Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59314
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,5, 3, 1,6, 3, 3
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.
* These authors contributed equally

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للجسيمات واحدة تتبع تحليل الصور التي تتيح التقييم الكمي لنشر معاملات، أنواع الحركة والكتلة أحجام الجسيمات واحد الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري الأسفار.

Abstract

الجسيمات التي تتبع في تسلسل فيديو والتحليل اللاحق لمساراتها في الوقت الحاضر بعملية مشتركة في العديد من الدراسات البيولوجية. تحليل مستقبلات غشاء الخلية باستخدام مجموعات كنموذج، ونحن في الوقت الحاضر بروتوكول مفصل لهذه المهمة تحليل الصور باستخدام فيجي (إيماجيج) وإجراءات Matlab ل: 1) تحديد المناطق ذات الاهتمام وتصميم أقنعة تتكيف مع هذه المناطق؛ 2) تتبع الجسيمات في الأسفار مجهرية أشرطة الفيديو؛ 3) تحليل خصائص انتشار وشدة من المسارات المحددة. التحليل الكمي لمعاملات نشر، أنواع الحركة، وحجم الكتلة التي حصلت عليها مجهرية الأسفار ومعالجة الصور ويوفر أداة قيمة لتحديد موضوعيا ديناميات الجسيمات والمترتبة على تعديل الظروف البيئية. في هذا المقال نقدم بروتوكولات مفصلة لتحليل هذه الميزات. الطريقة الموضحة هنا ليس فقط يسمح الكشف عن تتبع جزيء واحد، ولكن أيضا أتمتة تقدير معلمات الانتشار الأفقي في غشاء الخلية ويصنف نوع مسار ويسمح تحليل كامل وبالتالي التغلب على الصعوبات في قياس حجم بقعة على مساره الكامل في غشاء الخلية.

Introduction

بروتينات الغشاء جزءا لا يتجزأ من بلير الدهن في حركة مستمرة بسبب نشر الحرارية. ديناميتها ضرورية لتنظيم استجابات الخلية، كما جزيئية تسمح تشكيل المجمعات التي تختلف في الحجم من مونومرات إلى ليغومرات وتؤثر في استقرار مما يشير إلى المجمعات. وهكذا توضيح آليات السيطرة على ديناميات البروتين تحديا جديداً في بيولوجيا الخلايا، اللازمة لفهم سبل توصيل الإشارات وتحديد مهام الخلية غير متوقعة.

وقد وضعت بعض وسائل بصرية لدراسة هذه التفاعلات في معيشة الخلايا1. ومن بين هذه، يسمح الانعكاس الداخلي الكلي مجهرية الفلورية (TIRF)، وضعت في أوائل الثمانينات، دراسة التفاعلات الجزيئية على أو بالقرب جداً من غشاء الخلية2. دراسة المعاملات الحيوية من الغشاء بروتين المسارات التي تم الحصول عليها من بيانات TIRF في الخلايا الحية، مطلوب جسيم واحد تتبع أسلوب (SPT). على الرغم من أن تتوفر عدة خوارزميات لذلك، نستخدم حاليا تلك التي نشرتها جاكامان et al.3 التي تعالج تباين الحركة الجسيمات في حقل جسيمات كثيفة التي تربط الجزيئات بين إطارات متتالية للاتصال المسار الناتج شرائح في مسارات كاملة (اختفاء الجسيمات مؤقتة). البرنامج يلتقط الجسيمات دمج وتقسيم تلك النتيجة من التجميع وتفكك الأحداث3. من بيانات الإخراج من هذا البرنامج الكشف عن الجسيمات على طول المسار الكامل بتحديد مواقفها X و Y في كل إطار.

وبمجرد اكتشاف الجسيمات، نقوم بتطبيق خوارزميات مختلفة لتحديد تيميلاج قصيرة نشرها معامل (د1-4)4،5. بتطبيق التحليل8 7،،من6لحظة قياس الطيف (MSS) أو عن طريق تركيب القيمة 'ألفا' بالتكيف للتشرد متوسط مربع (MSD) ل المنحنى9، نحن أيضا تصنيف الجسيمات استناداً إلى نوع المسار.

تحليل كثافة بقعة في الصور الأسفار هدف مشترك للعلماء في ميدان10،11. الخوارزمية الأكثر شيوعاً المستخدمة هو عدد ما يسمى والسطوع. ومع ذلك لا يسمح هذا الأسلوب الكشف الصحيح الإطار بكثافة في الجسيمات في كسر الجوال. ونحن، وهكذا ولدت خوارزمية جديدة لتقييم هذه الجسيمات كثافات الإطار حسب الإطار وتحديد حالتها التجميع. بمجرد اكتشاف إحداثيات كل الجسيمات باستخدام البرمجيات Track2 يو3، علينا أن نحدد كثافة في كل إطار عبر مسار كامل، أيضا مع مراعاة الخلفية الخلية في كل إطار. هذا البرنامج يوفر إمكانيات مختلفة لتحديد كثافة بقعة وخلفية الخلية، واستخدام البروتينات أحادي و dimeric المعروفة كمراجع، يحسب العدد التقريبي للبروتينات في الكشف عن الجسيمات (حجم الكتلة).

في هذه المقالة، يصف لنا دليل دقيق لتنفيذ الخطوات الثلاثة التالية: 1) كشف وتتبع الجسيمات واحدة على طول شريط فيديو للأسفار مجهرية باستخدام يو-المسار؛ 2) تحليل معامل نشر فوري (د1-4) لتلك الجزيئات ونوع الحركة (المحصورة أو الحرة أو الموجهة) الجسيمات مع مسارات طويلة من MSS؛ 3) قياس كثافة بقعة على طول الفيديو تصحيح بالأسفار الخلفية المقدرة لكل نقطة. وهذا يسمح لتقدير حجم الكتلة، وتحديد الخطوات فوتوبليتشينج.

استخدام هذا البروتوكول لا تتطلب مهارات متخصصة ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مع ثقافة الخلية، والتدفق الخلوي والفحص المجهري مرافق. يستخدم البروتوكول إيماجيج أو فيجي (توزيع ImageJ12) والمسار يو3وبعض إجراءات المخصصة المقدمة الإعلانية (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). إجراءات يو--المسار والمخصصة دهس Matlab التي يمكن تثبيتها في أي كمبيوتر متوافق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد العينات البيولوجية

  1. تنمو خلايا جوركات في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10 ٪ السفح، نابير ولام الجلوتامين (ربمي كاملة). الخلايا جوركات اليكتروبوراتي (20 × 106 خلايا/400 ميليلتر من 1640 RPMI مع السفح 10 ٪) مع ناقل مستقبلات chemokine أحادي بروتينات فلورية خضراء المسمى (CXCR4-أكجفب، 20 ميكروغرام) للسماح بالكشف عنها باستخدام مجهر الأسفار.
    ملاحظة: من الممكن استخدام أحادي البروتينات الفلورية الأخرى مثل مشري، مسكارليت، إلخ.
  2. تحليل ح 24 بعد تعداء الخلايا في سيتوميتير تدفق لتحديد جدوى الخلية والتعبير CXCR4-أكجفب.
  3. حدد الخلايا معربا عن مستويات منخفضة من CXCR4-أكجفب بالخلية فرز الخلايا إيجابيةانخفاض التجارة والنقل (الشكل 1)، كما مطلوب التعبير منخفضة من مستقبلات ترانسفيكتيد في تجارب تيرفم بغية ضمان تتبع الجسيمات مفردة للتتبع الفردية 9من المسارات.
  4. تحديد كمية عدد مستقبلات في سطح الخلية.
    ملاحظة: كما مثال13، مستقبلات المسمى أكجفب ~ 8,500-22,000/الخلية، تناظر ~ 2-4.5 الجسيمات/ميكرو2.
  5. ريسوسبيند فرز الخلايا في ربمي كاملة واحتضانها لمالا يقل عن 2 ح في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. الطرد المركزي خلايا (300 غ س، 5 دقيقة)، وحراكه لهم في TIRF المخزن المؤقت (pH حبس، 25 مم حبيس، FCS 2%، 7.3).
    1. لوحة على أطباق زجاجية ميكروويل 35 ملم (2-3 × 105 خلية/طبق) المغلفة مع فيبرونيكتين (20 ميكروغرام/مل، ح 1، 37 درجة مئوية) في وجود أو عدم وجود يجند المناسب (أي، CXCL12، 100 نانومتر، ح 1، 37 درجة مئوية). احتضان خلايا (20 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2) قبل الحصول على الصور.
  6. القيام بتجارب باستخدام مجهر TIRF، مجهزة بكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر، 100 × الهدف النفط-الغمر (APO رر HCX 100 x/1.46 غ) و 488 نانومتر ليزر صمام ثنائي. المجهر يتيح التحكم في درجة الحرارة والحضانة مع CO2. قم بتحديد موقع وتركز الخلايا مع المقابض التركيز الخشنة وغرامة، باستخدام حقل مشرق للتقليل من آثار فوتوبليتشينج. للغرامة تركيز استخدام التكيف في وضع TIRF كثافة ليزر منخفضة، غير كافية للكشف عن الجسيمات مفردة أو للحث على آثار فوتوبليتشينج (طاقة الليزر 5 ٪، 28 μW).
  7. الحصول على أفلام (تسلسل الصور) لما يقرب من 50 s تقليل الفاصل الزمني بين الإطارات. ينبغي أن يكون اختراق الحقل زائل 70-90 نيوتن متر من العمق. حفظ الأفلام المكتسبة لكل شرط التجريبية ك ".lif" (video.lif).
    ملاحظة: تم اقتناء الأفلام في المثال المبين في 49 في المائة في طاقة الليزر (2 ميجاوات) مع وقت تعرض لمرض التصلب العصبي المتعدد 90، وفاصل زمني من 98 مرض التصلب العصبي المتعدد، ل 49 s (500 إطارات). كان الاختراق الموجه زائل المحددة 90 نانومتر.

2-اختيار الصور وإنشاء أقنعة

  1. لكل حالة تجريبية (video.lif)، قم بإنشاء مجلد جديد (فيديونامي) التي يجب أن تحتوي على مجلدات مختلفة لكل مجموعة. ويتضمن كل مجلد مجلد "فيديوسيق" لصور الفيديو ومجلد "نتائج" لنتائج التحليل. تأكد من أن بنية الملف في هذه اللحظة هو ما يلي:
    VideoName/video.lif
    فيديونامي/Series1/فيديوسيق
    فيديونامي/Series1/النتائج
    ملاحظة: من المجهر يتم الحصول على ملفات.lif مختلفة مع العديد من أشرطة الفيديو لكل شرط المعاملة (أي الجبهة الوطنية، الجبهة الوطنية + قوات الدفاع الذاتي). "video.lif" يتوافق مع ملف الفيديو input.lif مع جميع المقتنيات أفلام TIRF (سلسلة) يؤديها في المجهر. سوف يحتوي المجلد "فيديوسيق" على 500 إطارات الفيلم الذي نحن بتحليل. وسوف تحتوي على المجلد "نتائج" كافة الملفات الناتجة عن تحليل أداء. مصطلحات دقيقة والتعريب من مجلدات مختلفة ضرورية للدالة الصحيحة من الخوارزميات. أسماء بخط غامق في القائمة أعلاه هي ثابتة (أي، لديهم ليتم استدعاؤها في هذه الطريقة لأن هذه هي أسماء طلبتها البرامج النصية). يمكن تغيير الأسماء لا بخط غامق ليعكس إجراء التجربة.
  2. فتح الفيديو تيرفم (ملف.lif) مع فيجي أو إيماجيج عن طريق سحب وإسقاط الملف على شريط القوائم في فيجي وانقر فوق موافق لاستيراد الملف الآنف باستخدام بيوفورماتس (تكميلية الشكل 1).
  3. حدد سلسلة العملية ثم انقر فوق موافق (2A الرقم الإضافي). تصميم قناع لتحليل هذا الفيديو، استيراد أيضا صورة متعددة القنوات مع صباغات مختلفة (في المثال 1 سلسلة هو صورة متعددة القنوات وسلسلة 2 الفيديو المقابلة). وينبغي فتح الفيديو (والصورة الأقنية) رصة ImageJ. في المثال ("تكميلية الشكل" 2B)، الصورة على اليسار وشريط الفيديو على الحق.
    ملاحظة: إذا ليس هناك حاجة إلى إنشاء قناع للفيديو، انتقل إلى "الخطوة 2، 5".
  4. إنشاء قناع. إنشاء صورة واحدة مع القنوات مفيدة لتصميم القناع. وفي هذه الحالة، قنوات مثيرة للاهتمام هي الأحمر والأخضر والرمادي.
    1. تقسيم القنوات من الصورة الأقنية (3A الشكل التكميلية): حدد الصورة في الشريط القائمة ثم انقر فوق لون | تقسيم القنوات. سوف تظهر قنوات مختلفة كصور منفصلة (3B الشكل التكميلية).
    2. دمج القنوات الثلاث مرة أخرى في صورة واحدة (4A الرقم الإضافي): حدد الصورة في الشريط القائمة، وحدد لون | دمج قنوات. تحديد القنوات المناسبة واضغط موافق (4B الرقم الإضافي). وسوف تكون صورة جديدة غير مكدسة ولدت (تكميلية الشكل 4).
    3. مزامنة windows اثنين باستخدام أداة مزامنة Windows (5A الرقم الإضافي): حدد تحليل في الشريط القائمة | أدوات | مزامنة Windows. سيظهر إطار جديد مع إمكانيات الصورة تزامن (5B الرقم الإضافي).
    4. مع اثنين windows مزامنة (فقط الفيديو إذا لم يكن هناك لا صورة متعددة القنوات المرتبطة)، يمكن حصدها في نفس المنطقة في كل من ويندوز. رسم منطقة الاهتمام باستخدام أداة التحديد المستطيل من القائمة العائمة إيماجيج. حدد الصورة في الشريط القائمة وتحديد المحاصيل (6A الرقم الإضافي). سوف تظهر اثنين من اقتصاص الصور منفردة (6B الرقم الإضافي).
    5. أونسينتشرونيزي كل من ويندوز (6B الرقم الإضافي) بالضغط على زر أونسينتشرونيزي كافة في إدارة Windows المزامنة .
  5. إذا لم يتم إنشاء قناع كما في الخطوة 2، 4، رسم منطقة الاهتمام باستخدام أداة التحديد المستطيل من القائمة العائمة إيماجيج.
  6. حفظ الفيديو تسلسل الصور في الدليل فيديوسيق تحت الدليل فيديو المقابلة ("الشكل تكميلية" 7A): حدد الملف في الشريط القائمة ثم انقر فوق حفظ باسم | صورة تسلسل... إعادة تسمية التسميات لتسلسل الفيديو ك video0000.tif، video0001.tif،..., video0499.tif (7B الرقم الإضافي): في المربع الاسم ، قم بإعادة تسمية الفيديو ، ثم انقر فوق موافق. يجب أن يكون التسلسل وحدها في الدليل الخاص به لاستخدامها بنجاح من قبل يو-المسار.
    ملاحظة: إذا لم يكن وضع قناع للفيديو، انتقل إلى الخطوة 2.8.
  7. تصميم قناع. حدد صورة متعددة القنوات وفتح محرر تجزئة البرنامج المساعد (تكميلية الشكل 8 أ): حدد الإضافات في الشريط القائمة وحدد تجزئة | محرر تجزئة. إضافة وإعادة تسمية تسميات تجزئة حسب الاقتضاء بالحق النقر فوق تسميات المحرر تجزئة (8B "الرقم الإضافي"، ج).
    1. اختر أداة التحديد المناسبة في القائمة العائمة ImageJ (هنا، استخدم اليدوي)، حدد تسمية (الأخضر) والتصميم الأول قناع الأبعد ("تكميلية الشكل" 9 ألف). مجرد مصممة، سيتم عرض الزر اضغط + في اختيار خيار من نافذة المركبة ، والقناع المحدد على المشاهد ("تكميلية الشكل" 9 ألف). كرر هذه الخطوة مع التسميات التالية (الداخلية، باللون الأحمر) (9B الرقم الإضافي).
      ملاحظة: بعد وضع القناع للتسميات الخضراء، والداخلية، وسوف تشغل القناع الخارجي بقية الصورة.
    2. يتم ترميز الأقنعة في الصورة كمناطق 0، 1، 2،... ووفقا لترتيب التسميات في إطار التسميات RGB. عند كل الأقنعة لتسميات مختلفة مصممة، حفظ القناع مع نفس اسم الملف كالفيديو، مع اسم mask.tif (تكميلية الشكل 9): حدد الملف في الشريط القائمة، وحدد حفظ باسم | Tiff....
      ملاحظة: سوف تستخدم أقنعة المحدد في حساب معاملات نشرها والتصنيف للمسارات (راجع الخطوة 4، 2).
  8. تحقق من أن بنية الملف في هذه اللحظة هو ما يلي:
    VideoName/video.lif
    فيديونامي/Series1/ mask.tif
    فيديونامي/Series1/ فيديوسيق/video0000.tif
    فيديونامي/Series1/ فيديوسيق/video0001.tif
    ...
    فيديونامي/Series1/ فيديوسيق/video0499.tif
    فيديونامي/Series1/ النتائج
    ملاحظة: Mask.tif صورة مع القناع كما تم تصميمها في خطوات 2.4 و 2.7. Video*.tiff هو الفيديو كما تم حفظها في "الخطوة 2، 6". النحو المبين أعلاه، الأسماء في غامق في ثابتة في القائمة أعلاه، أي، لديهم ليتم استدعاؤها في هذه الطريقة لأن هذه هي أسماء طلبتها البرامج النصية. يمكن تغيير الأسماء لا بخط غامق ليعكس إجراء التجربة.

3-تتبع الجسيمات

  1. تتبع جميع الجسيمات ينظر في أشرطة الفيديو المحدد باستخدام يو-المسار.
  2. فتح Matlab وإضافة الدليل يو-المسار إلى المسار باستخدام "تعيين مسار" | إضافة مع خيار المجلدات الفرعية الموجودة في القائمة. حفظ المسار بحيث في المستقبل تنفيذ أحكام الإعدام في Matlab يو-المسار في المسار. هذا الإعداد المسار يحتاج إلى القيام به مرة واحدة فقط.
  3. تغيير دليل العمل إلى الدليل الذي يحتوي على سلسلة ليتم تحليلها. استدعاء يو-المسار بكتابة في وحدة التحكم (تكميلية الشكل 10) موفيسيليكتورجي واضغط على enter. إطار اختيار الفيلم سيتم فتح (الرقم الإضافي 11 ألف).
  4. اضغط على الزر فيلم جديد وسوف تظهر نافذة فيلم الطبعة (الرقم الإضافي 11B).
  5. اضغط على إضافة قناة لاختيار الدليل بالفيديو (فيديونامي/Series1/فيديو) وملء المعلمات معلومات الفيلم. تعيين دليل الإخراج لنتائج يو-المسار إلى النتائج (فيديونامي/Series1/النتائج).
    ملاحظة: يمكن الحصول على المعلمات معلومات الفيلم من المجهر وشروط اكتساب.
  6. اضغط على إعدادات متقدمة القناة وملء المعلمات المتعلقة باقتناء. تبدو قيم المعلمات في المثال (تكميلية الشكل 11).
  7. اضغط على حفظ في نافذة الإعدادات المتقدمة القناة و حفظ في إطار فيلم الطبعة . البرنامج سوف يطلب تأكيدا لكتابة ملف يسمى movieData.mat في الدليل النتائج . تأكيد.
  8. بعد إنشاء الفيلم، اضغط على متابعة في إطار التحديد الفيلم. U-المسار سوف يسأل عن نوع الكائن يتم تحليلها. اختر واحدة-الجسيمات (تكميلية الشكل 12). سوف يظهر إطار لوحة التحكم (الشكل تكميلية 13A).
    1. حدد الخطوة الأولى الخطوة 1: الكشف عن واضغط على الإعداد. سوف تظهر نافذة الإعداد المناسب غاوسي خليط من طراز (الرقم الإضافي 13B). في المثال، يتم تعيين "قيمة ألفا للمقارنة مع الخلفية المحلية" إلى 0.001 و "المتداول-نافذة الوقت المتوسط" إلى 3 (الرقم الإضافي 13B).
    2. اضغط على تطبيق في نافذة إعدادات تركيب خليط من طراز الضبابي و تشغيلها في لوحة التحكم. مع التكوين التكميلي رقم13، يعمل الخطوة الكشف فقط. هذه الخطوة تستغرق بضع دقائق (2-5). التحقق من النتائج بالضغط على زر نتيجة الخطوة 1 (الكشف، تكميلية الشكل 14).
      ملاحظة: كما هو موضح أعلاه، يظهر الفيلم دوائر حمراء على الكشف عن الجسيمات. وإذا تبين لا دائرة حمراء، ثم هذه الخطوة لم يعمل بشكل صحيح.
  9. القيام بتحديد المسارات، هي دمج جزيئات الكشف عنها في الخطوة السابقة في المسارات التي تمتد على إطارات متعددة. هذا الخطوة 2: تتبع يو-مسار الإعدادات التي يجب أن يكون تعريف كما هو موضح في "الشكل الإضافي" 15 ألف-جيم. يتم عرض الإعدادات دالة تكلفة الخطوة 2 ربط الإطار إلى الإطار و سد الفجوة ودمج وتقسيم في المثال في الشكل الإضافي 15 باء و جيم، على التوالي.
  10. بعد تعيين المعلمات لخطوة 2، اضغط تشغيل في لوحة التحكم وتشغيل فقط الخطوة 2 (تكميلية الشكل 16).
  11. إجراء تحليل المسار، الخطوة 3. تعريف الإعدادات كما هو موضح في تكميلية الرقم 17 (اللوحة اليمنى). ثم اضغط تطبيق في الفريق لتحليل وضع الحركة، و تشغيل في "عنصر تحكم" لوحة-U-المسار. هذه الخطوة تستغرق بضع ثوان.
  12. تحقق مع زر نتيجة الخطوة 3 أن العملية قد حددت بشكل صحيح كافة المسارات. للقيام بذلك، انقر فوق إظهار مسار عدد من الإطار خيارات الفيلم ، وتحقق من تحديد الإطار حسب الإطار بكل مسار بشكل صحيح (تكميلية الشكل 18). يدوياً إضافة تعليق تلك الجسيمات التي ليست جسيمات حقيقية.
    ملاحظة: إذا لم يتم هذا التحديد اليدوي، تحديد تلقائي أضعف يمكن أن يؤديها في وقت لاحق عندما يتم حساب معامل نشر (راجع الخطوة 4).

4-حساب معاملات نشرها والتصنيف للمسارات

  1. تأكد من أن كافة البرامج النصية يتم استدعاؤها من الدليل للفيديو التي تم تحليلها (في المثال، فيديونامي/Serie1).
  2. قراءة جميع المسارات لحساب معاملات نشرها بإصدارها في Matlab وحدة الأمر: trajectories=readTrajectories(0.1)، حيث هو 0.1 الوقت بالثواني بين إطارين متتاليين (الفاصل الزمني، يظهر في لوحة فيلم المعلومات، الشكل تكميلية 11B).
  3. استبعاد المسارات المقابلة للبقع/المسارات التي تم تحديدها بشكل غير صحيح. إعطاء قائمة من المواقع لاستبعاد. على سبيل المثال، لاستثناء النقاط 4 و 5 و 28، اكتب: المسارات = ريدتراجيكتوريس (0.1 [4، 5، 28]).
  4. حساب معاملات نشر فوري لكل واحد من المسارات من هذه الخلية. وفي هذه الحالة، حساب معامل نشر لفارق زمني = 4، دعا د1-4. للقيام بذلك، قم بتشغيل في وحدة التحكم Matlab الأمر: د = كالكولاتيديفوسيون (المسارات، 113.88e-3، 0.0015، 'ألفا') حيث المسارات هي المسارات التي تم الحصول عليها في الخطوة 3, 113.88e-3 حجم بكسل الصور المكتسبة في ميكرون، و 0.0015 الحد الأعلى لمعاملات نشر جزيئات غير متحركة تقاس في/s2ميكرومتر، و 'ألفا' هو النموذج المجهزة كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: عند استخدام الكاميرا أسرع والحاجة إلى المزيد من الإطارات لحساب المعلمة نشر زيادته، مثلاً إلى 20، د = كالكولاتيديفوسيون (المسارات، 113.88e-3, 0.0015، 'ألفا'، ''، 20). معلمة السلسلة قبل 20، في المثال أعلاه، ''، هو لاحقة تضاف إلى ملفات الإخراج. يمكن استخدام هذا اللاحقة التفريق بين تحليلات مختلفة.
  5. صالح MSD مع دالة مختلفة بواسطة استدعاء الدالة كالكولاتيديفوسيون مرة أخرى مع وضع تركيب مختلفة ('حصر' أو 'الحرة'، أو 'توجيه'). في هذا المثال، 'حصر': د = كالكولاتيديفوسيون (المسارات، 113.88e-3, 0.0015، 'حصر').
  6. الحصول على نتائج مناسبة لنموذج الموجه، كما هو مبين في تكميلية الرقم 20.
  7. تحلل المسارات إلى مسارات قصيرة وطويلة. استخدم الأمر: [شورتراجيكتوريس، longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) فيها 50 هو الحد الأدنى لطول مسار تعتبر منذ فترة طويلة (في المثال الموضح) في الإطارات.
  8. دراسة مسارات قصيرة باستخدام نفس الإجراء المناسب هو موضح في "الخطوة 4، 3": د = كالكولاتيديفوسيون (شورتراجيكتوريس، 113.88e-3, 0.0015، 'توجيه'، 'قصيرة'). تحليل مسارات قصيرة والشاذ مع الأمر: د = كالكولاتيديفوسيون (شورتراجيكتوريس، 113.88e-3, 0.0015، 'ألفا'، 'قصيرة').
  9. تحليل مسارات طويلة لتصنيف نوع الحركة من خلال هذه اللحظة قياس الطيف (MSS)7. الأمر: تراجيكتوريسكلاسيفيكيشن = كلاسيفيلونجتراجيكتوريس (لونجتراجيكتوريس، 113.88e-3,0.0015، 'طويلة') يبين التحليل في الشاشة ويقوم بإنشاء ملف يسمى تراجيكتوريكلاسيفيكيشن < لاحقة >.txt في الدليل results\TrackingPackage\tracks.

5-حساب سايز الكتلة من خلال كثافة الجسيمات

ملاحظة: تأكد من أن كافة البرامج النصية يتم استدعاؤها من الدليل للفيديو التي تم تحليلها (في المثال الموضح، فيديونامي/Serie1).

  1. تحليل كثافة كل الجسيمات على طول مسار بهم. للقيام بذلك، استدعاء البرنامج النصي عن طريق كتابة في وحدة Matlab: أناليزيسبوتينتينسيتيس أن يأخذ كإدخال مسارات حسبتها يو-المسار في القسم الأول. في أبسط أشكاله، استدعاء البرنامج النصي دون أي حجة من الدليل للفيديو التي تم تحليلها (في المثال الموضح، فيديونامي/Series1) analyzeSpotIntensities(). تكوين هذا السلوك الأساسية في العديد من الطرق المختلفة بتقديم حجج للبرنامج النصي كما هو الحال في: أناليزيسبوتينتينسيتيس ('Arg1´، Value1,' Arg2´, Value2،...). الحجج المقنعة مع قيمها متغير المناظرة (' ArgN´، فالوين) وترد.
    1. (' spotRadius´، 1)
      تحليل كثافة الأسفار باستخدام سبوتراديوس مقدار 1 بكسل (بشكل افتراضي) يتوافق مع تصحيح بحجم 3 × 3 تركزت على الفور ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      ملاحظة: لتصحيح من 5 × 5 تركزت على الفور، اختر سبوتراديوس 2، وما إلى ذلك.
    2. (' onlyInitialTrajectories´، 1)
      إذا أعطيت هذه الوسيطة (true، القيمة 1)، تحليل المسارات التي تبدأ في الإطار الأول من الفيديو فقط. وهذا مفيد لتحليل الصور تحكم (بشكل افتراضي 0، كاذبة).
    3. (' trackTrajectory´, 0)
      إذا تم تعيين هذه الوسيطة إلى 0 (false)، ثم الحفاظ على إحداثيات للموقع في الإطار الأول لكل الإطارات (وهذا مفيد للبقع غير متحرك). إذا تم تعيين الوسيطة إلى 1 (بشكل افتراضي 1، صحيح)، ثم تعقب الفور على طول الفيديو التالية حساب الإحداثيات قبل يو-المسار.
    4. (' excludeTrajectories´، [4,5,28])
      تضمين رقم مسار من هذه المسارات المستبعدة في "الخطوة 4، 3" (في المثال 4، 5، 28).
    5. (' اكستيندتراجيكتوري ´، 1)
      إذا تم تعيين هذه الوسيطة إلى 1 (صواب)، ثم تحليل الكثافة في التصحيح إلى نهاية الفيديو (حتى إذا توقف المسار في وقت سابق). إحداثي المكان هو تنسيق آخر في المسار (إذا كان صحيحاً تراكتراجيكتوري) أو تنسيق الأولى في المسار (إذا كان تراكتراجيكتوري كاذبة). وهذه الحجة false (0) بشكل افتراضي.
    6. (' subtractBackground´، 1)
      إذا تم تعيين هذه المعلمة، ثم الصحيح الفلورية الخام يقاس في كل بقعة تقدير fluorescence الخلفية لهذا المكان (انظر أدناه). وهذه الحجة true (1)، بشكل افتراضي.
    7. (' meanLength´، رقم الإطار)
      إذا تم تعيين هذه المعلمة، يتم قياس الفور كثافة يعني على طول أشارت إلى. مجموعة 'مينلينجث'، 20 لقياس كثافة بقعة يعني في الإطارات 20 أولاً. إذا لم يتم تعيين الوسيطة، ثم كثافة بقعة يحسب في مسار كامل (بشكل افتراضي، طول كامل).
    8. (' showIntensityProfiles´، 1)
      تعيين هذه المعلمة 1 (بشكل افتراضي 0، كاذبة)، لرسم الشخصية كثافة على طول إطارات مختلفة فضلا عن خلفيتهم.
      ملاحظة: هذه المؤامرات مفيدة جداً لتحديد فوتوبليتشينج كما هو موضح في تكميلية الرقم 21. لكل مسار، يحلل الروتين تلقائياً إذا كان من الممكن أن هناك فوتوبليتشينج. يتم ذلك عن طريق مقارنة قيم الكثافة مع تي الطالب في الإطارات ن الأول والأخير على طول المسار. بشكل افتراضي، N هو 10، ولكن يمكن تعديل هذه القيمة من خلال الوسيطة ' Nbleach´.
    9. (' backgroundMethod´، قيمة)
      تعيين هذه المعلمة إلى تحديد الخلفية من كل بقعة. يمكن أن يتم ذلك بطرق عدة، وواحد لاستخدامه يمكن أن يكون المحدد تغيير "قيمة":
      1. (' backgroundMethod´, 0)
        استخدم هذه القيمة لتحديد الخلفية للفيديو كله يدوياً. تسمح بتحديد 8 نقاط في الإطار الأول من الفيديو. ويتم تحليل تصحيحًا حول هذه النقاط على طول الفيديو كله، وكانتيل 95% من جميع هذه الكثافات يتم اختيارها ككثافة الخلفية لجميع النقاط.
      2. (' backgroundMethod´، 1)
        استخدم هذه القيمة لتحديد خلفية لكل إطار يدوياً. اختر 8 نقاط لكل بقعة وكل إطار. هذه مهمة تستغرق وقتاً طويلاً ولكن فإنه يعطي قدرا كبيرا من التحكم للمستخدم. كانتيل 95% من الشدة في هذه البقع يتم اختيارها ككثافة الخلفية لهذه البقعة في هذا الإطار.
      3. (' backgroundMethod´، 2)
        استخدام تقدر هذه القيمة حساب الخلفية لكل نقطة من 8 نقاط تقع في دائرة حول المكان مع دائرة نصف قطرها يسيطر عليها الحجة ' backgroundRadius´ (بشكل افتراضي، 4 * سبوتراديوس).
      4. (' backgroundMethod´، 3)
        استخدم هذه القيمة لحساب الخلفية لكل إطار بواسطة تحديد الخلية الأولى في الفيديو ثم تحليل كثافة الخلية في كل إطار (تكميلية الشكل 22).
        ملاحظة: الخلفية يتم اختيارها كقيمة الرمادي في كانتيل المعطاة لهذا التوزيع (حسب الافتراضي 0.5 (= 50%)، على الرغم من أن هذه المعلمة يمكن السيطرة عليها من خلال الوسيطة ' backgroundPercentile´، هذا يمكن تعيين القيمة أعلى، على سبيل المثال، 0.9 (= 90%) إذا كان يريد معظم الخلية باعتبار الخلفية. للمساعدة في تحديد الخلية، تشير إلى الذي هو قيمة الخلفية الحد الأقصى المتوقع على طول الإطارات باستخدام الوسيطة ' maxBackground´ (على سبيل المثال، في جميع أشرطة الفيديو تم تحليلها، القيمة الخلفية عادة لم يتجاوز 6000)13. بشكل افتراضي، يتم تعيين هذا الخيار إلى 0، مما يعني أن هذه التعليمات لا يستخدم بشكل افتراضي. انظر ما هو الكشف عن الخلية ومنطقة مختارة لتقدير الخلفية عن طريق تعيين الوسيطة ' showImages´ إلى 1 (وقف التنفيذ في أي وقت عن طريق الضغط على CTRL-C).
  2. جمع المعلومات التي نشرها وكثافة لجميع المسارات المحسوبة في الخطوات 4 و 5-1، على التوالي، باستخدام gatherDiffusion.AndIntensity (). جمع فقط معلومات نشرها وكثافة لمسارات قصيرة. للقيام بذلك، استخدم لاحقات المستخدمة في "الخطوة 4، 7"، واكتب: جاثيرديفوسيوناندينتينسيتي ('Short´) حيث' Short´ هو لاحقة المستخدمة في "الخطوة 4، 7".
  3. جمع "مقياس الطيف لحظة" وكتابة informationby الكثافة: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') حيث 'طويلة' اللاحقة يستخدم في "الخطوة 4، 7". ويرد موجز لجميع الملفات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول في الشكل 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح استخدام هذا البروتوكول التتبع الآلي من الجسيمات التي اكتشفت في الأسفار مجهرية الأفلام وتحليل الخصائص الدينامية ل. في البداية، هي transfected الخلايا مع البروتين إلى جانب فلوريسسينتلي تعقبه. يعرض المستوى المناسب من مستقبلات على سطح الخلية يسمح SPT يتم الحصول عليها بالخلية الفرز (الشكل 1). ويتم تحليل الخلايا المحددة بالفحص المجهري TIRF الذي يقوم بإنشاء ملفات الفيديو في تنسيق التي يمكن دراستها مع الأدوات الموصوفة في هذا البروتوكول (تكميلية الفيديو 1).

لا يمكن تحليل أشرطة الفيديو التي تم إنشاؤها مباشرة، وإطارات مستقلة لكل فيديو مطلوبة. استخدام ImageJ ينشئ الملفات التي يمكن أن تفسر باستخدام برامجيات Matlab مثل إطارات الفيديو بتنسيق.tiff أو أقنعة. U-تتبع مسارات الجسيمات في الفيديو المحدد ويحفظ المعلومات في ملفات Matlab (.mat) (movieData.mat، Channel_1_detection_result.mat، channel_1.mat، Channel_1_tracking_result.mat)، انظر الشكل 2.

كما هو مبين في الشكل 2، حساب معاملات نشرها والتصنيف مسارات الأوامر، يقوم بإنشاء ملفات مختلفة (diffusionCoefficients.txt، diffusionCoefficientsMobile.txt، diffusionCoefficientsShort.txt، trajectoryClassificationLong.txt، إلخ). أفضل إدارة المعلومات الواردة في هذه الملفات باستخدام برنامج Excel والمنشور. وتتضمن المعلومات التي يمكن الحصول عليها من هذا التحليل:

  1. النسبة المئوية للبقع غير متحرك. يمكنك استخدامها كمرجع للجسيمات غير متحرك: المئوية 95% د1-4 القيم التي تم الحصول عليها (1) من جزيئات مفردة في الخلايا الثابتة و/أو (2) من البروتين المنقي الفلورسنت يعلق على كوفيرسليبس (الشكل 3A).
  2. النسبة المئوية للمسارات الطويلة (> 50 الإطارات) (الشكل 3).
  3. نوع الحركة من المسارات الطويلة: توجه، مجاناً، وتقتصر (الشكل 3).
  4. معامل نشر (د1-4) من الجزيئات المحمولة في الخلايا تعامل مع التحفيز المختلفة (الشكل 4 أ).

ويحلل الخطوة 5 من البروتوكول كثافة كل الجسيمات على طول المسار. البرنامج النصي أناليزيسبوتينتينسيتيس سيطبع على الشاشة جميع المعلومات التي تم تحليلها. لكل بقعة والإطار، يعرض البرنامج النصي إحداثي المكان في هذا الإطار (x, y) في وحدات بكسل، تقدير الخلفية الفلورية (k0)، كثافة بقعة الخام في التصحيح 3 × 3، كثافة المصوبة (محسوبة ككثافة الخام ناقص، الخلفية)، الحد الأقصى لقيمة كثافة لوحظ في التصحيح، وعدد المنطقة داخل القناع حيث هذا المكان يقع في هذا الإطار. مثال على هذا نوع الإنتاج

بقعة = 43 الإطار = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
k0 = 1571
سبوتراوينتينسيتي = 5550.1111
سبوتكورريكتيدينتينسيتي = 3979.1111
ماكسكورريكتيدسبوتينتينسيتي = 6243
ماسكريجيون = 2

يتم تخزين كافة هذه المعلومات في ملف سجل (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) وجدول الذي يمكن قراءته من Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). بعد تحليل كل بقعة، يطبع البرنامج النصي كثافة متوسط على طول المسار ومنطقة الأغلبية داخل القناع

بقعة = 43
مينكوريكتيدسبوتينتينسيتي على طول إطارات = 4762.303
المنطقة الأغلبية = 3

يتم تخزين هذه المعلومات في ملف السجل أعلاه وجدول الذي يمكن قراءته من جدول بيانات (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). على سبيل مثال، يبين الشكل 4Bمتوسط كثافة بقعة (msi) لكل الجسيمات على طول على مسار في خلايا حفز مع ظروف مختلفة. قد نستخدم هذه المعلومات لتقدير حجم الكتلة الفلورسنت تقريبا الآن. كما يعني في بقعة يرتبط كثافة تصحيحها مع عدد البروتينات الفلورية الموجودة في هذه البقعة، والأسفار من مونومر يمكن أن يقاس من خلال تجربة مشابهة ولكنها مستقلة، ومباشرة بحساب عدد مستقبلات كل الجسيمات. ويرد توزيع تواتر عدد مستقبلات كل الجسيمات باستخدام كمرجع كثافة البروتين أحادي المعرب عنها في نفس الخلايا في الشكل 4.

نشر جمع وكثافة الأمر إنشاء ملفين: واحد يسمى diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtوآخر يسمى log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt في الدليل والنتائج/ المسارات تراكينجباكاجي/. كلا الملفين تحتوي على 1) في فهرس بقعة 2) معامل نشر، 3) الكثافة وعدد 4) في المنطقة داخل القناع. ويمكن قراءة هذه الملفات من جدول بيانات.

وبالمثل، سيتم إنشاء الأمر التصنيف وكثافة مسار جمع الملفين واحد يسمى trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt و آخر log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt في دليل النتائج/تراكينجباكاجي/المسارات. أول واحد يحتوي على 1) الفهرس الموضعية، 2) ونوع الحركة، 3) البقعة اللحظة الأولى، 4) الكثافة، 5) د1-4 و 6) رقم المنطقة داخل القناع. يمكن قراءة هذا الملف من Excel.

ويرد موجز لجميع الملفات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول في الشكل 2. التحليلات الأخرى التي يمكن تنفيذها باستخدام هذا البروتوكول يتضمن مقارنة المعاملات الحيوية مقابل الصغيرة بقع أكبر، أي مونومرات مقابل ليغومرات، الاختلافات في هذه المعاملات الحيوية الناجمة عن يغاندس، ومثبطات، وتكوين غشاء، تغيير إشارات المسارات، إلخ. وقد أجريت تحليلاً كاملا للسلوك CXCR4 ردا على ما يجند CXCL12 تحت ظروف تجريبية مختلفة باستخدام هذا البروتوكول13.

Figure 1
الشكل 1 : فرز الخلايا. التعبير عن التجارة والنقل في الخلايا جوركات ترانسفيكتيد مع أكجفب CXCR4 قبل وبعد فرز الخلايا. تحديد الخلية معربا عن المستويات المنخفضة للتجارة والنقل (بروتينات فلورية خضراءمنخفضة) والمستخدمة لتجارب TIRF.

Figure 2
الشكل 2 : ملخص للملفات التي تم إنشاؤها- ويوضح الشكل كافة الملفات التي تم إنشاؤها باستخدام روتين Matlab الموصوفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تصنيف المسارات. عدد من أنواع مختلفة من المسارات المقابلة للخلايا تعامل مع محفزات مختلفة. (أ) النسبة المئوية للبقع غير متحركة، (ب) النسبة المئوية لمسارات طويلة ونوع حركة المسارات الطويلة (ج).

Figure 4
الشكل 4 : معامل نشر، ومتوسط كثافة بقعة وعدد مستقبلات كل الجسيمات. (أ) توزيع قيم معاملات (د1-4) نشر قصيرة لكل بقعة في الاستجابة للمحفزات المختلفة (الأول والثاني والثاني والرابع). الخط الأحمر يمثل القيمة الوسطية لمد1-4. (ب) متوسط كثافة بقعة (msi) قيم لكل نقطة على طول إطارات 20 أولاً في الاستجابة للمحفزات المختلفة (الأول والثاني والثاني والرابع). الخط الأحمر يمثل قيمة متوسط الكثافة (SD). (ج) النسبة المئوية لمستقبلات/الجسيمات المستخرجة من توزيع كثافة الجزيئات الفردية، أخذ كعرض بن قيمة كثافة البروتين أحادي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الإضافي رقم 1: فتح ملف تيرفم في فيجي أو إيماجيج. الخيارات التي تظهر في نافذة الأشكال الحيوية عند سحب وإسقاط فيديو.lif. اضغط هنا لتحميل الرقم. 

تكميلية الشكل 2: حدد السلسلة. الصور الموجودة في الفيديو.lif. (أ) الإطار الذي يسمح تحديد سلسلة ليتم تحليلها، بما في ذلك صور متعددة القنوات. (ب) مثال نتيجة لسلسلة مختارة، بما في ذلك الصورة متعدد القنوات (إلى اليسار) والمقابلة فيديو (يمين). اضغط هنا لتحميل الرقم. 

تكميلية الشكل 3: تقسيم القنوات. (أ) إطار التقاط الأوامر إيماجيج بحاجة لتقسيم القنوات صورة متعددة القنوات ومثال (ب) نتيجة للقناة تقسيم. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 4: دمج القنوات. (أ) دمج قنوات مختلفة في صورة واحدة. (ب) التحديد بدمج قناة. (ج) مثال نتيجة دمج للقناة. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 5: مزامنة windows. (أ) الترجمة في القائمة إيماجيج الأوامر المطلوبة لتزامن الصورة والإطار الناتج عن ذلك (ب). اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 6: حدد منطقة الفائدة. (أ) اختيار الإطار الاهتمام باستخدام أداة التحديد المستطيل والنتيجة (ب) لاقتصاص الصورة. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 7: حفظ الفيديو. إنقاذ منطقة الفائدة كتسلسل صورة والمعلمات للحفظ كنافذة تسلسل الصورة. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 8: تجزئة. (أ) فتح تجزئة محرر البرنامج المساعد في قائمة الإضافات إيماجيج. (ب) إضافة تسميات والمواد للتجزئة. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 9: تصميم قناع. (أ) اختيار التسميات المناسبة وتعريف قناع أخضر. (ب) اختيار القناع الأحمر. سبيل المثال أقنعة اثنين المقابلة لتسميات اثنين. (ج) توفير الأقنعة كملف.tiff. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 10: دليل العمل Matlab. اختيار الدليل الصحيح الذي يحتوي على سلسلة ليتم تحليلها. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 11: U-المسار القائمة الرئيسية. (أ) اختيار الفيلم وطبعه فيلم (ب) (ج) قناة إعدادات القوائم. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 12: حدد نوع الكائن لتعقب. حدد تتبع واحدة من الجسيمات. اضغط هنا لتحميل الرقم.

التكميلي رقم 13: الكشف عن الجسيمات. (أ) ش-المسار، لوحة التحكم. (ب) مثال لإعدادات للكشف عن الجسيمات. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 14: مثال للنتائج للكشف عن الجسيمات. الإطارات المختلفة التي تتضمن قائمة عارض وقائمة خيارات الفيلم والفيلم. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 15: تتبع القائمة. مثال لإعدادات. (ج) وتتبع (أ)، (ب) الإعداد--ربط الإطار إلى إطار الفجوة إغلاق ودمج وتقسيم القوائم. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 16: مثال لنتائج للجسيمات تتبع. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الرقم 17: قائمة تحليل المسار. مثال لإعدادات. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 18: تحقق تحليل المسار. شاشة عرض بعد تحليل المسار، بما في ذلك إطار فيديو يظهر الكشف عن الجسيمات والمسارات المقابلة. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الرقم 19: حساب معاملات نشرها. تحسب رسوم بيانية لمعاملات نشر (يسار) ويعني التربيعية التشرد (MSD، حق). اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الشكل 20: حساب معاملات نشرها بما في ذلك وسائط مناسبة مختلفة. تحسب رسوم بيانية لمعاملات نشر (يسار) ويعني التربيعية التشرد (MSD، الحق) لنموذج المحصورة. اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الرقم 21: كثافة. مثال لكثافة بقعة على طول المسار (الخط الأزرق) والخلفية (الخط الأحمر). اضغط هنا لتحميل الرقم.

تكميلية الرقم 22: الخلفية لكل إطار. اليسرى: صورة الخلية عينة. الأوسط: الكشف عن الخلية تلقائياً. حق: تحديد مجال تلقائياً كخلفية. اضغط هنا لتحميل الرقم.

فيديو إضافية 1: مثال نموذجي الفيديو المجهري TIRF تبين وجود جسيمات بكثافات مختلفة وأنواع من الحركات. اضغط هنا لتحميل الفيديو.

مواد تكميلية 1: الملفات التي تحتوي على كافة البرامج النصية بروتوكول المستخدمة في إجراءات مخصصة تستخدم لتصنيف المسارات وتحليل حجم الكتلة. اضغط هنا لتحميل المواد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصف الأسلوب السهل للقيام حتى بدون وجود أي خبرة سابقة في العمل مع Matlab. بيد أن الروتين Matlab تتطلب بالغة الدقة مع تسمية الأوامر المختلفة وإضفاء الطابع المحلي على المجلدات المختلفة المستخدمة من قبل البرنامج. في التعقب التحليل الروتيني (الخطوة 3)، يمكن تعديل معلمات متعددة. نافذة "إعداد خليط ضبابي النموذج المناسب" (الخطوة 3.8) يتحكم كيف يو-المسار سيتم الكشف عن الجسيمات واحد على الفيديو. ويتم ذلك بتركيب نموذج غاوسي خليط كما هو موضح في3. إحدى المعلمات الرئيسية لتركيب هذا تعريف عامل تصفية للمساعدة في تحديد ماكسيما المحلية. أن نجاح هذه العملية يتوقف على تباين الصورة والضوضاء الموجودة في الصور. يتحكم المعلمة الأولى (قيمة ألفا للمقارنة مع الخلفية المحلية) ثقة ماكسيما يجري بقعة حقيقية، بينما تساعد الثانية للحد من الضوضاء أثناء تحديد البقع. المعالم الهامة في الخطوة "تتبع" (3.9) هي عدد الإطارات لسد الثغرات (وهذا مسار قد تمتد عبر الإطارات التي الجسيمات لا يعتبر فعلا، ولكن ينظر إليه على أنه قبل هذه الإطارات وبعد هذه الإطارات؛ وفي المثال، 0) ، وعدد الإطارات التي يجب أن تمتد على مسار لكي يعتبر كمسار ناجح (في هذا المثال، المعلمة 20؛ وهذه تتصل بسرعة اقتناء كاميرا وعدد الإطارات في المسار يجب أن يسمح حساب شركة نشر الكفاءة). من المهم أيضا أن تقرر ما إذا كنت تريد دمج وتقسيم شرائح (في المثال اختيرت هذه الإمكانيات اثنين). ثم، يجب تعيين المعلمات لالخطوه 1 في وظائف التكلفة (ربط الإطار للإطار). تتحكم هذه الدالة كيف يتم تعقبها الجسيمات على طول الإطارات. المعلمات الأكثر أهمية في هذه المرحلة هو اختيار قيمة radius البحث براونية، التي تتحكم في مدى كل بقعة من المتوقع أن يكون في الإطار التالي. في المثال الخاص بنا نحن اختيار 0 و 5 كالدنيا والحدود العليا، على التوالي. علما أن هذه المعلمات محددة جداً لطبيعة الجسيمات التي يتم تعقبها، وأنها قد تكون لضبطها في كل حالة على حدة. أهمية خاصة هي سلطة التحجيم في البراونية وخطي البحث عن إنصاف أقطار. هذه تحجيم القوى يعتمد على نوع حركة الجسيمات (نشر مجاناً أو المحصورة). في المثال، اختيرت القيم (0.5، 0.01) مجاناً من نشرها. للحصول على وثائق محددة لهذه المعلمات، راجع3.

في حساب الأمر نشر معاملات (الخطوة 4، 4)، يمكن أن يكون معلوما الحد الأعلى لمعامل نشر جزيئات غير متحرك من التجارب السابقة أو بواسطة تشغيل الدالة كالكولاتيديفوسيون في مشروع منفصل مع غير متحرك وأفادت الجسيمات (تنقية البروتين أحادي الفلورسنت) ورؤية معاملات نشر. تأخذ هذه الدالة معلمتين من معلمات إضافية: 'outputSuffix´، التي يتم إضافتها إلى أسماء ملفات الإخراج وافتراضياً يأخذ قيمة فارغة، و' plotLength´، التي بشكل افتراضي هو 13 وهو عدد الفاصل الزمني (بالثواني) الذي يتم تنفيذ العملية الحسابية نشر. ويعني الوضع المناسب 'ألفا' تعديلاً من MSD للمنحنى

Equation 1

أن إزاحة (MSD0)، ووظيفة سلطة من الوقت متخلفة. الأس هذا وظيفة السلطة، Equation 2 ، يحدد ما إذا كانت الحركة يقتصر (0 < α < 0.6)، والشاذ (0.6 < α < 0.9)، مجاناً (0.9 < α < 1.1)، أو توجيه (α > 1.1). لإجراء استعراض لهذا النوع من التحليل ويحال القارئ إلى مانزو et al.9

حساب معاملات نشر4 تنتج الرقمين الإخراج (انظر تكميلية الشكل 19). أول واحد يظهر الرسم بياني لنشر معاملات المحسوبة (المذكرة أن هناك في هذه المرحلة، معامل نشر مستقلة لكل مسار). كما ترد في وحدة التحكم Matlab يعني والقيمة المئوية 95% من هذه المعاملات. ويبين الرسم الثاني MSD (المنحنى الأحمر) وعدد الخطوات التي نظرت لحسابها كدالة للفاصل الزمني لتلك المسارات التي تعتبر المتنقلة (تلك التي معامل نشر فوق العتبة في سطر الأوامر). ويحسب المتوسط والانحراف المعياري لمسارات متحركة (وهذه هي القيم للمسارات في خلية واحدة). في المثال، يتم الأس 0.59 معنى أن تقتصر الحركة. لهذا المنحنى المناسب، تقارير البرنامج عدم اليقين المرتبطة بكل واحد من المعلمات (كما هو موضح في الانحراف المعياري لكل واحد) والخير من صالح (حلاً مثاليا ستصل إلى الصفر). وفي هذه المرحلة، وبعد التحقق من قيمة ألفا قد نقرر أن تناسب MSD مع وظيفة مختلفة:

Equation 3    إذا كان 0 < α < 0.6 (المحصورة)

Equation 4إذا 0.9 < α < 1.1 (مجاناً)

Equation 5إذا كان α > 1.1 (توجيه)

لا يمكن أن تكون مزودة مسارات الشاذ وظيفة مختلفة. في حالة الجسيمات المحصورة يمكن حساب حجم الولادة (في ميكرون) كما هو الحال في ديستينفيل وآخرون14

Equation 6

مؤشر جيد من المناسب الصحيح أن الخير لصالح ينبغي أن يقلل من ألفا المناسب لتركيب النهائي (في المثال، الخير تناسب يسقط من 0.30474 إلى 0.15749، تكميلية الشكل 19-20). ملفات كالكولاتيديفوسيونكريتيس اثنين في "results\TrackingPackage\tracks" داخل الدليل سلسلة تسمى "diffusionCoefficients.txt" و "diffusionCoefficientsMobile.txt". تحتوي هذه الملفات على ثلاثة أعمدة: 1) الفهرس لكل إدخال مسار، 2) عن معامل نشر المقابلة، 3) منطقة الأغلبية في القناع حيث ينتمي هذا المسار إلى (المناطق التي تم الحصول عليها من الملف "mask.tif" التي ولدت لنا في الخطوات 2.7؛ إذا كان هذا الملف غير موجود، ثم هذا العمود غير موجود). يمكنك استخدام هذا الملف والملفات المماثلة التي تم إنشاؤها للخلايا الأخرى لتحليل توزيع معامل نشر لمجموعة من الخلايا تحت ظروف تجريبية مماثلة.

في حساب معامل نشر لمسارات قصيرة (خطوات 4.7-4.8)، المعلمة الأخيرة 'قصيرة' لاحقة إضافة إلى اسم ملف الإخراج حيث كنت قد تحليل مجموعات فرعية مختلفة من المسارات دون الكتابة فوق في diffusionCoefficients.txt الملفات. هو الاسم الفعلي لملفات الإخراج ".txt ديفوسيونكوفيسينتس < لاحقة >" و "ديفوسيونكوفيسينتسموبيلي < لاحقة >.txt". إذا أعطيت لا لاحقة، كما هو الحال في التحليل العام إجراء أعلاه، ثم يفترض لاحقة فارغة. معلمات النموذج (د والخامس MSD0) قد تختلف عن تلك المجهزة على جميع المسارات. آخر ملحوظ، عادة زيادة الانحراف المعياري للمعلمات، فضلا عن احتواء الخير. والسبب هو أن مسارات قصيرة هم أكثر اضطرابا ومناسب يمكن الاعتماد عليها أكثر صعوبة.

تحليل مسارات طويلة (الخطوة 4.9) تصنيفهما في المحصورة (1)، مجاناً (2)، أو (3) الموجهة وفقا لتلك اللحظة الأولى وموقعه فيما يتعلق مقاييس النسبة المئوية 2.5% و 97.5 في المائة من اللحظة الأولى من مسارات عشوائية 500 مع البراونية، نفس معامل الانتشار وطول مسار يجري تحليل ومحاكاة عن طريق مونتي كارلو. إذا كان أول لحظة من مسار يجري تحليل أقل من 2.5% اللحظات الأولى التي لوحظت في عمليات المحاكاة، والمسار قيد الدراسة تصنف كما تقتصر. إذا كان فوق ال 97.5 في المائة اللحظات الأولى محاكاة، تصنف حسب توجيهات؛ وإلا فإن المسار يصنف براونية. استخدم في الأمر، 113.88e-3 حجم بكسل في ميكرومتر، 0.0015 الحد الأعلى لمعامل انتشار بقع غير متحركة تقاس في/ق2ميكرومتر، و 'طويلة' هو لاحقة لاسم ملف الإخراج. العمود الأول من هذا الملف ("trajectoryClassificationLong.txt") هو رقم المسار، والثاني هو تصنيفه (1 = محصورة، 2 = مجاناً، 3 = الموجهة)، والثالث هو المسار اللحظة الأولى.

البرنامج النصي لحساب كثافة كل الجسيمات (الخطوة 5، 1) هو درجة عالية من المرونة ويتيح تتبع كثافات fluorescence في العديد من الطرق المختلفة (كل واحدة مناسبة تماما لحالات مختلفة مثل تتبع البقع غير متحرك من تجربة مراقبة أو تتبع البقع العالية المنقولة عبر خلية مع الخلفية الفلورية متغير). البرنامج النصي سيتم تحليل جميع المسارات على طول كل الإطارات. لكل نقطة في كل إطار سوف قياس كثافة بكسل حول الحال (هو يحلل رقعة مربعة حول مكان الحادث، بشكل افتراضي حجم 3 × 3 بكسل)، وتقدير الحال الخلفية وحساب الأسفار الفرق بين الحال الخلفية. ويمكن تقدير النسبة المئوية للجسيمات فوتوبليتشينج وعدد الجسيمات الفلورية في كتلة واحدة، ينظر إليها على أنها بقعة واحدة، بهذه الطريقة.

ينتج هذا الأسلوب الآلي (جاثيرتراجيكتوريكلاسيفيكاتيوناندينتينسيتي) معلومات حول معلمات متعددة (كثافة بقعة، نشر الأفقي، ونوع الحركة)، التي يمكن أن تساعد على دراسة العلاقة بين حجم البقعة وديناميته في ظروف القاعدية، وكيف يمكن العلاجات المختلفة لتعديل هذه المعلمات.

تحديد الأسلوب الرئيسي أنه يتطلب تعداء الخلايا مع البروتين الفلورسنت لتعقب. تعداء يؤدي عادة إلى overexpression البروتين، مما يعوق البروتين وحيد تتبع. خلية الفرز خطوة يجب تضمين لتحديد الخلايا الإعراب عن عدد من المستقبلات التي تسمح لكشف وتتبع الجسيمات مفردة بالفحص المجهري SPT TIRF. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب لتتبع الجزيئات الحيوية المسمى مع نقاط الكم أو القوات المسلحة البوروندية وشظايا. يتطلب بروتوكول وصف عدد من عناصر التحكم التي يجب أن يتم تحليلها سابقا بغية التأكد من صحة استنتاجات مدفوعة من التحليل. أولاً وقبل كل شيء، من المهم تحديد شروط التعبير المناسبة التي تسمح بكشف وتتبع الجسيمات مفردة. أفلام ذات الكثافة من ~ 4.5 الجسيمات/ميكرون2، المقابلة لمستقبلات 8,500-22,000/الخلية، استخدمت لتحليل المنظمة الزمانية ل مستقبلات غشاء الخلية13.

من المهم إنشاء معامل نشر الاكتشاف الحد الأدنى باستخدام تنقية البروتينات أكجفب أحادي أو الخلايا الثابتة. وفي كلتا الحالتين يفترض أن هناك لا نشرها ولذلك فإننا نقدر أن نشر قيم الجسيمات التي تم تحليلها في هذه الظروف تتطابق مع جزيئات المعطل تداولها وتستخدم للتمييز بين مسارات متحركة وغير متحركة13.

التحليل وقد قدمنا هنا هو أداة تحليل مسار عام، التي يمكن تطبيقها في تحليل نشر مستقبلات سوبيريسولوشن وتحليل الصور حيود محدودة لتحليل حركة الخلوية بالفحص المجهري القياسية . والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب مع الآخرين الموصوفة سابقا، مثل تحليل عدد وسطوع11، أنه يتيح تقييم قيم الكثافة يعني من كل بقعة الفردية على طول مساره، آخذا في الاعتبار وقت البقاء على قيد الحياة البروتين أحادي أكجفب قبل فوتوبليتشينج. الوقت البقاء على قيد الحياة من جزيء قبل فوتوبليتشينج سوف تعتمد بشدة على ظروف الإثارة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

نحن نشكر مانزو كارلو وماريا غارسيا براجو للتعليمات البرمجية الخاصة بهم في التعليمات ومصدر لتحليل معامل نشر. بتأييد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من وزارة العلوم الإسبانية، والابتكار والجامعات (القوات المسلحة السودانية عام 2017-82940-R) وبرنامج ريتيكس معهد الصحة "كارلوس الثالث" (RD12/0009/009 و RD16/0012/0006؛ RIER). تدريبيا والشركة معتمدة من قبل برنامج كومفوتورو للسفن العامة مؤسسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 146، SPT، مستقبلات تشيموكيني، تتبع، مجموعات، ونشرها، وتحليل البرمجيات
معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sorzano, C. O. S.,… More

Sorzano, C. O. S., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter