Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para acompanhamento de análise de imagem que permite a avaliação quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de tamanhos de cluster e o movimento de partículas único detectados por microscopia de fluorescência de partícula única.

Abstract

Acompanhamento em uma sequência de vídeo e a análise posterior de suas trajetórias de partículas hoje em dia é uma operação comum em muitos estudos biológicos. Usando a análise dos receptores de membrana celular de clusters como modelo, apresentamos um protocolo detalhado para esta tarefa de análise de imagem usando Fiji (ImageJ) e rotinas de Matlab para: 1), definir as regiões de interesse e projetar máscaras adaptadas a estas regiões; 2) acompanhar as partículas em vídeos de microscopia de fluorescência; 3) analise as características de difusão e intensidade de faixas selecionadas. A análise quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de movimento e o tamanho do cluster obtidas por microscopia de fluorescência e processamento de imagem fornece uma ferramenta valiosa para determinar objetivamente a dinâmica da partícula e as consequências de modificar condições ambientais. Neste artigo apresentamos protocolos detalhados para a análise desses recursos. O método descrito aqui não só permite a detecção de rastreamento único-molécula, mas também automatiza a estimativa dos parâmetros de difusão lateral na membrana celular, classifica o tipo de trajetória e permite a análise completa, assim, superar a dificuldades em quantificar o tamanho de ponto ao longo de sua trajetória inteira na membrana celular.

Introduction

Proteínas de membrana incorporadas a bicamada lipídica estão em contínuo movimento devido à difusão térmica. Sua dinâmica é essencial para regular as respostas celulares, como interações intermoleculares permitem a formação de complexos que variam em tamanho de monômeros de oligômeros e influenciam a estabilidade de complexos de sinalização. Elucidar os mecanismos para controlar a dinâmica da proteína é, portanto, um novo desafio em biologia celular, necessária para compreender as vias de transdução de sinal e para identificar as funções da célula imprevistos.

Foram desenvolvidos alguns métodos ópticos para estudar essas interações na vida, as células¹. Entre estes, microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total, desenvolvida na década de 1980, permite o estudo de interações moleculares ou muito próximo da membrana celular². Para estudar parâmetros dinâmicos de trajetórias de proteína de membrana obtidos de dados TIRF em células vivas, uma única partícula rastreamento método (SPT) é necessária. Embora vários algoritmos estão disponíveis para isto, atualmente usamos aqueles publicados por Jaqaman et al.³ que abordam a heterogeneidade de movimento das partículas em um campo de partículas densas, vinculando as partículas entre quadros consecutivos para se conectar a faixa resultante segmentos em trajetórias completas (desaparecimento temporário das partículas). O software capta a partícula mesclando e dividindo esse resultado de agregação e dissociação de eventos³. Um dos dados de saída deste software é a detecção das partículas ao longo da trajetória inteira definindo suas posições X e Y em cada quadro.

Uma vez que as partículas são detectadas, aplicamos diferentes algoritmos para determinar o curto lapso difusão coeficiente (D_1-4)^4,5. Aplicando-se o espectro de dimensionamento do momento (MSS)^6,7,8 análise ou por encaixe o valor 'alpha' pelo ajuste de deslocamento o quadrado médio (MSD) para a curva⁹, podemos também classificar as partículas de acordo com o tipo de trajetória.

Análise de intensidade local em imagens de fluorescência é um objectivo comum para os cientistas no campo^10,11. O algoritmo mais comum usado é o número de chamados e brilho. Este método, no entanto, não permitir a detecção de intensidade correta do frame-por-frame em partículas na fração móvel. Temos, assim, geramos um novo algoritmo para avaliar estas partículas intensidades quadro-a-quadro e determinar o seu estado de agregação. Uma vez que as coordenadas de cada partícula são detectadas usando U-Track2 software³, definimos a sua intensidade em cada quadro sobre a trajetória completa, tendo também em conta o plano de fundo de célula em cada quadro. Este software oferece diferentes possibilidades para determinar a intensidade do ponto e o plano de fundo da célula e, usando proteínas monoméricas e dimérica conhecidas como referências, calcula o número aproximado de proteínas na partícula detectada (tamanho do cluster).

Neste artigo, descrevemos um cuidado guia para executar estas três etapas: 1) detecção e rastreamento única partículas ao longo de um vídeo de microscopia de fluorescência usando U-faixa; 2) analisando o coeficiente de difusão instantânea (D_1-4) de tais partículas e o tipo de movimento (confinado, livre ou dirigido) de partículas com longa trajetória por MSS; 3) medindo a intensidade local ao longo do vídeo corrigido por fluorescência fundo estimado para cada ponto. Isso permite que a estimativa de tamanho de cluster e identificação das etapas fotobranqueamento.

O uso do presente protocolo não requer habilidades especializadas e pode ser executado em qualquer laboratório com cultura celular, instalações de microscopia e citometria de fluxo. O protocolo usa ImageJ ou Fiji (uma distribuição do ImageJ¹²), U-faixa³e algumas rotinas de hoc feita anúncio (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-track e ad-hoc rotinas atropelar Matlab que pode ser instalado em qualquer computador compatível.

Protocol

1. preparação de amostras biológicas

1. Desenvolvem-se células Jurkat em RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS, NaPyr e L-glutamina (RPMI completa). Células Electroporate Jurkat (20 x 10⁶ células/400 µ l de RPMI 1640 com 10% de FCS) com um vetor de receptor do chemokine monomérica com rótulo GFP (CXCR4-AcGFP, 20 μg) para permitir que sua detecção usando microscopia de fluorescência.
   Nota: É possível usar outras proteínas monoméricas fluorescentes como mCherry, mScarlet, etc.
2. 24 h após a transfeccao analisar as células em um citômetro de fluxo para determinar tanto a viabilidade celular e a expressão do CXCR4-AcGFP.
3. Selecione células expressando baixos níveis de CXCR4-AcGFP, classificando o celular de células positivas GFP,^baixo (Figura 1), como a baixa expressão do receptor transfectado é exigido em experimentos TIRFM a fim de assegurar o acompanhamento de partícula única para rastreamento individual trajetórias de⁹.
4. Quantificar o número de receptores na superfície celular.
   Nota: Como um exemplo¹³, receptores de AcGFP-rotulado ~ 8.500-22.000/célula, correspondem a ~ 2-4,5 μm de².
5. Ressuspender as células classificadas em RPMI completa e incubar durante pelo menos 2 h a 37 ° C, 5% de CO₂. Centrifugar as células (300 x g, 5 min) e resuspended-los em tampão TIRF (HBSS, 25mm HEPES, FCS de 2%, pH 7,3).
   1. Placa em pratos de microplacas com fundo de vidro de 35 mm (2-3 x 10⁵ célula/prato) revestida com fibronectina (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) na presença ou ausência de ligante apropriado (ou seja, CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Incube as células (20 min a 37 ° C, 5% CO₂) antes da aquisição de imagens.
6. Realizar experimentos usando um microscópio TIRF, equipado com uma câmera EM CCD, uma 100 x objetivo de óleo-imersão (HCX PL APO 100 x / 1.46 nd) e um laser de díodo 488 nm. O microscópio permite controle de temperatura e incubação com CO₂. Localizar e focar as células com os botões de foco grosso e fino, usando o campo claro para minimizar efeitos de fotobranqueamento. Para o ajuste de foco fino no modo TIRF use uma intensidade do laser de baixa, insuficiente para a deteção da único-partícula ou para induzir efeitos fotobranqueamento (poder do laser de 5%, 28 μW).
7. Adquirir filmes (sequências de imagem) de aproximadamente 50 s minimizando o intervalo de tempo entre os quadros. Penetração do campo evanescente deve ser de 70-90 nm de profundidade. Salve os filmes adquiridos para cada condição experimental como ".lif" (video.lif).
   Nota: Filmes no exemplo descrito foram adquiridos em 49% a potência do laser (2 mW) com um tempo de exposição de 90 ms e um intervalo de tempo de 98 ms, por 49 s (500 frames). Penetração da onda evanescente selecionada foi de 90 nm.

2. seleção de imagens e criação de máscaras

1. Para cada condição experimental (video.lif), crie uma nova pasta (VideoName) que deve conter pastas diferentes para cada série. Cada pasta contém uma pasta "videoSeq" para as imagens de vídeo e uma pasta de "resultados" para os resultados da análise. Certifique-se que a estrutura de arquivo neste momento é o seguinte:
   VideoName/video.lif
   Series1/VideoName/videoSeq
   VideoName/Series1/resultados
   Nota: O microscópio .lif diferentes arquivos são obtidos com vários vídeos para cada condição de tratamento (ou seja, FN, FN + SDF). "video.lif" corresponde o input.lif arquivo de vídeo com todas as aquisições de filmes TIRF (série) realizado no microscópio. "videoSeq" pasta conterá os 500 frames do filme que estamos analisando. A "resultados" pasta conterá todos os arquivos resultantes das análises efectuadas. Exata nomenclatura e localização das pastas diferentes são essenciais para o funcionamento correto dos algoritmos. Nomes em negrito na lista acima são fixos (ou seja, eles têm de ser chamado assim, porque estes são os nomes que procurou pelos scripts). Nomes não em negrito podem mudar para refletir a experiência realizada.
2. Abra o vídeo TIRFM (arquivo .lif) com Fiji ou ImageJ arrastando e soltando o arquivo na barra de menu de Fiji e clique no Okey para importar o arquivo de lif usando BioFormats (complementar a Figura 1).
3. Selecione a série de processar e clique em Okey (Supplemental Figura 2A). Para criar uma máscara para a análise deste vídeo, também importar uma imagem multicanal com os diferentes cromóforos (no exemplo, o série 1 é o imagem multicanal e série 2 o vídeo correspondente). O vídeo (e a imagem multicanal) devem abrir como uma pilha de ImageJ. No exemplo (Supplemental figura 2B), a imagem está à esquerda e o vídeo é à direita.
   Nota: Se não é necessária a criação de uma máscara para o vídeo, vá para a etapa 2.5.
4. Crie uma máscara. Crie uma única imagem com os canais úteis para o desenho da máscara. Neste caso, os canais interessantes são as de vermelhas, verdes e cinza.
   1. Dividir os canais da imagem multicanal (complementar a figura 3A): selecione a imagem na barra de menu e clique em cor | Separação de canais. Os diferentes canais irão mostrar como imagens separadas (complementar a Figura 3B).
   2. Mesclar novamente os três canais em uma única imagem (Supplemental figura 4A): selecione a imagem na barra de menu e selecione cor | Mesclagem de canais. Selecione os canais apropriados e pressione Okey (Supplemental Figura 4B). Uma nova imagem empilhados não será gerado (Supplemental Figura 4).
   3. Sincronizar as duas janelas usando a ferramenta Sincronizar janelas (Supplemental figura 5A): selecione analisar na barra de menu de | Ferramentas | Sincronizar o Windows. Uma nova janela com as possibilidades de imagem sincronizar aparece (Supplemental figura 5B).
   4. Com as duas janelas sincronizadas (somente o vídeo se não há nenhuma imagem multicanal associada), a mesma região em ambas as janelas pode ser cortada. Desenhe a região de interesse com a ferramenta de seleção retangular de menu flutuante ImageJ. Selecione a imagem na barra de menu e selecione Crop (Supplemental figura 6A). As duas imagens cortadas mostrará individualmente (Supplemental figura 6B).
   5. Unsynchronize as duas janelas (Supplemental figura 6B) pressionando o botão Unsynchronize todos no Gerenciador de Sincronização Windows .
5. Se não foi criada uma máscara como na etapa 2.4, desenhe a região de interesse com a ferramenta de seleção retangular de menu flutuante ImageJ.
6. Salvar o vídeo como uma sequência de imagens no diretório videoSeq sob o diretório de vídeo correspondente (Supplemental figura 7A): selecione o arquivo na barra de menu e clique em salvar como | Sequência de imagem... renomear os rótulos para a sequência de vídeo como video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (Supplemental figura 7B): na caixa de Name , renomeie como vídeo e clique em Okey. A sequência deve ser sozinha no seu diretório para ser utilizado com sucesso pela U-trilha.
   Nota: Se não projetar uma máscara para o vídeo, vá para a etapa 2.8.
7. Desenha uma máscara. Selecione a imagem multicanal e abrir o Editor de segmentação plugin (Supplemental figura 8A): selecione Plugins na barra de menu e selecione segmentação | Editor de segmentação. Adicionar e renomear os rótulos da segmentação conforme necessário clicando com o botão direito sobre os rótulos do editor de segmentação (Supplemental figura 8B, C).
   1. Escolha a ferramenta de seleção apropriada no menu flutuante ImageJ (aqui, usar à mão livre), selecione uma etiqueta (verde) e desenha primeiro a máscara ultraperiférica (Supplemental Figura 9A). Uma vez projetado, o + a tecla na opção de seleção da janela de composição e a máscara selecionada será exibida no visualizador (Supplemental Figura 9A). Repita este passo com rótulos próxima (no Interior, em vermelho) (complementar figura 9B).
      Nota: Depois de projetar a máscara para os rótulos verde e Interior, a máscara Exterior ocupará o resto da imagem.
   2. Máscaras são codificadas na imagem como regiões 0, 1, 2,... de acordo com a ordem dos marcadores na janela de rótulos RGB. Quando todas as máscaras para os rótulos diferentes são projetados, salvar a máscara com o mesmo nome de arquivo como o vídeo, com o nome mask.tif (Supplemental Figura 9): selecione o arquivo na barra de menu e selecione salvar como | TIFF....
      Nota: As máscaras selecionadas serão utilizadas no cálculo dos coeficientes de difusão e classificação das trajectórias (consulte a etapa 4.2).
8. Verifique se a estrutura de arquivos neste momento é o seguinte:
   VideoName/video.lif
   Series1/VideoName/mask.tif
   Series1/VideoName/ videoSeq / video0000.tif
   Series1/VideoName/ videoSeq / video0001.tif
   ...
   Series1/VideoName/ videoSeq / video0499.tif
   VideoName/Series1/resultados
   Nota: A mask.tif é uma imagem com a máscara como projetado em etapas 2.4 e 2.7. O video*.tiff é o vídeo que salvou no passo 2.6. Como acima, os nomes em negrito na lista acima são fixos, ou seja, eles têm que ser chamado assim, porque estes são os nomes que procurou pelos scripts. Nomes não em negrito podem mudar para refletir a experiência realizada.

3. as partículas de rastreamento

1. Rastrear todas as partículas vistas nos vídeos selecionados usando U-faixa.
2. Abrir o Matlab e adicionar diretório U-trilha para o caminho usando Definir caminho | Adicionar com opção de subpastas no menu. Salve o caminho para que no futuro as execuções de Matlab U pista é no caminho. Essa configuração de caminho precisa ser feito apenas uma vez.
3. Altere o diretório de trabalho para o diretório que contém a série para ser analisado. Invocar o U-track, digitando no console (Supplemental Figura 10) movieSelectorGUI e pressione enter. A janela de seleção de filme será aberta (Figura suplementar 11A).
4. Pressione o botão de filme de novo e a janela de edição do filme aparecerá (Supplemental figura 11B).
5. Pressione Adicionar canal para escolher o diretório com o vídeo (vídeo/VideoName/Series1) e preencher os parâmetros de informações do filme. Defina o diretório de saída para os resultados de U-faixa de resultados (videoName/Series1/resultados).
   Nota: Os parâmetros de informações de filme podem ser obtidos o microscópio e as condições de aquisição.
6. Pressione sobre as configurações de canal avançada e preencher os parâmetros relacionados com a aquisição. Veja os valores dos parâmetros no exemplo (Supplemental Figura 11).
7. Pressione salvar na janela de Configurações avançadas do canal e salvar na janela de edição do filme . O programa irá pedir confirmação de escrever o arquivo chamado movieData.mat no diretório de resultados . Confirme.
8. Depois de criar o filme, pressione em continuar na janela de seleção de filme. U-faixa irá perguntar sobre o tipo de objeto a ser analisado. Escolha de Single-partículas (Supplemental Figura 12). A janela do painel de controle aparecerá (Supplemental figura 13A).
   1. Selecione o primeiro passo passo 1: deteção e pressione na configuração. A janela de Configuração Gaussian mistura-modelo encaixe aparecerá (Supplemental figura 13B). No exemplo, "Valor de alfa para comparação com fundo local" é definido como 0,001 e "Rolling-janela tempo média" para 3 (Supplemental figura 13B).
   2. Carregue em aplicar na janela Configurações Gaussian mistura-modelo encaixe e executar no painel de controle. Com a configuração em suplementar Figura 13, somente a etapa de deteção será executada. Esta etapa leva alguns minutos (2-5). Verificar os resultados, pressionando o botão resultado do passo 1 (deteção, suplementar Figura 14).
      Nota: Como mostrado acima, o filme mostra círculos vermelhos das partículas detectadas. Se nenhum círculo vermelho é mostrado, então esta etapa não tem funcionado corretamente.
9. Realize a identificação das faixas, ou seja, mesclando as partículas detectadas na etapa anterior em faixas que abrangem vários quadros. Este é o passo 2: acompanhamento da U-faixa cujas configurações devem ser definidos como mostrado na Figura suplementar 15A-C. As configurações de função de custo etapa 2 para vinculação de quadro a quadro e fechamento de Gap, mesclagem e divisão no exemplo são mostradas na Figura suplementar 15B e C, respectivamente.
10. Depois de definir os parâmetros para o passo 2, pressione executar no painel de controle e só passo 2 é executado (Supplemental Figura 16).
11. Realizar análise de trilha, etapa 3. Defina as configurações, conforme mostrado na Figura suplementar 17 (painel direito). Em seguida, prima aplicar no painel de configuração-Motion Analysis e executar no painel de controle-U-faixa. Esta etapa leva alguns segundos.
12. Verificar com o botão do resultado da etapa 3, que o processo identificou corretamente todas as faixas. Para fazer isso, clique em mostrar o número da faixa da janela Opções de filme e verificar quadro a quadro, que cada faixa tem sido corretamente identificado (Supplemental Figura 18). Anote manualmente as partículas que não são verdadeiras partículas.
    Nota: Se não for feita esta selecção manual, uma fraca seleção automática pode ser realizada mais tarde, quando o coeficiente de difusão é calculado (ver passo 4).

4. cálculo dos coeficientes de difusão e classificação das trajetórias

1. Certifique-se de que todos os scripts são invocados do diretório do vídeo sendo analisado (no exemplo, VideoName/Serie1).
2. Ler todas as trajetórias para calcular os coeficientes de difusão, emitindo em Matlab a consolar o comando: trajectories=readTrajectories(0.1), onde 0.1 é o tempo em segundos entre dois quadros consecutivos (intervalo de tempo, mostrado no painel filme Informações, suplementar figura 11B).
3. Trajetórias de exclusão correspondente incorretamente identificaram pontos/trajetórias. Dê uma lista dos pontos para excluir. Por exemplo, para excluir os pontos 4, 5 e 28, digite: trajetórias = readTrajectories (0.1, [4, 5, 28]).
4. Calcule os coeficientes de difusão instantânea para cada uma das faixas dessa célula. Neste caso, calcular o coeficiente de difusão para um intervalo de tempo = 4, chamado D_1-4. Para fazer isso, execute no console do Matlab com o comando: D = calculateDiffusion (trajetórias, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha') onde as trajetórias são as trajetórias obtidas na etapa 3, 113.88e-3 é o tamanho do pixel das imagens adquiridas em mícrons, 0,0015 é um limite superior para os coeficientes de difusão de partículas imóveis medidos em µm²/s e 'alpha' é o modelo ajustado conforme explicado abaixo.
   Nota: Quando usando uma câmera mais rápida e a necessidade mais quadros para calcular o parâmetro de difusão aumentá-lo, por exemplo, até 20, por D = calculateDiffusion (trajetórias, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', ', 20). O parâmetro de sequência de caracteres antes de 20, no exemplo acima, ', é o sufixo adicionado aos arquivos de saída. Este sufixo pode ser usado para diferenciar as diferentes análises.
5. Encaixe o MSD com uma função diferente, chamando a função calculateDiffusion novamente com um modo de encaixe diferentes ('confinado', 'livre' ou 'dirigido'). Neste exemplo, 'confinado': D = calculateDiffusion (trajetórias, 113.88e-3, 0,0015, 'confinado').
6. Obter os resultados de encaixe para o modelo dirigido, como mostrado na Figura suplementar 20.
7. Decompor as trajetórias em trajetórias curtas e longas. Use o comando: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) onde 50 é o comprimento mínimo em quadros de uma trajetória para ser considerado longo (no exemplo mostrado).
8. Estudar as trajetórias curtas usando o mesmo procedimento de instalação descrito no passo 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, 'dirigido', 'Curtas'). Analisar as trajetórias curtas e anômalas com o comando: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', 'Curto').
9. Analise a longa trajetória para classificar o tipo de movimento através de seu espectro de dimensionamento do momento (MSS)⁷. O comando: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'Long') mostra a análise em tela e gera um arquivo chamado trajectoryClassification < sufixo >. txt diretório results\TrackingPackage\tracks.

5. cálculo de Cluster Ssize através da densidade de partículas

Nota: Certifique-se de que todos os scripts são invocados do diretório do vídeo sendo analisado (no exemplo mostrado, VideoName/Serie1).

1. Analise a intensidade de cada partícula ao longo de sua trajetória. Para fazê-lo, chamar o script digitando no console do Matlab: analyzeSpotIntensities que toma como entrada as trajetórias calculadas pela U-trilha na primeira seção. Em sua forma mais básica, simplesmente chamar o script sem qualquer argumento do diretório do vídeo sendo analisado (no exemplo mostrado, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Configurar esse comportamento básico de muitas maneiras diferentes, fornecendo argumentos para o script, como em: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, valor1, ' Arg2´, valor2,...). Argumentos válidos, com seus respectivos valores de variável ('ArgN´, Valor_n) são listados.
   1. ('spotRadius´, 1)
      Analisar a intensidade de fluorescência usando o spotRadius de 1 pixel (por padrão) que corresponde a um pedaço de tamanho 3x3 centrado no ponto ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Nota: Um patch de 5 x 5 centrado no local, para escolher um spotRadius de 2, etc.
   2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      Se esse argumento for fornecido (true, o valor de 1), analise apenas as trajetórias que começam no primeiro frame do vídeo. Isso é útil para analisar imagens de controle (por padrão é 0, falso).
   3. ('trackTrajectory´, 0)
      Se este argumento estiver definido para 0 (falso), então mantenha a coordenada do ponto em seu primeiro quadro para todos os quadros (isto é útil para manchas imóveis). Se o argumento é definido como 1 (por padrão 1, verdadeiro), o local é controlado ao longo o seguinte vídeo as coordenadas calculadas pela U-trilha.
   4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Inclua o número de trajetória dessas trajetórias excluídos no passo 4.3 (no exemplo 4, 5, 28).
   5. ('extendTrajectory ´, 1)
      Se este argumento estiver definido como 1 (verdadeiro), em seguida, analise a intensidade no patch para o final do vídeo (mesmo se a trajetória parar mais cedo). A coordenada do ponto é a última coordenada na trajetória (se trackTrajectory) ou a primeira coordenada na trajetória (se trackTrajectory é false). Este argumento é falso (0) por padrão.
   6. ('subtractBackground´, 1)
      Se este parâmetro estiver definido, então correto a fluorescência bruta medido em cada ponto pela estimativa da fluorescência fundo para esse ponto (veja abaixo). Este argumento é verdadeiro (1), por padrão.
   7. ('meanLength´, número do quadro)
      Se este parâmetro estiver definido, então, o ponto de média intensidade é medido no comprimento indicado. Conjunto de 'meanLength', 20 para medir a intensidade de ponto média para os primeiros 20 frames. Se o argumento não estiver definido, a intensidade do ponto é calculada a trajetória inteira (por padrão, comprimento total).
   8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Defina este parâmetro como 1 (por padrão 0, falso), para traçar o perfil de intensidade ao longo de diferentes quadros, bem como seus antecedentes.
      Nota: Estes gráficos são muito úteis para identificar o fotobranqueamento conforme o suplementar figura 21. Para cada caminho, a rotina automaticamente analisa se é possível que tenha havido fotobranqueamento. Isto é feito comparando os valores de intensidade com t de um estudante nos primeiros e o últimos quadros de N ao longo do caminho. Por padrão, N é 10, mas esse valor pode ser modificado através de argumento ' Nbleach´.
   9. ('backgroundMethod´, valor)
      Defina esse parâmetro para determinar o plano de fundo de cada ponto. Isto pode ser feito de várias maneiras, e qual deles usar pode ser selecionado mudando o "valor":
      1. ('backgroundMethod´, 0)
         Use esse valor para identificar manualmente o plano de fundo para o vídeo inteiro. Permitem selecionar 8 pontos no primeiro quadro do vídeo. Um patch em torno destes pontos é analisado ao longo do vídeo inteiro, e o Quantil de 95% de todas estas intensidades é escolhida como a intensidade de fundo para todos os pontos.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
         Use esse valor para identificar manualmente o plano de fundo para cada quadro. Escolha 8 pontos para cada ponto e cada quadro. Esta é uma tarefa demorada, mas ela dá um monte de controle para o usuário. O Quantil de 95% das intensidades nessas manchas é escolhida como a intensidade de fundo para este ponto neste quadro.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
         Usar este valor para calcular o fundo de cada ponto estimado de 8 pontos, localizados em um círculo em torno do local, com um raio controlado pelo argumento ' backgroundRadius´ (por padrão, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
         Use este valor para calcular o fundo de cada quadro primeiro localizando a célula no vídeo e em seguida analisar as intensidades da célula em cada quadro (Supplemental Figura 22).
         Nota: O plano de fundo é escolhido como o valor de cinza em um determinado Quantil desta distribuição (por padrão 0,5 (= 50%), embora este parâmetro pode ser controlado através de argumento ' backgroundPercentile´, esse valor pode ser definido mais elevado, por exemplo, 0,9 (= 90%) se querer a maioria da célula a ser considerado como plano de fundo. Para ajudar na identificação da célula, indicar qual é o valor de fundo máximo esperado ao longo os quadros usando o argumento ' maxBackground´ (por exemplo, em todos os vídeos analisados, o valor de fundo normalmente nunca ultrapassa 6000)¹³. Por padrão, essa opção é definida para 0, significando que esta ajuda não é usada por padrão. Ver o que é a detecção de células e a área selecionada para a estimativa do fundo, definindo o argumento ' showImages´ como 1 (parar a execução a qualquer momento pressionando CTRL-C).
2. Reunir as informações de difusão e intensidade para todas as trajetórias calculadas nos passos 4 e 5.1, respectivamente, usando gatherDiffusion.AndIntensity (). Coletar somente as informações de difusão e intensidade de trajetórias curtas. Para fazer isso, usar os sufixos usados na etapa 4.7 e tipo: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) onde ' Short´ é o sufixo utilizado na etapa de 4,7.
3. Reunir a escala do espectro de momento e a digitação de informação de intensidade: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') onde 'Tempo' é o sufixo usado na etapa 4.7. Um resumo de todos os arquivos gerados usando este protocolo é mostrado na Figura 2.

Representative Results

O uso deste protocolo permite o monitoramento automatizado de partículas detectada em filmes de microscopia de fluorescência e a análise de suas características dinâmicas. Inicialmente, as células são transfected com a proteína fluorescente acoplados a serem controladas. O nível adequado de receptores presentes na superfície das células, o que permite que o SPT é obtido por célula de triagem (Figura 1). Células selecionadas são analisadas por microscopia TIRF que gera vídeos em um formato que pode ser posteriormente estudado com as ferramentas descritas neste protocolo (Supplemental vídeo 1).

Os vídeos gerados não podem ser analisados diretamente, e quadros independentes de cada vídeo são necessários. O uso do ImageJ gera arquivos que podem ser interpretados usando o software Matlab, tais como quadros de vídeo em formato. TIFF ou máscaras. U-faixa rastreia as partículas vistas no vídeo selecionado e salva as informações em arquivos de Matlab (MAT) (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), ver Figura 2.

Como mostrado na Figura 2, o cálculo dos coeficientes de difusão e classificação dos comandos de trajetórias, gera arquivos diferentes (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, etc). As informações contidas nestes arquivos são melhor geridos utilizando o software Excel e prisma. Informações que podem ser obtidas a partir desta análise incluem:

1. Porcentagem de pontos imóveis. Você pode usar como referência de partículas imóveis: o percentual de 95% de D_1-4 valores obtidos (1) da partícula única nas células fixas e/ou (2) a partir de proteína fluorescente purified anexado para as lamelas (Figura 3A).
2. Percentagem de trajetórias de longas (> 50 frames) (Figura 3B).
3. Tipo de movimento das trajectórias longa: dirigido, livre, confinado (Figura 3).
4. Coeficiente de difusão (D_1-4) de partículas móveis em células tratadas com diferentes estímulos (Figura 4A).

A etapa 5 do protocolo analisa as intensidades de cada partícula ao longo da trajetória. O script analyzeSpotIntensities irá imprimir na tela todas as informações analisadas. Para cada ponto e moldura, o script mostra a coordenada do ponto nesse quadro (x, y) em unidades de pixel, a estimativa da fluorescência fundo (k0), intensidade crua mancha no patch 3 x 3, a intensidade corrigida (calculada como a intensidade bruta menos sua plano de fundo), o valor máximo da intensidade observada no patch e o número de região dentro da máscara, onde este local está localizado a este quadro. Um exemplo do tipo de saída produzido é

local = quadro 43 = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

Todas essas informações são armazenadas em um arquivo de log (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) e uma tabela que pode ser lido a partir do Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). Depois de analisar cada ponto, o script imprime a intensidade média ao longo da trajetória e região majoritária dentro da máscara

local = 43
meanCorrectedSpotIntensity ao longo de quadros = 4762.303
região majoritária = 3

Essas informações são armazenadas no arquivo de log acima e uma tabela que pode ser lido de uma planilha (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). Como exemplo, intensidades de ponto médios (msi) para cada partícula ao longo de sua trajetória em células estimuladas com diferentes condições é mostrada na Figura 4B. Agora podemos usar esta informação para estimar aproximadamente o tamanho do cluster fluorescente. Como de um ponto intensidade corrigida está relacionada com o número de proteínas fluorescentes presentes neste local, e a fluorescência de um monômero pode ser medido através de uma experiência semelhante, mas independente, diretamente, calcular o número de receptores por partícula. A distribuição de frequência do número de receptores por partícula utilizando como referência a intensidade da proteína monomérica expressada nas mesmas células é mostrada na Figura 4.

A difusão se reúnem e intensidade comando criam dois arquivos: um chamado diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txte outro chamado log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt no diretório resultados / TrackingPackage/faixas. Ambos os arquivos contêm 1) o índice local, 2) o coeficiente de difusão, 3) a intensidade e número 4) da região dentro da máscara. Esses arquivos podem ser lidos de uma planilha.

Da mesma forma, o comando de classificação e intensidade de trajetória do recolhimento criará dois arquivos um chamado trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt e outro log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt na diretório de resultados/TrackingPackage/faixas. O primeiro contém 1) o índice local, 2) o tipo de movimento, 3) a mancha de primeiro momento, 4) a intensidade, 5) D_1-4 e 6) o número de região dentro da máscara. Este arquivo pode ser lido do Excel.

Um resumo de todos os arquivos gerados usando este protocolo é mostrado na Figura 2. Outras análises que podem ser executadas usando este protocolo inclui a comparação dos parâmetros dinâmicos de manchas maiores de vs pequenos, ou seja, o oligómeros vs monômeros, variações sobre estes parâmetros dinâmicos induzidos por ligantes, inibidores, composição de membrana, alteração da sinalização de caminhos, etc. Foi realizada uma análise completa do comportamento de CXCR4 em resposta ao seu ligante CXCL12 sob diferentes condições experimentais usando este protocolo¹³.

Figura 1 : Célula classificação. Expressão de GFP em células Jurkat transfected com CXCR4-AcGFP antes e depois da classificação da célula. Célula expressando baixos níveis de GFP (GFP^baixa) é seleccionada e empregada para TIRF experiências.

Figura 2 : Resumo dos arquivos gerados. A figura mostra todos os arquivos gerados usando a Matlab rotina descrita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Classificação das trajetórias. Número dos diferentes tipos de trajetórias correspondentes a células tratadas com diferentes estímulos. (A) porcentagem de manchas de imóveis, (B) percentagem de longos percursos e (C) tipo de movimento das trajectórias longo.

Figura 4 : Coeficiente de difusão, intensidades de ponto médios e número de receptores por partícula. (A) distribuição dos valores de coeficientes (D_1-4) de difusão curta para cada local em resposta a diferentes estímulos (I, II, II e IV). Linha vermelha representa o valor mediano para D_1-4. (B) valores de intensidades de ponto médio (msi) para cada ponto ao longo de seus primeiros 20 frames em resposta a diferentes estímulos (I, II, II e IV). Linha vermelha representa o valor de intensidade média (SD). (C) percentagem de receptores/partícula como extraído de distribuição de intensidade das partículas individuais, tendo como largura de bin o valor de intensidade de proteína monomérica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 1: Abrindo um arquivo TIRFM em Fiji ou ImageJ. Opções que aparecem na janela do Bio-formatos em cima arrastando e soltando um vídeo de .lif. Clique aqui para baixar a figura. 

Suplementar Figura 2: Selecione a série. Imagens apresentam no vídeo .lif. (A) janela que permite a selecção da série a ser analisar, incluindo imagens multicanais. (B) exemplo de resultado da seleção de séries, incluindo imagem multicanal (à esquerda) e correspondente vídeo (à direita). Clique aqui para baixar a figura. 

Suplementar Figura 3: Separação de canais. (A) janela captura dos comandos ImageJ precisava dividir para dividir canais de uma imagem multicanal e exemplo de resultado (B) do canal. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 4: Mesclagem de canais. (A) mesclando canais diferentes em uma única imagem. (B) canal seleção para a mesclagem. (C) exemplo de resultado de mesclagem o canal. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 5: Sincronize o windows. (A) localização no menu ImageJ dos comandos necessários para a sincronização de imagem e (B) janela resultante. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 6: Selecione a região de interesse. (A) seleção da janela de interesse usando a ferramenta de seleção retangular e (B) resultado da safra de imagem. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 7: Salve o vídeo. Salve a região de interesse como uma sequência de imagens e parâmetros para o salvar como janela de sequência de imagem. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 8: Segmentação. (A) abrir o segmentação editor plugin no menu de plugins do ImageJ. (B) adicionar rótulos/materiais para a segmentação. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 9: Desenho de máscara. (A) seleção de etiquetas apropriadas e definição da máscara verde. (B) seleção da máscara vermelha. Exemplo de duas máscaras, correspondente a dois rótulos. (C) salvar as máscaras como um arquivo. TIFF. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 10: Diretório de trabalho do MATLAB. Seleção de diretório correto contendo a série para ser analisado. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 11: U-faixa menu principal. (A) seleção de filme, edição de filme (B) e (C) canal menus de configurações. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 12: Selecione o tipo de objeto para rastrear. Selecione o controle de partículas única. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 13: Deteção de partículas. (A) U-track, painel de controle. (B) exemplo de configurações para a detecção de partículas. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 14: Exemplo dos resultados para a deteção de partícula. Janelas diferentes que incluem um menu do visualizador, menu de opções do filme e o filme. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 15: Menu de controle. Exemplo de configurações. (A) controle, (B) configuração - quadro a quadro de vinculação e (C) abertura fechamento, mesclagem e divisão menus. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 16: Exemplo dos resultados para rastreamento de partículas. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar figura 17: Menu de análise de trilha. Exemplo de configurações. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 18: Verificação da análise de trilha. Tela exibida após análise de trilha, incluindo uma janela de vídeo mostrando as partículas detectadas e suas faixas correspondentes. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 19: Cálculo dos coeficientes de difusão. Histogramas dos coeficientes de difusão calculado (à esquerda) e a média quadrado deslocamento (MSD, direita). Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar figura 20: Cálculo dos coeficientes de difusão, incluindo os modos diferentes de encaixe. Histogramas dos coeficientes de difusão calculado (à esquerda) e a média quadrado deslocamento (MSD, direita) para o modelo confinado. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar figura 21: Perfis de intensidade. Exemplo de intensidade local ao longo de sua trajetória (linha azul) e fundo (linha vermelha). Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar Figura 22: Plano de fundo para cada quadro. À esquerda: Imagem de célula exemplo. Médio: Detectado automaticamente a célula. Direita: Área automaticamente selecionada como plano de fundo. Clique aqui para baixar a figura.

Suplementar vídeo 1: Exemplo de um típico TIRF vídeo a microscopia mostrando a presença de partículas com diferentes intensidades e tipos de movimentos. Clique aqui para baixar o vídeo.

Material suplementar 1: Arquivos que contém todos os scripts de protocolo empregados nas rotinas ad-hoc utilizadas para a classificação das trajetórias e análise do tamanho do cluster. Clique aqui para baixar os materiais.

Discussion

O método descrito é fácil de executar mesmo sem ter qualquer experiência anterior com Matlab. No entanto, rotinas Matlab extremamente exigem precisão com a nomenclatura dos diferentes comandos e a localização das diferentes pastas utilizadas pelo programa. No acompanhamento de rotina de análise (etapa 3), vários parâmetros podem ser modificados. A janela "Configuração Gaussian-mistura modelo encaixe" (passo 3.8) controla como U-faixa irá detectar partículas única no vídeo. Isso é feito colocando-se um modelo de mistura gaussiano, conforme descrito em³. Dentre os parâmetros-chave para este encaixe define um filtro para ajudar a identificar local maxima. O sucesso desta operação depende o contraste da imagem e o ruído presente nas imagens. O primeiro parâmetro (valor de alfa para comparação com fundo local) controla a confiança de uma maxima sendo um lugar real, enquanto a segunda ajuda a reduzir o ruído durante a identificação dos pontos. Parâmetros importantes na etapa de "Tracking" (3.9) são o número de quadros para fechar as lacunas (que é que uma faixa pode abranger mais de quadros em que a partícula não é vista, mas é visto antes estes quadros e depois esses quadros; no exemplo, 0) e o número de quadros que uma faixa deve abranger a fim de ser considerada como uma faixa bem sucedida (no nosso exemplo, 20; este parâmetro está relacionado com a velocidade de aquisição da câmara e os quadros de número na pista devem ser tal que permite o cálculo da difusão de co eficiente). Também é importante decidir se deseja mesclar e dividir segmentos (no exemplo que estas duas possibilidades foram escolhidas). Em seguida, os parâmetros para a etapa 1 em funções de custo (vinculação de quadro-a-quadro) devem ser definidos. Essa função controla como as partículas são controladas ao longo os quadros. Os parâmetros mais importantes neste momento é a seleção do raio de busca Browniano, que controlam quanto cada ponto é previsto para o próximo quadro. Em nosso exemplo escolhemos a 0 e 5 como limites inferior e superior, respectivamente. Observe que esses parâmetros são muito específicos para a natureza das partículas sendo controladas, e que eles poderão ter de ser sintonizado em cada caso específico. Particularmente importantes são o poder de dimensionamento no browniano e Linear pesquisa raios. Estes poderes de dimensionamento dependem do tipo de movimento das partículas (difusão livre ou confinado). No exemplo, os valores (0,5, 0,01) foram escolhidos para livre difusão. Para a documentação específica desses parâmetros, consulte³.

No cálculo do comando de coeficientes de difusão (etapa 4.4), o limite superior do coeficiente de difusão de partículas do imóveis pode ser conhecido a partir de experiências anteriores ou executando a função de calculateDiffusion em um projeto separado com imóvel partículas (proteína fluorescente monomérica purificada) e vendo os coeficientes de difusão relataram. Esta função recebe dois parâmetros extras: ' outputSuffix´, que é adicionado para a saída de nomes de arquivos e por padrão usa o valor vazio, e ' plotLength´, que por padrão é 13 e é o número do intervalo de tempo (segundos) em que o cálculo de difusão é realizado. O modo de encaixe 'alpha' implica uma adaptação do MSD para a curva

ou seja, um deslocamento (MSD₀) e uma função de poder do tempo lag. O expoente desta função de poder, , determina se o movimento é confinado (0 < α < 0,6), anômala (0.6 < α < 0.9), livre (0,9 < α < 1.1), ou dirigido (α > 1.1). Para uma revisão deste tipo de análise, o leitor é referido Melo et al.⁹

O cálculo dos coeficientes difusão⁴ produz duas figuras de saída (ver suplementar Figura 19). O primeiro que mostra um histograma da difusão coeficientes calculados (nota que neste ponto, há um coeficiente de difusão independente para cada trajetória). A média e o percentil de 95% destes coeficientes são mostradas no console do Matlab. A trama do segunda mostra o MSD (curva vermelha) e o número de etapas consideradas para calculá-la como uma função do intervalo de tempo para essas trajetórias consideradas móveis (aqueles cujo coeficiente de difusão é acima do limiar de dado na linha de comando). A média e desvio padrão das trajectórias móvel é computado (estes são os valores para as trajetórias em uma única célula). No exemplo, o expoente é 0.59 significado que o movimento está confinado. Para este encaixe de curva, o programa informa a incerteza associada a cada um dos parâmetros (mostrado como o desvio padrão de cada um) e a bondade de ajuste (um ajuste perfeito iria chegar a zero). Neste ponto e depois de verificar o valor de alfa pode decidir caber o MSD com uma função diferente:

    se 0 < α < 0.6 (confinada)

se 0.9 < α < 1.1 (grátis)

Se α > 1.1 (dirigido)

Trajetórias de anômalas não podem ser equipadas com uma função diferente. No caso de partículas confinadas você pode calcular o tamanho de confinamento (em microns), como em Destainville et al.¹⁴

Um bom indicador de um encaixe correto é que a bondade de ajuste deverá diminuir a partir do alfa, ajustando-se para a prova final (no exemplo, a bondade de ajuste cai do 0.30474 para 0.15749, suplementar Figura 19-20). calculateDiffusioncreates dois arquivos no "results\TrackingPackage\tracks" dentro do diretório de série chamado "diffusionCoefficients.txt" e "diffusionCoefficientsMobile.txt". Esses arquivos contêm três colunas: 1) o índice de cada entrada trajetória, 2) e sua correspondente coeficiente de difusão, 3) região majoritária da máscara que onde esta faixa pertence (regiões são obtidas a partir do arquivo "mask.tif" que geramos em passos 2.7; Se este arquivo não existir, então esta coluna não está presente). Você pode usar esse arquivo e os arquivos análogos gerados por outras células para analisar a distribuição do coeficiente de difusão para um conjunto de células sob condições experimentais semelhantes.

No cálculo do coeficiente de difusão para trajetórias curtas (etapas 4.7-4.8), o último parâmetro 'Curtas' é um sufixo acrescentado ao nome do arquivo de saída para que você pode analisar diferentes subconjuntos de trajetórias sem sobrescrever o diffusionCoefficients.txt arquivos. O nome real dos arquivos de saída é diffusionCoefficients < sufixo >. txt"e"diffusionCoefficientsMobile < sufixo >. txt". Se nenhum sufixo é dado, como a análise geral realizada acima, em seguida, um sufixo vazio é assumido. Os parâmetros do modelo (D, v e MSD₀) podem diferir as equipadas para todas as trajetórias. Mais notavelmente, o desvio padrão dos parâmetros, bem como o ajuste de bondade normalmente aumentar. A razão é que as trajetórias curtas são mais instáveis e uma prova de confiança é mais difícil.

A análise das trajetórias de longas (etapa 4.9) classificá-las em confinados (1), livre (2), ou direcionado (3) de acordo com o seu primeiro momento e sua localização em relação os percentis 2,5% e 97,5% do primeiro momento de 500 caminhos aleatórios com movimento Browniano, o mesmo coeficiente de difusão e o comprimento como a trajetória, sendo analisados e simulação de Monte Carlo. Se o primeiro momento do caminho a ser analisado é inferior a 2,5% dos primeiros momentos observados nas simulações, o caminho a ser estudado é classificado como confinado. Se estiver acima de 97,5% dos primeiros momentos simulados, é classificado como dirigido; caso contrário, o caminho é classificado como Browniano. No comando empregado, 113.88e-3 é o tamanho do pixel em µm, 0,0015 é o limite superior do coeficiente de difusão do imóveis pontos medidos em µm²/s e 'Tempo' é o sufixo para o nome do arquivo de saída. A primeira coluna deste arquivo ("trajectoryClassificationLong.txt") é o número de trajetória, o segundo é a sua classificação (1 = confinado, 2 free, = 3 = dirigido), e a terceira é a trajetória de primeiro momento.

O script para calcular a intensidade de cada partícula (etapa 5.1) é altamente flexível e permite que controle as intensidades de fluorescência em muitas maneiras diferentes (cada um adequado para diferentes situações como rastreamento de imóveis manchas de um experimento de controle ou rastreamento móveis altamente pontos sobre uma célula com fundo fluorescente variável). O script irá analisar todas as trajetórias ao longo de todos os quadros. Para cada ponto em cada frame vai medir a intensidade dos pixels em torno do ponto (analisa um patch quadrado em torno do local, à revelia de um tamanho 3 x 3 pixels), estimar o ponto de fundo e calcular a diferença de fluorescência entre o local e o plano de fundo. A porcentagem de partículas de fotobranqueamento e o número de partículas fluorescentes em um único cluster, visto como um único ponto, pode ser estimada desta forma.

Este método automatizado (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) produz informações sobre vários parâmetros (intensidade local, difusão lateral, tipo de movimento), que podem ajudar a estudar a relação entre o tamanho de ponto e sua dinâmica em condições basais, e como diferentes tratamentos podem modificar estes parâmetros.

A principal limitação do método é que ele requer transfection da pilha com a proteína fluorescente a serem controladas. Geralmente a transfeccao leva a superexpressão da proteína, um fato que dificulta a única proteína de rastreamento. Uma célula classificação passo deve ser incluída para selecionar células expressando um número de receptores que permitir a detecção e monitoramento de partículas única por microscopia de SPT-TIRF. Esse método também pode ser empregado para rastrear biomoléculas marcadas com pontos quânticos ou fragmentos de Fab. O protocolo descrito requer um número de controles que devem ser previamente analisados para que as conclusões conduzidas a partir da análise sejam corretas. Em primeiro lugar, é fundamental para determinar as condições de expressão adequadas que permitem a deteção e rastreamento de partículas único. Filmes com densidades de ~ 4,5 µm de², correspondente a 8.500-22.000 receptores/celular, foram utilizados para analisar a organização espaço-temporal da membrana celular receptor¹³.

É importante estabelecer o coeficiente mínimo detectável de difusão usando proteínas monoméricas purified do AcGFP ou células fixas. Em ambos os casos presume-se que não há nenhuma difusão e, portanto, estima-se que os valores de difusão das partículas analisadas nestas condições correspondem às partículas imobilizadas e usado para discriminar entre móveis e imóveis trajetórias¹³.

A análise que apresentamos aqui é uma ferramenta de análise de trajetória geral, que pode ser aplicada à análise da difusão dos receptores por superresolution, para a análise de imagens de difração limitada e à análise de movimento celular pela microscopia padrão . A principal vantagem deste método com outros descritos anteriormente, tais como análise de brilho e número¹¹, é que permite a avaliação dos valores de cada ponto individual ao longo de sua trajetória, tendo em conta o tempo de média intensidade sobrevivência da proteína monomérica AcGFP antes fotobranqueamento. O tempo de sobrevivência de uma molécula antes fotobranqueamento dependerá consideravelmente as condições de excitação.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Jurkat cells	ATCC	CRL-10915	Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator	BioRad		We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands.
Cytomics FC 500 flow cytometer	Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter	Beckman Coulter		Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Recombinant human CXCL12	PeproTech	300928A
Inverted Leica AM TIRF	Leica
EM-CCD camera	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software			Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism	GraphPad software