Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Protokoll för bildbehandling för analys av diffusionen och klusterstorleken av membranreceptorer av fluorescensmikroskopi

Published: April 9, 2019 doi: 10.3791/59314
Automatic Translation
*1,2, *3,4, 3,5, 3, 1,6, 3, 3
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för enskild partikel spårning bildanalys som tillåter kvantitativ utvärdering av Diffusionskoefficienterna, typer av rörelse och klustret storlekar av enstaka partiklar upptäcks av fluorescensmikroskopi.

Abstract

Partikel spårning på en videosekvens och bakre analys av deras banor är numera en gemensam operation i många biologiska studier. Med hjälp av analys av cellmembranet receptorn kluster som modell, vi presenterar ett detaljerat protokoll för denna bild analys uppgift med hjälp av Fiji (ImageJ) och Matlab-rutiner för att: 1) definiera områden av intresse och design masker anpassas till dessa regioner. (2) spåra partiklar i fluorescence mikroskopi videor; (3) analysera diffusion och intensitet kännetecknar valda spår. Den kvantitativa analysen av Diffusionskoefficienterna, typer av rörelse och cluster storlek erhålls genom fluorescensmikroskopi och bildbehandling ger ett värdefullt verktyg för att objektivt fastställa partikel dynamics och konsekvenserna av att ändra miljöförhållanden. I denna artikel presenterar vi detaljerade protokoll för analys av dessa funktioner. Den metod som beskrivs här inte bara tillåter singel-molekyl spårning upptäckt, men också automatiserar uppskattning av lateral diffusion parametrar på cellmembranet, klassificerar typ av bana och tillåter fullständig analys således att övervinna den svårigheter att kvantifiera strålpunkt över dess hela bana på cellmembranet.

Introduction

Membranproteiner inbäddad i den lipid lipidens är i kontinuerlig rörelse på grund av termisk diffusion. Deras dynamik är viktiga att reglera cell svaren, som intermolekylära växelverkningar tillåta bildandet av komplexen som varierar i storlek från monomers att Oligomerer och påverka stabiliteten i signalering komplex. Klarlägga de mekanismer som styr protein dynamics är således en ny utmaning i cellbiologi, nödvändigt att förstå cellsmedierade reaktioner och identifiera oförutsedda cellfunktioner.

Vissa optiska metoder har utvecklats att studera dessa interaktioner i levande celler1. Bland dessa tillåter Totalreflexion (Frida) fluorescensmikroskopi, utvecklades i början av 1980, studier av molekylära interaktioner på eller mycket nära den cellmembran2. För att studera dynamiska parametrar av membran protein banor från Frida data i levande celler, krävs en enda partikel spårning metod (SPT). Även om flera algoritmer finns för detta, använder vi för närvarande de som publicerats av Jaqaman et al.3 som adress partikel motion heterogenitet i en tät partikel-fältet genom att länka partiklar mellan bildrutor att ansluta resulterande banan segment i kompletta banor (tillfällig partikel försvinnande). Programvaran fångar partikeln sammanslagning och uppdelning som leder från aggregering och dissociation händelser3. En av utdata av denna programvara är detektion av partiklar längs hela banan genom att definiera sin X och Y positioner i varje bildruta.

När partiklar upptäcks, tillämpar vi olika algoritmer för att avgöra den korta valutakursändringen diffusion koefficient (D1-4)4,5. Genom den ögonblick skalning spektrum (MSS)6,7,8 analysen eller passande 'alpha' värdet vid justering av de Mean Square deplacement (MSD) till kurva9, klassificera vi också partiklarna enligt typ av bana.

Analys av spot intensitet i fluorescens bilder är en gemensam målsättning för forskare i fältet10,11. Den vanligaste algoritm som används är så kallade nummer och ljusstyrka. Denna metod ändå tillåter inte rätt bildruta-för-bildruta intensitet upptäckt i partiklar i mobila fraktionen. Vi har, således, genereras en ny algoritm att utvärdera dessa partikel stödnivåer bildruta-för-bildruta och avgöra deras aggregation tillstånd. När koordinaterna för varje partikel upptäcks med hjälp av U-Track2 programvara3, definiera vi dess intensitet i varje ram över hela banan, också med hänsyn till cellbakgrund i varje ram. Denna programvara erbjuder olika möjligheter för att bestämma den plats intensiteten och Cellbakgrund och använda kända monomer och dimeriskt proteiner som hänvisningar, beräknar det ungefärliga antalet proteiner i partikel upptäckt (cluster storlek).

I den här artikeln beskriver vi en försiktig guide för att utföra dessa tre steg: 1) att upptäcka och spåra enstaka partiklar längs en video av fluorescensmikroskopi använder U-spår; (2) analysera den momentana diffusionskoefficienten (D1-4) av dessa partiklar och vilken typ av rörelse (trånga, fri eller dirigerad) av partiklar med långa banor av MSS; (3) mätning spot intensiteten längs videon korrigeras genom den uppskattade bakgrund fluorescensen för varje plats. Detta tillåter kluster storlek uppskattning och identifiering av fotoblekning steg.

Användning av detta protokoll kräver inte specialkunskaper och kan utföras i ett laboratorium med cellkultur, flow flödescytometri och mikroskopi. Protokollet används ImageJ eller Fiji (en fördelning av ImageJ12), U-spår3och några ad hoc gjort rutiner (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-spår och ad hoc-rutiner köra över Matlab som kan installeras i valfri kompatibel dator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av biologiska prover

  1. Odla Jurkat cellerna i RPMI 1640 medium kompletteras med 10% FCS, NaPyr och L-glutamin (komplett RPMI). Electroporate Jurkat celler (20 x 106 celler/400 µL RPMI 1640 med 10% FCS) med en monomer GFP-märkta chemokine receptor vektor (CXCR4-AcGFP, 20 μg) att möjliggöra dess upptäckt använder fluorescensmikroskopi.
    Obs: Det är möjligt att använda andra monomer fluorescerande proteiner såsom mCherry, mScarlet, etc.
  2. 24 h efter transfection analysera celler i en flödescytometer att bestämma både cellernas viabilitet och CXCR4-AcGFP uttryck.
  3. Markera celler som uttrycker låga CXCR4-AcGFP nivåer av cell sortering av GFPlåg positiva celler (figur 1), som låg uttrycket av transfekterade receptorn krävs i TIRFM experiment för att säkerställa enda partikel spårning för spårning enskilda bollbanor9.
  4. Kvantifiera antalet receptorer på cellytan.
    Obs: Som ett exempel13, ~ 8500-22.000 AcGFP-märkt receptorer/cell, motsvara ~ 2-4.5 partiklar/μm2.
  5. Omsuspendera sorterade celler i komplett RPMI och inkubera i minst 2 h vid 37 ° C, 5% CO2. Centrifugera celler (300 x g, 5 min) och resuspended dem i Frida buffert (HBSS, 25 mM HEPES, 2% FCS, pH 7,3).
    1. Plattan på 35 mm glasbotten mikrobrunn rätter (2-3 x 105 cell/maträtt) belagd med Fibronektin (20 μg/mL, 1 h, 37 ° C) i närvaro eller frånvaro av lämpliga ligand (dvs CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 ° C). Inkubera cellerna (20 min vid 37 ° C, 5% CO2) före bild förvärv.
  6. Utföra experiment med Frida Mikroskop, utrustad med en EM-CCD-kamera, en 100 x Oljeimmer mål (HCX PL APO 100 x / 1,46 NA) och en 488 nm diode laser. Mikroskopet kan temperaturkontroll och inkubation med CO2. Leta upp och fokusera celler med grova och fina fokus vreden, med ljusa fält för att minimera fotoblekning effekter. Använd en låg laser intensitet, otillräcklig för singel-partikel upptäckt eller inducera fotoblekning effekter (5% lasereffekt, 28 μW) för fina fokusjustering i Frida läge.
  7. Förvärva filmer (bildsekvenser) av ungefärligt 50 s minimera tidsintervallet mellan ramar. Penetration av flyktig fältet bör vara 70-90 nm av djup. Spara de förvärvade filmerna för varje experimentella villkor som ”.lif” (video.lif).
    Obs: Filmer i det beskrivna exemplet förvärvades på 49% vid lasereffekt (2 mW) med en exponeringstid på 90 ms och ett tidsintervall på 98 ms, för 49 s (500 ramar). Genomträngningen av den valda flyktig vågen var 90 nm.

2. Val av bilder och skapande av masker

  1. För varje experimentella villkor (video.lif), skapa en ny mapp (VideoName) som måste innehålla olika mappar för varje serie. Varje mapp kommer att innehålla en ”videoSeq” mapp för videobilder och ett ”resultat”-mappen för resultaten av analysen. Kontrollera att filstrukturen i nuläget är följande:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/videoSeq
    VideoName/Series1/resultat
    Obs: Från mikroskopet erhålls olika .lif filer med flera videor för varje behandling tillstånd (dvs FN, FN + SDF). ”video.lif” motsvarar input.lif videofilen med alla Frida filmer förvärv (serien) utförs vid mikroskopet. ”videoSeq” mappen kommer att innehålla 500 bildrutorna i filmen som vi analyserar. ”Resultat” mappen kommer att innehålla alla filer från analysen utförs. Korrekta nomenklaturen och lokalisering av de olika mapparna är avgörande för funktionen av algoritmer. Namnen i fetstil i listan ovan är fasta (dvs. de måste anropas på detta sätt eftersom dessa är namnen yrkanden skript). Namn inte i fetstil kan ändras för att återspegla experimentet utförs.
  2. Öppna TIRFM video (.lif fil) med Fiji eller ImageJ genom att dra och släppa filen på Fiji menyraden och klicka på OK importera lif filen med BioFormats (kompletterande figur1).
  3. Välj serien att bearbeta och klicka på OK (kompletterande figur 2A). För att utforma en mask för analys av denna video, importerar också en flerkanalsbild med de olika chromophores (i exemplet serie 1 är den flerkanalsbild och serie 2 motsvarande video). Videon (och en flerkanalsbild) bör öppna som en ImageJ stack. I exempel (kompletterande figur 2B) bilden är till vänster och videon är till höger.
    Obs: Om skapandet av en mask för video inte behövs, gå till steg 2.5.
  4. Skapa en mask. Skapa en enda bild med kanaler som är användbara för utformningen av masken. I det här fallet är de intressanta kanalerna de röda, gröna och grå.
    1. Dela upp kanalerna från flerkanalsbild (kompletterande figur 3A): Välj bild i bar-menyn och klicka färg | Dela kanaler. De olika kanalerna visas som separata bilder (kompletterande figur 3B).
    2. Sammanfoga igen de tre kanalerna i en enda bild (kompletterande figur 4A): Välj bild i bar menyn och välj färg | Sammanfoga kanaler. Välj lämpliga kanaler och tryck OK (kompletterande figur 4B). En ny icke-stacked bild kommer att genereras (kompletterande figur 4 c).
    3. Synkronisera de två Fönstren med hjälp av verktyget Synkroniserar Windows (kompletterande figur 5A): Välj analysera i bar menyn | Verktyg | Synkronisera Windows. Ett nytt fönster med synkronisera bild möjligheter kommer att visas (kompletterande figur 5B).
    4. Med två windows synkroniseras (endast video om det finns ingen flerkanalsbild associerade), kan regionen samma i båda Fönstren beskäras. Rita regionen av intresse med verktyget Rektangulär markering av ImageJ flytande meny. Välj bild i bar-menyn och välj Beskär (kompletterande figur 6A). De två beskurna bilderna visar individuellt (kompletterande figur 6B).
    5. Unsynchronize både windows (kompletterande figur 6B) genom att trycka på knappen Unsynchronize alla i Sync Windows manager.
  5. Om en mask inte har skapats som i steg 2,4, dra regionen av intresse med verktyget Rektangulär markering av ImageJ flytande meny.
  6. Spara videon som en bildsekvens i den katalogen videoSeq under motsvarande videokatalogen (kompletterande figur 7A): Välj fil i bar-menyn och klicka Spara som | Bild sekvens... byta namn på etiketterna för videosekvensen som video0000.tif, video0001.tif,..., video0499.tif (kompletterande figur 7B): i rutan Byt namn som video och klicka på OK. Sekvensen måste vara ensam i sin katalog att användas framgångsrikt av U-spår.
    Obs: Om inte utforma en mask för video, gå till steg 2,8.
  7. Utforma en Mask. Välj en flerkanalsbild och öppna segmentering Editor plugin (kompletterande figur 8A): Välj Plugins i bar-menyn och välj segmentering | Segmentering redaktör. Lägg till och Byt namn på etiketterna på segmentering som behövs genom att högerklicka på etiketterna på redigeraren segmentering (kompletterande figur 8B, C).
    1. Välj lämplig markeringsverktyget ImageJ flytande meny (här använda freehand), Välj en etikett (grön) och utforma först den yttersta masken (kompletterande figur 9A). När utformat, visas Tryck på + -knappen i utväljande valen av komposit fönster och den valda masken i visningsprogram (kompletterande figur 9A). Upprepa proceduren med nästa etiketter (interiör, i rött) (kompletterande figur 9B).
      Obs: Efter utformar masken för Green och interiör etiketterna, kommer att exteriör masken ockupera resten av bilden.
    2. Masker är kodade i bilden som regioner 0, 1, 2... enligt ordningen på etiketterna i fönstret RGB-etiketter. När alla masker, för olika etiketter, spara masken med samma filnamn som video, med det namn mask.tif (kompletterande figur 9 c): Välj fil i bar menyn och välj Spara som | TIFF....
      Obs: De valda maskerna kommer att vara anställd i beräkningen av Diffusionskoefficienterna och klassificering av de banor (se punkt 4.2).
  8. Kontrollera att filstrukturen i nuläget är följande:
    VideoName/video.lif
    VideoName/Series1/mask.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0000.tif
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0001.tif
    ...
    VideoName/Series1/ videoSeq / video0499.tif
    VideoName/Series1/resultat
    Obs: Mask.tif är en bild med mask som utformats i steg 2.4 och 2.7. Video*.tiff är videon som sparats i steg 2,6. Som ovan, namnen i fetstil i listan ovan är fasta, dvs, de måste anropas på detta sätt eftersom dessa är de namn som eftersträvas av skript. Namn inte i fetstil kan ändras för att återspegla experimentet utförs.

3. spåra partiklarna

  1. Spåra alla de partiklar som sett i de valda videor med U-spår.
  2. Öppna Matlab och lägga till U-spår katalog i sökvägen med hjälp av Set Path | Lägga till med undermappar alternativ i menyn. Spara sökvägen så att i framtiden avrättningar av Matlab U-spår är i vägen. Den här sökvägen inställningen behöver bara göras en gång.
  3. Ändra arbetskatalog till den katalog som innehåller serien som skall analyseras. Åberopa U-spår genom att skriva in i konsolen (kompletterande diagram 10) movieSelectorGUI och tryck enter. Fönstret film urval kommer att öppnas (kompletterande Fig. 11A).
  4. Tryck på knappen ny film och film edition fönster visas (kompletterande Fig. 11B).
  5. Tryck på Lägg till kanal för att välja katalogen med video (VideoName/Series1/video) och fyll movie information parametrarna. Ange utdatakatalogen för resultaten av U-spår till resultat (videoName/Series1/resultat).
    Obs: Parametrarna film information kan erhållas från mikroskopet och förvärvet villkoren.
  6. Tryck på avancerade kanalinställningar och fylla de parametrar relaterade till förvärvet. Titta värdena för parametrarna i exemplet (kompletterande figur 11C).
  7. Tryck på Spara i fönstret avancerade kanalinställningar och Spara i fönstret film edition . Programmet kommer att be om bekräftelse för att skriva filen heter movieData.mat på katalogen resultat . Bekräfta.
  8. Efter skapa filmen, tryck på Fortsätt i fönstret film urval. U-spår kommer att fråga om vilken typ av objekt som skall analyseras. Välja Single-partiklar (kompletterande figur 12). Kontrollpanelen visas (kompletterande figur 13A).
    1. Välj det första steget steg 1: upptäckt och tryck på inställningen. (Kompletterande figur 13B) visas fönstret Inställning Gaussisk blandning-modell passande . I exempel är ”Alpha för jämförelse med lokala bakgrund” värdet till 0,001 och ”rullande-fönster tid genomsnitt” 3 (kompletterande figur 13B).
    2. Tryck på Verkställ i fönstret Inställningar Gaussisk blandning-modell passande och kör i Kontrollpanelen. Med konfigurationen i kompletterande figur 13körs endast detektionssteget . Detta steg tar ett par (2-5) minuter. Kolla resultaten genom att trycka på knappen resultatet av steg 1 (upptäckt, kompletterande figur 14).
      Obs: Som visas ovan, visar filmen röda cirklar på upptäckta partiklarna. Om ingen röd cirkel visas, har sedan detta steg inte fungerat korrekt.
  9. Utföra identifiering av spår, det vill säga sammanslagning de partiklar som upptäckts i föregående steg i spår som sträcker sig över flera ramar. Detta är den steg 2: spårning av U-spår vars inställningar måste definieras som visas i Kompletterande figur 15A-C. Steg 2 kostnad funktionsinställningarna för bildruta-för-bildruta länkning och Gap utgående, sammanslagning och uppdelning i exemplet visas i kompletterande figur 15B och C, respektive.
  10. Efter inställning av parametrar för steg 2, Tryck kör i Kontrollpanelen och körs bara steg 2 (kompletterande figur 16).
  11. Utföra spår analys, steg 3. Definiera inställningar som visas i kompletterande figur 17 (höger panel). Tryck sedan på Verkställ på panelen i inställning-Motion analys och köra i kontroll panelen-U-banan. Detta steg tar ett par sekunder.
  12. Kontrollera med knappen resultat steg 3 att processen korrekt har identifierat alla spår. För att göra detta, klicka på Visa spårnummer på Filmalternativ fönstret och kontrollera bildruta för bildruta att varje spår har varit korrekt identifierad (kompletterande figur 18). Manuellt kommentera dessa partiklar som inte är sant partiklar.
    Obs: Om inte detta manuellt val görs, kan en svagare automatiskt val utföras senare när den diffusionskoefficienten beräknas (se Steg4).

4. beräkning av Diffusionskoefficienterna och klassificering av banor

  1. Vara säker på att alla skript anropas från katalogen av videon som analyseras (i exemplet, VideoName/Serie1).
  2. Läs alla de banor för att beräkna Diffusionskoefficienterna av utfärdande i Matlab konsolen kommandot: trajectories=readTrajectories(0.1), där 0,1 är tiden i sekunder mellan två bildrutor (tidsintervall, visas i panelen film Information kompletterande Fig. 11B).
  3. Utesluta banor motsvarar felaktigt identifierade ställen/banor. Ge en lista över de ställen att utesluta. Till exempel för att utesluta ställen 4, 5 och 28, skriv: banor = readTrajectories (0.1, [4, 5, 28]).
  4. Beräkna de momentana Diffusionskoefficienterna för var och en av spårar av denna cell. I detta fall beräkna den diffusionskoefficienten för en tidsfördröjning = 4, kallas D1-4. För att göra det, kör i Matlab konsolen kommandot: D = calculateDiffusion (banor, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha') där banor är de banor som erhålls i steg 3, 113.88e-3 är pixel storleken på de förvärvade bilderna i mikron är 0,0015 en övre gräns för Diffusionskoefficienterna av orörliga partiklar mätt i µm2/s, och 'alpha' är den anpassade modellen som förklaras nedan.
    Obs: När du använder en snabbare kamera och behöver fler bildrutor att beräkna parametern diffusion öka det, e.g. till 20, med D = calculateDiffusion (banor, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', '', 20). Strängparametern innan 20, i exemplet ovan, '', är suffixet tillsätts utdatafiler. Detta suffix kan användas för att skilja olika analyser.
  5. Passa MSD med olika funktion genom att anropa funktionen calculateDiffusion igen med en annan passande läge ('enbart', 'fri' eller 'regi'). I detta exempel 'endast': D = calculateDiffusion (banor, 113.88e-3, 0,0015, 'enbart').
  6. Skaffa passande resultaten för riktad modell, som visas i kompletterande figur 20.
  7. Bryta ner banor till korta och långa banor. Använd kommandot: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50) där 50 är den minsta längden i ramar på en bana kan anses länge (i exemplet).
  8. Studera korta banor med samma montering proceduren i steg 4.3: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, 'regi', 'Kort'). Analysera kort och avvikande banor med kommandot: D = calculateDiffusion (shortTrajectories, 113.88e-3, 0,0015, 'alpha', 'Kort').
  9. Analysera långa banor för att klassificera vilken typ av rörelse genom sin stund skalning spektrum (MSS)7. Kommandot: trajectoriesClassification = classifyLongTrajectories (longTrajectories, 113.88e-3,0.0015, 'lång') visar analysen i skärmen och genererar en fil som heter trajectoryClassification < Suffix > .txt i den Katalog results\TrackingPackage\tracks.

5. beräkning av kluster Ssize genom partikel tätheten

Obs: Vara säker på att alla skript anropas från katalogen av videon som analyseras (i exemplet, VideoName/Serie1).

  1. Analysera intensiteten i varje partikel längs deras bana. För att göra detta, anropa skriptet genom att skriva i konsolen Matlab: analyzeSpotIntensities som tar som indata de banor som beräknas av U-spår i det första avsnittet. I sin mest grundläggande form, helt enkelt ringa skriptet utan något argument från katalogen av videon som analyseras (i exemplet, VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Konfigurera grundläggande problemet på många olika sätt genom att tillhandahålla argument till skriptet som i: analyzeSpotIntensities ('Arg1´, värde1, ' Arg2´, värde2...). Giltiga argument med deras motsvarande variabel värden ('ArgN´, ValueN) listas.
    1. ('spotRadius´, 1)
      Analysera fluorescensintensiteten använder spotRadius av 1 pixel (som standard) som motsvarar en lapp av storlek 3 x 3 centrerad på plats ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      Obs: Välj en spotRadius för en lapp av 5 x 5 centrerad på plats, av 2, etc.
    2. ('onlyInitialTrajectories´, 1)
      Om detta argument ges (sant, värdet 1), analysera endast de banor som börjar i den första bildrutan i videon. Detta är användbart för att analysera kontroll bilder (som standard 0, falskt).
    3. ('trackTrajectory´, 0)
      Om detta argument anges till 0 (falskt), sedan hålla koordinaten för plats i dess första bildrutan för alla ramar (detta är användbart för orörliga ställen). Om argumentet anges till 1 (som standard 1, sant), sedan spåras plats längs video följande koordinaterna beräknas av U-spår.
    4. ('excludeTrajectories´, [4,5,28])
      Inkludera bana antalet dessa banor uteslutet steg 4,3 (i exempel 4, 5, 28).
    5. ('extendTrajectory ´, 1)
      Om detta argument har värdet 1 (sant), sedan analysera intensiteten i patch till slutet av videon (även om banan slutar tidigare). Koordinaten för platsen är antingen sista koordinaten i banan (om trackTrajectory är sant) eller första koordinaten i banan (om trackTrajectory är false). Detta argument är falskt (0) som standard.
    6. ('subtractBackground´, 1)
      Om denna parameter är inställd, då rätt rå fluorescensen mätt på varje plats i uppskattningen av den bakgrund fluorescensen för just den punkten (se nedan). Detta argument är sant (1), som standard.
    7. ('meanLength´, bildrutenummer)
      Om denna parameter är inställd, då mäts genomsnittliga intensitet plats vid den längd som anges. Ställ in 'meanLength', 20 att mäta genomsnittlig plats intensiteten på de första 20 ramarna. Om argumentet inte anges, sedan beräknas plats intensitet på hela banan (som standard, full längd).
    8. ('showIntensityProfiles´, 1)
      Som denna parameter som 1 (standard 0, falsk), för att rita den intensitet profilen längs de olika ramarna samt deras bakgrund.
      Obs: Dessa tomter är mycket användbart för att identifiera fotoblekning som visas i den kompletterande figur 21. För varje väg analyserar rutinen automatiskt om det är möjligt att det har förekommit fotoblekning. Detta görs genom att jämföra intensitetsvärdena med en Students t i de första och sista N frames längs banan. Som standard är N 10, men detta värde kan ändras genom argumentet ' Nbleach´.
    9. ('backgroundMethod´, värde)
      Ställa in denna parameter för att fastställa bakgrunden på varje plats. Detta kan göras på flera sätt, och vilken som ska användas kan vara valda föränderliga ”värde”:
      1. ('backgroundMethod´, 0)
        Använd detta värde till manuellt identifiera bakgrunden för hela videon. Tillåta för att välja 8 poäng i den första bildrutan i videon. En lapp runt dessa punkter analyseras längs hela videon, och den 95% quantile av alla dessa stödnivåer väljs som bakgrund intensiteten för alla ställen.
      2. ('backgroundMethod´, 1)
        Använd detta värde till manuellt identifiera bakgrunden för varje bildruta. Välja 8 poäng för varje plats och varje bildruta. Detta är en tidskrävande uppgift men det ger en massa kontroll till användaren. Den 95% quantile av stödnivåerna i dessa fläckar har valts som bakgrund intensiteten för denna plats i denna ram.
      3. ('backgroundMethod´, 2)
        Använd detta värde för att beräkna bakgrund av varje plats beräknad från 8 punkter som ligger i en cirkel runt plats med en radie som kontrolleras av argumentet ' backgroundRadius´ (standard, 4 * spotRadius).
      4. ('backgroundMethod´, 3)
        Använda detta värde för att beräkna bakgrunden för varje bildruta genom att först lokalisera cellen i videon och sedan analysera stödnivåerna i cellen i varje bildruta (kompletterande figur 22).
        Obs: Bakgrunden är valt som grå värdet vid en viss quantile av denna fördelning (som standard 0,5 (= 50%), även om den här parametern kan styras via argumentet ' backgroundPercentile´, detta värde kan anges högre, till exempel 0,9 (= 90%) om vill ha de flesta av cellen till betraktas som bakgrund. För att bidra till identifiering av cellen, ange vilket är den maximala bakgrundsvärde förväntades längs bildrutorna använder argumentet ' maxBackground´ (exempelvis i alla analyserade videor, bakgrunden värdet normalt aldrig går längre än 6000)13. Som standard är här alternativet satt till 0, vilket innebär att denna hjälp inte används som standard. Se vilken som är cellen detektion och området valts för bakgrunden uppskattning genom att ställa in argumentet ' showImages´ 1 (stop utförande när som helst genom att trycka på CTRL-C).
  2. Samla informationen diffusion och intensitet för alla de banor som beräknades i steg 4 och 5.1, respektive, gatherDiffusion.AndIntensity (). Samla endast diffusion och intensitet information för korta banor. För att göra detta, använda de suffix som används i steg 4,7 och typ: gatherDiffusionAndIntensity ('Short´) där ' Short´ är det suffix som används i steg 4,7.
  3. Samla den ögonblick spektrum skalning och intensitet informationby typning: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long') där 'Lång' suffixet används i steg 4.7. En sammanfattning av alla de filer som genereras med hjälp av detta protokoll visas i figur 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Användning av detta protokoll tillåter automatisk spårning av partiklar som upptäckts i fluorescence mikroskopi filmer och analys av deras dynamiska egenskaper. Celler är inledningsvis transfekterade med proteinet fluorescently-kopplade spåras. Lämplig nivå av receptorer presenterar på cellytan som tillåter SPT erhålls genom cell sortering (figur 1). Markerade cellerna analyseras av Frida mikroskopi som genererar videor i ett format som kan studeras med verktygen som beskrivs i detta protokoll (kompletterande Video 1).

De videor som genereras inte kan analyseras direkt och oberoende ramar av varje video krävs. Användning av ImageJ genererar filer som kan tolkas med hjälp av Matlab programvara såsom videobildrutor i TIFF-format eller masker. U-spår spårar de partiklar som sett i den valda videon och sparar informationen i Matlab (.mat) filer (movieData.mat, Channel_1_detection_result.mat, channel_1.mat, Channel_1_tracking_result.mat), se figur 2.

I figur 2visas beräkningen av Diffusionskoefficienterna och klassificering av banor kommandon, genererar olika filer (diffusionCoefficients.txt, diffusionCoefficientsMobile.txt, diffusionCoefficientsShort.txt, trajectoryClassificationLong.txt, etc). Informationen i dessa filer hanteras bäst med Excel och prisma programvara. Information som kan erhållas från denna analys inkluderar:

  1. Procentandel av orörliga ställen. Du kan använda som referens av orörliga partiklar: 95% percentilen av D1-4 värden som erhålls (1) från enstaka partiklar i fasta celler och/eller (2) från renat fluorescerande protein kopplade till coverslips (figur 3A).
  2. Procentandel av långa banor (> 50 bildrutor) (figur 3B).
  3. Typ av rörelse av de långa banor: regisserad, gratis, begränsat (figur 3 c).
  4. Diffusion koefficient (D1-4) av mobila partiklar i celler behandlas med olika stimulans (figur 4A).

I steg 5 i protokollet analyserar stödnivåerna varje partikel längs banan. I skriptet analyzeSpotIntensities kommer ut på skärmen alla informationen analyseras. För varje plats och RAM, skriptet visas koordinaten för plats i ramen (x, y) i pixel enheter, uppskattningen av den bakgrunden fluorescensen (k0), rå spot intensiteten i 3 x 3 patch, korrigerade intensiteten (beräknat som raw intensiteten minus dess bakgrund), det maximala värdet av intensiteten hos patch, och antalet regionen inom Maskeringen där denna plats ligger vid denna ram. Ett exempel på typ av produktion som produceras är

plats = 43 ram = 184
x = 78.0397
y = 72.5395
K0 = 1571
spotRawIntensity = 5550.1111
spotCorrectedIntensity = 3979.1111
maxCorrectedSpotIntensity = 6243
maskRegion = 2

All denna information lagras i en loggfil (results/TrackingPackage/tracks/log.txt) och en tabell som kan läsas från Excel (results/TrackingPackage/tracks/spotIntensitiesByFrame.txt). Efter att ha analyserat varje plats, skriver skriptet genomsnittliga intensiteten längs banan och majoritetsval regionen inom masken

plats = 43
meanCorrectedSpotIntensity längs ramar = 4762.303
majoritetsval region = 3

Denna information lagras i loggfilen ovan och en tabell som kan läsas från ett kalkylblad (results/TrackingPackage/tracks/meanSpotIntensities.txt). Som ett exempel, menar spot intensiteter (msi) för varje partikel längs sin bana i celler stimuleras med olika villkor visas i figur 4B. Vi kan nu använda denna information för att grovt uppskatta storleken på fluorescerande klustret. Som en plats menar korrigerade intensitet är relaterade med antalet fluorescerande proteiner närvarande i denna plats, och fluorescensen av en monomer kan mätas genom ett liknande men oberoende experiment, direkt beräkna antalet receptorer per partikel. Frekvens distribution av receptorn antal per partikel med som referens intensiteten av monomer protein uttryckt i samma celler visas i figur 4 c.

Du samla diffusion och intensitet kommandot Skapa två filer: en kallas diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txtoch en annan kallas log_diffusionCoefficientsAndIntensitiesShort.txt i katalogen resultat / TrackingPackage/spår. Båda filerna innehåller 1) spot index, (2) den diffusionskoefficienten, 3) intensiteten och 4) regionsnumret inom Maskeringen. Dessa filer kan läsas från ett kalkylblad.

Likaså kommandot samla bana klassificering och intensitet kommer att skapa två filer en kallas trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt och en annan log_trajectoryClassificationAndIntensitiesLong.txt i den Katalog resultat/TrackingPackage/spår. Ena innehåller 1) spot index, (2) vilken rörelse, 3) plats första stund, 4) intensiteten, 5) D1-4 och 6) regionsnumret inom Maskeringen. Denna fil kan läsas från Excel.

En sammanfattning av alla de filer som genereras med hjälp av detta protokoll visas i figur 2. Andra analyser som kan utföras med hjälp av detta protokoll innehåller jämförelsen av de dynamiska parametrarna av små vs större ställen, dvs monomerer vs oligomerer, variationer på dessa dynamiska parametrar som induceras av ligander, -hämmare, membran sammansättning, ändring av signalering vägar, etc. En fullständig analys av CXCR4 beteende som svar på dess ligand CXCL12 under olika experimentella förhållanden har utförts med detta protokoll13.

Figure 1
Figur 1 : Cell sortering. Uttryck för god Jordbrukarsed i Jurkat celler transfekterade med CXCR4-AcGFP före och efter cell sortering. Cellen uttrycker låga nivåer av god Jordbrukarsed (GFPlåg) väljs och anställd för Frida experiment.

Figure 2
Figur 2 : Sammanfattning av de filer som skapas. Figuren visar alla filer som genereras med hjälp av Matlab rutinen beskrivs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Klassificeringen av bollbanor. Antal olika typer av banor motsvarande celler behandlas med olika stimuli. (A) procentandelen orörliga fläckar, (B) andelen långa banor och (C) typ av förflyttning av de långa banor.

Figure 4
Figur 4 : Diffusion koefficient, genomsnittlig plats stödnivåer och antalet receptorer per partikel. (A) Distribution av kort diffusion koefficienter (D1-4) värdena för varje plats som svar på olika stimuli (I, II, II och IV). Röda linjen representerar medianvärdet för D1-4. (B) genomsnittlig plats stödnivåer (msi) värden för varje plats längs dess första 20 ramar som svar på olika stimuli (I, II, II och IV). Röda linjen representerar den genomsnittliga intensitetsvärdet (SD). (C) procentandelen receptorer/partikel som extraherade från intensitet distribution av de enskilda partiklarna, tar som bin bredd monomer protein intensitetsvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur 1: Öppna ett TIRFM fil i Fiji eller ImageJ. Alternativ som visas i fönstret Bio-format på att dra och släppa en .lif video. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran. 

Kompletterande figur 2: Välj serie. Bilder finns i .lif videon. (A) fönster som tillåter urval av serien att vara analysera, inklusive flerkanaliga bilder. (B) resultatet exempel på serien urval, inklusive flerkanalsbild (vänster) och motsvarande video (höger). Vänligen klicka här för att ladda ner siffran. 

Kompletterande figur 3: Dela kanaler. (A) fönstret capture av kommandona ImageJ behövs för att dela kanaler av en flerkanalsbild och (B) resultatet exempel på kanalen split. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 4: Lägg samman kanaler. (A) sammanfoga olika kanaler i en enda bild. (B) kanalval för sammanslagningen. (C) resultatet exempel på kanal kopplingen. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 5: Synkronisera windows. (A) lokalisering i ImageJ menyn av de kommandon som krävs för bild synkronisering och (B) resulterande fönstret. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 6: Välj området av intresse. (A) Val av fönstret av intresse med hjälp av rektangulära markeringsverktyget och (B) resultatet av bild grödan. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 7: Spara videon. Spara regionen av intresse som en bildsekvens och parametrar för spara som bild sekvens fönster. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 8: Segmentering. (A) öppna segmentering editor plugin i Imagej's plugins-menyn. (B) lägga till etiketter/material för segmentering. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 9: Maskdesign. (A) Val av lämpliga etiketter och definitionen av den gröna masken. (B) urval av röda masken. Exempel på två masker motsvarar två etiketter. (C) spara masker som en TIFF-fil. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 10: MATLAB arbetskatalogen. Val av rätt katalog som innehåller serien som skall analyseras. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 11: U-spår huvudmenyn. (A) film val, (B) film edition och (C) kanal inställningsmenyer. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 12: Välj typ av objekt att spåra. Välj tracking av enstaka partiklar. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 13: Detektion av partiklar. (A) U-spår, Kontrollpanelen. (B) exempel på inställningar för detektion av partiklar. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 14: Exempel på resultat för partikel upptäckt. Olika fönster som inkluderar en viewer meny, film alternativmenyn och filmen. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 15: Uppföljning-menyn. Exempel på inställningar. (A) spårning, (B) ställa in - ram till ram länka och (C) gap utgående, sammanslagning och uppdelning menyer. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande bild 16: Exempel på resultat för partikel spårning. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 17: Track analys-menyn. Exempel på inställningar. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 18: Verifiering av spår analys. Skärmen visas efter spår analys, inklusive ett videofönster som visar de partiklar som upptäckts och deras motsvarande spår. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 19: Beräkning av Diffusionskoefficienterna. Histogrammen för Diffusionskoefficienterna beräknas (vänster) och medelvärdet fyrkant deplacement (MSD, höger). Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 20: Beräkning av Diffusionskoefficienterna inklusive de olika passande lägen. Histogrammen för Diffusionskoefficienterna beräknas (vänster) och medelvärdet fyrkant deplacement (MSD, höger) för slutna modellen. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 21: Intensitet-profiler. Exempel på plats intensitet längs dess bana (blå linje) och bakgrunden (röda linjen). Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande figur 22: Bakgrunden för varje bildruta. Vänster: Cell exempelbild. Mitten: Identifieras automatiskt cell. Höger: Område väljs automatiskt som bakgrund. Vänligen klicka här för att ladda ner siffran.

Kompletterande Video 1: Exempel på en typisk Frida video mikroskopi visar förekomst av partiklar med olika stödnivåer och typer av rörelser. Vänligen klicka här för att ladda ner video.

Kompletterande Material 1: Filer som innehåller alla protokoll skript anställda i de ad hoc- rutiner används för klassificering av banor och analys av klusterstorleken. Vänligen klicka här för att ladda ner materialet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrivna metoden är lätt att utföra även utan någon tidigare erfarenhet av arbete med Matlab. Matlab-rutiner kräver dock extremt noggrannhet med nomenklaturen av olika kommandon och lokalisering av de olika mapparna som används av programmet. I spårning analys rutin (steg 3), flera parametrar kan ändras. Fönstret ”inställningen Gaussian-blandning modell passande” (steg 3.8) styr hur U-spår kommer att upptäcka enstaka partiklar på videon. Detta görs genom att montera en Gaussisk blandning modell som beskrivs i3. En av de viktigaste parametrarna för denna montering definierar ett filter för att identifiera lokala maxima. Framgången för denna operation beror på avbildakontrasten och brus i bilderna. Den första parametern (Alpha värde för jämförelse med lokala bakgrund) styr förtroende för en maxima är en verklig plats, medan de andra hjälper till att minska buller under identifiering av ställen. Viktiga parametrar i steget ”spårning” (3,9) är antalet ramar att stänga luckor (det är ett spår kan sträcka sig över ramar som partikeln inte är faktiskt sett, men det ses innan dessa ramar och efter dessa ramar; i exempel 0) , och antalet ramar som ett spår måste omfatta för att betraktas som ett lyckat spår (i vårt exempel 20; denna parameter är relaterad till kameran förvärv hastighet och antal bildrutor i spåret skall vara sådan att den tillåter beräkning av diffusion co (effektiv). Det är också viktigt att besluta om att sammanfoga och dela upp segment (i exemplet dessa två möjligheter valdes). Sedan måste parametrarna för steg 1 i kostnad funktioner (bildruta-för-bildruta länkning) anges. Denna funktion styr hur partiklarna spåras längs ramar. De viktigaste parametrarna vid denna punkt är valet av Brownian sökradien, som styr hur långt varje spot är väntat till vara i nästa bildruta. I vårt exempel valde vi 0 och 5 som lägre och övre gränser, respektive. Observera att dessa parametrar är mycket specifika för arten av de partiklar som spåras, och att de kan behöva stämmas i varje enskilt fall. Särskilt viktigt är skalning kraften i Brownian och linjär söka radier. Dessa skalning krafter beror på vilken typ av rörelsen av partiklarna (gratis eller trånga diffusion). I exempel valdes värdena (0,5, 0,01) gratis diffusion. För den specifika dokumentationen av dessa parametrar, se3.

I beräkningen av kommandot diffusion koefficienter (steg 4,4), kan den övre gränsen för den diffusionskoefficienten av orörliga partiklar vara känd från tidigare experiment eller genom att köra funktionen calculateDiffusion på ett separat projekt med orörliga partiklar (renat monomer fluorescerande protein) och ser Diffusionskoefficienterna rapporterade. Denna funktion har två extra parametrar: ' outputSuffix´, som läggs till i utdata filnamnen och som standard tar det tomma värdet, och ' plotLength´, vilken som standard är 13 och antalet fördröjning (sekunder) i som diffusion beräkningen utförs. Passande läge 'alpha' innebär en justering av MSD i kurvan

Equation 1

det vill säga släpar en förskjutning (MSD0) och en ström funktion av tiden. Exponenten för denna makt funktion, Equation 2 , avgör huruvida rörelsen begränsas (0 < α < 0.6), avvikande (0,6 < α < 0,9), gratis (0,9 < α < 1.1), eller regi (α > 1.1). En översyn av denna typ av analys hänvisas till Manzo et al.9

Beräkningen av diffusion koefficienter4 producerar två produktionssiffrorna (se kompletterande diagram 19). Den första som visar ett histogram över de diffusion Koefficienterna beräknas (Observera att vid denna punkt, det finns en oberoende diffusion koefficient för varje bana). Medelvärde och 95% percentilen av dessa koefficienter visas i konsolen Matlab. Den andra tomten visar MSD (röd kurva) och antalet steg som ansåg att beräkna det som en funktion av fördröjningen för de banor som anses vara mobila (de vars diffusion koefficient är högre än det tröskelvärde som anges i kommandoraden). Genomsnittet och standardavvikelsen för de mobila banor beräknas (dessa är värdena för banor i en enda cell). I exemplet är exponenten 0,59 innebörden att rörelsen är begränsat. För denna kurva montering rapporterar programmet osäkerheten att var och en av parametrarna (visas som standardavvikelsen av varje) och godhet passform (perfekt passform skulle nå noll). Vid denna punkt och efter kontroll värdet alpha besluta vi att passa MSD med olika funktion:

Equation 3    om 0 < α < 0.6 (begränsad)

Equation 4om 0.9 < α < 1.1 (gratis)

Equation 5om α > 1.1 (regi)

Avvikande banor kan inte förses med en annan funktion. Vid trånga partiklar kan du beräkna förlossning storleken (i mikrometer) som i Destainville et al.14

Equation 6

En bra indikator på en korrekt montering är att godhet-av-passform bör minska från alfa passande att slutlig montering (i exemplet med den godhet som passar faller från 0.30474 till 0.15749, kompletterande diagram 19-20). calculateDiffusioncreates två filer i den ”results\TrackingPackage\tracks” inne i serien katalogen kallas ”diffusionCoefficients.txt” och ”diffusionCoefficientsMobile.txt”. Dessa filer innehåller tre kolumner: 1) index för varje ingång bana, 2) deras motsvarande diffusion koefficient, 3) majoritetsval regionen i masken där denna låt tillhör (regionerna erhålls från filen ”mask.tif” som vi genererade i steg 2.7; om filen inte finns, då finns denna kolumn inte). Du kan använda filen och motsvarande filer genereras för andra celler för att analysera fördelningen av den diffusionskoefficienten för en uppsättning celler under liknande experimentella förhållanden.

I beräkningen av den diffusionskoefficienten för korta banor (steg 4.7-4.8), är den sista parametern 'Kort' ett suffix som läggs till utdatafilnamnet så att du kan analysera olika undergrupper av banor utan att skriva över diffusionCoefficients.txt filer. Det faktiska namnet på utdatafiler är ”diffusionCoefficients < Suffix > .txt” och ”diffusionCoefficientsMobile < Suffix > .txt”. Om inget suffix ges, liksom den allmänna analysen utförs ovan, sedan antas en tom suffixet. Parametrarna modell (D, v och MSD0) kan skilja sig från de monteras på alla banor. Mest anmärkningsvärt är standardavvikelsen för parametrarna samt den godhet passformen normalt öka. Anledningen är att korta banor är mer instabila och en pålitlig montering är svårare.

Analysen av långa banor (steg 4,9) klassificera dem i trånga (1), gratis (2) eller riktad (3) enligt sin första stund och dess läge med avseende på 2,5% och 97,5% percentilerna av första stund av 500 slumpmässiga banor med Brownsk rörelse, samma Diffusion koefficient och längd som banan som analyseras och simulerade av Monte Carlo. Om den första ögonblicket av sökvägen som analyseras är under 2,5% av de första ögonblicken som observerats i simuleringarna, är sökvägen som studeras klassad som begränsas. Om det är över 97,5% av de simulerade första ögonblicken, klassificeras enligt anvisningarna; i annat fall klassificeras sökvägen som Brownian. I kommandot sysselsatt, 113.88e-3 är pixelstorlek i µm, 0,0015 är den övre gränsen för den diffusionskoefficienten av orörliga fläckar mätt i µm2/s, och 'Lång' är suffixet för utdatafilens namn exempel.pdf. Den första kolumnen i den här filen (”trajectoryClassificationLong.txt”) är antalet bana, andra är dess klassificering (1 = begränsat, 2 = gratis, 3 = regi), och tredje är banan första stund.

Skriptet för beräkning av intensiteten i varje partikel (steg 5.1) är mycket flexibel och tillåter spårning fluorescens stödnivåerna på många olika sätt (var och en väl lämpad för olika situationer som spårning orörliga fläckar av ett kontroll-experiment eller spårning mycket rörliga fläckar över en cell med variabel fluorescerande bakgrund). Skriptet kommer att analysera alla banor längs alla ramar. För varje plats vid varje bildruta det kommer att mäta intensiteten av pixlarna runt den plats (det analyserar en fyrkantig lapp runt platsen, som standard en storlek 3 x 3 pixlar), uppskatta plats bakgrund och beräkna fluorescens skillnaden mellan platsen och den bakgrund. Procentandelen fotoblekning partiklar och antalet fluorescerande partiklar i ett enda kluster, ses som en enda plats, kan uppskattas på detta sätt.

Denna automatiserade metod (gatherTrajectoryClassificationAndIntensity) ger information om flera parametrar (spot intensitet, lateral diffusion, typ av rörelse), som kan bidra till att studera förhållandet mellan strålpunkt och dess dynamiska under basala förhållanden, och hur olika behandlingar kan ändra dessa parametrar.

Den största begränsningen för metoden är att den kräver cell transfection med fluorescerande proteinet spåras. Transfection leder vanligtvis till protein överuttryck, ett faktum som hindrar enda protein spårning. En cell som sortering steg måste ingå att markera celler uttrycker ett antal receptorer som tillåter identifiering och spårning av enstaka partiklar av SPT-Frida mikroskopi. Denna metod kan också användas för att spåra biomolekyler märkt med kvantprickar eller Fab fragment. Protokollet beskrivs kräver ett antal kontroller som tidigare måste analyseras för att säkerställa att slutsatserna från analysen är korrekta. Först och främst är det viktigt att fastställa lämpliga uttryck villkor som möjliggör identifiering och spårning av enstaka partiklar. Filmer med densitet ~ 4,5 partiklar/µm2, motsvarande 8.500-22.000 receptorer/cell, användes för att analysera den plats och tid organisationen av cellmembranet receptor13.

Det är viktigt att fastställa den minsta detekterbara diffusionskoefficienten med hjälp av renade monomer AcGFP proteiner eller fasta celler. I båda fallen förutsätts det att det finns ingen diffusion och därför uppskattar vi att diffusion värdena av partiklar som analyseras i dessa villkor motsvarar immobiliserade partiklar och används för att diskriminera mellan mobila och orörliga banor13.

Den analys som vi har presenterat här är en allmän bana analysverktyg, som kan användas till analys av diffusion av receptorer av Superupplösning, analys av diffraktion begränsad bilder och analys av cellulära rörelse av standard mikroskopi . Den största fördelen med denna metod med andra tidigare beskrivits, såsom analys av antal och ljusstyrka11, är att det tillåter utvärdering av genomsnittliga intensitetsvärdena för varje enskild plats längs dess bana, med hänsyn till tidpunkten för överlevnad av AcGFP monomer protein innan fotoblekning. Överlevnadstiden för en molekyl innan fotoblekning beror starkt på magnetiseringen villkorar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma att Carlo Manzo och Maria García Parajo för deras hjälp och källa koden av diffusion koefficient analysen. Detta arbete var stöds delvis genom bidrag från det spanska ministeriet för vetenskap, Innovation och universitet (SAF 2017-82940-R) och RETICS programet av det Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 och RD16/0012/0006; RIER). LMM och JV stöds av programmet COMFUTURO av den Fundación General CSIC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Jurkat cells ATCC CRL-10915 Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP Clontech 632469 Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine
Gene Pulse X Cell electroporator  BioRad  We use 280 V, 975 mF, for Jurkat cells.  Use the transfection method best working in your hands. 
Cytomics FC 500 flow cytometer  Beckman Coulter
MoFlo Astrios Cell Sorter  Beckman Coulter Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required.  You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest.
Dako Qifikit DakoCytomation K0078 Used for quantification the number of receptors in the cell surface.
Glass bottom microwell dishes MatTek corporation P35G-1.5-10-C
Human Fibronectin from plasma Sigma-Aldrich F0895
Recombinant human CXCL12 PeproTech 300928A
Inverted Leica AM TIRF Leica
EM-CCD camera Andor  DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB The MathWorks, Natick, MA
U-Track2 software Danuser Laboratory
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi FiJI https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software Matlab tool.  For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice
GraphPad Prism GraphPad software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601 (2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Tags

Immunologi och infektion fråga 146 SPT chemokine receptorn spårning kluster diffusion analysprogram
Protokoll för bildbehandling för analys av diffusionen och klusterstorleken av membranreceptorer av fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sorzano, C. O. S.,… More

Sorzano, C. O. S., Martínez-Muñoz, L., Cascio, G., García-Cuesta, E. M., Vargas, J., Mellado, M., Rodriguez Frade, J. M. Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (146), e59314, doi:10.3791/59314 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter