अध्ययन करने के लिए तरीकों को लगातार अनुकूलित किया जाना चाहिए और पर सुधार करने के लिए इन अध्ययनों की सुविधा । इस प्रोटोकॉल के तरीके कि वयस्क तंत्रिका संतति कोशिकाओं में P2X7 समारोह का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है रूपरेखा, और यह आशा व्यक्त की है कि न्यूरोजेनिक niches में P2X7 रिसेप्टर्स की एक बड़ी समझ को प्राप्त करने स्ट्रोक के उपचार में प्रगति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और अंय इस्कीमिक चोटों ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस शोध में उनके योगदान के लिए मारिया काशेर्मन और Xin हुआंग का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । यह काम M.W., T.C.L., और एमएल के लिए रेबेका एल कूपर मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC) से T.C.L. करने के लिए (५७११०० और १०४८०८२) और Baxter चैरिटेबल फाउंडेशन ( सिडनी, ऑस्ट्रेलिया). बीजी वर्गीज को ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (एआरसी) फ्यूचर फैलोशिप (FT120100581), एनएचआरसी परियोजना अनुदान (१०४८०८२, १०६१४१९ और ११२००९५) और विक्टोरियन सरकार के फ्लोरे संस्थान को प्रचालनात्मक अवसंरचना सहायता अनुदान द्वारा सहायता प्रदान की गई । एमएल एक चार्ल्स डी केल्मन, एमडी Postdoctoral पुरस्कार (२०१०) अंतरराष्ट्रीय रेटिना रिसर्च फाउंडेशन (यूएसए) से समर्थन किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A438079 Tocris 2972/10
ATP Sigma-Aldrich A2383
AZ10606120 Tocris 3323/10
bzATP Sigma-Aldrich B6396
Cytochalasin D Sigma-Aldrich C8273
FACSCalibur Becton Dickinson 
Fluo-8AM AAT-Bioquest 21080 Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully 
Fluoresbrite YG Microspheres  Polysciences Inc 17154-10 1.00 µm, yellow-green
Glutamine ThermoFisher Scientific 25030081 200 mM
HBSS ThermoFisher Scientific 14170112
Heparin Sigma-Aldrich H3149
NeuroCult Basal Medium Stemcell Technologies 5700 Mouse and rat
NeuroCult Proliferation Supplement Stemcell Technologies 5701 Mouse and rat
Oxidized ATP Sigma-Aldrich A6779
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 pluronic acid
Recombinant Murine EGF Peprotech 315-09
Recombinant Murine FGF-basic Peprotech 450-33
Tetramethylammonium Hydroxide Sigma-Aldrich T7505
Time Zero Module Cytek Biosciences
Tissue culture flasks BD Falcon (Corning) 353108 (T25), 353136 (T75) Blue vented screw cap
TrypLE Express Gibco 12604013
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher Scientific 25200056 with phenol red
UltraPure Ethidium Bromide ThermoFisher Scientific 15585011 10 mg/mL

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References

  1. Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
  2. Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
  3. Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64 (2017).
  4. Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
  5. Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
  6. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
  7. Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
  8. North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
  9. Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
  10. Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281 (2014).
  11. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  12. Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
  13. Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
  14. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
  15. Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89 (2011).
  16. Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry - Recent Perspectives. , (2012).
  17. Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
  18. Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
  19. Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
  20. Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
  21. Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
  22. Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
  23. Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
  24. Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).

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विकासात्मक जीवविज्ञान निर्गम १४६ P2X7 रिसेप्टर्स फ्लो साइटोमेट्री कैल्शियम प्रिन्जिक सिग्नलिंग फैगोसाइटोसिस पोरे फॉर्मेशन न्यूरल प्रजनक कोशिकाएं
वास्तविक समय लाइव सेल फ्लो Cytometry कैल्शियम का तांता, ताकना गठन की जांच करने के लिए, और P2X7 रिसेप्टर्स द्वारा वयस्क तंत्रिका प्रजनक कोशिकाओं में Phagocytosis
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Leeson, H. C., Chan-Ling, T.,… More

Leeson, H. C., Chan-Ling, T., Lovelace, M. D., Brownlie, J. D., Weible II, M. W., Gu, B. J. Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (146), e59313, doi:10.3791/59313 (2019).

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