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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Bildverarbeitungs-Protokoll für die Analyse der Diffusion und Cluster-Größe von Membranrezeptoren durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59314
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,5, 3, 1,6, 3, 3
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.
* These authors contributed equally

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die einzelnen Partikels tracking Bildanalyse, die quantitative Bewertung des Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größen der einzelnen Partikel erkannt durch Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht.

Abstract

Particle tracking auf einer Videosequenz und die hinteren Analyse ihre Flugbahnen ist heutzutage ein häufiger Vorgang in vielen biologischen Studien. Mit der Analyse der Zellmembran Rezeptor-Cluster als Modell, präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für dieses Bild Analyseaufgabe Fidschi (ImageJ) und Matlab Routinen zu verwenden: 1) Regionen von Interesse zu definieren und gestalten Masken angepasst auf diese Regionen; (2) die Partikel in Fluoreszenz-Mikroskopie-Videos zu verfolgen; (3) Analyse der Verbreitung und Intensität Eigenschaften der ausgewählten Stücke. Die Quantitative Analyse der die Diffusionskoeffizienten, Arten von Bewegung und Cluster-Größe durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildverarbeitung bietet ein wertvolles Werkzeug, um Partikel Dynamik und die Folgen einer Änderung Objektiv zu bestimmen Umweltbedingungen. In diesem Artikel präsentieren wir ausführliche Protokolle für die Analyse dieser Funktionen. Die beschriebene Methode hier können nicht nur Einzelmolekül-Tracking-Erkennung, aber auch automatisiert die Schätzung der lateralen Diffusion Parameter an der Zellmembran, klassifiziert den Typ der Flugbahn und ermöglicht die vollständige Analyse so überwinden die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung der Punktgröße in seiner gesamten Flugbahn an der Zellmembran.

Introduction

Membranproteine in der Lipid-Bilayer eingebettet sind in kontinuierlicher Bewegung durch thermische Diffusion. Ihre Dynamik sind für Zell-Reaktionen zu regulieren wie intermolekulare Wechselwirkungen Bildung von komplexen, die variieren in der Größe von Monomeren, Oligomeren und beeinflussen die Stabilität erlauben der komplexe Signalisierung. Aufklärung der Mechanismen, die Steuerung von Proteindynamik ist somit eine neue Herausforderung in der Zellbiologie, notwendig, Transduktion Signalwege zu verstehen und unerwartete Zellfunktionen zu identifizieren.

Einige optische Methoden zu studieren diese Interaktionen in lebenden Zellen1. Unter diesen ermöglicht Totalreflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie, entwickelt in den frühen 1980er Jahren die Untersuchung der molekularen Wechselwirkungen an oder sehr nahe der Zellmembran2. Um dynamische Parameter der Membrane Protein Trajektorien gewonnenen TIRF Daten in lebenden Zellen zu untersuchen, ist ein einzelnes Teilchen tracking-Methode (SPT) erforderlich. Obwohl mehrere Algorithmen dafür zur Verfügung stehen, verwenden wir derzeit von Jaqaman Et Al.3 , die Partikel Bewegung Heterogenität in einem dichten Partikel Feld Adresse durch die Verknüpfung von Teilchen zwischen den aufeinander folgenden Frames, die daraus resultierende Strecke verbinden Segmente in komplette Trajektorien (temporäre Teilchen verschwinden). Die Software erfasst das Teilchen zusammenführen und teilen, die sich aus der Aggregation und Dissoziation Veranstaltungen3. Die Ausgabedaten dieser Software gehört Erkennung der Partikel entlang der gesamten Flugbahn durch die Festlegung ihrer X und Y Positionen in jedem Frame.

Sobald Partikel erkannt werden, wenden wir verschiedene Algorithmen, um die kurze Spanne Diffusion-Koeffizient (D1-4)4,5zu bestimmen. Durch Anwendung der Moment Skalierung Spektrum (MSS)6,7,8 Analyse oder durch den Einbau des 'Alpha'-Wert durch Anpassung der mittlere quadratische Verschiebung (MSD) auf der Kurve9klassifizieren wir auch die Partikel der Typ der Flugbahn.

Analyse der spot Intensität in Fluoreszenzbilder ist ein gemeinsames Ziel für Wissenschaftler im Bereich10,11. Der am häufigsten verwendete Algorithmus ist die so genannte Zahl und Helligkeit. Diese Methode erlaubt dennoch keine richtige Frame-by-Frame-Intensität-Erkennung in Teilchen in der mobilen Fraktion. Wir haben, so einen neuen Algorithmus, diese Teilchen Intensitäten Frame-by-Frame zu bewerten und zu bestimmen, deren Aggregatzustand erzeugt. Sobald die Koordinaten jedes Partikels mit U-Track2 Software3erkannt werden, definieren wir ihre Intensität in jedem Frame über die gesamte Flugbahn, auch unter Berücksichtigung der Hintergrund der Zelle in jedem Frame. Diese Software bietet verschiedene Möglichkeiten, die vor Ort Intensität und der Hintergrund der Zelle bestimmen und mit bekannten Monomeren und dimeres Proteine als Referenzen, die ungefähre Anzahl der Proteine in der Partikel erkannt (Clustergröße) berechnet.

In diesem Artikel beschreiben wir eine sorgfältige Anleitung um diese drei Schritte ausführen: 1) Erkennung und Verfolgung einzelner Partikel entlang ein Video von Fluoreszenz-Mikroskopie mit U-Track; (2) Analyse der momentanen Diffusionskoeffizienten (D1-4) von diesen Teilchen und die Art der Bewegung (geschlossenen, frei oder gerichtet) Partikel mit lange Flugbahnen von MSS; (3) Messung der vor Ort Intensität entlang der Video korrigiert, indem die geschätzten Hintergrundfluoreszenz für jeden Fleck. Dadurch können Cluster Größe Schätzung und Ermittlung von Immunofluoreszenz-Schritte.

Die Verwendung dieses Protokolls erfordert keine spezielle Fähigkeiten und kann in jedem Labor mit Zellkulturen durchgeführt werden, fließen Cytometry und Mikroskopie Einrichtungen. Das Protokoll verwendet ImageJ oder Fidschi (eine Verteilung von ImageJ-12), U-Track3und einige Ad-Hoc gemacht-Routinen (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-Track und ad-hoc-Routinen Überfahren von Matlab, die in jedem kompatiblen Computer installieren kann.

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Protocol

1. Vorbereitung von biologischen Proben

  1. Jurkat Zellen in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % FCS, NaPyr und L-Glutamin (komplette RPMI). Electroporate Jurkat-Zellen (20 x 106 Zellen/400 µL von RPMI 1640 mit 10 % FCS) mit einem Monomeren GFP gekennzeichnet Chemokin-Rezeptor Vektor (CXCR4-AcGFP, 20 μg) ermöglichen die Erkennung mit Fluoreszenz-Mikroskopie.
    Hinweis: Es ist möglich, andere Monomeren fluoreszierende Proteine wie mCherry, mScarlet, etc. zu verwenden.
  2. 24 h nach Transfektion analysieren Zellen im Durchflusszytometer Zellviabilität und CXCR4-AcGFP Ausdruck bestimmen.
  3. Wählen Sie Zellen mit dem Ausdruck CXCR4-AcGFP niedrige durch Zellsortierung GFPgeringe positive Zellen (Abbildung 1), wie geringe Expression des Rezeptors transfizierten in TIRFM Experimente erforderlich ist, um Einzelkorn-Tracking für die Verfolgung einzelner zu gewährleisten Trajektorien9.
  4. Die Anzahl der Rezeptoren der Zelloberfläche zu quantifizieren.
    Hinweis: Als ein Beispiel13, ~ 8.500-22.000 AcGFP beschriftet Rezeptoren/Zelle, entsprechen Sie ~ 2-4,5 Partikel/μm2.
  5. Aufschwemmen Sie sortierte Zellen in komplette RPMI und inkubieren Sie für mindestens 2 h bei 37 ° C, 5 % CO2. Zentrifugieren Sie Zellen (300 X g, 5 min), und Nukleinsäuretablette sie in TIRF Puffer (HBSS, 25 mM HEPES, 2 % FCS, pH 7,3).
    1. Platte auf 35 mm Glasboden Microwell Gerichte (2-3 x 105 Zelle/Gericht) ummantelt mit Fibronektin (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) das Vorhandensein oder Fehlen der entsprechenden Liganden (z. B. CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Inkubieren Sie Zellen (20 min bei 37 ° C, 5 % CO2) vor der Bildaufnahme.
  6. Experimente mit einem TIRF-Mikroskop, ausgestattet mit einer EM-CCD-Kamera, ein 100 x Ölimmersion Ziel (HCX PL APO 100 X / 1,46 NA) und einem 488 nm Diodenlaser. Das Mikroskop ermöglicht Kontrolle der Temperatur und Inkubation mit CO2. Suchen Sie und konzentrieren Sie sich Zellen mit grob- und Fokusknöpfe, mit Hellfeld, um Immunofluoreszenz Auswirkungen zu minimieren. Verwenden Sie für feine Fokus-Einstellung im TIRF-Modus, eine niedrige Laserintensität, nicht ausreichend für einzelne Partikeldetektoren oder Immunofluoreszenz Effekte (5 % Laserleistung, 28 Wμ) induzieren.
  7. Erwerben Sie Filme (Bildsequenzen) von ca. 50 s das Zeitintervall zwischen den Frames zu minimieren. Durchdringung der evaneszenten Feldes sollte 70-90 nm Tiefe. Speichern Sie die erworbenen Filme für jede experimentelle Bedingung als ".lif" (video.lif).
    Hinweis: Filme im beschriebenen Beispiel mit 49 % am Laserleistung erworben wurden (2 mW) mit einer Belichtungszeit von 90 ms und ein Zeitintervall von 98 ms für 49 s (500 Bilder). Durchdringung der ausgewählten evaneszenten Welle war 90 nm.

2. Auswahl von Bildern und Erstellen von Masken

  1. Für jede Versuchsbedingung (video.lif) Erstellen eines neuen Ordners (VideoName), das verschiedene Ordner für jede Serie enthalten muss. Jeder Ordner enthält einen Ordner "VideoSeq" für die Videobilder und einen Ordner "Ergebnisse" für die Ergebnisse der Analyse. Stellen Sie sicher, dass die Dateistruktur in diesem Moment die folgende ist:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/VideoSeq
    VideoName/Series1/Ergebnisse
    Hinweis: Vom Mikroskop werden verschiedene .lif Dateien mit mehreren Videos für jede Behandlung Zustand (d. h. FN, FN + SDF) erzielt. "video.lif" entspricht die input.lif video-Datei mit allen TIRF Filme Akquisitionen (Serie) unter dem Mikroskop durchgeführt. "VideoSeq" Ordner enthält die 500 Frames des Films, die wir analysieren. Die "Ergebnisse"-Ordner enthält alle Dateien, die aus der Analyse durchgeführt. Exakte Nomenklatur und Lokalisierung von den verschiedenen Ordnern sind unerlässlich für die korrekte Funktion der Algorithmen. Namen in Fettschrift in der obigen Liste sind festgelegt (d. h., sie haben auf diese Weise aufgerufen werden, denn das sind die Namen von den Skripts gesucht). Namen nicht in Fett können ändern sich entsprechend der Versuch durchgeführt.
  2. Öffnen Sie das TIRFM Video (.lif Datei) mit Fidschi oder ImageJ per Drag & Drop die Datei auf die Fidschi-Menüleiste und klicken Sie auf OK um die Lif-Datei mit BioFormats (ergänzende Abbildung1) zu importieren.
  3. Wählen Sie die Serie zu verarbeiten und klicken Sie auf "OK" (zusätzliche Abbildung 2A). Um eine Maske für die Analyse des Videos zu entwerfen, auch die Einfuhr von einem Mehrkanalbild mit verschiedenen Chromophore (im Beispiel Serie 1 ist das Multichannel-Bild und Serie 2 das entsprechende Video). Das Video (und die Mehrkanalbild) sollte als eine ImageJ-Stapel öffnen. Im Beispiel (Supplemental Abb. 2 b) das Bild auf der linken Seite und das Video ist auf der rechten Seite.
    Hinweis: Wenn Erstellung einer Maske für das Video nicht benötigt wird, fahren Sie mit Schritt 2.5.
  4. Erstellen Sie eine Maske. Erstellen Sie ein einzelnes Bild mit den Kanälen nützlich für das Design der Maske. In diesem Fall sind die interessante Kanäle rot, grün und grau.
    1. Die Kanäle von Mehrkanalbild (ergänzende Abbildung 3A) aufgeteilt: Wählen Sie Bild in der Bar-Menü und klicken Sie auf Farbe | Kanäle trennen. Die verschiedenen Kanäle zeigen als Einzelbilder (ergänzende Abbildung 3 b).
    2. Verschmelzen wieder die drei Kanäle in einem einzigen Bild (ergänzende Abbildung 4A): Wählen Sie Bild in der Bar-Menü und wählen Sie Farbe | Kanäle verbinden. Wählen Sie die entsprechenden Kanäle und drücken Sie "OK" (zusätzliche Abbildung 4 b). Ein neues Bild nicht gestapelt werden generiert (ergänzende Abbildung 4).
    3. Synchronisieren Sie die beiden Fenster mit dem Synchronisieren Windows -Werkzeug (ergänzende Abbildung 5A): Wählen Sie analysieren in der Bar Menü | Werkzeuge | Synchronisieren Windows. Ein neues Fenster mit der Synchronisation Bild Möglichkeiten erscheint (ergänzende Abbildung 5 b).
    4. Mit den beiden Fenstern synchronisiert (nur das Video ist keine Mehrkanalbild verbunden sind) kann die gleiche Region in beiden Fenstern beschnitten werden. Zeichnen Sie die Region von Interesse mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug ImageJ schwebenden Menüs. Wählen Sie Bild in der Bar-Menü und wählen Sie Ernte (ergänzende Abbildung 6A). Die beiden abgeschnittenen Bilder zeigen individuell (ergänzende Abbildung 6 b).
    5. Unsynchronize Sie beide Fenster (ergänzende Abbildung 6 b) durch Drücken der Unsynchronize alle im Sync Windows Manager.
  5. Wenn eine Maske nicht wie in Schritt 2.4 erstellt wurde, zeichnen Sie die Region von Interesse mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug ImageJ schwebenden Menüs.
  6. Speichern Sie das Video als eine Bildsequenz in das Verzeichnis VideoSeq unter dem entsprechenden video-Verzeichnis (ergänzende Abbildung 7A): Wählen Sie die Datei in der Bar-Menü und klicken Sie auf als speichern | Bild-Sequenz... benennen Sie die Beschriftungen für die video-Sequenz als video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (ergänzende Abbildung 7 b): in das Feld Name benennen Sie als video und klicken Sie auf "OK". Die Sequenz muss allein in seinem Verzeichnis erfolgreich von U-Track verwendet werden.
    Hinweis: Wenn nicht entwerfen eine Maske für das Video, gehen Sie zu Schritt 2,8.
  7. Entwerfen Sie eine Maske. Wählen Sie das Mehrkanal-Bild und öffnen Sie die Segmentierung Editor Plugin (ergänzende Abbildung 8A): Wählen Sie Plugins in der Bar-Menü und wählen Sie Segmentierung | Segmentierung Editor. Fügen Sie hinzu und benennen Sie die Beschriftungen der Segmentierung nach Bedarf mit der rechten Maustaste auf den Etiketten der Segmentierung Editor (ergänzende Abbildung 8 b, C).
    1. Wählen Sie die entsprechende Auswahl-Werkzeug in ImageJ Schwebendes Menü (hier freihändig verwenden), wählen Sie eine Beschriftung (grün) und entwerfen zunächst die Regionen in äußerster Maske (ergänzende Abbildung 9A). Nachdem gestaltet, wird das + drücken Sie Option "Auswahl" der Verbundfenster und die ausgewählte Maske auf den Betrachter (ergänzende Abbildung 9A) angezeigt. Wiederholen Sie diesen Schritt mit folgenden Labels (innen in rot) (ergänzende Abbildung 9 b).
      Hinweis: Nachdem Sie die Maske für die grünen und Interieur Etiketten entworfen, wird die äußere Maske der Rest des Bildes einnehmen.
    2. Masken werden als Bereiche 0, 1, 2 im Bild codiert... entsprechend der Reihenfolge der Bezeichnungen in der RGB-Etiketten-Fenster. Wenn alle Masken für die verschiedenen Etiketten entworfen sind, speichern Sie die Maske mit den gleichen Dateinamen wie das Video mit dem Namen mask.tif (ergänzende Abbildung 9): Wählen Sie die Datei in der Bar-Menü und wählen Sie als speichern | TIFF....
      Hinweis: Die ausgewählte Masken werden in die Berechnung des Diffusionskoeffizienten und Einteilung der Bahnen (siehe Punkt 4.2) eingesetzt werden.
  8. Überprüfen Sie, dass die Dateistruktur in diesem Moment die folgende ist:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/mask.tif
    VideoName/Series1/ VideoSeq / video0000.tif
    VideoName/Series1/ VideoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Series1/ VideoSeq / video0499.tif
    VideoName/Series1/Ergebnisse
    Hinweis: Die mask.tif ist ein Bild mit der Maske wie Schritte 2.4 und 2.7 konzipiert. Die video*.tiff ist das Video, wie in Schritt 2.6 gespeichert. Wie oben beschrieben, die Namen in Fettdruck in die obigen Liste sind fest vorgegeben, d. h., sie müssen auf diese Weise bezeichnen, denn das sind die Namen von den Skripts gesucht. Namen nicht in Fett können ändern sich entsprechend der Versuch durchgeführt.

3. tracking die Partikel

  1. Verfolgen Sie alle Partikel, die in den ausgewählten Videos mit U-Track zu sehen.
  2. Öffnen Sie Matlab und U-Track-Verzeichnis auf den Pfad mithilfe Set Path hinzufügen | Fügen Sie mit Unterordnern Option im Menü. Speichern Sie den Pfad, sodass in Zukunft Hinrichtungen von Matlab U-Track ist auf dem Weg. Diese Einstellung muss nur einmal durchgeführt werden.
  3. Ändern Sie das Arbeitsverzeichnis in das Verzeichnis mit der Serie analysiert werden. U-Track durch Eingabe in die Konsole (ergänzende Abbildung 10) MovieSelectorGUI aufrufen, und drücken Sie die Eingabetaste. Die Film-Auswahl -Fenster wird geöffnet (ergänzende Abbildung 11A).
  4. Drücken Sie auf die Schaltfläche neu Film und der Film Edition Fenster erscheint (ergänzende Abbildung 11 b).
  5. Drücken Sie auf Kanal hinzufügen , wählen das Verzeichnis mit dem Video (VideoName/Series1/Video) und füllen die Film-Informationen-Parameter. Legen Sie das Ausgabeverzeichnis für die Ergebnisse von U-Track auf Ergebnisse (VideoName/Series1/Ergebnisse).
    Hinweis: Das Mikroskop und die Übernahme-Bedingungen können der Film Informationsparameter entnommen werden.
  6. Drücken Sie auf die erweiterten Kanaleinstellungen und füllen Sie die Parameter in Bezug auf den Erwerb. Suchen Sie die Werte der Parameter in das Beispiel (ergänzende Abbildung 11).
  7. Drücken Sie im Fenster Erweiterte Einstellungen Speichern und Speichern im Fenster Film Edition . Das Programm fragt nach Bestätigung des Schreibens der Datei namens movieData.mat im Verzeichnis Ergebnisse . Bestätigen.
  8. Nach dem Erstellen des Films, drücken Sie auf weiter im Fenster Film Auswahl. U-Bahn fragt über den Typ des Objekts analysiert werden. Wählen Sie Single-Partikel (ergänzende Abbildung 12). Das Control Panel Fenster erscheint (Supplemental Abb. 13A).
    1. Wählen Sie den ersten Schritt Schritt 1: Erkennung und drücken Sie auf Einstellung. Die Einstellung "glockenförmig" Mischung-Modell-Montage Fenster erscheint (ergänzende Abbildung 13 b). Im Beispiel ist "Alpha-Wert für den Vergleich mit lokalen Hintergrund" 0,001 und "Rolling-Fenster Zeit durchschnittlich" auf 3 (ergänzende Abbildung 13 b) festgelegt.
    2. Drücken Sie auf Apply im Fenster " Einstellungen" glockenförmig "Mischung-Modell passend " und in der Systemsteuerung Ausführen . Mit der Konfiguration in ergänzenden Abbildung 13läuft nur die Detektion . Dieser Schritt dauert ein paar Minuten (2-5). Überprüfen Sie die Ergebnisse durch Drücken der Schaltfläche " Ergebnis " von Schritt 1 (Erkennung, ergänzende Abbildung 14).
      Hinweis: Wie oben dargestellt, zeigt der Film rote Kreise auf die detektierten Partikel. Wenn kein roter Kreis angezeigt wird, hat diesen Schritt nicht richtig funktioniert.
  9. Führen Sie die Identifizierung von Spuren, d. h. Zusammenführung der Partikel, die im vorherigen Schritt in Tracks, die sich über mehrere Frames erkannt. Dies ist die Schritt2: Tracking- von U-Track, dessen Einstellungen werden, wie in Zusätzliche Abbildung 15A-Cgezeigt definiert müssen. Schritt2 Kosten Funktionseinstellungen für Verknüpfung von Frame zu Frame und Lücke schließen, Verschmelzung und Spaltung im Beispiel zusätzliche Abbildung 15 b und C, bzw. entnehmen Sie bitte.
  10. Nach dem Einstellen der Parameter für Schritt2, drücken Sie in der Systemsteuerung ausgeführt und nur Schritt2 läuft (ergänzende Abbildung 16).
  11. Durchzuführen Sie Track-Analyse, Schritt 3. Definieren Sie die Einstellungen wie in zusätzliche Abbildung 17 (rechte Abbildung) dargestellt. Drücken Sie anwenden im Bereich der Einstellung-Bewegungsanalyse und im Control Panel-U-Track laufen . Dieser Schritt dauert wenige Sekunden.
  12. Überprüfen Sie mit der Schaltfläche " Ergebnis " von Schritt 3, dass der Prozess alle Titel korrekt identifiziert hat. Dazu klicken Sie auf Show-Track-Nummer des Fensters Filmoptionen , und überprüfen Sie Frame für Frame, dass jeder Track wurde richtig erkannt (ergänzende Abbildung 18). Manuell kommentieren Sie diese Teilchen, die nicht wahr sind.
    Hinweis: Wenn diese manuelle Auswahl nicht erfolgt ist, kann eine schwächere automatische Auswahl später durchgeführt werden, wenn die Diffusionskoeffizienten berechnet wird (siehe Schritt 4).

4. Berechnung des Diffusionskoeffizienten und Klassifizierung von Trajektorien

  1. Achten Sie darauf, dass die Skripte aus dem Verzeichnis des Videos analysiert (im Beispiel VideoName/Serie1) aufgerufen werden.
  2. Lesen Sie die Bahnen zur Berechnung des Diffusionskoeffizienten durch die Ausgabe in der Matlab Konsole den Befehl: trajectories=readTrajectories(0.1), wo 0,1 die Zeit in Sekunden zwischen zwei aufeinander folgenden Frames (Zeitintervall ist, gezeigt im Bedienfeld "Film" Informationen, ergänzende Abbildung 11 b).
  3. Schließen Sie Trajektorien entsprechend nicht falsch identifizierten Flecken/Flugbahnen aus. Geben Sie eine Liste der Orte, auszuschließen. Zum Beispiel um die Plätze 4, 5 und 28 auszuschließen, geben Sie: Bahnen = ReadTrajectories (0,1 [4, 5, 28]).
  4. Berechnen Sie die momentane Diffusionskoeffizienten für jeden von den Spuren dieser Zelle. In diesem Fall berechnen die Diffusionskoeffizienten für eine zeitliche Verzögerung = 4, D-1-4genannt. Dafür, in der Matlab-Konsole den Befehl ausführen: D = CalculateDiffusion (Bahnen, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha') wo Bahnen sind die Bahnen, die in Schritt 3, 113.88e-3 ist die Pixelgröße der erworbenen Bilder in Mikron, 0,0015 ist eine Obergrenze für die Diffusionskoeffizienten von unbeweglichen Teilchen gemessen in µm2/s und "Alpha" ist das angepasste Modell, wie nachfolgend erläutert.
    Hinweis: Wenn ein schneller Kamera und müssen mit mehr Frames zur Berechnung des Parameters Verbreitung erhöhen sie die z. B. auf 20, von D = CalculateDiffusion (Bahnen, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', '', 20). Die String-Parameter vor 20, im obigen Beispiel '', das Suffix hinzugefügt, um die Ausgabedateien. Das Suffix kann verwendet werden, um verschiedene Analysen zu unterscheiden.
  5. Passen Sie die MSD mit einer anderen Funktion durch Aufrufen der CalculateDiffusion-Funktion wieder mit einem unterschiedlichen Montage-Modus ("beschränkt", "frei" oder "gerichtet"). In diesem Beispiel beschränkt: D = CalculateDiffusion (Bahnen, 113.88e-3, 0,0015 "beschränkt").
  6. Erhalten Sie die passenden Ergebnisse für das gerichtete Modell wie in zusätzliche Abbildung 20dargestellt.
  7. Zerlegen Sie die Bahnen in kurzen und langen Bahnen. Verwenden Sie den Befehl: [ShortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) wo 50 ist die minimale Länge im Rahmen einer Flugbahn lange (im gezeigten Beispiel) berücksichtigt werden.
  8. Kurze Flugbahnen mit dem gleichen passende Verfahren in Schritt 4.3 beschriebenen zu studieren: D = CalculateDiffusion (ShortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, "Regie", "Short"). Analysieren Sie kurze und anomale Flugbahnen mit dem Befehl: D = CalculateDiffusion (ShortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, "alpha", "Short").
  9. Analysieren Sie lange Bahnen um die Art der Bewegung durch ihre Moment Skalierung Spektrum (MSS)7zu klassifizieren. Der Befehl: TrajectoriesClassification = ClassifyLongTrajectories (LongTrajectories, 113.88e-3,0.0015, "Long") zeigt die Analyse in Bildschirm und erzeugt eine Datei namens TrajectoryClassification < Suffix > .txt der Verzeichnis Results\TrackingPackage\tracks.

5. Berechnung der Cluster Ssize durch die Teilchendichte

Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Skripte aus dem Verzeichnis des Videos analysiert (in diesem Beispiel gezeigt, VideoName/Serie1) aufgerufen werden.

  1. Analysieren Sie die Intensität der einzelnen Partikel entlang ihrer Flugbahn. Dafür, das Skript aufrufen, indem Sie in der Matlab-Konsole eingeben: AnalyzeSpotIntensities, die als akzeptiert Eingabe die Flugbahnen von U-Track im ersten Abschnitt berechnet. In seiner einfachsten Form, rufen Sie einfach das Skript ohne irgendein Argument aus dem Verzeichnis des Videos (im Beispiel gezeigt, VideoName/Series1) analysierten analyzeSpotIntensities(). Konfigurieren Sie dieses grundlegende Verhalten in vielfältiger Weise durch die Bereitstellung von Argumente an das Skript wie in: AnalyzeSpotIntensities ("Arg1´, Wert1, ' Arg2´, Value2,...). Stichhaltige Argumente mit ihren entsprechenden Variablen Werten ("ArgN´, ValueN) aufgeführt sind.
    1. ("SpotRadius´, 1)
      Analysieren der Fluoreszenzintensität mit SpotRadius von 1 Pixel (standardmäßig), das entspricht einen Patch der Größe 3 x 3 zentriert an der Stelle ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Hinweis: Für einen Patch von 5 x 5 an der Stelle zentriert, wählen Sie eine SpotRadius von 2, usw..
    2. ("OnlyInitialTrajectories´, 1)
      Wenn dieses Argument (wahr, Wert 1) gegeben ist, analysieren Sie nur die Bahnen, die in den ersten Frame des Videos zu beginnen. Dies ist sinnvoll, Kontrolle Bilder (standardmäßig 0, false) zu analysieren.
    3. ("TrackTrajectory´, 0)
      Wenn dieses Argument auf 0 (False) gesetzt ist, dann halten Sie die Koordinate des Punktes in seinem ersten Rahmen für alle Frames (Dies ist nützlich für immobile Spots). Wenn das Argument (standardmäßig 1, true) auf 1 festgelegt ist, wird dann vor Ort verfolgt entlang video Folgendes die Koordinaten berechnet von U-Track.
    4. ("ExcludeTrajectories´, [4,5,28])
      Auch die Flugbahn an diese Trajektorien im Schritt 4.3 (im Beispiel 4, 5, 28) ausgeschlossen.
    5. ("ExtendTrajectory ´, 1)
      Wenn dieses Argument auf 1 (True) gesetzt ist, dann analysieren Sie die Intensität in den Patch, um das Ende des Videos (auch wenn die Bahn früher stoppt). Die Koordinate des Punktes ist die letzte Koordinate in der Bahn (wenn TrackTrajectory wahr ist) oder die erste Koordinate in der Bahn (wenn TrackTrajectory falsch ist). Dieses Argument ist falsch (0) standardmäßig.
    6. ("SubtractBackground´, 1)
      Wenn dieser Parameter gesetzt ist, gemessen, dann richtig die rohe Fluoreszenz an jedem Ort die Schätzung der Hintergrundfluoreszenz für diesen Platz (siehe unten). Dieses Argument ist wahr (1), standardmäßig.
    7. ("MeanLength´, Frame-Nummer)
      Wenn dieser Parameter gesetzt ist, wird der mittlere Intensität-Spot in der angegebenen Länge gemessen. Set 'MeanLength', 20, die mittlere Platz Intensität an die ersten 20 Frames zu messen. Wenn das Argument nicht festgelegt ist, wird die Stelle Intensität auf die ganze Bahn (standardmäßig in voller Länge) berechnet.
    8. ("ShowIntensityProfiles´, 1)
      Setzen Sie diesen Parameter als 1 (standardmäßig 0, false), um die Intensität Profil entlang der verschiedenen Frames sowie ihren Hintergrund zu zeichnen.
      Hinweis: Diese Grundstücke sind sehr nützlich für Immunofluoreszenz zu identifizieren, wie in der ergänzenden Abbildung 21dargestellt. Für jeden Pfad analysiert die Routine automatisch wenn es möglich ist, dass Immunofluoreszenz stattgefunden hat. Dies geschieht durch den Vergleich der Intensitätswerte mit ein Student t in den vor- und Nachnamen N-Frames auf dem Weg. Standardmäßig ist N 10, aber dieser Wert kann geändert werden, durch das Argument "Nbleach´.
    9. ("BackgroundMethod´, Wert)
      Setzen Sie diesen Parameter, um den Hintergrund von jedem Ort zu bestimmen. Dies kann auf verschiedene Arten erfolgen kann, und die man verwenden ausgewählte Wandel der "Wert":
      1. ("BackgroundMethod´, 0)
        Verwenden Sie diesen Wert, um den Hintergrund für das komplette Video manuell zu identifizieren. 8 Punkte in den ersten Frame des Videos wählen lassen. Ein Patch um diese Punkte wird entlang der ganzen Videos analysiert und das 95 %-Quantil diese Intensitäten wird als die Hintergrundintensität für alle Spots gewählt.
      2. ("BackgroundMethod´, 1)
        Verwenden Sie diesen Wert, um den Hintergrund für die einzelnen Frames manuell zu identifizieren. Wählen Sie 8 Punkte für jeden Punkt und jedes Frame. Dies ist eine Zeit raubende Aufgabe, aber es gibt eine Menge Kontrolle für dem Benutzer. Das 95 %-Quantil der Intensitäten in diese Patches wird als die Hintergrundintensität für diese Stelle in diesem Rahmen gewählt.
      3. ("BackgroundMethod´, 2)
        Verwendet diesen Wert, um den Hintergrund von jedem Fleck berechnen von 8 Punkten befindet sich in einem Kreis um die Stelle mit einem Radius gesteuert durch das Argument geschätzt "BackgroundRadius´ (standardmäßig 4 * SpotRadius).
      4. ("BackgroundMethod´, 3)
        Verwenden Sie diesen Wert, um den Hintergrund für jeden Frame berechnen, indem Sie zuerst die Zelle in dem Video suchen und dann analysieren die Intensitäten der Zelle in jedem Frame (ergänzende Abbildung 22).
        Hinweis: Der Hintergrund wird als Grauwert auf einen bestimmten Quantil dieser Distribution gewählt (standardmäßig 0,5 (= 50 %), obwohl dieser Parameter kann, durch das Argument gesteuert werden "BackgroundPercentile´, dieser Wert kann höher eingestellt werden, zum Beispiel 0,9 (= 90 %) Wenn die meisten der Zelle als Hintergrund zu betrachten wollen. Um bei der Identifizierung der Zelle helfen, anzugeben, die die maximale Hintergrundwert entlang den Rahmen mit dem Argument erwartet "MaxBackground´ (zum Beispiel in allen analysierten Videos, den Hintergrundwert geht normalerweise nie über 6000)13. Standardmäßig ist diese Option festgelegt auf 0, was bedeutet, dass diese Hilfe nicht standardmäßig verwendet wird. Sehen, welche die Zelle-Erkennung und ausgewählte für die Hintergrund-Schätzung durch setzen das Argument Bereich ' ShowImages´, 1 (Haltestelle der Ausführung jederzeit durch Drücken von Strg-C).
  2. Informieren Sie die Verbreitung und Intensität für die Bahnen, die in den Schritten 4 und 5.1, jeweils mit berechnet (gatherDiffusion.AndIntensity). Informieren Sie sich nur die Verbreitung und Intensität für kurze Bahnen. Dazu verwenden die Suffixe in Schritt 4.7 und Art verwendet: GatherDiffusionAndIntensity ('Short´) wo ' Short´ ist das Suffix in Schritt 4.7 verwendet.
  3. Sammeln die Moment-Spektrum-Skalierung und die Intensität Informationby Typisierung: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') wo 'Long' wird das Suffix für Schritt 4.7. Eine Übersicht über alle Dateien, die generiert mithilfe dieses Protokolls ist in Abbildung 2dargestellt.

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Representative Results

Die Verwendung dieses Protokolls ermöglicht die automatische Verfolgung von Fluoreszenz-Mikroskopie-Filme und die Analyse ihrer dynamischen Eigenschaften detektierten Partikel. Zunächst werden Zellen mit dem Eindringmittel gekoppelt Protein zu verfolgenden transfiziert. Die angemessene Höhe der Rezeptoren präsentiert auf der Zelloberfläche, die ermöglicht, dass SPT durch Zelle sortieren (Abbildung 1) gewonnen wird. Markierten Zellen werden von TIRF-Mikroskopie analysiert, die Videos in ein Format erzeugt, die mit den in diesem Protokoll (Supplemental Video 1) beschriebenen Tools untersucht werden können.

Die erzeugten Videos nicht direkt analysiert und unabhängige Frames des Videos erforderlich sind. Die Verwendung von ImageJ erzeugt Dateien, die mit einer Matlab Software wie video-Frames im TIFF-Format oder Masken interpretiert werden können. U-Spur verfolgt die Partikel in das ausgewählte Video gesehen und speichert die Informationen in Matlab (.mat) Dateien (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), siehe Abbildung 2.

Wie in Abbildung 2dargestellt, erzeugt die Berechnung des Diffusionskoeffizienten und Klassifizierung von Trajektorien Befehle verschiedene Dateien (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, etc.). In diesen Dateien enthaltene Informationen werden am besten mit Excel und Prisma Software verwaltet. Informationen, die sich aus dieser Analyse kann gehören:

  1. Prozentsatz der immobile Flecken. Können Sie als Referenz der immobile Partikel: das 95 %-Perzentil der D1 bis 4 ermittelten Werte (1) vom Einzelkörner in festen Zellen und/oder (2) vom gereinigten fluoreszierende Protein an Deckgläsern (Abbildung 3A) befestigt.
  2. Prozentsatz der langen Bahnen (> 50 Frames) (Abb. 3 b).
  3. Art der Bewegung der langen Bahnen: Regie, kostenlos, beschränkt (Abbildung 3).
  4. Diffusionskoeffizienten (D1-4) mobile Partikel in Zellen mit unterschiedlichen Reiz (Abb. 4A) behandelt.

Schritt 5 des Protokolls analysiert die Intensitäten der einzelnen Partikel entlang der Flugbahn. Das Skript AnalyzeSpotIntensities wird auf dem Bildschirm alle Informationen analysiert gedruckt. Für jeden Fleck und Rahmen, das Skript zeigt die Koordinate des Punktes in diesem Frame (X, y) in Pixeleinheiten, die Schätzung der Hintergrundfluoreszenz (k0), roh vor Ort Intensität in den 3 x 3-Patch, die korrigierte Intensität (berechnet als die rohen Intensität minus seine bei diesem Frame Hintergrund), befindet sich der maximale Wert der Intensität in den Patch und die Regionsnummer innerhalb der Maske zu beobachten, wo diese Stelle. Ein Beispiel für die Art der produzierten Erzeugnisse ist

vor Ort = 43 Frame = 184
X = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
SpotRawIntensity = 5550.1111
SpotCorrectedIntensity = 3979.1111
MaxCorrectedSpotIntensity = 6243
MaskRegion = 2

All diese Informationen werden in eine Log-Datei (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) und eine Tabelle, die von Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt) gelesen werden kann. Nach der Analyse jeder Spot, druckt das Skript die durchschnittliche Intensität entlang der Flugbahn und der Mehrheits-Region innerhalb der Maske

vor Ort = 43
MeanCorrectedSpotIntensity entlang Frames = 4762.303
Mehrheits-Region = 3

Diese Informationen werden gespeichert in der Log-Datei oben und eine Tabelle, die aus einer Tabelle (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt) gelesen werden kann. Als Beispiel ist in Abbildung 4 bmittlere Stelle Intensitäten (Msi) für jedes Teilchen entlang ihrer Flugbahn in den Zellen angeregt mit unterschiedlichen Bedingungen gezeigt. Diese Informationen können wir jetzt um die Größe des Clusters fluoreszierende grob zu schätzen. Als ein Ort Mittel korrigierte Intensität bezieht sich mit der Anzahl von fluoreszierenden Proteinen an dieser Stelle, und die Fluoreszenz von einem Monomer kann durch eine ähnliche, aber unabhängige Experiment gemessen werden, die Anzahl der Rezeptoren pro Partikel direkt berechnen. Abbildung 4zeigt die Häufigkeitsverteilung der Rezeptor-Anzahl pro Partikel mit als Referenz die Intensität des Monomeren Proteins in den gleichen Zellen exprimiert.

Die Gather Verbreitung und Intensität Befehl erstellen Sie zwei Dateien: ergibt sich eine sogenannte diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtund eine weitere namens log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt im Verzeichnis / TrackingPackage/Spuren. Beide Dateien enthalten (1) der Ort Index, (2) die Diffusionskoeffizienten und (3) die Intensität (4) der Regionalcode innerhalb der Maske. Diese Dateien können aus einer Tabelle gelesen werden.

Ebenso der Befehl Gather, Flugbahn, Klassifizierung und Intensität erstellt zwei Dateien eines namens trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt und eine weitere log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt in der Verzeichnis- Ergebnisse/TrackingPackage/Tracks. Die erste enthält 1) spot Index, (2) die Bewegungsart, (3) der Ort Anfang, (4) die Intensität, (5) D-1 bis 4 und 6) die Zahl der Region innerhalb der Maske. Diese Datei kann von Excel gelesen werden.

Eine Übersicht über alle Dateien, die generiert mithilfe dieses Protokolls ist in Abbildung 2dargestellt. Anderen Analyse, die durchgeführt werden kann, unter Verwendung dieses Protokolls beinhaltet den Vergleich der dynamischen Parameter der kleinen Vs größere Flecken, d.h. Monomere Vs Oligomere, Variationen über diese dynamische Parameter induziert durch Liganden, Inhibitoren, Membran-Zusammensetzung, Änderung der Signalisierung, Wege, etc.. Eine vollständige Analyse der CXCR4 Verhalten als Reaktion auf die Liganden CXCL12 unter verschiedenen experimentellen Bedingungen wurde unter Verwendung dieses Protokolls13durchgeführt.

Figure 1
Abbildung 1 : Zellsortierung. Ausdruck der GFP in Jurkat Zellen transfiziert mit CXCR4-AcGFP vor und nach der Zellsortierung. Zelle mit dem niedrigen Niveau der GLP (GFPniedrig) Ausdruck ausgewählt und für TIRF Experimente angestellt.

Figure 2
Abbildung 2 : Zusammenfassung der generierten Dateien. Die Abbildung zeigt alle Dateien, die mit Hilfe der Matlab-Routine beschrieben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Klassifikation der Flugbahnen. Anzahl der verschiedenen Arten von Trajektorien, die entsprechenden Zellen mit verschiedenen Reize behandelt. (A) Anteil der immobile Flecken, (B) Anteil der langen Bahnen und (C) Art der Bewegung der langen Bahnen.

Figure 4
Abbildung 4 : Diffusion Koeffizient, mittlere Intensitäten vor Ort und Anzahl der Rezeptoren pro Partikel. (A) Verteilung der kurzen Verbreitung Koeffizienten (D1-4) Werte für jeden Fleck in Reaktion auf verschiedene Reize (I, II, II und IV). Rote Linie stellt den Medianwert für D1-4dar. (B) mittlere Stelle Intensitäten (Msi) Werte für jeden Fleck auf seiner ersten 20 Frames als Reaktion auf verschiedene Reize (I, II, II und IV). Rote Linie stellt die durchschnittliche Helligkeitswert (SD). (C) Prozentsatz der Rezeptoren/Partikel als extrahiert aus Intensitätsverteilung der einzelnen Teilchen, wobei als Lagerplatz Breite der Monomeren Proteinwert Intensität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 1: Öffnen einer Datei TIRFM in Fidschi oder ImageJ. Optionen, die auf dem Bio-Formate-Fenster auf Drag & Drop eine .lif Video erscheinen. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen. 

Ergänzende Abbildung 2: Serie auswählen. Bilder präsentieren in das .lif Video. (A) Fenster, die Auswahl der Serie analysiert werden, einschließlich Multi-Channel-Bilder erlaubt. (B) Ergebnis Beispiel Serie Auswahl, einschließlich Multi-Channel-Bild (links) und entsprechenden video (rechts). Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen. 

Ergänzende Abbildung 3: Kanäle aufgeteilt. (A) Fenster Erfassung von ImageJ-Befehle benötigt für die Aufteilung der Kanäle von einem Mehrkanalbild und (B) Ergebnis Beispiel des Kanals aufgeteilt. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Kanäle zusammenfügen. (A) verschiedene Kanäle in einem einzigen Bild zu verschmelzen. (B) Kanalwahl für das Zusammenführen. (C) Ergebnis-Beispiel für die Kanal-Zusammenführung. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Synchronisieren Sie Windows. (A) Lokalisierung im Menü ImageJ für Bild-Synchronisation und (B) daraufhin angezeigten Fenster erforderlichen Befehle. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Wählen Sie die Region von Interesse. (A) Wahl des Fensters mit den rechteckigen Auswahlwerkzeug und (B) Ergebnis der Ernte Bild. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Speichern Sie das Video. Speichern Sie die Region von Interesse als Bildsequenz und Parameter für das Speichern als Bild-Sequenz-Fenster. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Segmentierung. (A) öffnen die Segmentierung Editor Plugin in die ImageJ Plugins Menü. (B) hinzufügen von Beschriftungen/Materialien für die Segmentierung. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 9: Maskendesign. (A) Auswahl der passenden Labels und Definition der grünen Maske. (B) Auswahl der roten Maske. Beispiel für zwei Masken, zwei Bezeichnungen entspricht. (C) die Masken als TIFF-Datei speichern. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 10: MATLAB-Arbeitsverzeichnis. Auswahl an das korrekte Verzeichnis der Serie analysiert werden. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 11: U-Bahn ins Hauptmenü zurück. (A) Filmauswahl, Film-Edition (B) und (C) Kanal Einstellungsmenüs. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 12: Wählen Sie den Typ des Objekts, zu verfolgen. Wählen Sie die Verfolgung der einzelnen Partikel. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 13: Detektion von Partikeln. (A) U-Track, Systemsteuerung. (B) Beispiel für die Einstellungen für den Nachweis von Partikeln. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 14: Beispiel für Ergebnisse für Partikeldetektoren. Verschiedenen Fenstern, die eine Viewer-Menüs, Menü "Optionen" Film und der Film enthalten. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 15: Tracking-Menü. Beispiel für Einstellungen. (A) Tracking, (B) Einstellung - Frame zu Frame Verlinkung und (C) Lücke schließen, Verschmelzung und Spaltung Menüs. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 16: Beispiel für Ergebnisse nach tracking-Teilchen. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 17: Menü "Spur Analyse". Beispiel für Einstellungen. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 18: Überprüfung der Track-Analyse. Bildschirm nach Track-Analyse, einschließlich ein video-Fenster zeigt die detektierten Partikel und ihre entsprechenden Spuren angezeigt. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 19: Berechnung des Diffusionskoeffizienten. Histogramme die Diffusionskoeffizienten berechnet (links) und der Mittelwert quadriert Verschiebung (MSD, rechts). Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 20: Berechnung des Diffusionskoeffizienten inklusive verschiedene Modi. Histogramme die Diffusionskoeffizienten berechnet (links) und der Mittelwert quadriert (MSD, rechts) Verdrängung für die geschlossenen Modell. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 21: Intensität-Profile. Beispiel für spot Intensität entlang seiner Flugbahn (blaue Linie) und Hintergrund (rote Linie). Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 22: Hintergrund für jeden Frame. Links: Beispielbild Zelle. Mitte: Automatisch erkannt Zelle. Rechts: Bereich automatisch als Hintergrund gewählt. Klicken Sie bitte hier, um das Bild herunterzuladen.

Ergänzende Video 1: Beispiel für eine typische TIRF Videomikroskopie zeigt die Anwesenheit von Partikeln mit unterschiedlicher Intensität und Arten von Bewegungen. Klicken Sie bitte hier um das Video herunterzuladen.

Zusatzmaterial 1: Dateien, die alle Protokoll-Skripts, die in der ad-hoc- Routinen für die Klassifizierung der Flugbahnen und Analyse der Clustergröße beschäftigt beschäftigt. Bitte klicken Sie hier, um die Materialien zum download.

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Discussion

Das beschriebene Verfahren ist einfach durchzuführen, auch ohne Vorkenntnisse, die Arbeit mit Matlab. Matlab-Routinen erfordern jedoch extrem Genauigkeit mit der Nomenklatur der verschiedenen Befehle und die Lokalisation der verschiedenen Ordner das Programm angestellt. In der Überwachungsdatenbank Analyse-Routine (Schritt 3), mehrere Parameter können geändert werden. Das Fenster "Einstellung passend Gauß-Mischung-Modell" (Schritt 3,8) steuert, wie U-Track einzelne Partikel auf dem Video zu erkennen. Dies geschieht durch den Einbau einer Gaußschen Mischung Modell wie unter3beschrieben. Einer der wichtigsten Parameter für diese Armatur definiert einen Filter um Identifizierung lokaler Maxima zu helfen. Der Erfolg dieser Operation hängt den Bildkontrast und das Rauschen in den Bildern. Der erste Parameter (Alpha-Wert für den Vergleich mit lokalen Hintergrund) steuert das Vertrauen von einem Maxima wird eine echte Stelle, während der zweiten hilft zur Lärmminderung bei der Identifizierung der Spots. Wichtige Parameter in der "Tracking" Schritt (3,9) sind die Anzahl der Frames, Lücken zu schließen (das heißt eine Spur über Frames erstrecken kann, in dem das Teilchen ist nicht tatsächlich gesehen, aber es ist vor diesen Bildern und nach diese Frames, im Beispiel 0) , und die Anzahl der Frames, die eine Spur erstrecken muss, um als erfolgreiche Track in Betracht gezogen werden (in unserem Beispiel 20; dieser Parameter bezieht sich auf die Kamerageschwindigkeit und die Anzahl Frames in der Spur müssen so sein, dass es die Berechnung der Diffusion co ermöglicht (effizient). Es ist auch wichtig zu entscheiden, ob Sie zusammenführen und Segmente (im Beispiel, die, das diese beiden Möglichkeiten gewählt wurden) aufgeteilt. Dann müssen die Parameter für die Schritt 1 in Kostenfunktionen (Verknüpfung von Frame zu Frame) eingestellt werden. Diese Funktion steuert, wie die Partikel entlang der Rahmen verfolgt werden. Die wichtigsten Parameter zu diesem Zeitpunkt ist die Auswahl des Brownschen Suchradius, die Steuern, wie weit jeder einzelne Strahler voraussichtlich in der nächsten Einstellung. In unserem Beispiel haben wir jeweils 0 und 5 als untere und obere Grenze. Beachten Sie, dass diese Parameter sind sehr spezifisch für die Art der Partikel, die verfolgt werden und sie müssen in jedem Einzelfall abgestimmt sein können. Besonders wichtig sind die Skalierung macht in der Brownschen und lineare Suche Radien. Diese Skalierung Kräfte hängen von der Art der Bewegung der Partikel (frei oder begrenzten Verbreitung). Im Beispiel wurden die Werte (0.5, 0.01) kostenlose Verbreitung gewählt. Für die spezifische Dokumentation dieser Parameter siehe3.

Bei der Berechnung des Befehls Verbreitung Koeffizienten (Schritt 4,4) sein die obere Grenze des Diffusionskoeffizienten von unbeweglichen Teilchen aus früheren Experimenten oder durch Ausführen der CalculateDiffusion-Funktion auf ein separates Projekt mit unbeweglich bekannt Partikel (gereinigtes Monomeren fluoreszierende Protein) und sehen die Diffusionskoeffizienten berichtet. Diese Funktion nimmt zwei zusätzliche Parameter: "OutputSuffix´, die standardmäßig nimmt den empty-Wert wird hinzugefügt, um die Ausgabe-Dateinamen, und" PlotLength´, die standardmäßig ist 13 und die Anzahl der zeitlichen Verzögerung (Sekunden) in denen die Verbreitung Berechnung durchgeführt wird. Der passende Modus 'Alpha' impliziert eine Anpassung der MSD der Kurve

Equation 1

Das heißt, hinken ein Offset (MSD-0) und eine Potenzfunktion der Zeit. Der Exponent dieser Potenzfunktion, Equation 2 , bestimmt, ob die Bewegung beschränkt ist (0 < α < 0,6), anomale (0,6 < α < 0,9), frei (0,9 < α < 1.1), oder gerichtet (α > 1.1). Für eine Überprüfung dieser Art der Analyse wird der Leser Manzo Et Al.9 bezeichnet.

Die Berechnung der Diffusion Koeffizienten4 produziert zwei Produktionszahlen (siehe ergänzende Abbildung 19). Die erste zeigt ein Histogramm der Diffusion Koeffizienten berechnet (beachten Sie, dass an dieser Stelle gibt es eine unabhängige Diffusionskoeffizienten für jede Flugbahn). Der Mittelwert und 95 % Perzentil der diese Koeffizienten sind in der Matlab-Konsole angezeigt. Das zweite Diagramm zeigt MSD (rote Kurve) und die Anzahl der Schritte betrachtet es als Funktion der Zeit Lag für die Bahnen als mobile berechnen (die deren Diffusionskoeffizienten oberhalb der Schwelle in der Kommandozeile angegeben ist). Der Mittelwert und die Standardabweichung der mobilen Bahnen errechnet (das sind die Werte für die Bahnen in einer einzelnen Zelle). Im Beispiel ist der Exponent 0,59 Bedeutung, dass die Bewegung begrenzt ist. Für diese Kurvenanpassung meldet das Programm die jeweils die Parameter (wie die Standardabweichung eines jeden gezeigt) und die Anpassungsgüte verbundene Unsicherheit (eine perfekte Passform erreichen würde Null). An dieser Stelle und nach Überprüfung des Wertes von Alpha beschließen wir die MSD mit einer anderen Funktion passen:

Equation 3    Wenn 0 < α < 0,6 (beschränkt)

Equation 4Wenn 0,9 < α < 1.1 (kostenlos)

Equation 5Wenn α > 1.1 (Regie)

Anomale Trajektorien können nicht mit einer anderen Funktion ausgestattet werden. Bei beengten Partikel können Sie berechnen die Entbindung Größe (in µm) wie in Destainville Et Al.14

Equation 6

Ein guter Indikator für einen korrekten Sitz ist, dass die Güte der Anpassung aus der Alpha-passend zu der Endmontage verringern soll (im Beispiel die Güte passen fällt von 0.30474 auf 0.15749, ergänzende Abbildung 19-20). CalculateDiffusioncreates zwei Dateien in den "Results\TrackingPackage\tracks" innerhalb des Verzeichnisses Serie namens "diffusionCoefficients.txt" und "diffusionCoefficientsMobile.txt". Diese Dateien enthalten drei Spalten: 1) der Index der einzelnen Eingang Flugbahn, (2) ihre entsprechende Diffusionskoeffizienten, (3) die Mehrheits Region in der Maske, wo dieser Track gehört (die Regionen ergeben sich aus der Datei "mask.tif", die wir in Schritten erzeugt 2.7; Wenn diese Datei nicht vorhanden ist, dann ist diese Spalte nicht vorhanden). Diese Datei und die analogen für andere Zellen erzeugten Dateien können Sie um die Verteilung der Diffusionskoeffizienten für eine Gruppe von Zellen unter ähnlichen Versuchsbedingungen zu analysieren.

Bei der Berechnung des Diffusionskoeffizienten für kurze Bahnen (Schritte 4,7-4,8) ist der letzte Parameter "Kurz" ein Suffix zu der Ausgabe-Dateiname hinzugefügt, so dass Sie verschiedene Teilmengen von Trajektorien analysieren können, ohne die zu überschreiben diffusionCoefficients.txt Dateien. Der eigentliche Name der Ausgabedatei ist "DiffusionCoefficients < Suffix > .txt" und "DiffusionCoefficientsMobile < Suffix > .txt". Wenn kein Suffix angegeben ist, wie in der allgemeinen Analyse durchgeführt, wird ein Suffix leer ausgegangen. Die Modellparameter (D, V und MSD0) können von denen ausgestattet, um alle Trajektorien abweichen. Am bemerkenswertesten, die Standardabweichung der Parameter sowie die Güte der Anpassung normalerweise erhöhen. Der Grund ist, dass kurze Bahnen instabil sind und eine zuverlässige Montage schwieriger ist.

Die Analyse der langen Bahnen (Schritt 4,9) klassifizieren sie in engen (1), frei (2) oder gerichtet (3) nach ihrer ersten Augenblick und seine Position in Bezug auf die 2,5 % und 97,5 % Perzentile des ersten Moments 500 zufällige Pfade mit Brownsche Bewegung, das gleiche Diffusionskoeffizienten und Länge wie die Flugbahn wird analysiert und simuliert von Monte Carlo. Wenn Anfang des Pfades wird analysiert unter 2,5 % von den ersten Momenten in den Simulationen zu beobachten ist, wird der zu untersuchende Pfad als beschränkt klassifiziert. Wenn es mehr als 97,5 % der simulierten ersten Momente ist, wird es als gerichtet eingestuft; Andernfalls wird der Pfad als Brownsche eingestuft. In dem Befehl beschäftigt, 113.88e-3 ist die Pixelgröße in µm, 0,0015 ist die Obergrenze des Diffusionskoeffizienten der immobile Spots gemessen in µm2/s, und "Long" ist das Suffix für die Ausgabe-Dateiname. Die erste Spalte der Datei ("trajectoryClassificationLong.txt") ist die Anzahl der Flugbahn, die zweite ist die Klassifizierung (1 = beschränkt, 2 = frei, 3 = gerichtet), und die dritte ist die Flugbahn ersten Moment.

Das Skript für die Berechnung der Intensität der einzelnen Partikel (Schritt 5.1) ist sehr flexibel und ermöglicht die Verfolgung der Fluoreszenz-Intensitäten auf viele verschiedene Arten (jeweils gut geeignet für verschiedene Situationen wie tracking unbewegliche Flecken von einem Kontrollexperiment oder sehr bewegliche Spots verfolgen über eine Zelle mit variabler fluoreszierende Hintergrund). Das Skript wird alle Bahnen entlang alle Frames analysieren. Für jeden Fleck bei jedem Frame wird messen die Intensität der Pixel vor Ort (es analysiert einen quadratische Patch vor Ort, standardmäßig eine Größe 3 x 3 Pixel), schätzen der Spot Hintergrund und Berechnung der Fluoreszenz-Differenz zwischen Ort und die Hintergrund. Der Anteil der Immunofluoreszenz Partikel und die Anzahl der fluoreszierenden Partikeln in einem einzigen Cluster, als ein einzelner Punkt, kann auf diese Weise geschätzt werden.

Diese automatisierte Methode (GatherTrajectoryClassificationAndIntensity) erzeugt Informationen über mehrere Parameter (spot Intensität, laterale Diffusion, Art der Bewegung), die helfen können, um die Beziehung zwischen Spotgröße und seiner Dynamik bei basalen Bedingungen zu studieren, und wie verschiedene Behandlungen können diese Parameter zu ändern.

Die wichtigste Einschränkung der Methode ist, dass es Zelle Transfektion mit fluoreszierenden Proteins nachverfolgt werden. Transfektion führt meist zu Protein Überexpression, eine Tatsache, die einzigen Proteins Verfolgung behindert. Eine Zelle sortieren Schritt muss, markieren die Zellen mit dem Ausdruck einer Reihe von Rezeptoren, die Erkennung und Verfolgung von Einzelkörner SPT-TIRF-Mikroskopie aufgenommen werden. Diese Methode könnte auch eingesetzt werden, für die Verfolgung von Biomolekülen mit Quantenpunkte beschriftet oder Fab-Fragmente. Das beschriebene Protokoll erfordert eine Reihe von Steuerelementen, die zuvor analysiert werden müssen, um sicherzustellen, dass die Schlussfolgerungen aus der Analyse angetrieben korrekt sind. Zunächst einmal ist es wichtig, die entsprechenden Ausdruck Bedingungen festzulegen, die Erkennung und Verfolgung der einzelnen Partikel erlauben. Filme mit dichten von ~ 4,5 Partikel/µm2, entspricht 8.500-22.000 Rezeptoren/Zelle, wurden verwendet, um die räumlich-zeitliche Organisation der Zellmembran Rezeptor13zu analysieren.

Es ist wichtig, die minimale nachweisbare Diffusionskoeffizienten mithilfe gereinigten Monomere AcGFP Proteine oder festen Zellen herzustellen. In beiden Fällen wird davon ausgegangen, dass es keine Diffusion und daher wir schätzen, dass der Wert für diffuses Licht aus Teilchen, die in diesen Bedingungen analysiert immobilisierten Partikel entsprechen und zur Unterscheidung zwischen mobile und immobile Bahnen13verwendet.

Die Analyse, die wir hier vorgestellt haben ist ein allgemeine Flugbahn Analysetool, das auf die Analyse der Verbreitung von Rezeptoren durch hochauflösendes, zur Analyse der Beugung begrenzt Bilder und der Analyse der zellulären Bewegung von standard-Mikroskopie angewendet werden können . Der Hauptvorteil dieser Methode mit anderen bereits beschrieben, wie die Analyse der Anzahl und Helligkeit11, ist, dass es die Bewertung der mittleren Intensitätswerte jeder einzelnen Stelle entlang seiner Flugbahn ermöglicht, unter Berücksichtigung der Tageszeit Überleben des AcGFP Monomere Proteins vor Immunofluoreszenz. Die Überlebenszeit eines Moleküls vor Immunofluoreszenz wird stark von der Erregung Bedingungen abhängen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir sind dankbar, dass Carlo Manzo und Maria García Parajo für ihre Hilfe und Quell-Code der Diffusion Koeffizient Analyse. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch Zuschüsse vom spanischen Ministerium für Wissenschaft, Innovation und Universitäten (SAF 2017-82940-R) und die RETICS-Programm des Instituto de Salud Carlos III (RD12/0009/009 und RD16/0012/0006; RIER). LMM und JV unterstützt das COMFUTURO-Programm von der Fundación General CSIC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 146 SPT Chemokin-Rezeptor tracking Cluster Verbreitung Analyse-software
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Sorzano, C. O. S., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

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