Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59314
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,5, 3, 1,6, 3, 3
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים עבור חלקיק יחיד מעקב וניתוח תמונות המאפשר הערכה כמותית של דיפוזיה מקדמים, סוגי תנועה וגדלי אשכול של חלקיקים אחד שזוהה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ פרוטוקול.

Abstract

חלקיק מעקב על רצף וידאו וניתוח האחורי של מסלולים שלהם היא כיום פעולה נפוצה במחקרים ביולוגיים רבים. באמצעות הניתוח של קרום התא קולטן אשכולות כמודל, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור משימה זו ניתוח התמונה באמצעות פיג'י (ImageJ) ו- Matlab שגרות: 1) מגדירים אזורים מעניינים ומעצבים את מסכות המותאמים לאזורים אלה; 2) לאתר את חלקיקי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ וידאו; 3) לנתח את מאפייני דיפוזיה והעוצמה של הרצועות. ניתוח כמותי של מקדמי דיפוזיה, סוגי תנועה וגודל האשכול מתקבל על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, עיבוד תמונה מספק כלי חשוב כדי לקבוע באופן אובייקטיבי dynamics החלקיקים ואת ההשלכות של שינוי תנאים סביבתיים. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורט לניתוח של תכונות אלה. השיטה המתוארת כאן לא רק מאפשר זיהוי מעקב מולקולה בודדת, אבל גם ממכן הערכת פרמטרים דיפוזיה לרוחב-קרום התא, מסווג את סוג המסלול, מאפשר ניתוח מלא ובכך להתגבר קשיים לכימות בגודל נקודה לאורך המסלול כולו שלו-קרום התא.

Introduction

חלבוני ממברנה שמוטבע על שכבה ליפידית הן בתנועה מתמדת עקב פיזור תרמי. הדינמיקה שלהם חיוניים כדי לווסת את התגובות התא, כפי האינטראקציות הבין-מולקולרי לאפשר היווצרות מתחמים להשתנות בגודלו מונומרים כדי oligomers ולהשפיע על יציבותו של איתות תסביכים. שחקרתי את מנגנוני שליטה חלבון דינמיקה היא לפיכך אתגר חדש ב ביולוגיה של התא, הדרושים כדי להבין את האות התמרה חושית מסלולים וכדי לזהות פונקציות תא בלתי צפויות.

פותחו מספר שיטות אופטי ללמוד אינטראקציות אלה החיים תאים1. בין אלה, מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה, שפותחה בשנות ה-80 המוקדמות, מאפשר חקר אינטראקציות מולקולרית ליד או מאוד את קרום התא2. ללמוד פרמטרים דינמיים של מסלולים חלבון ממברנה המתקבל TIRF נתונים בתאים חיים, חלקיק בודד שיטת (SPT) מעקב נדרש. למרות מספר אלגוריתמים זמינים עבור זה, אנו כעת להשתמש לאלה שפורסמו על ידי Jaqaman et al.3 המטפלות הטרוגניות תנועה של חלקיקים בשדה החלקיקים צפופים על-ידי קישור חלקיקים בין מסגרות רצופים כדי להתחבר למסלול וכתוצאה מכך מקטעי לתוך מסלולים מלאה (היעלמות זמנית החלקיקים). התוכנה לוכדת את החלקיקים מיזוג ופיצול הנגרמות כתוצאה צבירת ו דיסוציאציה אירועים3. אחד נתוני הפלט של תוכנה זו היא זיהוי של החלקיקים לאורך המסלול כולו על-ידי הגדרת את עמדותיהם X ו- Y בכל מסגרת.

ברגע זוהו חלקיקים, אנו מיישמים אלגוריתמים שונים כדי לקבוע את timelag קצר דיפוזיה מקדם (ד1-4)4,5. על-ידי החלת הניתוח8 רגע דרוג ספקטרום (MSS)7,6,, או על-ידי התאמת הערך 'alpha' על-ידי התאמה של ממוצע הריבועים הזחה (MSD) עקומת9, אנחנו גם לסווג את החלקיקים על פי סוג מסלול.

ניתוח בעוצמה ספוט בתמונות פלורסצנטיות הוא מטרה משותפת עבור מדענים שדה10,11. האלגוריתם הנפוץ ביותר בשימוש הוא מספר כביכול בהירות. שיטה זו בכל זאת אינו מאפשר זיהוי נכון מסגרת עוצמת ב חלקיקי השבר ניידים. לנו יש, לכן, שנוצר אלגוריתם חדש כדי להעריך אלו חלקיקים בעוצמות-המסגרת וכדי לקבוע את מצב צבירת שלהם. ברגע נקודות הציון של כל חלקיק מזוהים באמצעות תוכנת U-Track23, אנו מגדירים בעוצמתה בכל מסגרת מעל המסלול המלא, גם אם ניקח בחשבון את הרקע לתא בכל מסגרת. תוכנה זו מציעה אפשרויות שונות כדי לקבוע את עוצמת המקום והרקע תא לקניה, באמצעות חלבונים monomeric ו- dimeric ידוע גם הפניות, מחשבת את המספר המשוער של חלבונים בהחלקיק זוהה (גודל האשכול).

במאמר זה, אנו מתארים מדריך זהיר כדי לבצע את השלבים 3: 1) זיהוי ומעקב אחר חלקיקים בודדים לאורך וידאו של מיקרוסקופיית פלורסצנטיות באמצעות U-track; 2) מנתח את מקדם דיפוזיה מיידי (ד1-4) של החלקיקים כאלו וסוג התנועה (מוגבל, חינם או מכוונת) של חלקיקים עם מסלולים ארוכים על ידי MSS; 3) מדידת עוצמת ספוט לאורך הווידאו על-ידי קרינה פלואורסצנטית הרקע מוערך בכל מקום. כך מתאפשר הערכת גודל האשכול וזיהוי של השלבים photobleaching.

השימוש בפרוטוקול זה אינו דורש כישורים מיוחדים ניתן לבצע במעבדה כלשהי עם תרבית תאים, flow cytometry ומתקני מיקרוסקופ. הפרוטוקול משתמש ImageJ או פיג'י (הפצה של ImageJ12), U-track3והשגרה הוק עשה כמה לספירה (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track, אד הוק רוטינות לדרוס Matlab שניתן להתקין בכל מחשב תואם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת דגימות ביולוגיות

  1. לגדל תאים Jurkat בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% FCS, NaPyr וגלוטמין (RPMI מלאה). Electroporate Jurkat תאים (20 x 106 תאים/400 µL של RPMI 1640 עם 10% FCS) עם וקטור קולטן כימוקין מתויג-GFP monomeric (CXCR4-AcGFP, 20 μg) כדי לאפשר זיהוי שלו באמצעות מיקרוסקופ זריחה.
    הערה: זה אפשרי להשתמש בחלבונים פלורסנט monomeric אחרים כגון mCherry, mScarlet, וכו '.
  2. 24 שעות לאחר תרביות תאים לנתח בתאים cytometer זרימה כדי לקבוע תא הכדאיות וביטוי CXCR4-AcGFP.
  3. בחר את התאים לבטא רמות נמוכות CXCR4-AcGFP על-ידי התא מיון של GFP תאים חיובינמוך (איור 1), כפי נמוך לביטוי קולטן transfected נדרש TIRFM ניסויים על מנת להבטיח מעקב חלקיק יחיד לעקיבה בודדים מסלולים9.
  4. לכמת את מספר הקולטנים על פני השטח של התא.
    הערה: כמו לדוגמה13, קולטנים התווית על-ידי AcGFP ~ 8,500-22,000/תא, מקבילים ~ 2-4.5 חלקיקים/μm2.
  5. Resuspend תאים ממוינים RPMI מלאה, תקופת דגירה של פחות 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. צנטריפוגה תאים (300 x g, 5 דקות), resuspended אותם במאגר TIRF (HBSS, 25 מ מ HEPES, FCS 2%, pH 7.3).
    1. צלחת על מנות תת microwell 35 מ מ (2-3 x 105 תא/צלחת) מצופה fibronectin (20 μg/mL, 1 h, 37 מעלות צלזיוס), נוכחות או היעדרות של ליגנד המתאים (קרי, CXCL12, 100 ננומטר, 1 h, 37 ° C). דגירה תאים (20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) לפני ייבוא תמונות.
  6. ביצוע ניסויים באמצעות מיקרוסקופ TIRF, מצוידים עם מצלמה EM-CCD, 100 x שמן-טבילה אובייקטיבי (HCX PL APO 100 x / 1.46 NA), 488 ננומטר דיודת לייזר. המיקרוסקופ מאפשר בקרת טמפרטורה הדגירה עם CO2. לאתר ולהתמקד תאים עם השפם להתמקד בסדר וגסים, באמצעות שדה בהיר כדי למזער את ההשפעות photobleaching. כוונון פוקוס בסדר במצב TIRF להשתמש לייזר נמוך עוצמה, מספיקים לצורך זיהוי חד-חלקיקים או לגרום השפעות photobleaching (עוצמת הלייזר 5%, 28 μW).
  7. לרכוש סרטים (רצפי תמונות) של 50 s למזער את מרווח הזמן בין מסגרות. חדירה של השדה evanescent צריך להיות 70-90 ננומטר של עומק. שמור לסרטים שנרכשו עבור כל תנאי ניסיוני בשם ".lif" (video.lif).
    הערה: סרטים בדוגמה המתוארת היו רכשה 49%-עוצמת הלייזר (2 mW) עם מועד החשיפה של 90 ms, מרווח זמן של 98 ms, עבור 49 s (מסגרות 500). חדירה של הגל evanescent שנבחר היה 90 ננומטר.

2. מבחר תמונות ויצירת מסיכות

  1. כל ניסיוני תנאי (video.lif), צור תיקיה חדשה (VideoName) חייבים להכיל תיקיות שונות עבור כל סדרה. כל תיקיה תכיל תיקייה "videoSeq" עבור תמונות וידאו ותיקיה "תוצאות" עבור התוצאות של הניתוח. ודא מבנה הקבצים ברגע זה הפעולות הבאות:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/videoSeq
    VideoName/Series1/תוצאות
    הערה: תגלי את קבצי .lif שונים מתקבלים עם כמה קטעי וידאו עבור כל תנאי טיפול (כלומר FN, FN + דנה). "video.lif" מקבילה input.lif קובץ הווידאו עם TIRF כל סרטים רכישות (סדרות) ביצע על המיקרוסקופ. "videoSeq" תיקיה תכיל מסגרות 500 של הסרט בו אנו מנתחים. תיקיית "תוצאות" יכיל כל הקבצים המתבררת מניתוח שבוצעה. במינוח מדויק ולוקליזציה של התיקיות שונים הם חיוניים עבור הפונקציה הנכון של האלגוריתם. שמות המודגשות ברשימה שלעיל קבועים (קרי, הם חייבים להיות נקרא כך כי אלה שמות המבוקש על-ידי קבצי ה-script). שמות לא באותיות מודגשות ניתן לשנות כדי לשקף ביצע הניסוי.
  2. פתח את הוידאו TIRFM (קובץ .lif) עם פיג'י או ImageJ על-ידי גרירה ושחרור של הקובץ על שורת התפריטים פיג'י, לחץ על בסדר כדי לייבא את הקובץ lif באמצעות BioFormats (משלים איור 1).
  3. בחר את הסידרה כדי לעבד ולחץ על OK (איור משלים 2A). לעיצוב מסכה לניתוח של הוידאו, לייבא גם תמונה רב-ערוצית עם הן שונות (בדוגמה, סדרה 1 הוא רב-ערוצית סדרה 2 וידאו המקביל). הוידאו (וגם את רב-ערוצית) אמורה להיפתח כמו אוסף ImageJ. בדוגמה (איור משלים 2B), התמונה היא בצד השמאל ואת הוידאו הוא בצד הימין.
    הערה: אם יצירת מסיכה עבור הווידאו אינה דרושה, ללכת צעד 2.5.
  4. ליצירת מסיכה. צור תמונה אחת עם הערוצים שימושי עבור העיצוב של המסכה. במקרה זה, ערוצים מעניינים הם אלה אדום, ירוק, אפור.
    1. לפצל את הערוצים מהתמונה רב-ערוצי (איור משלים 3A): בחרו תמונה בסרגל בתפריט ולחץ צבע | לפצל ערוצים. הערוצים השונים יראה כמו תמונות נפרדות (איור משלים 3B).
    2. למזג שוב את הערוצים שלוש בתמונה אחת (איור משלים 4A): בחרו תמונה בסרגל ובחר צבע | מיזוג ערוצים. בחר את הערוצים ולחץ OK (איור משלים 4B). תמונה חדשה לא מוערם יהיה שנוצר (4C איור משלים).
    3. לסנכרן את שני חלונות באמצעות הכלי Windows לסנכרן (איור משלים 5A): בחרו ' ניתוח ' בסרגל התפריט | כלים | סינכרון של Windows. חלון חדש עם אפשרויות סינכרון תמונות יוצגו (איור משלים 5B).
    4. עם שני החלונות מסונכרן (רק וידאו אם אין תמונה רב-ערוצית הקשורים), באותו האזור בחלונות שני יכול להיחתך. צייר האזור עניין בעזרת הכלי בחירה מלבנית של תפריט צף ImageJ. בחר תמונה בשורת התפריט, בחר חיתוך (איור משלים 6A). שתי תמונות החתוכה תציג בנפרד (איור משלים 6B).
    5. לא מסונכרן בשני חלונות (איור משלים 6B) על ידי לחיצה על לחצן ביטול סינכרון הכל מנהל הסינכרון של Windows .
  5. אם מסכה לא נוצרה כמו שלב 2.4, לצייר האזור עניין בעזרת הכלי בחירה מלבנית של תפריט צף ImageJ.
  6. שמירת הוידאו רצף תמונות ב מדריך videoSeq תחת ספריית וידאו המקביל (משלימה איור 7 א): בחר קובץ בשורת בתפריט ולחץ שמירת | התמונה רצף לשנות את התוויות עבור הרצף וידאו כמו video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif, (איור משלים 7 ב): בתיבת שם , שינוי שם כמו וידאו ולחץ על אישור. הרצף חייב להיות לבד בספריית שלה כדי לשמש בהצלחה על ידי U-track.
    הערה: אם לא בעיצוב מסיכה עבור הוידאו, ללכת צעד 2.8.
  7. עיצוב מסכה. בחר בתמונה רב-ערוצי ולפתוח את התוסף פילוח עורך (איור משלים 8A): בחר תוספים בשורת התפריט, בחר באפשרות פילוח | פילוח של עורך. להוסיף ולשנות את התוויות של פילוח לפי הצורך על-ידי לחיצה ימנית על התוויות של העורך פילוח (איור משלים 8 ב', ג).
    1. בחרו בכלי הבחירה המתאימה בתפריט צף ImageJ (הנה, תשתמש ביד חופשית), בחר בתווית (ירוק) ועיצוב קודם המסכה החיצוני (איור משלים 9A). לאחר תוכנן, לחץ על + כפתור הבחירה באפשרות של חלון ללא הפרדות צבע , ואת המסכה שנבחרו יוצגו על הצופה (איור משלים 9A). חזור על שלב זה עם תוויות הבא (פנימי, באדום) (איור משלים 9B).
      הערה: לאחר עיצוב המסכה עבור התוויות פנים וירוק, המסכה החיצוני לכבוש את שאר התמונה.
    2. מסכות מוצפנים בתמונה כמו אזורים 0, 1, 2,... על-פי הסדר של המדבקות לחלון תוויות RGB. כאשר כל המסיכות עבור התוויות שונות מיועדות, לשמור את המסכה באותו שם כמו הוידאו, השם mask.tif (איור משלים 9C): בחר קובץ בשורת ובחר שמירת | Tiff..
      הערה: המסכות שנבחר המעולים חישוב מקדמי דיפוזיה, סיווג של מסלולים (ראה שלב 4.2).
  8. בדוק מבנה הקבצים ברגע זה הפעולות הבאות:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/mask.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Series1/תוצאות
    הערה: Mask.tif היא תמונה עם המסכה כמתוכנן ב- 2.4 שלבים ו- 2.7. Video*.tiff הוא הווידאו כפי שנשמר ב- 2.6 שלב. לעיל, בעיצוב מודגש השמות ברשימה לעיל קבועים, כלומר, הם חייבים להיות נקרא כך כי אלה שמות המבוקש על-ידי קבצי ה-script. שמות לא באותיות מודגשות ניתן לשנות כדי לשקף ביצע הניסוי.

3. מעקב אחר החלקיקים

  1. מעקב אחר כל החלקיקים ראו קטעי וידאו נבחרים באמצעות U-track.
  2. פתח Matlab, הוסף מדריך U-track לנתיב באמצעות להגדיר נתיב | להוסיף עם תיקיות משנה אפשרות בתפריט. שמור את הנתיב כך בעתיד הוצאות להורג של Matlab U-track נמצאת בנתיב. הגדרת נתיב זה צריך להיעשות רק פעם אחת.
  3. שינוי ספריית העבודה לספריה המכילה את הסדרה כדי להיות מנותח. הפעל U-track על-ידי הקלדת המסוף (משלימה איור 10) movieSelectorGUI ולחצו על enter. חלון בחירת הסרט יהיה פתח (איור משלים 11 א).
  4. לחץ על לחצן הסרט החדש , חלון הסרט מהדורה יופיע (איור משלים 11B).
  5. לחץ על הוסף ערוץ כדי לבחור את הספרייה עם הוידאו (VideoName/Series1/וידאו) ולמלא את הפרמטרים מידע של הסרט. הגדר את ספריית הפלט עבור התוצאות של U-track תוצאות (videoName Series1 תוצאות).
    הערה: ניתן להשיג את הפרמטרים מידע הסרט המיקרוסקופ ותנאי רכישה.
  6. הקש על הגדרות מתקדמות הערוצים ולמלא את הפרמטרים הקשורים הרכישה. בדוק ערכי הפרמטרים של הדוגמה (11C איור משלים).
  7. הקש על להציל בחלון הגדרות מתקדמות ערוץ , שמור על החלון סרט מהדורה . התוכנית יבקש אישור לכתוב את קובץ הנקרא movieData.mat על הספריה תוצאות . לאשר.
  8. לאחר יצירת הסרט, הקש על המשך בחלון הבחירה סרט. U-track ישאל על סוג האובייקט כדי להיות מנותח. בחר יחיד-חלקיקים (משלימה איור 12). מהחלון לוח הבקרה יופיע (איור משלים 13A).
    1. בחר את הצעד הראשון שלב 1: זיהוי , לחץ על הגדרה. חלון הגדרת תערובת-דגם מתאים לפי עקומת גאוס יופיעו (איור משלים 13 ב'). בדוגמה, "ערך אלפא לשם השוואה עם רקע המקומי" מוגדרת 0.001 ו "רולינג-חלון זמן ממוצע של" 3 (איור משלים 13 ב').
    2. לחץ על החל בחלון הגדרות תערובת-דגם מתאים לפי עקומת גאוס , להפעיל לוח הבקרה. עם התצורה משלים באיור13, פועל רק השלב זיהוי . שלב זה לוקח כמה דקות (2-5). בדקו את התוצאות על-ידי לחיצה על לחצן תוצאה של שלב 1 (זיהוי, משלימה איור 14).
      הערה: כמתואר לעיל, הסרט מציג עיגולים אדומים על החלקיקים שזוהו. אם אין עיגול אדום מוצג, ואז צעד זה לא פעל כראוי.
  9. לבצע את הזיהוי של רצועות, כלומר, מיזוג החלקיקים שאותרו בשלב הקודם לתוך רצועות המתפרסים על מסגרות מרובות. . זה שלב 2: מעקב אחר של U-track ההגדרות שלו חייבת להיות מוגדרת כמוצג באיור משלימה 15A-C. עלות שלב 2 פונקציה הגדרות עבור מסגרת-על קישור של סגירת הפער, מיזוג ופיצול בדוגמה מוצגים איור משלים 15 ב ו- Cבהתאמה.
  10. לאחר הגדרת הפרמטרים עבור שלב 2, הקש הפעל לוח הבקרה ופועל רק בשלב 2 (16 איור משלים).
  11. לבצע מעקב אחר ניתוח, שלב 3. להגדיר את ההגדרות כפי שמוצג משלימה איור 17 (לוח נכון). לאחר מכן, הקש החל הפאנל של הגדרה-Motion Analysis ולאחר לרוץ בתוך פקד לוח-U-המסלול. שלב זה לוקח כמה שניות.
  12. ודא עם הלחצן תוצאה של שלב 3 כי התהליך זיהה כראוי כל המסלולים. לעשות זאת, לחץ על הצג מספר רצועה של החלון ' אפשרויות סרט ' ובדוק מסגרת על-ידי מסגרת כי כל מסלול כבר זיהו נכונה (משלימה איור 18). ידנית להוסיף החלקיקים כאלו שאינם חלקיקים אמיתי.
    הערה: אם זו בחירה ידנית לא נעשה, בחירה אוטומטית חלש יכול להתבצע מאוחר יותר בעת חישוב מקדם דיפוזיה (ראה שלב 4).

4. חישוב של סיווג של מסלולים והקבוע דיפוזיה

  1. ודא כי כל התסריטים מופעלים מהספריה של הוידאו שעוברים ניתוח (בדוגמה, VideoName/Serie1).
  2. לקרוא את כל מסלולי לחישוב מקדמי דיפוזיה באמצעות הנפקת ב- Matlab מסוף הפקודה: trajectories=readTrajectories(0.1), איפה 0.1 הזמן בשניות בין שתי מסגרות רצופים (מרווח זמן, שמוצג בחלונית סרט מידע, משלימה איור 11B).
  3. הכללת מסלולים המתאימים כתמים/מסלולים שזוהתה באופן שגוי. תן רשימה של המקומות כדי לא לכלול. למשל, כדי לא לכלול נקודות 4, 5 ו- 28, הקלד: מסלולים = readTrajectories (0.1 [4, 5, 28]).
  4. חישוב מקדמי דיפוזיה מיידי לכל אחד מהשירים של תא זה. במקרה זה, לחשב את מקדם דיפוזיה של פער-זמן = 4, שנקרא D1-4. לעשות זאת, הפעל במסוף Matlab את הפקודה: D = calculateDiffusion (מסלולים, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha') איפה מסלולים מסלולים שהושג בשלב 3, 113.88e-3 הוא גודל פיקסל תמונות שנרכשו במיקרון, 0.0015 חסם עליון עבור דיפוזיה המקדמים של חלקיקים משותק נמדד /s2מיקרומטר, ו 'alpha' הוא המודל מצויד כמוסבר להלן.
    הערה: כאשר באמצעות מצלמה מהירה יותר צורך מסגרות נוספות כדי לחשב את הפרמטר דיפוזיה להגדיל אותו, למשל ל 20, מאת D = calculateDiffusion (מסלולים, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', ', 20). הפרמטר מחרוזת לפני 20, בדוגמה שלעיל, ', הוא הסיומת שיתווספו קבצי הפלט. סיומת זו עשוי לשמש כדי להבדיל ניתוחים שונים.
  5. להתאים את MSD עם פונקציה שונה על-ידי קריאה הפונקציה calculateDiffusion שוב עם מצב התאמה שונים ('מוגבל', 'ללא' או 'ביים'). בדוגמה זו, 'מוגבל': D = calculateDiffusion (מסלולים, 113.88e-3, 0.0015, 'מוגבלת').
  6. להשיג את תוצאות המדידה עבור המודל מכוונת, כפי שמוצג באיור20 משלימה.
  7. לפרק את מסלולי לתוך מסלולים קצרים וארוכים. השתמש בפקודה: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) איפה 50 האורך המינימלי במסגרות של מסלול כדי להיחשב זמן (בדוגמה).
  8. ללמוד מסלולים קצרים באמצעות ההליך הולם אותו המתוארים שלב 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'ביים', 'קצר'). ניתוח קצר, חריג מסלולים עם הפקודה: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', 'קצר').
  9. לנתח מסלולים ארוכים כדי לסווג את הסוג של תנועה דרך שלהם רגע דרוג ספקטרום (MSS)7. הפקודה: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'זמן') מציג הניתוח במסך ויוצרת קובץ בשם trajectoryClassification > < סיומת. txt מדריך results\TrackingPackage\tracks.

5. חישוב של אשכול Ssize דרך צפיפות החלקיקים.

הערה: ודא כי כל התסריטים מופעלים מהספריה של הוידאו שעוברים ניתוח (בדוגמה המוצגת, VideoName/Serie1).

  1. לנתח את האינטנסיביות של כל חלקיק לאורך מסלולם. לעשות זאת, הפעל את ה-script על-ידי הקלדת במסוף Matlab: analyzeSpotIntensities שלוקח כמו קלט את מסלולי מחושב על ידי U-track בסעיף הראשון. בצורתו הבסיסית ביותר, פשוט לקרוא את התסריט בלי שום ויכוח מהספריה של הוידאו שעוברים ניתוח (בדוגמה המוצגת, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). להגדיר התנהגות בסיסית זו בדרכים שונות על-ידי מתן ארגומנטים לקובץ ה-script כמו: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, Value1, ' Arg2´, Value2). טיעונים עם ערכי המשתנה המקביל שלהם ('ArgN´, ValueN) מפורטים.
    1. ('spotRadius´, 1)
      לנתח את עוצמת קרינה פלואורסצנטית באמצעות את spotRadius של 1 פיקסל (כברירת מחדל) המתאים מדבקה בגודל 3 x 3 מרוכז בנקודה ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      הערה: במשך תקופה של 5 x 5 מרוכז בנקודה, לבחור spotRadius 2, ועוד.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      אם ארגומנט זה צוין (true, ערך של 1), לנתח רק את מסלולים שמתחילים המסגרת הראשונה של הוידאו. פעולה זו שימושית לנתח שליטה תמונות (כברירת מחדל 0, שווא).
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      אם ארגומנט זה מוגדר כ- 0 (false), ואז שמור הקוארדינטה של המקום המסגרת הראשונה עבור כל המסגרות (זה שימושי עבור משותק כתמים). אם הארגומנט מוגדרת ל- 1 (כברירת מחדל 1, נכון), אז במקום מתבצע לאורך הבאות וידאו נקודות הציון מחושב באמצעות U-track.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      כוללים את מסלול מספר מסלולים אלה נכללים 4.3 שלב (בדוגמה 4, 5, 28).
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      אם ארגומנט זה מוגדר כ- 1 (true), ואז לנתח את עוצמת במדבקה לסוף הווידאו (גם אם המסלול נעצר מוקדם יותר). הקואורדינטה של המקום הוא הקואורדינטה שעבר מסלול (אם trackTrajectory נכון) או הקואורדינטה הראשונה מסלול (אם trackTrajectory שווא). ארגומנט זה הוא false (0) כברירת מחדל.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      אם פרמטר זה מוגדר, אז נכון ידי קרינה פלואורסצנטית raw נמדדת בנקודה כל ההערכה של זריחה רקע באותו מקום (ראו להלן). ארגומנט זה הוא true (1), כברירת מחדל.
    7. ('meanLength´, מספר מסגרת)
      אם פרמטר זה מוגדר, במקום בעוצמה אומר נמדד בהאורך שצוין. סט 'meanLength', 20 כדי למדוד את עוצמת ספוט רשע על המסגרות הראשון 20. אם הארגומנט אינו מוגדר, אז עוצמת ספוט מחושבת ב המסלול כולו (כברירת מחדל, באורך מלא).
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      הגדר פרמטר זה כ- 1 (כברירת מחדל 0, שווא), כדי להתוות את הפרופיל בעוצמה לאורך במסגרות שונות, כמו גם הרקע שלהם.
      הערה: חלקות אלה שימושיים מאוד לזהות photobleaching, כפי שמוצג באיור 21 משלימה. עבור כל נתיב, השגרה מנתחת באופן אוטומטי אם זה אפשרי כי היו photobleaching. פעולה זו מתבצעת על-ידי השוואת את ערכי העוצמה עם t של סטודנט במסגרות N הראשונה והאחרונה לאורך הנתיב. כברירת מחדל, N 10, אך ניתן לשנות ערך זה באמצעות הארגומנט ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, ערך)
      הגדר פרמטר זה כדי לקבוע את הרקע של כל מקום. זה יכול להיעשות במספר דרכים, מי מהם להשתמש וניתן הנבחר "ערך המשתנה":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        השתמש בערך זה כדי לזהות באופן ידני את הרקע עבור הווידאו. אפשר לבחור 8 נקודות המסגרת הראשונה של הוידאו. ניתוח תיקון סביב נקודות אלה לאורך הווידאו, quantile 95% של כל עוצמות אלו נבחר כמו עוצמת רקע עבור כל נקודות.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        השתמש בערך זה כדי לזהות באופן ידני את הרקע עבור כל מסגרת. לבחור 8 נקודות עבור כל נקודה של כל מסגרת. זוהי משימה זמן רב אבל זה נותן הרבה שליטה למשתמש. Quantile 95% של עוצמות בכתמים אלו נבחר כמו עוצמת רקע בשביל התפקיד במסגרת זו.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        שימוש ערך זה כדי לחשב את הרקע של כל המקום המשוער של 8 נקודות ממוקם במעגל סביב הנקודה עם רדיוס נשלט על-ידי הארגומנט ' backgroundRadius´ (כברירת מחדל, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        השתמש בערך זה כדי לחשב את הרקע עבור כל מסגרת תחילה באיתור התא וידאו ולאחר מכן ניתוח עוצמות של התא בכל מסגרת (משלימה איור 22).
        הערה: הרקע נבחר הערך אפור quantile נתון של התפלגות זו (כברירת מחדל 0.5 (= 50%), אף על פי פרמטר זה יכול להיות נשלט באמצעות הארגומנט ' backgroundPercentile´, ערך זה ניתן להגדיר גבוה יותר, למשל, 0.9 (= 90%) אם רוצים רוב התא כדי להיחשב כרקע. כדי לסייע בזיהוי של התא, מצביעים על אשר הוא הערך המרבי רקע צפוי לאורך בין המסגרות באמצעות הארגומנט ' maxBackground´ (למשל, אצל כל קטעי וידאו שנותחה, הערך רקע מעבר בדרך כלל לעולם 6000)13. כברירת מחדל, אפשרות זו מוגדרת ל- 0, כלומר עזרה זו לא משמש כברירת מחדל. רואים שזה הגילוי תא והאזור שבחרת עבור הערכת רקע על-ידי הגדרת הארגומנט ' showImages´ ל- 1 (לעצור ההוצאה להורג בכל עת על ידי לחיצה על CTRL-C).
  2. לאסוף את המידע דיפוזיה ועוצמה עבור כל מסלולי מחושבת באופן של 4 שלבים ו- 5.1, בהתאמה, שימוש (gatherDiffusion.AndIntensity). לאסוף רק את המידע דיפוזיה ועוצמה עבור מסלולים קצרים. לעשות זאת, השתמש את הסיומות בשימוש שלב 4.7 וסוג: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) בו ' Short´ הוא הסיומת בשימוש שלב 4.7.
  3. לאסוף ברגע ספקטרום קנה המידה והקלדה של עוצמת informationby: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') איפה 'זמן' הסיומת משמש שלב 4.7. סיכום של כל הקבצים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מוצג באיור2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השימוש של פרוטוקול זה מאפשר את מעקב אוטומטי של חלקיקים זוהה סרטים מיקרוסקופ פלורסצנטיות, הניתוח של המאפיינים דינמי שלהם. בתחילה, התאים הם transfected עם החלבון מצמידים fluorescently לבצע אחריהם מעקב. הרמה המתאימה של קולטנים מציג על פני התא, המאפשר ש-SPT מתקבל על ידי התא מיון (איור 1). התאים שנבחרו הם נותחו על ידי מיקרוסקופ TIRF שיוצר סרטי וידאו בתבנית שניתן ללמוד את הכלים המתוארים פרוטוקול זה (משלימה Video 1).

לא יכול להיות מנותח ישירות קטעי וידאו שנוצר, מסגרות עצמאיות של כל וידאו נדרשים. השימוש ImageJ יוצרת קבצים שניתן לפרשם שימוש בתוכנת Matlab כגון מסגרות וידאו בתבנית .tiff או מסיכות. U-track עוקב אחר החלקיקים ראיתי את הוידאו שנבחר ושומר את המידע בקבצים Matlab (.mat) (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), ראה איור 2.

כפי שמוצג באיור2, חישוב מקדמי דיפוזיה והסיווג של מסלולים פקודות, יוצרת קבצים שונים (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, וכו '). המידע הכלול בקבצים אלה מנוהלות בצורה הטובה ביותר באמצעות תוכנת Excel ופריזמה. מידע ניתן להשיג ניתוח זה כולל:

  1. האחוז של כתמים משותק. באפשרותך להשתמש בתור הפניה של חלקיקים משותק: אחוזון 95% D1-4 ערכים שהושג (1) של חלקיקים בודדים בתאים קבוע ו/או (2) של חלבון פלואורסצנטי מטוהרים המצורפת coverslips (איור 3 א).
  2. אחוז מסלולים ארוכים (> 50 מסגרות) (איור 3B).
  3. סוג התנועה של מסלולים ארוכים: ביים, ללא תשלום, מוגבל (איור 3C).
  4. מקדם דיפוזיה (ד1-4) של חלקיקים ניידים בתאים מטופלים עם גירוי אחר (איור 4A).

שלב 5 של הפרוטוקול מנתח עוצמות כל חלקיק לאורך המסלול. התסריט analyzeSpotIntensities יודפסו על המסך כל מידע מנותח. כל מקום מסגרת, קובץ ה-script מראה הקוארדינטה של המקום באותה המסגרת (x, y) ביחידות פיקסלים, רקע זריחה (k0), עוצמת ספוט raw בהתיקון 3 x 3, עוצמת המתוקן של רכבת ישראל (מחושבת עוצמת raw מינוס שלה רקע), הערך המרבי של עוצמת שנצפתה התיקון ולאחר מספר האזור בתוך המסיכה איפה המקום הזה הינו ממוקם על מסגרת זו. להלן דוגמה של סוג פלט המיוצר

ספוט = 43 מסגרת = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
k0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

כל המידע מאוחסן קובץ יומן רישום (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) ו לטבלה ניתן לקרוא מ- Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). לאחר ניתוח כל נקודה, קובץ ה-script מדפיסה את העוצמה הממוצעת לאורך המסלול, האזור שלטון בתוך המסיכה

ספוט = 43
meanCorrectedSpotIntensity לאורך מסגרות = 4762.303
אזור שלטון = 3

מידע זה מאוחסן קובץ יומן הרישום לעיל ו לטבלה ניתן לקרוא מגיליון (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). כדוגמה, כלומר עוצמות ספוט (msi) עבור כל חלקיק לאורך מסלולם בתאים מגורה עם תנאים שונים מוצג באיור 4B. עכשיו אנו עשויים להשתמש במידע זה כדי להעריך בערך בגודל של האשכול פלורסנט. כמו אומר של מקום בעוצמה המתוקן קשורה עם מספר החלבונים פלורסנט הנוכחי, בנקודה זו, זריחה של מונומר ניתן למדוד באמצעות ניסוי דומה אך בלתי תלויות, ישירות לחשב את מספר הקולטנים לכל החלקיקים. התפלגות השכיחויות של קולטן מספר לכל חלקיק באמצעות כפי להפנות את העוצמה של החלבון monomeric לידי ביטוי לאותם התאים מוצג באיור 4C.

אסוף דיפוזיה והפקודה בעוצמה ליצור שני קבצים: אחד נקרא diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt, שנקרא אחר log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt בספריה תוצאות / TrackingPackage/מסלולים. שני הקבצים מכילים 1) האינדקס ספוט, מקדם דיפוזיה 2), 3) עוצמת ומספר אזור 4) בתוך המסיכה. גיליון אלקטרוני ניתן לקרוא קבצים אלה.

באופן דומה, לאסוף מסלול סיווג עוצמת הפקודה תיצור שני קבצים אחד בשם trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt , אחר log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt , מדריך תוצאות/TrackingPackage/רצועות. הראשון מכיל 1) האינדקס ספוט, 2) סוג תנועה, מקום 3) ברגע הראשון, 4) את העוצמה, 5) ד1-4 ו 6) מספר האזור בתוך המסיכה. ניתן לקרוא את הקובץ Excel.

סיכום של כל הקבצים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מוצג באיור2. ניתוח אחרים שניתן לבצע באמצעות פרוטוקול זה כולל השוואת הפרמטרים דינמי קטן לעומת המקומות גדול יותר, דהיינו מונומרים vs oligomers, וריאציות על פרמטרים דינמיים אלה המושרה על ידי ליגנדים, מעכבי, ממברנה הרכב, שינוי של איתות המסלולים, וכו '. ניתוח מלא של התנהגות CXCR4 בתגובה שלה ליגנד CXCL12 בתנאים שונים ניסיוני בוצעה באמצעות פרוטוקול זה13.

Figure 1
איור 1 : מיון תא. ביטוי של GFP בתאים Jurkat transfected עם CXCR4-AcGFP לפני ואחרי מיון תא. תא לבטא רמות נמוכות של GFP (GFPנמוך) נבחרה, המועסקים לניסויים TIRF.

Figure 2
איור 2 : סיכום של הקבצים שנוצרו. האיור מציג את כל הקבצים שנוצרו באמצעות השגרה Matlab המתואר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : סיווג של מסלולים- מספר סוגים שונים של מסלולים המתאימים תאים שטופלו גירויים שונים. (א) אחוז כתמים משותק, (B) אחוז מסלולים ארוכים וסוג (C) של תנועת מסלולים ארוכים.

Figure 4
איור 4 : מקדם דיפוזיה, כלומר עוצמות ספוט ומספר של קולטני לכל החלקיקים. (א) חלוקת הערכים המקדמים (ד1-4) דיפוזיה קצר עבור כל נקודה בתגובה לגירויים שונים (I, II, II ו- IV). הקו האדום מייצג את הערך החציוני עבור D1-4. (B) כלומר עוצמות ספוט (msi) ערכים עבור כל נקודה לאורך שלה קודם 20 מסגרות בתגובה לגירויים שונים (I, II, II ו- IV). הקו האדום מייצג את הערך בעוצמה רשע (SD). האחוז (C) של קולטנים/חלקיקים כמו שחולצו מהתפלגות בעוצמה של החלקיקים בודדים, לוקחים כמו סל רוחב בערך העוצמה חלבון monomeric. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה איור 1: פתיחת קובץ TIRFM פיג'י או ImageJ. האפשרויות המופיעות על החלון ביו-תבניות בעת גרירה ושחרור סרטון .lif. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות. 

משלימה איור 2: בחר סדרה. תמונות להציג וידאו .lif. (א) חלון המאפשר בחירה של הסדרה כדי להיות לנתח, כולל תמונות רב-ערוצי. (B) תוצאה דוגמא סדרת בחירה, לרבות רב-ערוצית (משמאל), המקביל וידאו (מימין). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות. 

משלימה איור 3: פצל ערוצים. (א) בחלון לכידתו של הפקודות ImageJ הדרושים עבור פיצול ערוצים של רב-ערוצית ו- (B) דוגמה תוצאה של הערוץ לפצל. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה באיור 4: מזג ערוצים. (א) מיזוג ערוצים שונים בתמונה אחת. (B) ערוץ הבחירה עבור המיזוג. (ג) תוצאה דוגמא המיזוג ערוץ. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 5: סנכרן windows. (א) לשפות אחרות בתפריט ImageJ של הפקודות הדרושות עבור סינכרון תמונה וחלון וכתוצאה מכך (B). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 6: בחר את האזור בעל עניין. (א) מבחר של החלון עניין באמצעות הכלי בחירה מלבנית (B) תוצאה של היבול התמונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 7: לשמור את הווידאו. שמור את האזור עניין רצף תמונות ופרמטרים עבור שמור כחלון רצף תמונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 8: פילוח. (א) פתח התוסף עורך פילוח בתפריט תוספים של ImageJ. (B) להוסיף תוויות/חומרים עבור פילוח. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 9: עיצוב מסכות. (א) מבחר של תוויות המתאימים, ההגדרה של מסיכת ירוק. (B) מבחר של המסכה האדומה. דוגמה מסכות שני המייצגים שתי תוויות. (ג) שמור את המסכות .tiff. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 10: ספריית עבודה Matlab. מבחר של הספריה נכונה המכילה את הסידרה כדי לנתח. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 11: U-track התפריט הראשי. (א) בחירת הסרט, מהדורת הסרט (B) ו- (ג) ערוץ הגדרות תפריטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 12: בחר את סוג האובייקט כדי לעקוב אחר. בחר מעקב של חלקיקים בודדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 13: הזיהוי של חלקיקים. (א) U-track, לוח הבקרה. (B) דוגמה הגדרות עבור הגילוי של חלקיקים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 14: דוגמה של תוצאות לגילוי חלקיקים. חלונות שונים הכוללים מציג תפריט, תפריט אפשרויות הסרט, הסרט. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה באיור 15: תפריט מעקב. דוגמה של הגדרות. (א) מעקב, (B) הגדרת - קישור למסגרת ו- (ג) הפער נסגר, מיזוג ופיצול תפריטים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה באיור 16: דוגמה של תוצאות עבור חלקיקים מעקב. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 17: מעקב אחר ניתוח תפריט. דוגמה של הגדרות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 18: אימות של ניתוח מסלול. מסך מוצג לאחר ניתוח מסלול, כולל חלון וידאו מציג את החלקיקים זוהה של שירים המתאימים שלהם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 19: חישוב מקדמי דיפוזיה. היסטוגרמות המקדמים דיפוזיה מחושב (משמאל), הממוצע בריבוע הזחה (MSD, נכון). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה באיור 20: חישוב מקדמי דיפוזיה כולל את מצבי התאמה שונים. היסטוגרמות המקדמים דיפוזיה מחושב (משמאל), הממוצע בריבוע הזחה (MSD, מימין) עבור המודל מוגבל. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 21: פרופילי בעוצמה. דוגמה בעוצמה נקודה לאורך המסלול (קו כחול) והרקע שלו (הקו האדום). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה איור 22: הרקע לכל מסגרת. משמאל: תמונה לדוגמה תא. האמצעי: זיהוי אוטומטי התא. מימין: אזור נבחרת אוטומטית כרקע. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.

משלימה וידאו 1: דוגמה טיפוסי TIRF וידאו מיקרוסקופ נוכחות של חלקיקים עם עוצמות שונות וסוגים של תנועות. אנא לחץ כאן כדי להוריד הוידאו-

חומר משלים 1: קבצים המכילים את כל התסריטים פרוטוקול העסיק את אד הוק שגרות המועסקים הסיווג של מסלולים וניתוח של גודל האשכול. אנא לחץ כאן כדי להוריד את החומרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת קל לבצע אפילו מבלי ניסיון עבודה עם Matlab. עם זאת, Matlab רוטינות לדרוש מאוד דיוק עם המינוח של פקודות שונות, הלוקליזציה של התיקיות שונות המועסקים על-ידי התוכנית. ב המעקב אחר ניתוח שגרתי (שלב 3), ניתן לשנות פרמטרים מרובים. חלון "הגדרה Gaussian-תערובת דגם נאוה" (שלב 3.8) קובעת איך U-track יזהה חלקיקים בודדים על הוידאו. פעולה זו מתבצעת על-ידי התאמת מודל תערובת גאוסיאנית כמתואר ב-3. אחד הפרמטרים מפתח למדידות הזה מגדיר מסנן כדי לסייע בזיהוי maxima מקומיים. ההצלחה של פעולה זו תלוי הניגוד תמונת הרעש הנוכחי של תמונות. הפרמטר הראשון (ערך אלפא לשם השוואה עם רקע מקומי) שולט. בטחון maxima להיות מקום אמיתי, בזמן מסייע השני כדי להפחית את הרעש במהלך הזיהוי של כתמים. פרמטרים חשובים בשלב "מעקב" (3.9) הם מספר המסגרות כדי לסגור פערים (זה שמסלול עשוי להתפרס על מסגרות שבו החלקיק לא ראה ממש, אבל זה נראה לפני מסגרות אלה, לאחר אלה מסגרות; בדוגמה, 0) , ואת המספר של מסגרות הזמן הכולל מסלול על מנת להיחשב מסלול מוצלח (בדוגמה שלנו, הפרמטר 20; זו קשורה המהירות רכישת המצלמה, מספר המסגרות במסלול חייב להיות כזה כי זה מאפשר חישוב הדו חמצני דיפוזיה יעיל). זה חשוב גם להחליט אם מזג ופצל מקטעים (בדוגמה שתי האפשרויות הללו נבחרו). לאחר מכן, יש להגדיר את הפרמטרים עבור שלב 1 בפונקציות עלות (מסגרת-על קישור). פונקציה זו קובעת איך החלקיקים נמצאים תחת מעקב לאורך המסגרות. הפרמטרים החשובים ביותר הוא בנקודה זו הבחירה של רדיוס חיפוש בראונית, אשר שולט עד כמה כל נקודה צפוי להיות בתוך המסגרת הבאה. בדוגמה שלנו בחרנו 0, 5 כ ועליונים, בהתאמה. שים לב כי הפרמטרים האלה הם מאוד ספציפי של אופי של החלקיקים במעקב כי יצטרכו להיות מכוון בכל מקרה ספציפי. חשוב במיוחד הכוח קנה בראונית הינם לינארית חיפוש רדיוס. אלה שינוי גודל הכוחות תלוי סוג התנועה של החלקיקים (דיפוזיה חופשית או סגור). בדוגמה, הערכים (0.5, 0.01) נבחרו בחינם דיפוזיה. ראו התיעוד הספציפי של פרמטרים אלה,3.

בחישוב של הפקודה המקדמים דיפוזיה (שלב 4.4), הגבול העליון של מקדם דיפוזיה של חלקיקים משותק ניתן לידיעה ניסויים קודמים או על ידי הפעלת הפונקציה calculateDiffusion על פרוייקט נפרד עם משותק חלקיקים (חלבון פלואורסצנטי monomeric מטוהרים) ולראות את מקדמי דיפוזיה דיווח. הפונקציה הזו מקבלת שני פרמטרים נוספים: ' outputSuffix´, אשר מתווסף שמות קובץ פלט, כברירת מחדל לוקח את הערך ריק, ו ' plotLength´, אשר כברירת מחדל 13 הוא המספר של זמן השהיה (שניות), אשר מתבצע החישוב דיפוזיה. מצב המדידה 'alpha' מרמז על התאמת MSD, עיקול

Equation 1

כלומר, היסט (MSD0) ופונקציה כוח של הזמן השהיה. המעריך של פונקציה זו כוח, Equation 2 , קובע אם התנועה מוגבל (0 < α < 0.6), חריגה (0.6 < α < 0.9), חינם (0.9 < α < 1.1), או מכוונת (α > 1.1). לסקירה של סוג זה של ניתוח נקרא הקורא מאנזו ואח9

חישוב מקדמי דיפוזיה4 מייצר שתי דמויות פלט (ראה תוספת איור 19). הראשון מציג היסטוגרמה של דיפוזיה המקדמים מחושב (הערה כי בשלב זה, יש מקדם דיפוזיה עצמאית בכל מסלול). אומר אחוזון 95% של מקדמים אלה מוצגים במסוף Matlab. העלילה השנייה מראה את MSD (עיקול אדום) את מספר השלבים נחשב לחישוב זה כפונקציה של זמן השהיה עבור אלה מסלולים נחשבת ניידים (אלה אשר מקדם דיפוזיה היא מעל לסף נתון בשורת הפקודה). ממוצע, סטיית תקן של מסלולים נייד מחושב (אלה הם הערכים מסלולים בתא יחיד). בדוגמה, המעריך הוא 0.59 אינצ משמעות כי התנועה מוגבל. בשביל זה פריסטלטיות, התוכנית מדווח הוודאות הקשורים לכל אחד מהפרמטרים (מוצג סטיית התקן של כל אחד), מטיב ההתאמה (מתאים יגיע לאפס). בשלב זה, לאחר בדיקת הערך של אלפא ייתכן החלטנו להתאים את MSD עם פונקציה שונה:

Equation 3    אם הוא 0 < α < 0.6 (מוגבל)

Equation 4אם 0.9 < α < 1.1 (חינם)

Equation 5אם α > 1.1 (בוים)

מסלולים חריגה לא יכול להיות מצויד פונקציה שונה. במקרה של חלקיקים חיכוכים מאי לחשב את גודל כליאה (של מיקרון) כמו Destainville et al.14

Equation 6

אינדיקטור טוב של התאמה נכונה היא כי לאל-של-התאם אמורה להפחית אלפא שראוי ההתאמה הסופי (בדוגמה, הטוב מתאים נופל מ 0.30474 כדי 0.15749, משלימה איור 19-20). calculateDiffusioncreates שני קבצים ב- "results\TrackingPackage\tracks" בתוך הספריה סדרה בשם "diffusionCoefficients.txt" ו- "diffusionCoefficientsMobile.txt". קבצים אלה מכילים שלוש עמודות: 1) אינדקס של כל קלט מסלול, מקדם דיפוזיה המתאימים 2) שלהם, 3) האזור שלטון במסיכת מאיפה השיר הזה שייך (האזורים מתקבלים מקובץ ה-"mask.tif" זה יצרנו בשלבים 2.7; אם קובץ זה לא קיים, אז הטור אינו נוכח). ניתן להשתמש בקובץ זה ואת הקבצים מקביל שנוצר עבור תאים אחרים כדי לנתח את ההתפלגות של מקדם דיפוזיה עבור קבוצה של תאים תנאים דומים ניסיוני.

בחישוב של מקדם דיפוזיה עבור מסלולים קצרים (שלבים 4.7 4.8-), והפרמטר האחרון 'קצר' הוא סיומת הוסיף לשם הקובץ פלט כך אולי תנתח שונים קבוצות משנה של מסלולים מבלי להחליף את diffusionCoefficients.txt קבצים. השם בפועל של קבצי הפלט הוא "diffusionCoefficients > < סיומת. txt" ו- "diffusionCoefficientsMobile > < סיומת. txt". אם אין סיומת צוין, כמו הניתוח הכללי ביצע לעיל, לאחר מכן ריק suffix הוא. הפרמטרים מודל (D, v ו- MSD0) שונות מאלה לגריל כל מסלולים. שכנראה הכי משמעותי, סטיית התקן של הפרמטרים, כמו גם את התאמת לאל בדרך כלל להגדיל. הסיבה היא כי מסלולים קצרים אינם יציבים יותר, התאמה אמין קשה יותר.

הניתוח של מסלולים ארוכים (שלב 4.9) לסווג אותם לתוך מוגבלת (1), חינם (2), או מכוונת (3) לפי הרגע הראשון שלהם ואת מיקומו ביחס 2.5% ו- 97.5% percentiles מהרגע הראשון של 500 נתיבים אקראי עם תנועה בראונית, אותו הדבר מקדם דיפוזיה, אורך כמו המסלול להיות מנותח, מדומה על ידי מונטה קרלו. אם מהרגע הראשון של הדרך שעוברים ניתוח מתחת 2.5% מן הרגעים הראשונים שנצפתה הסימולציות, הנתיב נחקר המסווג מוגבל. אם זה מעל 97.5% מן הרגעים הראשונים מדומה, זה מסווג בהמלצת; אחרת, הנתיב מסווג כ בראונית. בפקודה מועסק, 113.88e-3 גודל פיקסלים מיקרומטר, 0.0015 הוא הגבול העליון של מקדם דיפוזיה המקומות משותק נמדד ב /s2מיקרומטר, וב 'ארוך' הוא הסיומת עבור קובץ הפלט. העמודה הראשונה של קובץ זה ("trajectoryClassificationLong.txt") הוא המספר מסלול, השני שלה סיווג (1 = מרותק, 2 = ללא תשלום, 3 = ביים), והשלישית היא המסלול ברגע הראשון.

קובץ ה-script לחישוב עוצמת כל חלקיק (שלב 5.1) גמישה ומאפשרת מעקב עוצמות קרינה פלואורסצנטית בדרכים שונות (כל אחד מהם גם מתאים למצבים שונים כמו מעקב אחר נקודות משותק של ניסוי שליטה או מעקב אחר נקודות מאוד מטלטלין מעל תא עם רקע פלורסנט משתנה). קובץ ה-script תנתח כל מסלולים לאורך כל המסגרות. בכל מקום על כל מסגרת זה תוכלו למדוד את עוצמת הפיקסלים סביב הנקודה (שהוא מנתח תיקון מרובע סביב הנקודה, כברירת מחדל של פיקסלים בגודל 3 x 3), הערכת במקום רקע, חישוב ההפרש זריחה בין הנקודה ו רקע. האחוז של חלקיקים photobleaching את מספר החלקיקים פלורסנט באשכול אחד, ראיתי כמו נקודה בודדת, יכול להיות מוערך בדרך זו.

שיטה זו אוטומטית (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) מייצרת מידע על פרמטרים מרובים (עוצמת ספוט, דיפוזיה לרוחב, סוג של תנועה), זה יכול לעזור ללמוד את היחס בין גודל ספוט הדינאמי-תנאי הבסיס, כמה טיפולים שונים ניתן לשנות פרמטרים אלה.

המגבלה העיקרית של השיטה היא כי זה דורש תרביות תאים תאים עם החלבון הניאון לבצע אחריהם מעקב. בדרך כלל תרביות תאים מוביל ביטוי חלבון, עובדה כי מעכבת חלבון יחיד מעקב. תא מיון שלב חייב להיות כלול כדי לבחור את התאים לבטא מספר הקולטנים המאפשרים זיהוי ומעקב של חלקיקים יחיד על ידי מיקרוסקופ SPT-TIRF. שיטה זו גם יכולה להיות מועסק למעקב מולקולות עם נקודות קוונטיות או שברים Fab. הפרוטוקול המתואר דורש מספר של פקדים יש לנתח בעבר על מנת להבטיח כי המסקנות מונע ניתוח הנתונים נכונים. קודם כל, זה חיוני כדי לקבוע את התנאים המתאימים לביטוי המאפשרות גילוי ומעקב אחר חלקיקים בודדים. סרטים עם צפיפות של ~ 4.5 חלקיקים/מיקרומטר2, המתאים 8,500-22,000 קולטנים תא, שימשו כדי לנתח את הארגון-עתיים של קרום התא קולטן13.

חשוב להקים את מקדם דיפוזיה מינימלית לזיהוי באמצעות חלבונים מטוהרים AcGFP monomeric או תאים קבוע. בשני המקרים ההנחה כי אין כל פיזור, ולכן אנו מעריכים כי הערכים דיפוזיה של חלקיקים לנתח בתנאים אלו שיתאימו חלקיקים קיבוע ומשמש להפלות בין מסלולים משותק וניידים13.

ניתוח הנתונים שהוצגו כאן הוא כלי ניתוח מסלול כללי, שניתן להחיל לניתוח של דיפוזיה של קולטני מאת superresolution, לניתוח של תמונות דיפרקציה מוגבלת, לניתוח של התנועה הסלולרית על ידי מיקרוסקופ רגיל . היתרון העיקרי של שיטה זו עם אחרים שתואר קודם לכן, כגון ניתוח של מספר והבהירות11, הוא שזה מאפשר הערכת ערכי העוצמה הממוצע של כל ספוט בודדים לאורך מסלולה, לוקח בחשבון את הזמן של הישרדות של החלבון monomeric AcGFP לפני photobleaching. הזמן הישרדות של מולקולה לפני photobleaching תלויות בתוקף התנאים עירור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנחנו מודים ועד מאנזו קרלו מריה גארסיה Parajo שלהם עזרה וקוד המקור של ניתוח מקדם דיפוזיה. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים מן הספרדית משרד המדע, חדשנות אוניברסיטאות (SAF 2017-82940-R), את תוכנית RETICS של אינסטיטוטו דה סאלוד Carlos III (RD12/0009/009, RD16/0012/0006; RIER). LMM JV נתמכים על-ידי התוכנית COMFUTURO של CSIC Fundación הכללי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Tags

קולטן כימוקין אימונולוגיה זיהום גיליון 146 SPT מעקב אשכולות דיפוזיה ניתוח תוכנה
עיבוד פרוטוקול עבור הניתוח של פעפוע וגודל האשכול של קולטני ממברנה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ תמונה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sorzano, C. O. S.,… More

Sorzano, C. O. S., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter