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Immunology and Infection

Procesamiento de imagen protocolo para el análisis de la difusión y del tamaño del clúster de receptores de membrana por microscopía de fluorescencia

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59314
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,5, 3, 1,6, 3, 3
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la sola partícula seguimiento análisis de imagen que permite la evaluación cuantitativa de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y racimo de tamaños de partículas solo detectados por microscopía de fluorescencia.

Abstract

Rastreo en una secuencia de vídeo y el posterior análisis de sus trayectorias de partículas hoy en día es una operación común en muchos estudios biológicos. Usando el análisis del receptor de membrana de la célula de clusters como un modelo, presentamos un protocolo detallado para esta tarea de análisis de imagen con Fiji (ImageJ) y rutinas Matlab para: 1) definir regiones de interés y diseñar máscaras adaptadas a estas regiones; 2) rastrear las partículas en los videos de la microscopia de fluorescencia; 3) analizar las características de difusión y la intensidad de las pistas. El análisis cuantitativo de los coeficientes de difusión, tipos de movimiento y el tamaño de cluster obtenida por microscopía de fluorescencia y procesamiento de imágenes proporciona una herramienta valiosa para determinar objetivamente la dinámica de la partícula y las consecuencias de la modificación de condiciones ambientales. En este artículo presentamos protocolos detallados para el análisis de estas características. El método descrito aquí no sólo permite la detección de una sola molécula de seguimiento, pero también automatiza la estimación de los parámetros de difusión lateral en la membrana celular, clasifica el tipo de trayectoria y permite análisis completo superando así la dificultades para cuantificar el tamaño de punto durante su trayectoria entera en la membrana celular.

Introduction

Proteínas de la membrana incrustadas en la bicapa lipídica están en continuo movimiento debido a la difusión térmica. Sus dinámicas son esenciales para regular las respuestas celular, Interacciones intermoleculares permiten la formación de complejos que varían en tamaño desde monómeros oligómeros e influir en la estabilidad de complejos de señalización. Elucidar los mecanismos que controlan la dinámica de la proteína es así un nuevo reto en la biología de la célula, necesario para entender las vías de transducción de señal y para identificar funciones imprevistas.

Se han desarrollado algunos métodos ópticos para el estudio de estas interacciones en la vida de las células1. Entre estos, microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total, desarrollado en la década de 1980, permite el estudio de las interacciones moleculares en o muy cerca de la membrana de la célula2. Para estudiar los parámetros dinámicos de las trayectorias de la proteína de membrana obtenidas de TIRF datos en células vivas, se requiere una sola partícula (SPT) del método de seguimiento. Aunque para esto existen varios algoritmos, utilizamos actualmente las publicadas por Jaqaman et al.3 dirección heterogeneidad del movimiento de partículas en un campo de partículas densas uniendo partículas entre fotogramas consecutivos para conectar la pista resultante segmentos en trayectorias completadas (desaparición de partículas temporales). El software captura la partícula combinar y dividir ese resultado de agregación y disociación de eventos3. Uno de los datos de salida de este software es la detección de las partículas a lo largo de la trayectoria entera definiendo sus posiciones X e Y en cada fotograma.

Una vez que las partículas se detectan, se aplican diferentes algoritmos para determinar el intervalo corto difusión coeficiente (D1-4)4,5. Aplicando el análisis de espectro de escalamiento de momento (MSS)6,7,8 o ajustando el valor de 'alpha' por ajuste de desplazamiento cuadrático medio (MSD) a la curva9, también clasificar las partículas según el tipo de trayectoria.

Análisis de intensidad de la mancha en imágenes de fluorescencia es un objetivo compartido por los científicos en el campo10,11. El algoritmo más común utilizado es el número llamado y el brillo. Este método, sin embargo, no permite detección de correcta intensidad del cuadro a cuadro en las partículas en la fracción móvil. Así, hemos generado un nuevo algoritmo para evaluar estas partículas intensidades fotograma por fotograma y para determinar su estado de agregación. Una vez que las coordenadas de cada partícula se detectan utilizando U-Track2 software3, definimos su intensidad en cada fotograma sobre la trayectoria completa, teniendo en cuenta también el fondo de la celda en cada fotograma. Este software ofrece diferentes posibilidades para determinar la intensidad de la mancha y el fondo de la célula y utilizando proteínas monoméricas y dimérica conocidas como referencias, calcula el número aproximado de proteínas en la partícula detectada (tamaño del clúster).

En este artículo, describimos una guía cuidadosa para realizar estos tres pasos: 1) detección y seguimiento de las partículas individuales a lo largo de un vídeo de la microscopia de fluorescencia utilizando U-; 2) analizando el coeficiente de difusión instantánea (D1-4) de las partículas y el tipo de movimiento (confinado, libre o dirigido) de partículas con trayectorias largas por SMS; 3) medición de la intensidad de la mancha a lo largo del video corregido por la fluorescencia de fondo estimado para cada punto. Esto permite la estimación del tamaño de racimo y la identificación de los pasos de fotoblanqueo.

El uso de este Protocolo no requiere habilidades especializadas y se puede realizar en cualquier laboratorio con cultivo celular, servicios de microscopia y citometría de flujo. El protocolo utiliza ImageJ o Fiji (una distribución de ImageJ12), U-track3y algunas rutinas de hoc hecho ad (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). Rutinas U-track y ad hoc funcionan sobre Matlab que puede instalarse en cualquier computadora compatible.

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Protocol

1. preparación de muestras biológicas

  1. Cultivar células de Jurkat en Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FCS, NaPyr y L-glutamina (RPMI completo). Células de Electroporate Jurkat (20 x 106 células/400 μL de RPMI 1640 con 10% FCS) con un vector del receptor del chemokine etiquetados GFP monomérico (CXCR4-AcGFP, 20 μg) para permitir su detección mediante microscopía de fluorescencia.
    Nota: Es posible utilizar otras monoméricas fluorescentes como mCherry, mScarlet, etcetera.
  2. 24 h después de la transfección analizar las células en un citómetro de flujo para determinar la viabilidad celular y la expresión de CXCR4-AcGFP.
  3. Seleccionar las células que expresan bajos niveles de CXCR4-AcGFP por célula clasificación de GFPbajo las células positivas (figura 1), como exige la baja expresión de receptores transfected en TIRFM experimentos para garantizar seguimiento sola partícula individual de seguimiento trayectorias de9.
  4. Cuantificar el número de receptores en la superficie celular.
    Nota: Como un ejemplo13, ~ 8.500-22.000 AcGFP etiquetado receptores/célula, corresponden a ~ 2-4.5 μm/partículas2.
  5. Resuspender ordenan las células en RPMI completo e incubar durante al menos 2 h a 37 ° C, 5% CO2. Centrifugar las células (300 x g, 5 min) y suspendidas en tampón TIRF (HBSS, 25 mM HEPES, 2% FCS, pH 7.3).
    1. Placas en platos pocillos con fondo de cristal de 35 mm (2-3 x 105 células/plato) con fibronectina (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) en la presencia o ausencia de ligando apropiado (es decir, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Incube las células (20 min a 37 ° C, 5% CO2) antes de la adquisición de la imagen.
  6. Realizar experimentos usando un microscopio TIRF, equipado con una cámara EM-CCD, un 100 x objetivo de inmersión en aceite (HCX PL APO 100 x / 1.46 NA) y un láser de diodo de 488 nm. El microscopio permite el control de la temperatura y la incubación con CO2. Localizar y enfocar las células con las perillas de enfoque grueso y fino, utilizando campo claro para minimizar efectos de fotoblanqueo. Para el ajuste de enfoque fino de modo TIRF utilizar una intensidad de láser de baja, insuficiente para la detección de la solo-partícula, o para inducir efectos de photobleaching (energía del laser de 5%, 28 μW).
  7. Adquirir películas (secuencias de imágenes) de aproximadamente 50 s minimizar el intervalo del tiempo entre los fotogramas. Penetración del campo evanescente debería ser 70-90 nm de profundidad. Guarde las películas adquiridas para cada condición experimental como "LIF" (video.lif).
    Nota: Películas en el ejemplo descrito se adquirieron en el 49% en la energía del laser (2 mW) con un tiempo de exposición de 90 ms y un intervalo de tiempo de 98 m, 49 s (500 fotogramas). Penetración de la onda evanescente seleccionada fue de 90 nm.

2. selección de imágenes y creación de máscaras

  1. Para cada condición experimental (video.lif), crear una nueva carpeta (VideoName) que debe contener diferentes carpetas para cada serie. Cada carpeta contendrá una carpeta "videoSeq" para las imágenes de vídeo y una carpeta de "resultados" de los resultados del análisis. Asegúrese de que la estructura del archivo en este momento es el siguiente:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Serie1/videoSeq
    VideoName/Serie1/resultados
    Nota: Del microscopio LIF diferentes archivos se obtienen con varios videos para cada condición de tratamiento (es decir, FN, FN + SDF). "video.lif" corresponde al input.lif archivo de vídeo con todas las adquisiciones películas TIRF (serie) en el microscopio. "videoSeq" carpeta contendrá los 500 marcos de la película que estamos analizando. La carpeta de "resultados" contendrá todos los archivos resultantes de los análisis realizados. Nomenclatura exacta y la localización de las carpetas diferentes son esenciales para el correcto funcionamiento de los algoritmos. Los nombres en negrita en la lista de arriba son fijos (es decir, tienen que ser llamado de esta manera ya que estos son los nombres por las secuencias de comandos). Nombres no en negrita pueden cambiar para reflejar el experimento realizado.
  2. Abrir el video TIRFM (LIF archivo) con Fiji o ImageJ arrastrando y soltando el archivo en la barra de menú de Fiji y haga clic en Aceptar para importar el archivo de lif usando BioFormats (suplementario Figura 1).
  3. Seleccione la serie de procesos y haga clic en Aceptar (figura complementaria 2A). Para diseñar una máscara para el análisis de este video, también importar una imagen multicanal con los cromóforos diferentes (en el ejemplo, la serie 1 es la imagen multicanal y serie 2 el video correspondiente). El video (y la imagen multicanal) deben abrir como una pila de ImageJ. En el ejemplo (suplementario figura 2B), la imagen está a la izquierda y el video está a la derecha.
    Nota: Si no es necesaria la creación de una máscara para el vídeo, vaya a paso 2.5.
  4. Crear una máscara. Crear una imagen con los canales útiles para el diseño de la máscara. En este caso, los canales interesantes son el rojo, verde y gris.
    1. Dividir los canales de la imagen multicanal (suplementario Figura 3A): seleccione la imagen en la barra de menú y haga clic en Color | Dividir canales. Los distintos canales se mostrarán como imágenes separadas (suplementario figura 3B).
    2. Unir otra vez los tres canales en una sola imagen (suplementario Figura 4A): seleccione la imagen en la barra de menú y seleccione Color | Combinar canales. Seleccionar los canales adecuados y pulse OK (suplementario Figura 4B). Una nueva imagen de apilado no será generado (suplementario figura 4).
    3. Sincronizar las dos ventanas mediante la herramienta de Windows sincronizar (suplementario figura 5A): seleccione Analyze en la barra de menú | Herramientas | Sincronizar Windows. Aparecerá una nueva ventana con las posibilidades de la imagen de sincronizar (suplementario figura 5B).
    4. Con las dos ventanas sincronizadas (solo el video si no hay ninguna imagen multicanal asociada), la misma región en ambas ventanas puede ser recortada. Dibuje la región de interés con la herramienta de selección rectangular del menú flotante de ImageJ. Seleccione imagen en la barra de menú y seleccionar cultivos (suplementario figura 6A). Las dos imágenes recortadas se muestran individualmente (suplementario Figura 6B).
    5. Desincronizar ambas ventanas (suplementario Figura 6B) pulsando el botón Todos desincronizar en el administrador de Sincronización de Windows .
  5. Si no se ha creado una máscara como en el paso 2.4, dibuje la región de interés con la herramienta de selección rectangular del menú flotante de ImageJ.
  6. Guardar el vídeo como una secuencia de imágenes en el directorio videoSeq bajo el directorio de vídeo correspondiente (suplementario Figura 7A): seleccione el archivo en la barra de menú y haga clic Guardar como | Secuencia de imágenes... cambiar el nombre de las etiquetas de la secuencia de vídeo como video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (suplementario figura 7B): en el cuadro nombre , cambie el nombre video y haga clic en Aceptar. La secuencia debe estar sola en su directorio para ser utilizado con éxito por U-track.
    Nota: Si no diseñar una máscara para el video, vaya a paso 2.8.
  7. Diseño de una máscara. Seleccione la imagen multicanal y abra el complemento de Editor de segmentación (suplementario figura 8A): seleccione Plugins en la barra de menú y seleccionar segmentación | Editor de segmentación. Agregar y cambiar el nombre de las etiquetas de la segmentación como necesario haciendo clic derecho en las etiquetas del editor de segmentación (suplementario figura 8B, C).
    1. Elija la herramienta Selección apropiada en el menú flotante de ImageJ (aquí uso freehand), seleccione una etiqueta (verde) y diseñar primero la máscara exterior (suplementario Figura 9A). Una vez diseñado, el + el botón de opción de selección de ventana compuesto y la máscara seleccionada se mostrará en el visor (suplementario Figura 9A). Repita este paso con las siguiente etiquetas (Interior, en rojo) (suplementario figura 9B).
      Nota: Después de diseñar la máscara de las etiquetas verde y el Interior, la máscara Exterior ocupará el resto de la imagen.
    2. Máscaras se cifran en la imagen como 0, 1, 2... según el orden de las etiquetas en la ventana de etiquetas RGB. Cuando todas las máscaras para diseñan las diferentes etiquetas, guardar la máscara con el mismo nombre de archivo como el video, con el nombre mask.tif (suplementario Figura 9): seleccione el archivo en la barra de menú y seleccione guarda como | TIFF....
      Nota: Las máscaras seleccionadas se emplearán en el cálculo de los coeficientes de difusión y clasificación de las trayectorias (ver paso 4.2).
  8. Compruebe que la estructura del archivo en este momento es el siguiente:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Serie1/mask.tif
    VideoName/Serie1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Serie1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Serie1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Serie1/resultados
    Nota: La mask.tif es una imagen con la máscara como diseñado en pasos 2.4 y 2.7. El video*.tiff es el video ya guardado en el paso 2.6. Como el anterior, los nombres en negrita en la lista de arriba son fijos, es decir, tienen que ser llamado de esta manera ya que estos son los nombres por las secuencias de comandos. Nombres no en negrita pueden cambiar para reflejar el experimento realizado.

3. seguimiento de las partículas

  1. Seguimiento de todas las partículas en los vídeos seleccionados usando U-track.
  2. Abrir Matlab y agregar U-track directorio a la ruta con pone camino | Añadir con opción de subcarpetas en el menú. Guarde el camino para que en un futuro las ejecuciones de Matlab U-track es en el camino. Esta configuración de ruta de acceso debe hacerse sólo una vez.
  3. Cambiar el directorio de trabajo al directorio que contiene la serie a ser analizada. Invocar U-track escribiendo en la consola (suplementario Figura 10) movieSelectorGUI y pulse enter. La ventana de selección de películas será abierto (suplementario Figura 11A).
  4. Pulse en el botón de película de nuevo y aparecerá la ventana de edición de película (suplementario figura 11B).
  5. Pulse en Añadir canal a elegir el directorio con el vídeo (VideoName/Serie1/video) y rellenar los parámetros de información de la película. Establecer el directorio de salida de los resultados de U-track a los resultados (resultados de Serie1 de videoName).
    Nota: Los parámetros de información de la película pueden obtenerse desde el microscopio y las condiciones de adquisición.
  6. Pulse Configuración avanzada canal y llenar los parámetros relacionados con la adquisición. Busque los valores de los parámetros en el ejemplo (suplementario Figura 11).
  7. Pulse Guardar en la ventana de Configuración avanzada canal y Guardar en la ventana de edición de película . El programa le pedirá confirmación de la escritura el archivo llamado movieData.mat en el directorio de resultados . Confirmar.
  8. Después de crear la película, pulsa en continuar en la ventana de selección de película. U-pista preguntará sobre el tipo de objeto a analizar. Elegir solo-partículas (suplementario figura 12). La ventana de panel de Control aparecerán (suplementario Figura 13A).
    1. Seleccione el primer paso paso 1: detección de y pulsar en configuración. Aparecerá la ventana de Ajuste de mezcla modelo gaussiano ajuste (suplementario figura 13B). En el ejemplo, "Valor de alfa para la comparación con el fondo local" se establece en 0.001 y "Rolling-Window tiempo promedio" 3 (suplementario figura 13B).
    2. Pulse en Apply en la ventana de Ajuste de mezcla modelo gaussiano configuración y funcionamiento en el panel de Control. Con la configuración en la figura 13 suplementario, sólo el paso de detección funciona. Este paso toma unos pocos minutos (2-5). Compruebe los resultados presionando el botón de resultado de paso 1 (detección, suplementario figura 14).
      Nota: Como se muestra arriba, la película muestra círculos rojos en las partículas detectadas. Si no hay círculo rojo se muestra, este paso no ha funcionado correctamente.
  9. Realizar la identificación de pistas, es decir, fusión de las partículas detectadas en el paso anterior en temas que abarcan varios cuadros. Este es el paso 2: seguimiento de de U-track cuya configuración debe definirse como se muestra en la Figura complementaria 15A-C. Paso 2 costo función ajustes de fotograma a fotograma y de cierre de brecha, combinar y dividir en el ejemplo se muestran en suplementario figura 15B y C, respectivamente.
  10. Después de configurar los parámetros para el paso 2, pulse Ejecutar en el panel de Control y sólo de paso 2 carreras (suplementario Figura 16).
  11. Realizar análisis de pista, paso 3. Definir la configuración como se muestra en la figura 17 suplementario (panel derecho). A continuación, pulse aplicar en el panel de análisis de movimiento de ajuste y correr en la pista de Control Panel-U. Este paso toma unos segundos.
  12. Verificar con el botón de resultado del paso 3 que el proceso ha identificado correctamente todos los temas. Para hacerlo, haga clic en Mostrar número de pista de la ventana Opciones de película y cuadro por cuadro que cada canción ha sido correctamente identificado (suplementario Figura 18). Anotar manualmente las partículas que no son verdaderas partículas.
    Nota: Si no se hace esta selección manual, una débil selección automática se puede realizar más adelante cuando se calcula el coeficiente de difusión (ver paso 4).

4. cálculo de los coeficientes de difusión y clasificación de las trayectorias de

  1. Asegúrese de que todos los scripts son invocados desde el directorio del vídeo análisis (en el ejemplo, VideoName/Serie1).
  2. Leer todas las trayectorias para calcular los coeficientes de difusión emitiendo en Matlab el comando de consola: trajectories=readTrajectories(0.1), donde 0.1 es el tiempo en segundos entre dos fotogramas consecutivos (intervalo de tiempo, se muestra en el panel de película Información, suplementario figura 11B).
  3. Excluyen trayectorias correspondientes a trayectorias de puntos incorrectamente identificados. Dar una lista de los lugares para excluir. Por ejemplo, para excluir los puntos 4, 5 y 28, escriba: trayectorias = readTrajectories (0,1 [4, 5, 28]).
  4. Calcular los coeficientes de difusión instantánea de cada una de las pistas de esta célula. En este caso, calcular el coeficiente de difusión para un retraso de tiempo = 4, llamado D1-4. Para hacerlo, ejecuta en la consola de Matlab el comando: D = calculateDiffusion (trayectorias, 113.88e-3, 0.0015, 'alfa') donde trayectorias son la trayectoria obtenida en el paso 3, 113.88e-3 es el tamaño de píxel de las imágenes adquiridas en micrones, 0.0015 es un límite superior para los coeficientes de difusión de partículas inmóviles medidos en μm/s de2y 'alpha' es el modelo ajustado como se explica a continuación.
    Nota: Cuando se utiliza una cámara más rápida y la necesidad de más marcos para calcular el parámetro de difusión aumentan, por ejemplo a 20, por D = calculateDiffusion (trayectorias, 113.88e-3, 0.0015, 'alfa', '', 20). El parámetro de cadena antes de 20, en el ejemplo anterior, '', es el sufijo añadido a los archivos de salida. Este sufijo puede utilizarse para diferenciar diferentes análisis.
  5. Ajuste el MSD con una función diferente por llamar a la función calculateDiffusion nuevo con un modo de conexión diferentes ('limitado', 'libre' o 'dirigido'). En este ejemplo, 'limitado': D = calculateDiffusion (trayectorias, 113.88e-3, 0.0015, 'confinado').
  6. Obtener los resultados de ajuste para el modelo dirigido, como se muestra en la figura 20 suplementarios.
  7. Descomponer las trayectorias en trayectorias cortas y largas. Utilice el comando: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) donde 50 es la longitud mínima en los marcos de una trayectoria a considerar (en el ejemplo mostrado).
  8. Estudio de trayectorias cortas, usando el mismo procedimiento de instalación descrito en el paso 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'dirigida', 'Corto'). Analizar trayectorias cortas y anómalas con el comando: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', 'Corto').
  9. Analizar trayectorias largas para clasificar el tipo de movimiento a través de su espectro de escalamiento de momento (MSS)7. El comando: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'largo') en pantalla se muestran los análisis y genera un archivo llamado trajectoryClassification < sufijo > .txt en el directorio results\TrackingPackage\tracks.

5. cálculo de Ssize Cluster a través de la densidad de la partícula

Nota: Asegúrese de que todos los scripts son invocados desde el directorio del vídeo análisis (en el ejemplo mostrado, VideoName/Serie1).

  1. Analizar la intensidad de cada partícula a lo largo de su trayectoria. Para ello, invocar la secuencia de comandos escribiendo en la consola de Matlab: analyzeSpotIntensities que toma como entrada las trayectorias calculadas por U-pista en la primera sección. En su forma más básica, llamada simplemente el script sin ningún argumento desde el directorio del vídeo análisis (en el ejemplo mostrado, VideoName/Serie1) analyzeSpotIntensities(). Configurar este comportamiento básico de muchas maneras diferentes, proporcionando argumentos a la escritura como en: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, valor1, ' Arg2´, valor2,...). Argumentos válidos con sus correspondientes valores de las variables ('ArgN´, valorN) aparecen.
    1. ('spotRadius´, 1)
      Analizar la intensidad de la fluorescencia usando el spotRadius de 1 pixel (por defecto) que corresponde a un parche de tamaño 3 x 3 centrado en el punto ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Nota: Para un parche de 5 x 5 centrada en el lugar, elegir un spotRadius de 2, etcetera.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      Si este argumento se da valor de 1 (true), analizar sólo las trayectorias que comienzan en el primer fotograma del vídeo. Esto es útil para analizar imágenes de control (por defecto 0, false).
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Si este argumento se establece en 0 (falso), luego mantener la coordenada del punto en su primer fotograma para todos los marcos (esto es útil para puntos inmóviles). Si el argumento se establece en 1 (por defecto 1, true), entonces el lugar se realiza un seguimiento a lo largo de los siguientes videos calcularon las coordenadas de U-track.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Incluir el número de la trayectoria de esas trayectorias excluido en el paso 4.3 (en el ejemplo 4, 5, 28).
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      Si este argumento se establece en 1 (verdadero), entonces analizar la intensidad en el parche al final del video (incluso si la trayectoria se detiene antes). La coordenada del punto es la última coordenada en la trayectoria (si trackTrajectory es true) o la primera coordenada de la trayectoria (si trackTrajectory es false). Este argumento es falso (0) por defecto.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      Si se establece este parámetro, entonces correcta la cruda fluorescencia medidos en cada punto la estimación de la fluorescencia de fondo para ese punto (véase abajo). Este argumento es true (1), por defecto.
    7. ('meanLength´, número de fotograma)
      Si se establece este parámetro, el punto de intensidad media se mide en la longitud indicada. Conjunto 'meanLength', 20 para medir la intensidad media de punto en los primeros 20 frames. Si no es el argumento, la intensidad de la mancha se calcula en toda la trayectoria (por defecto, longitud total).
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Establezca este parámetro como 1 (por defecto 0, false), para trazar el perfil de intensidad a lo largo de los diferentes marcos, así como sus antecedentes.
      Nota: Estos diagramas son muy útiles para identificar fotoblanqueo como se muestra en la figura 21 suplementario. Para cada ruta, la rutina automáticamente analiza si es posible que haya habido fotoblanqueo. Esto se hace comparando los valores de intensidad con t de un estudiante en las primeras y la últimas N frames a lo largo de la ruta. Por defecto, N es 10, pero este valor puede modificarse a través del argumento de ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, valor)
      Establezca este parámetro para determinar el fondo de cada lugar. Esto puede hacerse de varias maneras, y que uno a utilizar puede ser seleccionado cambia el "valor":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Utilice este valor para identificar manualmente el fondo para el video entero. Permiten para seleccionar 8 puntos en el primer fotograma del vídeo. Un parche alrededor de estos puntos se analiza a lo largo del video entero, y el cuantil del 95% de estas intensidades es elegido como la intensidad de fondo para todos los puntos.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        Utilice este valor para identificar manualmente el fondo de cada marco. Elegir 8 puntos por cada punto y cada fotograma. Esta es una tarea mucho tiempo pero da mucho control al usuario. El cuantil del 95% de las intensidades en estos parches es elegido como la intensidad de fondo de este lugar en este marco.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        Usar este valor para calcular el fondo de cada punto estimado de 8 puntos en un círculo alrededor de la mancha con un radio controlado por el argumento ' backgroundRadius´ (por defecto, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        Utilice este valor para calcular el fondo de cada marco primero localizar el celular en el video y luego analizar las intensidades de la célula en cada fotograma (suplementario figura 22).
        Nota: El fondo es elegido como el valor de gris en un cuantil dado de esta distribución (por defecto 0.5 (= 50%), aunque este parámetro puede ser controlado a través de la discusión ' backgroundPercentile´, este valor se puede establecer más alto, por ejemplo, 0,9 (= 90%) Si ganas más de la célula para ser considerado como fondo. Para ayudar en la identificación de la célula, indica que es el valor máximo del fondo esperado a lo largo de los marcos utilizando el argumento de ' maxBackground´ (por ejemplo, en todos los videos analizados, el valor de fondo normalmente no va más allá de 6000)13. De forma predeterminada, esta opción se establece en 0, lo que significa que esta ayuda no se utilice por defecto. Ver cuál es la detección de células y el área seleccionada para la estimación de fondo estableciendo el argumento ' showImages´ 1 (parada de la ejecución en cualquier momento presionando CTRL-C).
  2. Recopile la información difusión e intensidad para todas las trayectorias calculadas en los pasos 4 y 5.1, respectivamente, utilizando gatherDiffusion.AndIntensity (). Recopilar sólo la información difusión e intensidad de corta trayectoria. Para hacerlo, utiliza los sufijos utilizados en paso 4.7 y tipo: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) que ' Short´ es el sufijo utilizado en paso 4.7.
  3. Reunir el escalamiento del espectro del momento y la intensidad informationby escribiendo: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') donde 'Largo' es el sufijo utilizado en paso 4.7. Un resumen de todos los archivos generados mediante este protocolo se muestra en la figura 2.

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Representative Results

El uso de este protocolo permite el seguimiento automatizado de las partículas detectadas en películas de microscopía de fluorescencia y el análisis de sus características dinámicas. Inicialmente, las células son transfectadas con la proteína fluorescente junto a ser rastreados. El nivel apropiado de receptores se presenta en la superficie celular que permite que SPT se obtiene por célula clasificación (figura 1). Las células son analizadas por microscopía TIRF que genera vídeos en un formato que puede ser estudiado con las herramientas descritas en este protocolo (1 Video suplementario).

Los videos generados no pueden analizarse directamente y se requiere de Marcos independientes de cada vídeo. El uso de ImageJ genera archivos que pueden ser interpretados usando software de Matlab como fotogramas de vídeo en formato .tiff o máscaras. U seguimiento de las partículas en el vídeo seleccionado y guarda la información en los archivos de Matlab (MAT) (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), véase la figura 2.

Como se muestra en la figura 2, el cálculo de los coeficientes de difusión y clasificación de los comandos de trayectorias, genera diferentes archivos (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, etcetera). La información contenida en estos archivos son mejor administrados utilizando software Excel y prisma. La información que se puede obtener de este análisis incluye:

  1. Porcentaje de puntos inmóviles. Se puede utilizar como referencia de partículas inmóviles: el percentil 95% de D1-4 los valores obtenidos (1) del solas partículas en las células fijas (2) de la proteína fluorescente purificada o unido al cubreobjetos (Figura 3A).
  2. Porcentaje de trayectorias largas (> 50 cuadros) (figura 3B).
  3. Tipo de movimiento de la larga trayectoria: dirigida, libre, confinado (figura 3).
  4. Coeficiente de difusión (D1-4) de las partículas móviles en células tratadas con diferentes estímulos (Figura 4A).

El paso 5 del protocolo analiza las intensidades de cada partícula a lo largo de la trayectoria. El script analyzeSpotIntensities se imprimirá en pantalla toda la información analizada. Para cada punto y el marco, el script muestra la coordenada del punto en que marco (x, y) en unidades de píxeles, la estimación de la fluorescencia del fondo (k0), la intensidad de punto cruda en el parche de 3 x 3, la intensidad corregida (calculado como la intensidad cruda menos su fondo), el valor máximo de la intensidad observada en el parche y el número de región dentro de la máscara en este lugar se encuentra en este marco. Un ejemplo del tipo de producción es

Spot = 43 marco = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

Toda esta información se almacena en un archivo de registro (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) y una tabla que puede ser leída desde Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). Después de analizar cada punto, la secuencia de comandos imprime la intensidad media a lo largo de la trayectoria y la región mayoritario dentro de la máscara

Spot = 43
meanCorrectedSpotIntensity a lo largo de Marcos = 4762.303
región mayoritario = 3

Esta información se almacena en el archivo de registro arriba y una tabla que se puede leer en una hoja de cálculo (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). Por ejemplo, intensidades spot media (msi) para cada partícula a lo largo de su trayectoria en las células estimuladas con diferentes condiciones se muestra en la Figura 4B. Ahora podemos utilizar esta información para estimar aproximadamente el tamaño del grupo fluorescente. Como media de un punto intensidad corregida está relacionada con el número de proteínas fluorescentes presentes en este lugar, y la fluorescencia de un monómero puede medirse a través de un experimento similar pero independiente, calcular directamente el número de receptores por partícula. La distribución de frecuencias del número de receptores por partícula utilizando como referencia la intensidad de la proteína monomeric expresada en las células mismas se muestra en la figura 4.

El comando de intensidad y difusión se reúnen crean dos archivos: uno llamado diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txty otro llamado log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt en el directorio resultados / Pistas de TrackingPackage. Ambos archivos contienen 1) el índice de punto 2) el coeficiente de difusión, 3) la intensidad y 4) el número de región dentro de la máscara. Estos archivos se pueden leer en una hoja de cálculo.

Del mismo modo, el comando se reúnen trayectoria clasificación e intensidad creará dos archivos uno llamado trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt y otro log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt en el directorio de pistas de TrackingPackage de resultados. El primero contiene 1) el punto índice, 2) el tipo de movimiento, 3) el punto primer momento 4) la intensidad, 5) D1-4 y 6) el número de región dentro de la máscara. Este archivo puede ser leído desde Excel.

Un resumen de todos los archivos generados mediante este protocolo se muestra en la figura 2. Otros análisis que se pueden realizar utilizando este protocolo incluyen la comparación de los parámetros dinámicos de puntos más grandes vs pequeño, es decir, oligómeros de monómeros vs, variaciones en estos parámetros dinámicos inducidas por ligandos, inhibidores, composición de la membrana, alteración de la señalización de vías, etcetera. Un análisis completo del comportamiento de CXCR4 en respuesta a su ligando CXCL12 bajo diferentes condiciones experimentales se ha realizado usando este protocolo13.

Figure 1
Figura 1 : Clasificación celular. Expresión de GFP en células Jurkat transfectadas con CXCR4-AcGFP antes y después de su clasificación de la célula. Células expresan bajos niveles de GFP (GFPbajo) se seleccionan y se emplea para experimentos TIRF.

Figure 2
Figura 2 : Resumen de los archivos generados. La figura muestra todos los archivos generados utilizando la rutina de Matlab descrita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Clasificación de las trayectorias de. Número de los diferentes tipos de trayectorias correspondientes a células tratadas con diferentes estímulos. (A) porcentaje de puntos inmóviles, (B) porcentaje de largas trayectorias y (C) tipo de movimiento de las trayectorias largas.

Figure 4
Figura 4 : Coeficiente de difusión, intensidades medias de punto y número de receptores por partícula. (A) distribución de los valores de coeficientes (D1-4) de corto de difusión para cada punto en respuesta a diversos estímulos (I, II, II y IV). Línea roja representa el valor medio de D1-4. (B) los valores de intensidades spot media (msi) para cada punto a lo largo de sus 20 primeros fotogramas en respuesta a diversos estímulos (I, II, II y IV). Línea roja representa el valor de intensidad media (SD). (C) porcentaje de receptores/partícula como extraído de la distribución de la intensidad de las partículas individuales, tomando como ancho del cubo el valor de la intensidad de proteína monomérica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 1: Abrir un archivo TIRFM en Fiji o ImageJ. Opciones que aparecen en la ventana de Bio-formatos con arrastrar y colocar un video de LIF. Haga clic aquí para descargar la figura. 

Suplementario Figura 2: Seleccione la serie. Imágenes presentan en el video de LIF. (A) la ventana que permite la selección de la serie para ser analizar, incluyendo imágenes multicanales. (B) ejemplo de resultado de la selección de la serie, incluyendo imagen multicanal (izquierda) y el correspondiente video (derecha). Haga clic aquí para descargar la figura. 

Suplementario Figura 3: Dividir canales. Ventana (A) captura de los comandos de ImageJ necesarios para partir canales de una imagen multicanal y (B) ejemplo de resultado del canal dividida. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario figura 4: Combinar canales. (A) combinar diferentes canales en una sola imagen. (B) selección de la fusión de canal. (C) ejemplo de resultado de la fusión de canal. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 5: Sincronizar windows. (A) localización en el menú de ImageJ de los comandos necesarios para la sincronización de imagen y la ventana resultante (B). Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 6: Seleccione la región de interés. (A) selección de la ventana de interés utilizando la herramienta de selección rectangular y (B) resultado de la cosecha de la imagen. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 7: Guardar el vídeo. Salvar a la región de interés como una secuencia de imágenes y parámetros para la operación de guardar como ventana de secuencia de imagen. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 8: Segmentación. (A) abrir el plugin del editor de segmentación en el menú de plugins de ImageJ. (B) añadir etiquetas y materiales para la segmentación. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 9: Diseño de la máscara. (A) selección de las etiquetas apropiadas y definición de la máscara verde. (B) selección de la máscara roja. Ejemplo de dos máscaras correspondientes a dos etiquetas. (C) guardar las máscaras como un archivo TIFF. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 10: Directorio de trabajo de MATLAB. Selección del directorio que contiene la serie a ser analizada. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 11: Menú principal de U-track. (A) selección de películas, edición de película (B) y (C) canal menús de configuración. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario figura 12: Seleccione el tipo de objeto a seguir. Seleccionar seguimiento de partículas individuales. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario figura 13: Detección de partículas. (A) U-track, panel de control. (B) ejemplo de configuración para la detección de partículas. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario figura 14: Ejemplo de resultados para la detección de partículas. Diferentes ventanas que incluyen un menú de visor, menú de opciones de película y la película. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 15: Menú de seguimiento. Ejemplo de configuración. (C) y (A) seguimiento, (B) ajuste - fotograma a fotograma enlazan a gap cierre, combinar y dividir menús. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 16: Ejemplo de resultados para el rastreo de partículas. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 17: Menú de análisis de pista. Ejemplo de configuración. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 18: Verificación del análisis de la pista. Pantalla mostrada después de análisis de pista, incluyendo una ventana de vídeo que muestra las partículas detectadas y sus correspondientes pistas. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario Figura 19: Cálculo de coeficientes de difusión. Histogramas de los coeficientes de difusión calculan (izquierda) y la media al cuadrado (MSD, derecha) de desplazamiento. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario figura 20: Cálculo de coeficientes de difusión incluyendo los modos de conexión diferentes. Histogramas de los coeficientes de difusión calculan (izquierda) y la media cuadrado de desplazamiento (MSD, derecha) para el modelo reducido. Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario figura 21: Perfiles de intensidad. Ejemplo de spot intensidad a lo largo de su trayectoria (línea azul) y fondo (línea roja). Haga clic aquí para descargar la figura.

Suplementario figura 22: Fondo para cada fotograma. Izquierda: Imagen de la célula de muestra. Medio: Detecta automáticamente el celular. Derecha: Área seleccionada automáticamente como fondo. Haga clic aquí para descargar la figura.

Video adicional 1: Ejemplo de una típico microscopia video TIRF mostrando la presencia de partículas con distintas intensidades y tipos de movimientos. Haga clic aquí para descargar el video.

Material adicional 1: Archivos que contienen todos los scripts de protocolo empleados en el ad hoc las rutinas empleadas para la clasificación de las trayectorias y análisis del tamaño del clúster. Haga clic aquí para descargar los materiales.

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Discussion

El método descrito es fácil de realizar incluso sin tener experiencia previa trabajando con Matlab. Sin embargo, las rutinas de Matlab extremadamente requieren exactitud con la nomenclatura de los diferentes comandos y la localización de las diferentes carpetas empleados por el programa. En el seguimiento de rutina de análisis (paso 3), pueden modificarse varios parámetros. La ventana de "Configuración gaussiana-mezcla modelo montaje" (paso 3.8) controla cómo U-track detecta partículas individuales en el video. Esto se hace instalando un modelo Gaussian de la mezcla como se indica en3. Uno de los parámetros clave para este ajuste define un filtro para ayudar a identificar máximos locales. El éxito de esta operación depende del contraste de la imagen y el ruido presente en las imágenes. El primer parámetro (valor de alfa para la comparación con el fondo local) controla la confianza de un maxima que un punto real, mientras que la segunda ayuda a reducir el ruido durante la identificación de los puntos. Parámetros importantes en el paso «Tracking» (3,9) son el número de fotogramas para cerrar brechas (que es que una pista puede abarcar sobre marcos en los que la partícula no se ve realmente, pero se ve antes de estos marcos y después de estos marcos, en el ejemplo, 0) y el número de fotogramas que una pista debe para ser considerado como un camino acertado (en nuestro ejemplo, 20, este parámetro está relacionado con la velocidad de la cámara y los marcos del número de la pista deben ser tal que permite el cálculo de la difusión de co eficiente). También es importante decidir si se va a combinar y dividir segmentos (en el ejemplo que se escogieron estas dos posibilidades). Luego, se deben establecer los parámetros para el paso 1 en las funciones de costo (enlace de fotograma a fotograma). Esta función controla cómo las partículas se realiza un seguimiento a lo largo de los marcos. Los parámetros más importantes en este punto es la selección del radio de búsqueda browniano, que controlar hasta qué punto cada punto se espera que en el siguiente fotograma. En nuestro ejemplo elegimos 0 y 5 como límites superior e inferior respectivamente. Tenga en cuenta que estos parámetros son muy específicos a la naturaleza de las partículas sean seguidos, y que pueden tener que ajustarse en cada caso concreto. Particularmente importante son el poder escalar en el browniano y lineal de búsqueda radios. Estos poderes de escala dependen de la clase de movimiento de las partículas (difusión libre o confinado). En el ejemplo, los valores (0.5, 0.01) fueron elegidos para libre difusión. Para la documentación específica de estos parámetros, véase3.

En el cálculo de la orden de coeficientes de difusión (paso 4.4), se puede saber el límite superior del coeficiente de difusión de partículas inmóviles de experimentos anteriores o mediante la ejecución de la función calculateDiffusion en un proyecto independiente con inmóvil partículas (purificada monomérica proteína fluorescente) y ver los coeficientes de difusión informaron. Esta función toma dos parámetros adicionales: ' outputSuffix´, que se agrega a los nombres de archivo de salida y por defecto toma el valor vacío, y ' plotLength´, que por defecto es 13 y es el número de intervalo de tiempo (segundos) en que se realiza el cálculo de la difusión. El modo de conexión 'alpha' implica un ajuste de la MSD a la curva

Equation 1

es decir, un desplazamiento (MSD0) y una función de energía del tiempo de retraso. El exponente de esta función de energía, Equation 2 , determina si el movimiento se limita (0 < α < 0.6), anómala (0.6 < α < 0.9), libre (0.9 < α < 1,1), o dirigida (α > 1.1). Para una revisión de este tipo de análisis el lector se refiere a Manzo et al9

El cálculo de los coeficientes de difusión4 produce dos figuras de salida (ver figura 19 suplementarios). La primera de ellas muestra un histograma de la difusión coeficientes calculados (nota que en este momento, hay un coeficiente de difusión independiente para cada trayectoria). La media y el percentil 95% de estos coeficientes se muestran en la consola de Matlab. La trama de la segunda muestra el MSD (curva roja) y el número de pasos considerados para calcular como una función de temporización para las trayectorias considerado móvil (aquellos cuyo coeficiente de difusión está por encima del umbral de la línea de comandos). Se calcula el promedio y desviación estándar de las trayectorias móviles (estos son los valores de las trayectorias en una sola célula). En el ejemplo, el exponente es 0,59 significa que se limita el movimiento. Para este ajuste de curvas, el programa informa de la incertidumbre asociada a cada uno de los parámetros (se muestra como la desviación estándar de cada uno) y la bondad de ajuste (un ajuste perfecto llegaría a cero). En este punto y después de comprobar el valor de alfa podemos decidir montar el MSD con una función diferente:

Equation 3    Si 0 < α < 0.6 (confinada)

Equation 4Si 0,9 < α < 1.1 (gratis)

Equation 5Si α > 1.1 (dirigido)

Trayectorias anómalas no pueden estar equipados con una función diferente. En el caso de partículas confinadas puede calcular el tamaño de confinamiento (en micras) como en Destainville et al.,14

Equation 6

Un buen indicador de un correcto montaje es que la bondad de ajuste debe disminuir de la alfa en el montaje final (en el ejemplo, la bondad de ajuste cae desde 0.30474 hasta 0.15749, suplementario Figura 19-20). calculateDiffusioncreates dos archivos en el "results\TrackingPackage\tracks" dentro del directorio de la serie llaman "diffusionCoefficients.txt" y "diffusionCoefficientsMobile.txt". Estos archivos contienen tres columnas: 1) el índice de cada entrada de trayectoria, 2) su correspondiente coeficiente de difusión, 3) la región mayoritario de la máscara donde esta pista pertenece a (las regiones se obtienen del archivo "mask.tif" que generó en los pasos 2.7; Si este archivo no existe, entonces esta columna no está presente). Puede utilizar este archivo y los archivos análogos generados por otras células para analizar la distribución del coeficiente de difusión para un conjunto de células bajo condiciones experimentales similares.

En el cálculo del coeficiente de difusión para trayectorias cortas (pasos 4.7-4.8), el último parámetro 'Corto' es un sufijo añadido al nombre del archivo de salida que puede analizar diferentes subconjuntos de trayectorias sin sobrescribir la diffusionCoefficients.txt archivos. El nombre real de los archivos de salida es "diffusionCoefficients < sufijo > .txt" y "diffusionCoefficientsMobile < sufijo > .txt". Si no se da sufijo, como en el análisis general realizado anteriormente, se asume un sufijo vacíelo. Los parámetros del modelo (D, v y MSD0) pueden diferir de las equipadas para todos trayectorias. Lo más notable posible, normalmente aumenta la desviación estándar de los parámetros, así como la bondad de ajuste. La razón es que cortas trayectorias son más inestables y una conexión confiable es más difícil.

El análisis de trayectorias largas (paso 4.9) los clasifican en confinados (1), free (2), o dirigida (3) según su primer momento y su ubicación con respecto a los percentiles 2,5% y 97,5% del primer momento de 500 caminos aleatorios con movimiento browniano, el mismo coeficiente de difusión y longitud que la trayectoria se analizaron y simulación por Monte Carlo. Si el primer momento del camino analizado está por debajo de 2.5% de los primeros momentos en las simulaciones, la ruta estudiada se clasifica como confinada. Si es superior el 97.5% de los primeros momentos simulados, se clasifica como se indica; de lo contrario, el camino se clasifica como browniano. El comando empleado, 113.88e-3 es el tamaño del pixel en μm, 0.0015 es el límite superior del coeficiente de difusión de inmóviles puntos medidos en μm/s de2y 'Largo' es el sufijo para el nombre de archivo de salida. La primera columna de este archivo ("trajectoryClassificationLong.txt") es el número de trayectoria, la segunda es su clasificación (1 = confinado, 2 = gratis, 3 = dirigida), y el tercero es la trayectoria de primer momento.

La secuencia de comandos para el cálculo de la intensidad de cada partícula (paso 5.1) es muy flexible y permite el seguimiento de las intensidades de fluorescencia de muchas maneras diferentes (cada uno adecuado para diversas situaciones como puntos inmóviles de un experimento de control de seguimiento o seguimiento lugares altamente movibles sobre una celda con fondo fluorescente variable). La escritura a analizar todas las trayectorias a lo largo de todos los marcos. Para cada punto en cada fotograma será medir la intensidad de los píxeles alrededor de la mancha (analiza un parche cuadrado alrededor de la mancha, por defecto de un tamaño 3 x 3 píxeles), calcular el punto de fondo y calcula la diferencia de fluorescencia entre el lugar y la fondo. El porcentaje de partículas de fotoblanqueo y el número de partículas fluorescentes en un único clúster, visto como un solo punto, se puede calcular de esta manera.

Este método automatizado (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) produce información sobre varios parámetros (intensidad de la mancha, difusión lateral, tipo de movimiento), que pueden ayudar a estudiar a la relación entre el tamaño del spot y su dinámica en condiciones basales, y cómo diferentes tratamientos pueden modificar estos parámetros.

La principal limitación del método es que requiere la transfección de la célula con la proteína fluorescente para realizar un seguimiento. Transfección conduce generalmente a la sobreexpresión de la proteína, lo que dificulta la única proteína de seguimiento. Una celda de paso de la clasificación debe ser incluida para seleccionar las células expresando una serie de receptores que permiten la detección y seguimiento de partículas individuales por microscopía TIRF de SPT. Este método podría emplearse también para el seguimiento de biomoléculas con puntos cuánticos o fragmentos Fab. El protocolo descrito requiere una serie de controles que debe analizarse previamente para asegurar que las conclusiones de los análisis son correctas. En primer lugar, es fundamental determinar las condiciones de expresión adecuados que permitan la detección y seguimiento de partículas individuales. Películas con densidades de ~ 4.5 partículas/μm2, correspondiente a 8.500-22.000 receptores/célula, fueron utilizados para analizar la organización espacio-temporal de la membrana celular del receptor13.

Es importante establecer el coeficiente de difusión detectable mínimo mediante purificado proteínas monoméricas de AcGFP o células fijas. En ambos casos se asume que hay no hay difusión y por lo tanto, estimamos que los valores de difusión de partículas en estas condiciones corresponden a partículas inmovilizadas y sirve para discriminar entre trayectorias móviles e inmóviles13.

El análisis que hemos presentado aquí es una herramienta de análisis de la trayectoria general que puede aplicarse al análisis de la difusión de los receptores de superresolución, el análisis de imágenes de difracción limitada y el análisis del movimiento celular por microscopia estándar . La principal ventaja de este método con otros descritos previamente, como el análisis del brillo y la número11, es que permite la evaluación de los valores de la intensidad media de cada punto individual a lo largo de su trayectoria, teniendo en cuenta el tiempo de supervivencia de la AcGFP proteína monomérica antes de fotoblanqueo. El tiempo de supervivencia de una molécula antes de fotoblanqueo dependerá fuertemente de las condiciones de excitación.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Estamos agradecidos a Carlo Manzo y Maria García Parajo por su ayuda y código fuente de los análisis de coeficiente de difusión. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Ministerio de ciencia, innovación y universidades (SAF 2017-82940-R) y el programa RETICS del Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 y RD16/0012/0006; RIER). LMM y JV son apoyadas por el programa COMFUTURO de la Fundación General CSIC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

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References

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