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Bioengineering

熱と圧力を用いた水性溶媒和による組み換えクモ絹の材料形成

doi: 10.3791/59318 Published: May 6, 2019

Summary

ここでは、水溶性の組換えクモ糸タンパク質溶液およびそれらの溶液から形成することができる材料形態を生成するためのプロトコルを提示する。

Abstract

多くのクモは7種類の絹を作り出します。シルクの6つはクモによって生産されたときの繊維の形です。これらの繊維は水溶性ではない。クモ絹の顕著な機械的特性を再現するためには、クモが領土と cannibalistic の両方であるように、それらは異種宿主で生産されなければなりません。クモ糸の合成類似体はまた、水溶液中に不溶性である傾向がある。したがって、組換えクモシルクの研究の大部分は、材料の大規模な生産に有害である有機溶媒に依存しています。当社グループの方法は、これらの組換えクモ絹の溶媒和を強制的に水にします。驚くべきことに、これらのタンパク質が熱および圧力のこの方法を使用して調製される場合、広範囲の物質形態は、組換えクモ糸タンパク質 (rSSp) の同じ溶液から、フィルム、繊維、スポンジ、ヒドロゲル、lyogel、および接着剤を含む調製することができる。この記事では、溶媒和 rSSp と材料形態の生産を、書かれた材料や方法だけではなく、より容易に理解できる方法で実演します。

Introduction

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スパイダーシルクは、強度、弾力性、および生体適合性の彼らの印象的な組み合わせの材料科学者の関心を集めています。繊維の再作成は、伝統的に研究の推進であった。この取り組みは、固有における組換えクモ糸タンパク質 (rSSp) の水に対する阻害性、ならびに従来の溶媒和技術 (カオトロピック剤および洗剤) が水性溶媒和を達成することができなかったことによって妨げられた。さらに、rSSp の溶媒和バージョンのために開発された技術は、すべての rSSp 変異体では動作せず、多くの場合、タンパク質損失1,2に起因するかなりの操作と時間を必要とします。これにより、繊維を形成する溶媒として1、1、1、3、3、3-hexafluoroisopropanol (HFIP)、および他の限られた材料の形態を利用する分野に大きく起因している。すべての既知の rSSp が HFIP に可溶性であるという利点は、各研究グループ間のデータの均一性を提供する。欠点は、HFIP が高価であり、健康上の懸念や環境への配慮のためにスケールすることは現実的ではない有毒な溶媒であるということです。

RSSp 溶媒和への斬新なアプローチは、過酷な有機溶剤 HFIP と rSSp 溶媒和に選択的に働く他の技術との間の技術的ギャップを埋めるものであった。特定の熱および圧力の組合せは rSSp および水の懸濁液に加えられた。結果は、100% の溶媒和と rSSp の回復だけでなく、高タンパク質濃度の近くであった;種々の材料形態は、HFIP または他の有機溶媒3456を使用してすべて達成可能ではなかったこれらの製剤からできると判断された。このアプローチの目的は、精製および乾燥された組換えスパイダータンパク質を、様々な材料形態の製造に利用することができる水溶液中で効率的かつ容易に可溶化することである。

繊維、フィルム、コーティング、接着剤、ヒドロゲル、lyogels、微小球、およびスポンジ材料はすべて、この方法を用いて同じ水性 rSSp 溶液から容易に accomplishable する。この方法の継続的な進化は、追加の rSSp だけでなく、他のタンパク質とともに、新しい材料形態および代替タンパク質の精製および可溶化経路をもたらす可能性がある。

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Protocol

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1. 凍結乾燥タンパク質ストックからの組換えクモ糸混合物調製

  1. 目的とする材料の形成に必要な定式化とボリュームを決定します。典型的な製剤の範囲は 3%(w/v) ~ 15%(w/v) です。この選択を使用して、適切な rSSp、濃度、および比率を計算します。
    1. このプロトコルに記載されている各材料を準備するために、以下のそれぞれの製剤を使用してください: ヒドロゲル/スポンジ/lyogels、6%(w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2;フィルム/コーティング, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2;接着剤、12%(w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2;繊維、12.5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2。
      注: ほとんどの製剤は、特定の形態および材料に適しているにもかかわらず、多くの場合、重複することができる製剤の広い範囲があります。さらに、最終的な rSSp 材料はまた形成および処理の間に好みの特性を作り出すために合わせることができる。一般的に、各タンパク質は、適切または有用なパラメータの調査を必要とします。
  2. ゴム製のスクリューキャップ付きの清潔で新しい 8 mL オートクレーブ可能ホウケイ酸ガラス培養を選択します。
  3. キャップを外し、空のバイアルを分析バランスに置きます。バランスがゼロ質量を読み取るように、空のバイアルの質量を風袋ます。
  4. 各特定の材料のための空のバイアルに所望の凍結乾燥 rSSp 粉末を追加します。
    1. 2 mL の溶液を調製する際に、各材料について各タンパク質タイプのこれらの特定の質量を使用してください: ヒドロゲル/スポンジ/lyogels, 60 mg の MaSp1 と 60 mg の MaSp2;フィルム/コーティング, 80 mg の MaSp1 と 20 mg の MaSp2;接着剤, 120 mg の MaSp1 と 120 mg の MaSp2;繊維, 200 mg の MaSp1 および50の mg の MaSp2.
  5. すでに加重 rSSp 粉末を含んでいるバイアルに、少なくとも2ml の超純水の所望の量を加えます。
    注: すべての溶媒和手順には、最小 2 mL のボリュームをお勧めします。
  6. バイアルキャップを密封し、溶媒和手順の準備ができている分散された、均質な、rSSp 混合物を作成するために内容を活発に渦。超音波処理またはインペラ混合などの追加の均質化アプローチは、または、渦混合に使用することができます。

2. 組み換えクモ糸溶媒和

注意: 高加熱と圧力は、溶媒和の手順で生成されます。このプロセスには、適切な個人用保護具、特にゴーグル、長袖、耐熱手袋が必要です。

  1. バイアル、または容器、キャップの最終チェックを行い、しっかりとしっかりと締め付けられていることを確認します。その後、懸濁した rSSp 混合物を従来の電子レンジに移す。
    注: 1500 700 の電力範囲内のマイクロ波ユニットは、より小さい内部チャンバ容量を有する、および回転プラットフォームは、より良い溶媒和条件を提供することをお勧めします。
  2. フルパワーで 5 s バーストとマイクロ波の動作を開始します。各バーストの後に簡単にドアを開き、慎重に沈殿し、懸濁混合物を維持するためにバイアルを混ぜ/旋回します。
  3. 混合物および/または溶液が、バイアルの部分を含む溶液に対して直接赤外温度計で測定された場合、少なくとも130° c の温度を得るまで、このマイクロ波プロセスを繰り返します。すべての固体微粒子が完全に溶解し、表示されなくなるまで、このプロセスを繰り返します。
    注: 特に製剤が高濃度の rSSp が存在する場合、バイアルおよび溶液を時折冷却することが推奨される。200° c を超える温度は、バイアルシール不良のリスクを増加させます。過熱混合物/溶液がシールに接触するのを防ぐために特別な注意を払わなければならないこともあり、その結果、バイアルの封じ込め不良も生じます。
  4. 首尾よく溶液に rSSp 混合物を溶媒和した後、溶液の温度とバイアルキャップは、開口部の前に100° c (沸点) 以下に冷却することができます。

3. ヒドロゲル

  1. 電子レンジから取り除いた後、溶液からヒドロゲルを調製し、冷却して設定します。それが完全に冷却することを可能にする前に、特定の形状にヒドロゲルをキャスト.
    注: 異なる rSSps は、ヒドロゲルに移行するために様々な量の時間を必要とするであろう。例えば、MaSp2 配列は、MaSp1 の配列と比較してより迅速にヒドロゲルを形成する傾向がある。タンパク質濃度、塩分濃度、および pH もまた、ヒドロゲルへの移行速度に直接影響を及ぼす。

4. スポンジ

  1. 第一の溶媒和溶液がヒドロゲルを形成できるようにすることによって、rSSp スポンジを調製する。
  2. 水浴にヒドロゲルを入れ、この浴を-20 ° c で冷凍庫に入れ、浴が完全に冷凍されるまで待つ。
  3. 冷凍ハイドロゲルと水浴を冷凍庫から取り出し、25° c で解凍してスポンジの形成プロセスを完了させます。得られたスポンジを解凍した水から除去できるようになりました。

5. Lyogel

  1. Lyogel の有無にかかわらず、形成されたヒドロゲルを直接凍結して rSSp を調製し、凍結したヒドロゲルサンプルを lyophilizer (凍結乾燥機) に移します。
  2. 耐湿昇華が発生した容器から最終的な凍結乾燥ゲル材料を除去します。

6. フィルムおよびコーティング

  1. 次の3つの方法のいずれかを使用します: 溶液鋳造、溶液噴霧、またはディップコーティングにより、rSSp のフィルムまたはコーティングを製造します。
    1. 可溶化したシルク溶液を、所望の形状の PDMS 形態に/にキャストする。
    2. フィルム溶液の200μ l を注ぎ、広げ、これを PDMS 基板の試験または処理のために剥離する前に乾燥させる。
    3. これらの乾燥を許可した後、機械的な特性を向上させるために、フィルムを処理または後処理のための形成されたフィルムを削除します。
  2. コーティングを調製するために、または基材から除去することができないフィルムは、薄膜層を生成するためにスプレーまたはディップコーティングを使用する。
    注: スプレーコートに、このプロトコルは、マスターエアブラシモデル塗装噴霧器で成功を発見しました。
    1. 選択の基質を可溶化された rSSp に単に沈めるし、乾燥後に所望の厚さを達成するために、ディップコーティングを形成する。
    2. 最終コーティングの一貫性と有効性を向上させるためにディップコートを適用する前に、最初のスプレーコートを実行します。

7. 接着剤

注: 接着剤の形成は、以下の方法のいずれかによって達成される。

  1. 可溶化された rSSp を基板上に直接添加し、2番目の基板を溶液の上部に塗布します。ピースをしっかりとクランプし、最低温度25° c のオーブンでサンプルを少なくとも16時間乾燥させます。
  2. または、スプレーコーティングで2つの基板表面をスプレーし、基板を一緒にクランプします。
  3. 基材をコーティングするディップ法を通して rSSp を塗布し、基材を固着させることも、接着剤の調製に使用することができます。

8. ウェットスパンファイバー

  1. 19 G のグライド針を通して Luer ロックの先端が付いている同心のスポイトに可溶化されたドープの解決を荷を積む。気泡を取り出し、ドープを注射器の Luer ロックの端に座らせます。
  2. Peek チューブ、内径0.01 インチの少なくとも 25 mm を挿入1/16 インチ OD と10/32 コーンのための PEEK チューブの1ピースフィンガータイトなフィッティング。このフィッティングは、ルアー・ロックメス・アダプターに PEEK チューブに取り付けます。
    1. このセットをロードされたシリンジに取り付けて、19ゲージの針を交換してください。
  3. 凝固の浴室に使用する 99% の純粋な isopropanol が付いている高く、明確なガラス浴室を満たしなさい。
    1. ストレッチ godets の下に位置するストレッチバスを、記入してください。これらは、80:20 isopropanol を持っています: 最初のストレッチ浴の蒸留水、および 20:80 isopropanol: 第二のストレッチ浴の蒸留水。
  4. 凝固浴の後の最初のゴデットローラーと第1の伸張浴の最初のゴデットローラーが同じ速度で回転しているようなゴデットローラーストレッチシステムを設定します。
    1. ストレッチバス1、中央上部ゴデットローラー、およびストレッチバス2の最初のゴデットローラーで同じ速度に最終ゴデットローラーの速度を調整することによって、最初のストレッチを開始します。この速度は、初期の繊維除去速度の2倍の速さになります。
    2. ストレッチバス2、最後の上部ゴデットローラー、および巻取り機の最終ゴデットローラーの速度を同じ速度に調整することによって、第2の伸張を開始する。この速度は、最初のストレッチに使用される速度の2倍の速さ、または初期繊維除去速度の4倍になります。
    3. 中間 godets の外側にニトリル手袋を置き、繊維を滑らせないようにします。
  5. 徐々に凝固浴に溶液を押し出すために開始します。自動化されたシステムでは、10 mm/s の除去速度に一致するように押出率を設定します。
    1. 薄い金属製のフックまたは鉗子を使用して、繊維を浴中に引っ張る前に繊維の押し出しを均一にすることができます。浴中から繊維を除去することを確認します PEEK チューブの先端との間にループを作成し、バスをお風呂のままに繊維をパス。
  6. 繊維が伸張浴に沈められるが、伸張の浴室間の空気で乾燥し、スプールに行く前に godets のシリーズを通して取り出された繊維を導きなさい。この乾燥は、より高い配置の中間 godets によって達成される。
    注: 繊維除去率および/または押出速度は、凝固浴の底部に繊維をプールすることなく十分な凝固時間を可能にするために、タンパク質濃度、添加剤、およびタンパク質タイプに基づいて調整する必要があります。
  7. テープを使用して、完全に引き伸ばされたファイバーをワインダーメカニズムのスプールに取り付けます。

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Representative Results

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RSSp の可溶化の説明方法から、図 1に見られるような様々な材料形態が実現できる。また、可溶化の方法は、熱と圧力を加え、従来のマイクロ波により発生させ、rSSp や水の懸濁液にすることである。臨界温度および圧力が達成されるとき、蛋白質は可溶化。この可溶化 rSSp 溶液から、ヒドロゲル、lyogels、スポンジ、接着剤、コーティング、フィルム、および繊維の7つの材料形態のために必要な条件が提示されます。ヒドロゲルは、可溶化した rSSp を冷却し、自然に自己会合させることによって調製される。ヒドロゲルを lyophilizing することによって lyogel が調製される。スポンジ材料は、水に浸漬されながらヒドロゲルを凍結することによって形成される。フィルムは PDMS 表面 (および他の受け入れ可能な表面) 上に可溶化された rSSp を鋳造することによって調製することができ、乾燥させる。PDMS はフィルムがポストの処置または分析のために容易に取除くことを可能にする。コーティングおよび接着剤は、スプレーまたはディップの方法またはスプレーとディップの組み合わせを使用して生成されます。繊維は、凝固浴に押し出し、後スピンストレッチ浴で生繊維を直列に延伸することにより、最も広範な処理を必要とします。繊維は、単独で凝固浴に押し出して生成することができる。しかし、繊維の最高の機械的能力は、後のスピンストレッチ浴3789で延伸を必要とします。

Figure 1
図 1: 水性溶媒和および rSSp 材料。この可溶化方法を用いて製剤化された材料の代表的な写真は rSSp 溶媒和を用いて熱と圧力を水中に形成した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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組換えクモ糸タンパク質が精製された後、それらは、その後、材料形成のために使用することができる溶液中に調製しなければならない。凍結乾燥したクモ糸タンパク質を水と混合し、この混合物をマイクロ波照射に曝露することにより、熱および圧力を発生させ、rSSp 溶液を調製することができる。この簡単で効率的な rSSp の可溶化法から、多種多様な材料の形態を作り出すことができます。各材料は、所望の結果と特性を達成するために一意に調製し、処理する必要があります。初期の製剤、形成条件、および/または処理パラメータの軽微な変更により、各材料は、この方法を使用して容易に調整することができる。ここに提示されているよりも多くの形態があり、フィールドで他の人によるさらなる調査を通して、これらの材料は、この技術を使用して新しい材料形態を探求するために進化し続けます。

溶液が主に水とタンパク質から構成されている場合 (添加剤を使用してゲル化を遅らせ、溶液の安定性を改善することができる)、生物学的に活性な成分と機能化の可能性が大幅に改善されるHFIP ベースの rSSp ソリューションとの比較。様々な成分が含まれているが、網羅的なサンプリングではないが、dopes のように材料の形態を含んでいる: 抗生物質、抗真菌薬、ヘパリン、銀ナノ粒子、細胞接着のためのインテグリン。添加物に加えて、様々なサイズの複数の組換えクモ糸タンパク質、配列、性質、およびソースは、この方法によって首尾よく溶媒和され、このプロトコルに記載された材料の形成に用いられる。

この方法において溶媒和だけでなくすべてのタンパク質に対する可溶化のこの方法の有用性をさらに拡大すると、バイアルまたはチャンバの内部の温度および圧力が十分に高いことを rSSp に溶液が滅菌されることである。これらの溶液は、培養物を汚染することなく細胞培養物に直接摂取してもよい。

これらの材料をインビボシステムに直接取り込む場合は、エンドトキシンレベルに対処する必要があります。そのレベルがであるか、または以下であるように、エンドトキシンを破壊するトリプルオートクレーブ法、推奨 0.25 EU/mL が最近報告されています10.オートクレーブはエンドトキシンを破壊するのに有用であるが、その圧力および温度は、通常、日付6に試みたすべての rSSp サンプルを完全に溶媒和物するために必要な臨界温度または圧力に達することができない。これには、溶媒和を完了するために必要な加熱または温度/圧力原子炉が求められます。

固有の、熱および圧力を使用する材料のエンドトキシンおよび溶媒和の除去は、結果として得られる材料形態4567のタンパク質または機械的能力を劣化させない。圧力および/または温度の高すぎる取得と、機械的能力および/またはタンパク質の破壊をもたらす熱と圧力のサイクルが多すぎるの転換点がある可能性が高いことが理解されています。この転換点は、rSSp 溶媒和の種類と、ある程度、使用されている rSSp の長さによって異なる可能性があります。しかし、溶媒和のこの基本的な方法では、いくつかのスカウト溶媒和実験を行って、特定のタンパク質に必要とされる適切な溶媒和温度と圧力を線引きすることができます。

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Disclosures

著者は利害の対立を宣言していない。

Acknowledgments

著者たちは、ユタ州科学技術研究 (USTAR) イニシアティブからの資金援助を感謝したいと考えています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe with Luer-Lok Tip BD 309657 Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips
4 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225142 Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL
8 mL culture vial, clear with rubber lined cap Wheaton 225144 Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL
99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade Pharmco-Aaper 231000099
Freezone 4.5 Plus Labconco 7386030 Freeze Dryer
Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) IDEX P-629
Microwave Magic Chef HMD1110B 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table
One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD IDEX F-120X
PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID IDEX 1531B
Sprayer: Master Airbrush Master Airbrush TC-60

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References

  1. Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Biochemistry. 43, (42), 13604-13612 (2004).
  2. Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12, (7), 2488-2495 (2011).
  3. Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 , (4), 1418-1425 (2015).
  4. Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 , (8), 3158-3170 (2014).
  5. Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17, (11), 3761-3772 (2016).
  6. Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17, (11), 1955 (2016).
  7. Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1, (7), 557-584 (2015).
  8. Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35, (4), 1262-1266 (2002).
  9. Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96, (2), 170-189 (1977).
  10. Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8, (12166), 1-6 (2018).
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Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).More

Jones, J. A., Harris, T. I., Bell, B. E., Oliveira, P. F. Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure. J. Vis. Exp. (147), e59318, doi:10.3791/59318 (2019).

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