Summary
यहां, हम पानी में घुलनशील पुनः संयोजक मकड़ी रेशम प्रोटीन समाधान और सामग्री रूपों है कि उन समाधानों से गठित किया जा सकता उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
कई मकड़ियों रेशम के सात प्रकार का उत्पादन । जब मकड़ियों द्वारा उत्पादित छह रेशम के रूप में फाइबर कर रहे हैं । ये रेशे पानी में घुलनशील नहीं होते हैं । मकड़ी silks के उल्लेखनीय यांत्रिक गुणों को पुन: पेश करने के लिए, वे heterologous मेजबान में उत्पादित किया जाना चाहिए के रूप में मकड़ियों दोनों क्षेत्रीय और नरभक्षी हैं । मकड़ी रेशम के सिंथेटिक analogs भी जलीय समाधान में अघुलनशील हो जाते हैं । इस प्रकार, पुनः संयोजक मकड़ी रेशम में अनुसंधान का एक बड़ा प्रतिशत कार्बनिक सॉल्वैंट्स कि सामग्री के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए हानिकारक है पर भरोसा करते हैं । हमारे समूह की विधि इन पुनः संयोजक मकड़ी रेशम के जल में विलायक को बल देता है । उल्लेखनीय है, जब इन प्रोटीनों गर्मी और दबाव के इस विधि का उपयोग कर तैयार कर रहे हैं, सामग्री रूपों की एक विस्तृत श्रृंखला पुनः संयोजक मकड़ी रेशम प्रोटीन सहित (आरएसएसपी) के एक ही समाधान से तैयार किया जा सकता है: फिल्मों, फाइबर, स्पंज, hydrogel, lyogel, और चिपकने वाला. यह लेख एक तरह से है कि और अधिक आसानी से लिखित सामग्री और अकेले तरीकों से समझ में आता है विलायकयोजित आरएसएसपी और सामग्री रूपों के उत्पादन को दर्शाता है ।
Introduction
मकड़ी रेशम शक्ति, लोच, और biocompatibility के अपने प्रभावशाली संयोजन के लिए सामग्री वैज्ञानिकों की रुचि जुटाने है । पुनर्निर्मित फाइबर पारंपरिक रूप से अनुसंधान का जोर दिया गया है । यह प्रयास पानी में रिकॉम्पानेंट स्पाइडर सिल्क प्रोटीन (आरएसएसपी) के साथ-साथ जलीय विलायक को प्राप्त करने के लिए पारंपरिक सॉल्वेशन तकनीकों (चाओट्रॉपिक एजेंटों और डिटर्जेंट) की अक्षमता से बाधित था । इसके अलावा, rssp के संस्करण solvating के लिए विकसित की गई तकनीकों सभी rssp वेरिएंट पर काम नहीं करते और भी पर्याप्त हेरफेर और समय है कि अक्सर प्रोटीन हानि1,2में परिणाम की आवश्यकता होती है । यह काफी हद तक क्षेत्र में 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) एक विलायक जहां से फाइबर, और अंय सीमित सामग्री रूपों के रूप में उपयोग के परिणामस्वरूप है । लाभ यह है कि सभी ज्ञात rSSp HFIP में घुलनशील हैं, प्रत्येक अनुसंधान समूह के बीच डेटा एकरूपता प्रदान कर रहा है । नुकसान यह है कि HFIP एक विषाक्त विलायक है कि महंगी और अव्यावहारिक है स्वास्थ्य चिंताओं और पर्यावरण के विचारों के कारण पैमाने पर है ।
आरएसएसपी विलायक के लिए एक नवीन दृष्टिकोण विकसित किया गया है कि कठोर कार्बनिक विलायक HFIP और अंय तकनीकों है कि चुनिंदा आरएसएसपी विलायक के लिए काम के बीच तकनीकी अंतर को पाटने । विशिष्ट तपता और दबावों का संयोजन आरएसएसपी और पानी के निलंबन के लिए लागू किया गया था । परिणाम १००% विलायकीयन और rssp की वसूली के पास थे, साथ ही उच्च प्रोटीन सांद्रता; सामग्री रूपों की एक किस्म के लिए इन योगों है कि सभी hfip या अंय कार्बनिक सॉल्वैंट्स3,4,5,6का उपयोग कर प्राप्त नहीं थे से संभव होना निर्धारित किया गया । इस दृष्टिकोण के उद्देश्य के लिए कुशलतापूर्वक और आसानी से एक जलीय समाधान है कि तब सामग्री रूपों की एक किस्म के उत्पादन के लिए उपयोग किया जा सकता है में शुद्ध और सूख पुनः संयोजक स्पाइडर प्रोटीन के solubilize है ।
फाइबर, फिल्म, कोटिंग्स, चिपकने वाले, हाइड्रोजैल, lyogels, microspheres, और स्पंज सामग्री सभी एक ही जलीय आरएसएसपी समाधान से आसानी से accomplishable इस विधि का उपयोग कर रहे हैं । इस पद्धति के जारी विकास, न केवल अतिरिक्त आरएसएसपी के साथ, लेकिन अंय प्रोटीन के साथ, नई सामग्री रूपों और वैकल्पिक प्रोटीन शुद्धि और विलेयीकरण रास्ते के लिए नेतृत्व कर सकता है ।
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Protocol
1. lyophilized प्रोटीन शेयरों से पुनः संयोजक मकड़ी रेशम मिश्रण तैयार
- आवश्यक निर्माण और वांछित सामग्री संरचनाओं के लिए आवश्यक मात्रा निर्धारित करते हैं । ठेठ योगों से लेकर 3% (w/v) 15% तक (w/ इस चयन का उपयोग करते हुए, उपयुक्त rSSp, सांद्रता, और अनुपात परिकलित करें ।
- इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रत्येक सामग्री तैयार करने के लिए निम्न संबंधित योगों का उपयोग करें: हाइड्रोजैल/स्पंज/lyogels, 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; चलचित्र/कोटिंग्स, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; चिपकने वाले, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; फाइबर, १२.५% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2 ।
नोट: भले ही अधिकांश योगों बेहतर विशिष्ट रूपों और सामग्री के लिए फिट कर रहे हैं, वहाँ योगों अक्सर ओवरलैप कर सकते हैं की एक विस्तृत श्रृंखला है. साथ ही, अंतिम rSSp सामग्री भी बनाने और इच्छित गुण का उत्पादन करने के लिए संसाधित करने के दौरान सिलवाया जा सकता है । आम तौर पर, प्रत्येक प्रोटीन उचित या उपयोगी मापदंडों में जांच की आवश्यकता होगी ।
- इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रत्येक सामग्री तैयार करने के लिए निम्न संबंधित योगों का उपयोग करें: हाइड्रोजैल/स्पंज/lyogels, 6% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; चलचित्र/कोटिंग्स, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; चिपकने वाले, 12% (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; फाइबर, १२.५% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2 ।
- एक साफ और नए 8 मिलीलीटर autoclavable बोरोसिलिकेट ग्लास संस्कृति शीशी एक रबर पंक्तिवाला पेंच टोपी के साथ चुनें ।
- कैप हटाकर खाली शीशी को एनालिटिकल बैलेंस पर रखें । धड़ा खाली शीशी का द्रव्यमान इतना है कि शेष शूंय मास पढ़ता है ।
- प्रत्येक विशिष्ट सामग्री के लिए खाली शीशी में वांछित lyophilized rSSp पाउडर जोड़ें ।
- प्रत्येक सामग्री के लिए प्रत्येक प्रोटीन प्रकार की इन विशिष्ट जनता का उपयोग करें, जब समाधान के 2 मिलीलीटर की तैयारी: hydrogels/स्पंज ६० ६०/ फिल्म/कोटिंग्स, ८० मिलीग्राम MaSp1 और 20 MaSp2 मिलीग्राम; चिपकने वाले, १२० मिलीग्राम की MaSp1 और १२० मिलीग्राम MaSp2; फाइबर, २०० मिलीग्राम MaSp1 और ५० मिलीग्राम MaSp2 ।
- Ultrapure पानी की वांछित मात्रा में जोड़ें, शीशी कि पहले से ही भारित आरएसएसपी पाउडर शामिल करने के लिए कम से 2 मिलीलीटर, ।
नोट: 2 मिलीलीटर की एक ंयूनतम मात्रा सभी विलायक प्रक्रियाओं के लिए सिफारिश की है । - सील शीशी टोपी और briskly भंवर सामग्री एक छितरी, और समरूप, rSSp मिश्रण है कि अब विलायक प्रक्रिया के लिए तैयार है बनाने के लिए । इस तरह के साथ, या इसके अलावा में, भंवर मिश्रण नियोजित किया जा सकता है मिश्रण sonication या प्ररित करनेवाला के रूप में अतिरिक्त homogenization दृष्टिकोण ।
2. पुनः संयोजक मकड़ी रेशम विलायक
सावधानी: उच्च तपता और दबाव विलायक प्रक्रिया के दौरान उत्पन्न होते हैं । उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण, विशेष रूप से काले चश्मे, लंबी आस्तीन, और गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं ।
- शीशी, या पोत, टोपी की अंतिम जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह दृढ़ता से और सुरक्षित रूप से कड़ा किया गया है । फिर निलंबित आरएसएसपी मिश्रण एक पारंपरिक माइक्रोवेव ओवन के लिए स्थानांतरण ।
नोट: ७०० से १,५०० वाट की शक्ति रेंज के भीतर माइक्रोवेव इकाइयों, छोटे आंतरिक चैंबर क्षमता रखने, और प्लेटफार्मों घूर्णन बेहतर विलायक शर्तों प्रदान करने के लिए सिफारिश की है । - पूर्ण शक्ति पर 5 एस फटने के साथ माइक्रोवेव का ऑपरेशन शुरू करते हैं । प्रत्येक फट के बाद संक्षेप में दरवाजा खुला और ध्यान से मिक्स//के लिए बसने को रोकने के लिए और निलंबित मिश्रण बनाए रखने की शीशी भंवर ।
- इस माइक्रोवेव की प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि मिश्रण और/या समाधान ने कम से १३० डिग्री सेल्सियस का तापमान प्राप्त कर लिया हो, जब शीशी के हिस्से वाले घोल से सीधे एक अवरक्त थर्मामीटर मापा जाता है । इस प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि सभी ठोस particulates पूरी तरह से भंग कर दिया गया है और अब दिखाई नहीं दे रहे हैं ।
नोट: यह करने के लिए शीशी और समाधान के लिए कभी कभार ठंडा करने के लिए अनुमति देने का सुझाव दिया है, खासकर अगर सूत्रीकरण में मौजूद rSSp की एक उच्च एकाग्रता है । २०० डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान शीशी सील विफलता के जोखिम को बढ़ा । सील को छूने से अतितप्त मिश्रण/विलयन को रोकने के लिए भी विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए, जिसके परिणामस्वरूप शीशी की रोकथाम में भी असफलता होगी । - सफलतापूर्वक एक समाधान में rSSp मिश्रण solvating के बाद समाधान के तापमान और शीशी टोपी को खोलने से पहले १०० डिग्री सेल्सियस (उबलते बिंदु) के नीचे शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
3. हाइड्रोजैल
- माइक्रोवेव से निकालने के बाद घोल से एक हाइड्रोजेल तैयार करें और उसे ठंडा करके सेट करने की अनुमति दे । यह पूरी तरह से शांत करने के लिए अनुमति देने से पहले विशिष्ट geometries में हाइड्रोजेल कास्ट ।
नोट: विभिन्न rSSps एक hydrogel करने के लिए संक्रमण के लिए समय की विभिन्न मात्रा की आवश्यकता होगी । उदाहरण के लिए, MaSp2-जैसे दृश्यों MaSp1-जैसे दृश्यों की तुलना में अधिक तेजी से हाइड्रोजैल बनाने के लिए करते हैं । प्रोटीन सांद्रता, लवणता, और पीएच भी सीधे एक hydrogel के लिए संक्रमण की दर को प्रभावित करते हैं ।
4. स्पंज
- एक आरएसएसपी स्पंज तैयार पहले प्राथमिक विलायकयोजित समाधान के लिए एक hydrogel फार्म की अनुमति ।
- एक जल स्नान में हाइड्रोजेल प्लेस,-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में इस स्नान जगह है, और स्नान पूरी तरह से जमे हुए है जब तक रुको ।
- फ्रीजर से जमे हुए हाइड्रोजेल और पानी स्नान को हटाने और 25 डिग्री सेल्सियस पर विगलन द्वारा स्पंज निर्माण की प्रक्रिया को पूरा करें । परिणामी स्पंज अब thawed पानी से हटाया जा सकता है ।
5. लियॉल
- एक का गठन हाइड्रोजेल सीधे बर्फ़ीली, के साथ या बिना एक पानी स्नान, और एक lyophilizer (फ्रीज ड्रायर) के लिए जमे हुए हाइड्रोजेल नमूना स्थानांतरित द्वारा एक आरएसएसपी lyogel तैयार करते हैं ।
- बर्तन है कि नमी उदात्तीकरण में हुई से अंतिम lyophilized जेल सामग्री निकालें
6. फिल्मों और कोटिंग्स
- तीन निम्न विधियों में से एक का उपयोग करें: समाधान कास्टिंग, समाधान छिड़काव, या rSSp की फिल्मों या कोटिंग्स का उत्पादन करने के लिए कोटिंग डुबकी.
- वांछित आकार के PDMS रूपों पर/में solubilized रेशम समाधान कास्ट ।
- डालो और फिल्म समाधान के २०० μL फैल और यह परीक्षण या उपचार के लिए PDMS सब्सट्रेट के बंद छीलने से पहले सूखी अनुमति देते हैं ।
- इन को सूखने देने के बाद यांत्रिक परीक्षण या फिल्मों के बाद यांत्रिक गुणों को बेहतर बनाने के लिए बनाई गई फिल्मों को हटा दें ।
- एक कोटिंग, या एक फिल्म है कि सब्सट्रेट से हटाया नहीं जा सकता तैयार करने के लिए, या तो स्प्रे या डुबकी कोटिंग का उपयोग करने के लिए एक पतली फिल्म परत का उत्पादन ।
नोट: स्प्रे कोट करने के लिए, इस प्रोटोकॉल एक मास्टर एयरब्रश मॉडल रंग स्प्रेयर के साथ सफलता मिली है ।- बस विकल्प के submerging घुलनशील rSSp में submerging और दोहराने के बाद इच्छित मोटाई प्राप्त करने के लिए सुखाने के द्वारा एक डुबकी कोटिंग फार्म ।
- एक डुबकी कोट को लागू करने के लिए निरंतरता और अंतिम कोटिंग की प्रभावशीलता को बढ़ाने से पहले एक प्रारंभिक स्प्रे कोट प्रदर्शन ।
7. चिपकने
नोट: चिपकने के गठन निम्नलिखित विधियों में से एक के माध्यम से प्राप्त की है ।
- सीधे एक सब्सट्रेट पर solubilized आरएसएसपी जोड़ने और फिर समाधान के शीर्ष पर एक दूसरा सब्सट्रेट लागू. मजबूती से टुकड़ों को एक साथ दबाना है और फिर एक ओवन में 25 डिग्री सेल्सियस के ंयूनतम तापमान के साथ कम से 16 घंटे के लिए नमूनों सूखी ।
- वैकल्पिक रूप से, एक स्प्रे कोटिंग के साथ दो सब्सट्रेट सतहों स्प्रे और फिर substrates एक साथ दबाना.
- आरएसएसपी पर लेप लगाने की डिप विधि के माध्यम से substrates और चिपका substrates भी तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और चिपकने वाला ।
8. गीले-काता फाइबर
- एक 19 जी फिसलना सुई के माध्यम से Luer-लोक टिप के साथ एक गाढ़ा सिरिंज में solubilized डोप समाधान लोड । हवा के बुलबुले बाहर फैंकना और डोप Luer-सिरिंज के लोक अंत में बैठते हैं ।
- तिरछी टयूबिंग, आंतरिक व्यास ०.०१ इंच, 1/16 इंच आयुध डिपो और 10/32 शंकु के लिए तिरछी नली का एक टुकड़ा उंगली तंग फिटिंग में कम से 25 मिमी डालें । एक तिरछी ट्यूबिंग Luer करने के लिए इस फिटिंग संलग्न-लोक महिला एडाप्टर ।
- 19 गेज सुई लोड सिरिंज पर इस सेट के साथ बदलें ।
- ९९% शुद्ध isopropanol के साथ एक लंबा, स्पष्ट गिलास स्नान भरने के लिए जमावट स्नान के लिए उपयोग करने के लिए ।
- खिंचाव स्नान, खिंचाव godets नीचे स्थित भरें । ये होगा 80:20 isopropanol: पहले खिंचाव स्नान में आसुत जल, और 20:80 isopropanol: दूसरा खिंचाव स्नान में आसुत पानी ।
- Godet खिंचाव प्रणाली ऐसे सेट करें कि जमावट स्नान के बाद पहला godet और पहले खिंचाव स्नान में पहले godet एक ही गति से घूर्णन कर रहे हैं ।
- खिंचाव 1 स्नान में अंतिम godet की गति का समायोजन करके पहले खंड आरंभ, मध्य ऊपरी godet, और एक ही गति को खिंचाव 2 स्नान में पहली godet । इस गति के रूप में प्रारंभिक फाइबर हटाने की गति के रूप में तेजी से 2x हो जाएगा ।
- खिंचाव 2 स्नान में अंतिम godet की गति का समायोजन करके दूसरे खंड आरंभ, पिछले ऊपरी godet, और एक ही गति को वाइंडर । इस गति के रूप में तेजी से पहले खिंचाव या 4x प्रारंभिक फाइबर हटाने की गति के लिए इस्तेमाल की गति के रूप में 2x हो जाएगा ।
- मध्यवर्ती godets के बाहर पर नाइट्रस दस्ताने जगह फिसल से फाइबर रखने के लिए ।
- धीरे से जमावट स्नान में समाधान बाहर निकालना करने के लिए शुरू करो । एक स्वचालित प्रणाली में बाहर निकालना दर 10 मिमी की एक हटाने की गति से मेल करने के लिए सेट/s.
- फाइबर बाहर निकालना एक पतली धातु हुक या संदंश के साथ उपयोग कर स्नान से बाहर फाइबर खींचने से पहले एक समान बनने के लिए अनुमति दें । सत्यापित करें कि स्नान से फाइबर हटाने तिरछी टयूबिंग टिप और मार्ग स्नान स्नान छोड़ने फाइबर के बीच एक पाश बनाया ।
- Godets की श्रृंखला के माध्यम से पुनर्प्राप्त फाइबर गाइड इस तरह कि फाइबर खिंचाव स्नान में डूबे हुए है लेकिन खिंचाव स्नान के बीच हवा में सुखाने और एक चरखी पर जाने से पहले । इस सुखाने उच्च रखा मध्यवर्ती godets द्वारा प्राप्त की है ।
नोट: फाइबर हटाने की दर और/या बाहर निकालना दर के लिए प्रोटीन एकाग्रता, additives पर आधारित समायोजित करने की आवश्यकता होगी, और प्रोटीन प्रकार जमावट स्नान के तल पर फाइबर पूलिंग के बिना पर्याप्त जमावट समय की अनुमति के लिए । - पूरी तरह से फैला फाइबर विंदर तंत्र पर स्पूल करने के लिए टेप का उपयोग कर देते हैं ।
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Representative Results
आरएसएसपी के घुलनशीकरण की वर्णित विधि से, विभिन्न प्रकार के भौतिक रूपों को प्राप्त किया जा सकता है जैसा कि चित्र 1में देखा गया है । घुलनशीकरण की विधि के लिए गर्मी और दबाव लागू होता है, एक पारंपरिक माइक्रोवेव द्वारा उत्पंन, rSSp और पानी के निलंबन के लिए । जब महत्वपूर्ण तापमान और दबाव प्राप्त कर रहे हैं, प्रोटीन घुलनशील होगा । हाइड्रोजैल, lyogels, स्पंज, चिपकने वाले, कोटिंग्स, फिल्मों, और फाइबर: इस घुलनशील आरएसएसपी समाधान से, आवश्यक शर्तों सात सामग्री रूपों के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं । Hydrogels घुलनशील rSSp शांत और स्वाभाविक रूप से स्वयं सहयोगी की अनुमति देकर तैयार कर रहे हैं । हाइड्रोजेल के लिओफिलेलाइज़िंग द्वारा एक लायोगल तैयार किया जाता है. स्पंज सामग्री हाइड्रोजेल ठंड से बना है, जबकि यह पानी में डूब रहा है । फिल्ंस pdms सतहों (और अंय उत्तरदायी सतहों) पर solubilized आरएसएसपी कास्टिंग द्वारा तैयार किया जा सकता है और सूख गया । PDMS फिल्म को आसानी से पोस्ट उपचार या विश्लेषण के लिए हटाया जा करने के लिए अनुमति देता है । कोटिंग्स और चिपकने या स्प्रे या डुबकी तरीकों या स्प्रे और डुबकी के संयोजन का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं । फाइबर एक जमावट स्नान में extruding द्वारा सबसे व्यापक प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है और फिर serially बाद स्पिन खिंचाव स्नान में कच्चे फाइबर खींच । फाइबर अकेले एक जमावट स्नान में extruding द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है । हालांकि, फाइबर में सबसे अच्छा यांत्रिक क्षमता के बाद स्पिन खिंचाव3,7,8,9स्नान में खींच की आवश्यकता है ।
चित्रा 1: जलीय विलायक और rSSp सामग्री. सामग्री है कि गर्मी और पानी में rssp विलायकयोजित के साथ दबाव की इस विलेयीकरण विधि का उपयोग कर तैयार किया गया है की प्रतिनिधि तस्वीरें । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
पुनः संयोजक के बाद मकड़ी रेशम प्रोटीन शुद्ध कर रहे है वे तो एक समाधान है कि सामग्री के गठन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है में तैयार किया जाना है । पानी के साथ lyophilized मकड़ी रेशम प्रोटीन मिश्रण और माइक्रोवेव विकिरण के लिए इस मिश्रण को उजागर करके, गर्मी और दबाव उत्पन्न करने के लिए, यह एक आरएसएसपी समाधान तैयार करने के लिए संभव है । सामग्री रूपों की एक विस्तृत विविधता आरएसएसपी solubilization के इस सरल और कुशल विधि से उत्पादित किया जा सकता है । प्रत्येक सामग्री के लिए विशिष्ट रूप से तैयार है और वांछित परिणाम और संपत्तियों को प्राप्त करने के लिए संसाधित किया जाना है । प्रारंभिक योगों, गठन की स्थिति, और/या प्रसंस्करण मापदंडों के लिए मामूली परिवर्तन के साथ, प्रत्येक सामग्री आसानी से इस विधि का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है । वहां से अधिक रूपों रहे है यहां प्रस्तुत कर रहे है और क्षेत्र में दूसरों के द्वारा आगे की जांच के माध्यम से, इन सामग्रियों को इस तकनीक का उपयोग कर नई सामग्री रूपों का पता लगाने के लिए विकसित करने के लिए जारी रहेगा ।
बशर्ते कि समाधान मुख्य रूप से पानी और प्रोटीन के शामिल है (additives जिलेटिन देरी और समाधान की स्थिरता में सुधार के लिए उपयोग किया जा सकता है) जैविक रूप से सक्रिय घटकों के साथ functionalization के लिए संभावना काफी में सुधार हुआ है HFIP की तुलना आधारित rSSp समाधान । विभिन्न प्रकार के घटक, लेकिन संपूर्ण न होने वाले युग्मन को dopes और इस प्रकार सामग्री रूपों में शामिल किया गया है: एंटीबायोटिक्स, एंटीबॉयोटिक्स, हेपरिन, सिल्वर नैनोकणों, और सेल आसंजन के लिए integrins । Additives के अलावा, विभिन्न आकारों, दृश्यों, natures, और स्रोतों के कई पुनः संयोजक मकड़ी रेशम प्रोटीन सफलतापूर्वक इस विधि के साथ विलायकयोजित किया गया है और इस प्रोटोकॉल में वर्णित सामग्री के गठन में इस्तेमाल किया ।
इसके अलावा न सिर्फ आरएसएसपी बल्कि सभी प्रोटीन इस विधि में विलायकयोजित के लिए घुलनशीकरण की इस विधि की उपयोगिता का विस्तार है, कि समाधान बाँझ रहे हैं प्रदान की शीशी या चैंबर के अंदर तापमान और दबाव पर्याप्त रूप से उच्च रहे हैं । इन समाधानों को संस्कृतियों को दूषित किए बिना सीधे कोशिका संस्कृति में ले जाया जा सकता है ।
यदि इन सामग्रियों को सीधे vivo प्रणाली में ले जाना है, तो एंडोटॉक्सिन के स्तर को संबोधित किया जाना चाहिए । एक ट्रिपल आटोक्लेव विधि है कि endotoxins को नष्ट कर देता है ताकि उनके स्तर पर, या नीचे हैं, की सिफारिश की ०.२५ यूरोपीय संघ/ जबकि आटोक्लेव एंडोटॉक्सिन को नष्ट करने के लिए उपयोगी है, इसके दबाव और तापमान आमतौर पर6तारीख करने का प्रयास किया rssp नमूनों के सभी पूरी तरह से विलायकयोजन करने के लिए आवश्यक गंभीर तापमान या दबाव तक पहुँचने के लिए असफल । यह करने के लिए आवश्यक microwaving या एक तापमान/
विशिष्ट रूप से, एंडोटॉक्सिन को हटाने और गर्मी और दबाव का उपयोग कर सामग्री की विलायकता प्रोटीन या परिणामी सामग्री फार्म4,5,6,7की यांत्रिक क्षमता नीचा नहीं है । यह सराहना की है कि वहां की संभावना है एक tipping बिंदु की भी उच्च प्राप्त करने के दबाव और/या तापमान और गर्मी और दबाव के भी कई चक्र के परिणाम है कि यांत्रिक क्षमता में अवक्रमित और/ इस tipping बिंदु की संभावना rssp विलायकयोजित के प्रकार के लिए भिंन होगा और, कुछ हद तक, rssp की लंबाई का उपयोग किया । हालांकि, विलायक के इस मूल विधि के साथ, कई स्काउटिंग विलायकीयन प्रयोगों कम क्रम में उचित विलायक तापमान और विशिष्ट प्रोटीन के लिए आवश्यक दबावों का वर्णन करने के लिए किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखकों ने हितों का टकराव नहीं होने की घोषणा की ।
Acknowledgments
लेखकों को कृतज्ञता यूटा विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुसंधान (USTAR) पहल से धन स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe with Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips |
| 4 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225142 | Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL |
| 8 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225144 | Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL |
| 99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Freeze Dryer |
| Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microwave | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table |
| One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD | IDEX | F-120X | |
| PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID | IDEX | 1531B | |
| Sprayer: Master Airbrush | Master Airbrush | TC-60 |
References
- Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).
- Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).
- Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).
- Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).
- Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).
- Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).
- Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).
- Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
- Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).
- Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).
