Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En automatisert metode for å utføre in vitro Mikronukleus analysen bruker multispectral Imaging Flow flowcytometri

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59324
Automatic Translation
1
1Biology Department, Luminex Corporation

Summary

The in vitro mikronukleus analysen er en veletablert metode for å evaluere gentoksisitet og cytotoksisitet men scoring analysen bruker manuell mikroskopi er arbeidskrevende og lider av subjektivitet og inter-scorer variasjon. Denne utredningen beskriver protokollen utviklet for å utføre en helautomatisk versjon av analysen ved hjelp av multispectral Imaging Flow flowcytometri.

Abstract

In vitro mikronukleus (MN)-analysen brukes ofte til å evaluere cytotoksisitet og gentoksisitet, men scoring analysen via manuell mikroskopi er arbeidskrevende og introduserer usikkerhet i resultatene på grunn av variasjon mellom scoret. For å bøte på dette, automatisert Slide-skanning mikroskopi samt konvensjonelle flyt flowcytometri metoder har blitt innført i et forsøk på å fjerne målscorer bias og forbedre gjennomstrømning. Men disse metodene har sine egne iboende begrensninger som manglende evne til å visualisere cytoplasma av cellen og mangelen på visuell MN verifisering eller bildedata lagring med Flow flowcytometri. Multispectral Imaging Flow flowcytometri (MIFC) har potensial til å overvinne disse begrensningene. MIFC kombinerer høyoppløselig fluorescerende bilder av mikroskopi med statistisk robusthet og hastighet av konvensjonelle strømnings flowcytometri. I tillegg kan alle innsamlede bilder lagres i dose spesifikke filer. Dette papiret beskriver protokollen utviklet for å utføre en helautomatisk versjon av MN-analysen på MIFC. Human lymphoblastoid TK6 celler ble forstørret ved hjelp av en hypotonisk løsning (75 mM KCl), fast med 4% formalin og kjernefysisk innhold ble beiset med Hoechst 33342. Alle prøvene ble kjørt i suspensjon på MIFC, tillater oppkjøp av høyoppløselige bilder av alle viktige hendelser som kreves for analysen (f. eks binucleated celler med og uten MN samt mononucleated og polynucleated celler). Bilder ble automatisk identifisert, kategorisert og nummerert i MIFC dataanalyse programvare, noe som åpner for automatisert scoring av både cytotoksisitet og gentoksisitet. Resultatene viser at bruk av MIFC å utføre in vitro MN-analysen tillater statistisk signifikant økning i MN frekvens som skal oppdages på flere ulike nivåer av cytotoksisitet sammenlignet med løsemiddel kontroller etter eksponering av TK6 celler til Mitomycin C og Kolkisin, og at ingen signifikant økning i MN frekvens observeres etter eksponering for mannitol.

Introduction

The in vitro mikronukleus (MN) analysen er en vanlig brukt test for å vurdere cytotoksisitet og gentoksisitet som en screening verktøy i flere felt av studien som kjemisk og farmasøytisk utvikling samt menneskelig biomonitorering blant individer utsatt for ulike miljø-, yrkes-eller livsstilsfaktorer1,2,3. MN består av kromosom fragmenter eller hele kromosomer generert under celledeling som ikke er innlemmet i en av de to viktigste datter kjerner. Etter telophase, dette kromosom materialet danner en individuell, avrundet kropp inne i cytoplasma som er atskilt fra en av de viktigste kjerner2. Derfor MN er representative for DNA skade og har vært brukt i mange år som et endepunkt i gentoksisitet testing4. Den mest hensiktsmessige metoden for å måle MN er cytokinesi-Block mikronukleus (CBMN) analysen. Ved hjelp av CBMN-analysen kan hyppigheten av MN i binucleated celler (BNCs) scores ved å innlemme Cytochalasin B (Cyt-B) i prøven. Cyt-B tillater kjernefysiske divisjon, men hindrer mobilnettet divisjon og dermed begrenser scoring av MN til BNCs som har delt bare én gang5.

Protokoller som bruker både mikroskopi og Flow flowcytometri er utviklet og validert og brukes rutinemessig til å utføre in vitro MN-analysen6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Mikroskopi fordeler fra å kunne visuelt bekrefte at MN er legitime, men er tidkrevende og utsatt for variasjon mellom scoret15. For å løse dette, ble automatiserte mikroskopi metoder utviklet for å skanne lysbilder og ta bilder av kjerner og MN16,17,18,19, men cytoplasma kan ikke bli visualisere, noe som gjør det vanskelig å avgjøre om en MN faktisk er knyttet til en bestemt celle. Videre disse metodene har vanskeligheter med å identifisere polynucleated (POLY) celler (inkludert Tri-og quadranucleated celler) som er nødvendig for beregning av cytotoksisitet når du bruker Cyt-B9. Flow flowcytometri metoder utviklet for å utføre MN analysen ansette fluorescens så vel som fremover og side scatter intensitet for å identifisere bestander av både kjerner og MN som har blitt frigjort fra cellen etter lyse20,21 ,22. Dette gjør at data kan anskaffes fra flere tusen celler i løpet av få minutter og tillater automatisert analyse23; men manglende evne til å visualisere cellene gjør det umulig å bekrefte at scoret hendelser er ekte. I tillegg lysering cellemembranen hemmer bruken av Cyt-B i tillegg til å skape en suspensjon som inneholder andre rusk som kromosom aggregater eller apoptotisk organer og det er ingen måte å skille disse fra MN24.

I lys av disse begrensningene, er multispectral Imaging Flow flowcytometri (MIFC) et ideelt system for å utføre MN analysen siden den kombinerer høyoppløselig fluorescerende bilder av mikroskopi med statistisk robusthet og hastighet konvensjonelle flyt flowcytometri. I MIFC blir alle celler introdusert i et fluider system og blir deretter hydrodynamically fokusert inn i midten av en strømningscelle Cuvette. Ortogonale belysning av alle celler oppnås gjennom bruk av en brightfield (BF) Light-Emitting Diode (LED), en side scatter laser og (minst) en fluorescerende laser. Fluorescerende fotoner er fanget av en av tre (20x, 40x eller 60x) høy numerisk blenderåpning objektiv linser og deretter passere gjennom en Spectral ned brytings element. Fotoner er så fokusere onto en avgift-koplet apparat (CCD) kameraet å få høy resolution profilen av alle celler det admission card igjennom det flyte cellen. Å unngå sløret eller striper, det CCD fungerer inne tid forsinkelsen integrasjon (TDI) måte hvilke spor emner av overfører pixel innhold fra rad å rad ned det CCD inne Synchrony med det hastighet av cellen inne flyte. Pikselinformasjon samles deretter inn fra den siste raden med bildepunkter. TDI-avbildning kombinert med Spectral nedbryting tillater opptil 12 bilder (2 BF, 10 fluorescerende) som skal fanges samtidig fra alle celler som passerer gjennom strømningscellen. Alle innspilte bilder lagres i prøve spesifikke datafiler, slik at analyser kan utføres når som helst ved hjelp av MIFC dataanalyse programvare. Til slutt, datafiler beholde koblingen mellom cellulære bilder og prikker på alle bivariate tomter. Dette betyr at enhver prikk på en tradisjonell bivariate tomten kan utheves og tilhørende BF og fluorescerende bilder vil bli vist25.

Nylig, MIFC-baserte metoder har blitt utviklet for å utføre MN analysen for både sortering stråling biodosimetry26,27,28,29,30,31 og genetisk toksikologiske32,33 testing. Dette arbeidet har vist at cellulære bilder av hoved kjerner, MN og cytoplasma kan bli avbildet med høyere gjennomstrømning enn andre metoder26. Alle celletyper som kreves for analyse, inkludert MONO celler, BNCs (med og uten MN), og POLY celler, kan automatisk identifiseres i MIFC dataanalyse programvare, og gjennomføringen av scoring kriterier utviklet av Fenech et al. oppnås gjennom Bruk av ulike matematiske algoritmer6,34. Resultater fra biodosimetry viste at kalibrerings kurvene for doserings responsen var like i størrelsesorden som de som ble innhentet fra andre automatiserte metoder i litteraturen da kvantifisere rate av MN per BNC29. I tillegg nyere arbeid i toksikologiske demonstrert at bilder av MONO-celler, BNCs (med og uten MN) og POLY celler kan automatisk fanget, identifisert, klassifisert og nummerert ved hjelp av MIFC. Protokollen og dataanalyse aktivert beregning av cytotoksisitet og gentoksisitet etter utsette TK6 celler til flere clastogens og aneugens32.

Protokollen som presenteres i dette dokumentet beskriver en metode for å utføre in vitro MN-analysen ved hjelp av MIFC. Prøven behandling teknikken som brukes i dette arbeidet krever mindre enn 2 t til å behandle en enkelt prøve og er relativt lett å utføre i forhold til andre metoder. Dataanalysen i MIFC analyseprogramvare er komplisert, men opprettelsen av analysen malen kan gjennomføres i et par timer etter trinnene skissert i denne utredningen. Videre, når malen er opprettet, kan den automatisk brukes på alle innsamlede data uten videre arbeid. Protokollen skisserer alle trinnene som kreves for å utsette TK6 celler til clastogens og aneugens, beskriver hvordan du kan kultur, prosess og beis cellene, og demonstrerer hvordan du anskaffer bilder med høy oppløsning ved hjelp av MIFC. Videre, denne papir illustrerer det aktuelle best praksis for analyserer data inne MIFC programvare å automatisk identifisere og snes MONO celler, BNCs, og POLY celler i den hensikt å beregnende begge to cytotoksisitet og gentoksisitet.

Protocol

1. utarbeidelse av kultur medium og dyrking av TK6 celler

Merk: noen kjemikalier som brukes i denne protokollen er giftige. Inhalering, svelging eller kontakt med huden med Cytochalasin B kan være dødelig. Bruk egnet personlig verneutstyr, inkludert en Laboratoriefrakk og to par nitril hansker. Vask hendene grundig etter håndtering. Formalin/formaldehyd er giftig ved innånding eller svelging; irriterer øynene, åndedrettssystemet og huden; og kan forårsake allergi ved innånding eller hudkontakt. Det er fare for alvorlige skader på øynene. Det er et potensielt kreftfremkallende stoff.

  1. Forbered 565 mL av 1x RPMI kultur medium. Tilsett 5 mL av MEM ikke-essensielle aminosyrer (100 x), 5 mL natrium pyruvat (100 mM), 5 mL penicillin-Streptomycin-glutamin (100 x), og 50 mL av Foster storfe serum (FBS) til en 500 mL flaske 1x RPMI 1640 medium. Forbered mediet i et biosafety skap og oppbevares ved 2-8 ° c. Varm opp mediet til 37 ° c før du legger det til TK6-cellene (se tabell over materialer).
  2. Tin 1 mL TK6 celler (lagret ved-80 ° c i DMSO) i 10 mL medium. Sentrifuger cellene ved 200 x g i 8 min og aspirer supernatanten. Overfør cellene til 50 av medier og ruge ved 37 ° c, 5% CO2. Dobling tiden av TK6 celler varierer fra ~ 12-18 h og noen (3 eller 4) passasjer vil være nødvendig for cellene å nå sin maksimale sprednings hastighet (se tabell over materialer).
  3. Kultur 100 mL celler til en konsentrasjon på ~ 7-8 x 105 celler/ml.

2. utarbeidelse av clastogens og/eller aneugens og Cytochalasin B

  1. Forbered egnede lager konsentrasjoner av ønsket clastogens og aneugens. For Mitomycin C oppløses for eksempel en full 2 mg flaske i 10 mL sterilt vann for å oppnå en endelig lager konsentrasjon på 200 mikrogram/mL. Mitomycin C kan oppbevares ved 4 ° c i tre måneder (se tabell over materialer).
  2. På eksperiment dagen, forberede fortynninger av de ønskede kjemikalier som er enten 10-fold eller 100-fold høyere enn de ønskede eksponerings konsentrasjonene hvis fortynning i sterilt vann eller DMSO, henholdsvis.
  3. For Mitomycin C klargjør du 3 mL fortynninger i sterilt vann på 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 og 5,0 μg/mL. For Kolkisin klargjør du 3 mL fortynninger i sterilt vann på 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 og 0,5 μg/mL. Til slutt, for mannitol, klargjør du 3 mL fortynninger i sterilt vann på 5, 10, 20, 30, 40 og 50 mg/mL.
  4. Klargjør en 200 μg/mL lager konsentrasjon av Cytochalasin B ved å oppløse en 5 mg flaske i 25 mL DMSO. Cytochalasin B kan oppbevares ved-20 ° c i flere måneder.

3. eksponering av celler til clastogens og/eller aneugens

  1. Tilsett 1 mL ønsket kjemikalie (f.eks. Mitomycin C) til 9 mL celler ved ~ 7-8x105 celler/ml i en T25 kolbe. Tilsett 1 mL sterilt vann for kontroll prøvene. Plasser flaskene i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator for 3 t.
    Merk: Hvis kjemikaliene fortynnes i DMSO, tilsett bare 100 μL av den kjemiske til hver kolbe og tilsett 100 μL av DMSO til kontroller. Hver kolbe skal inneholde 9,900 mL celler.
  2. Etter 3 timer, Fjern flasker fra inkubator og Overfør celler til 15 mL polypropylen rør. Sentrifuger på 200 x g i 8 min, aspirer supernatanten og Overfør celler til nye T25 flasker som inneholder totalt 10 ml fersk kultur medium. Tilsett 150 μL av lager konsentrasjonen (200 μg/mL) av Cytochalasin B til hver kolbe for å oppnå en endelig konsentrasjon på 3 μg/mL.
  3. Returner flaskene til 37 ° c, 5% CO2 inkubator for en Gjenopprettingstid lik 1.5-2,0 dobling ganger, som anbefalt av OECD-retningslinjene9. For TK6 cellene som brukes i dette arbeidet, gjenopprettingstiden var 24 h.
    Merk: dobling tiden av TK6 cellene som brukes her var 15 timer og en utvinning tid på 24 h (1,6 dobling ganger) ble brukt. Recovery ganger mindre enn 1,5 dobling ganger vil redusere spredning i prøver eksponert for høyere doser påvirker antall BNCs. omvendt, utvinning ganger på mer enn 2,0 vil produsere et uforholdsmessig stort antall polynucleated celler i kontroll prøver, forvrenger cytotoksisitet beregninger.

4. utarbeidelse av buffere for fiksering og merking av DNA-innhold (se tabell over materialer)

  1. Forbered 75 mM kalium klorid (KCl) ved å tilsette 2,79 g til 500 mL ultrarent vann. Rør oppløsningen i 5 min ved hjelp av en magnetisk stirrer og sterilt filter gjennom et 200 μm filter. 75 mM KCl-løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i flere måneder.
  2. Forbered en tilstrekkelig mengde 4% formalin for eksperimentet, i påvente av at totalt 2,1 mL må legges til hver prøve. Hvis du for eksempel vil klargjøre 10 mL 4% formalin, legger du til 4 mL på 10% formalin til 6 mL 1x Dulbecco fosfat-bufret saltoppløsning uten ca2 + eller mg2 + (PBS). Denne 4% formalin kan oppbevares ved romtemperatur i flere uker.
  3. Klargjør 510 mL vaskebuffer (2% FBS i 1X PBS) ved å legge 10 mL FBS til en 500 mL flaske 1x PBS.
  4. Forbered 10 mL av en 100 mikrogram/mL konsentrasjon av Hoechst 33342 ved å tilsette 100 μL av lager konsentrasjonen (1 mg/mL) til 9 900 μL av 1X PBS. Hoechst 33342-løsningen kan oppbevares ved 4 ° c i flere måneder.

5. prøve behandling: hypotonisk hevelse, fiksering, celle telling og merking av DNA-innhold

  1. På slutten av utvinningen perioden, fjerne alle flasker fra inkubator og overføre alle prøvene til 15 mL polypropylen rør. Sentrifuger alle prøvene på 200 x g i 8 min.
  2. Aspirer supernatanten, resuspend cellene og tilsett 5 mL 75 mM KCl. Bland forsiktig ved å vende tre ganger og ruge ved 4 ° c i 7 min.
  3. Tilsett 2 mL 4% formalin til hver prøve, bland forsiktig ved inversjon tre ganger og ruge ved 4 ° c i 10 min. Dette trinnet fungerer som en "myk fiksering".
  4. Sentrifuger alle prøvene ved 200 x g i 8 min. aspirer supernatanten og resuspend i 100 μL av 4% formalin i 20 min. Dette trinnet fungerer som en "hard fiksering".
  5. Tilsett 5 mL vaskebuffer og sentrifuger ved 200 x g i 8 min. aspirer supernatanten og resuspend i 100 μL vaskebuffer.
  6. Overfør alle prøvene til 1,5 mL mikrosentrifugen rør.
  7. Utfør en celle telling på hver prøve for å bestemme antall celler per utvalg. Prøvene vil være svært konsentrert, så en 1:100 fortynning i 1x PBS (10 μL av prøve i 990 μL av PBS) vil sannsynligvis være nødvendig for å oppnå en nøyaktig telling.
    Merk: på dette punktet er det best å utføre celle tellinger ved hjelp av en hemocytometer. Legge KCl gir cytoplasma et gjennomskinnelig utseende, noe som gjør det vanskelig for automatiserte celle tellere å gjenkjenne dem. Automatiserte tellere har også problemer med å skåre polynucleated celler på grunn av størrelsen.
  8. Hvis du ikke kjører prøvene på MIFC umiddelbart, kan de oppbevares ved 4 ° c i flere dager. Når du er klar til å kjøre prøver, tilsett 5 μL av 100 μg/mL per 1x106 celler/ml til hver prøve. Tilsett også 10 μL av 500 μg/mL RNase per 100 μL prøve for en endelig konsentrasjon på 50 μg/mL. Ruge prøvene ved 37 ° c, 5% CO2 for 30 min.
  9. Mikro-sentrifuger alle prøvene på 200 x g for 8 min og bruke en pipette for å fjerne supernatanten forlate ~ 30 μL. Bruk en pipette for å resuspend alle prøvene før du kjører på MIFC, slik at det ikke er bobler i slangen. Ikke Vortex.

6. starte og kalibrere MIFC

  1. Kontroller at skjede, system kalibrerings reagens, debubbler, rengjøringsmiddel og steriliseringsapparat beholdere er fulle og at avfallstanken er tom. Strøm opp systemet og dobbeltklikk på MIFC programvareikonet. Falle i staver det oppstart knapp og sikre det starten alle kalibreringer og prøver sjekkheftet er avkrysset. Dette vil spyle systemet, laste skjede og system kalibrering reagenser, og kalibrere systemet (se tabell over materialer).

7. kjøre prøver på MIFC

Merk: denne delen forutsetter bruk av et 2-kamera MIFC. Hvis du bruker et 1-kamera MIFC, kan du se supplement 1-full Protocol, § 7 for etablering av tomter under oppkjøpet

  1. Start MIFC programvare for datainnhenting (se tabell over materialer). Figur 1 viser instrumentets innstillinger. Slå på 405 NM laser og sette laseren strøm til 10 mW (A). Deaktiver alle andre lasere (inkludert SSC) og sett BF til kanal 1 og 9 (B). Bekreft at forstørrelses glidebryteren er satt til 60x (C), høy følsomhet er valgt (D), og at bare kanaler 1, 7 og 9 vises i bildegalleriet.
  2. Klikk på Scatterplot -ikonet. Velg alle populasjonen og velg areal M01 på X-aksen og størrelsesforholdet M01 på Y-aksen. Klikk på ikonet for kvadrat region , og tegn et område rundt enkeltcellene. Navngi denne regionen enkeltceller. Høyreklikk på plottet og velg regioner. Uthev enkelt cellens region og endre x-koordinatene til 100 og 900, og endre y-koordinatene til 0,75 og 1 (figur 1I).
  3. Klikk på Scatterplot -ikonet. Velg enkeltceller som den overordnede populasjonen, velg gradient RMS M01 på X-AKSEN, og gradient RMS M07 på Y-aksen. Klikk på ikonet for kvadrat region , og tegn et område rundt de fleste cellene. Navn denne regionen fokuserte celler. Høyreklikk på plottet og velg regioner. Uthev området for fokuserte celler og endre x-koordinatene til 55 og 75, og endre y-koordinatene til 9,5 og 20 (figur 1J).
  4. Klikk på histogram ikonet. Velg den fokuserte celler populasjonen og velg intensitet M07 som funksjonen. Klikk på ikonet for lineær region , og tegn et område på tvers av hoved toppen i histogrammet. Navngi denne regionen DNA-positive. Høyreklikk på plottet og velg regioner. Uthev den DNA-positive regionen og endre koordinatene til 2 x 105 og 2 x 106. Området må kanskje justeres avhengig av intensiteten på histogrammet (figur 1K).
  5. Angi anskaffelses parametrene (figur 1E). Angi filnavnet og målmappen, endre antall hendelser til 20 000 og velg den DNA-positive populasjonen.
  6. Klikk på Load (figur 1F) og plasser kontroll prøven i MIFC. Klikk på Hent -knappen for å samle inn dataene (figur 1G). Når anskaffelsen er fullført, klikker du på Return -knappen for å returnere prøven (figur 1H). Fjern prøve røret fra instrumentet. Gjenta denne prosessen for alle gjenværende prøver i eksperimentet.

8. åpne en datafil i IDEAS

  1. Start MIFC analyseprogramvare pakke (se tabell over materialer). Klikk på Start-analyse for å starte vei viseren for åpning av fil. Velg en datafil ved å bla til ønsket RAW image fil (. Rif). Klikk på Åpne -knappen og klikk på neste.
  2. Siden dette er en enkelt Fargeanalysen, er kompensasjon ikke nødvendig, så klikk neste for å omgå kompensasjons trinnet. På dette stadiet er det ingen analyse mal å bruke, så klikk neste igjen. Hvis analyse malen er lastet ned fra Tilleggsmaterialet, velger du den nå. Disse malene fungerer bare med en 2 kamera MIFC med BF satt til kanaler 1 og 9 og kjernefysiske bilder i kanal 7 under oppkjøpet.
  3. Som standard blir. CIF-og. DAF-filnavnene generert automatisk for å samsvare med. Rif. Det anbefales ikke å endre navn på. CIF og. DAF. Klikk neste. Angi egenskaper for bildevisning ved å velge 01 og 07. Klikk neste. Det finnes ingen Veiviser for dette programmet, så klikk Fullfør. Det er svært viktig å lagre dataanalyse filen (. DAF) og analyse malen (. ast) ofte i avsnittene 9 – 14 for å unngå tap av fremdrift.

9. lage masker og funksjoner for å identifisere BNCs

  1. Klikk på ikonet for Egenskaper for bildegalleri (blått/hvitt-ikon). I kategorien Egenskaper for skjerm klikker du angi område til piksel data , og deretter endrer du fargen til gul. Klikk på OK. Hoechst bilder er nå lettere å se mot den svarte bakgrunnen.
  2. Opprett det ikke-apoptotisk celle plottet.
    1. Klikk på analyse -fanen, og klikk deretter masker. Klikk ny og klikk deretter funksjon. Under funksjon Velg terskel, under maske Velg M07 og angi intensitet prosent til 50. Falle i staver OK så OK atter. Klikk Lukk.
    2. Klikk på fanen analyse , klikk på funksjoner, og klikk deretter på ny. For funksjons type Velg området. For maske Velg terskelen (M07, Ch07, 50). Klikk på angi standardnavn , og klikk på OK. Klikk Lukk for å begynne å beregne funksjons verdiene.
    3. Klikk på dot plot -ikonet. Velg alle populasjonen. For X-Axis-funksjonen velger du Contrast_M01_Ch01 -funksjonen og for Y-akse-funksjonen velger du Area_Threshold (M07, Ch07, 50). Klikk på OK.
    4. Klikk knappen for firkant område , og tegn et område rundt de fleste cellene. Ring denne regionen ikke-apoptotisk. Høyreklikk på plottet og klikk regioner. Uthev den ikke-apoptotisk regionen. Angi x-koordinatene til 0 og 15, og angi y-koordinatene til 50 og 300. Klikk Lukk.
  3. Opprett BNC-masken (trinn 9.3.1-9.3.5) for å identifisere celler som bare inneholder to kjerner.
    1. Bla etter en BNC i bildegalleriet og klikk på den. Dette er for å visualisere opprettelsen av masken i Hoechst-kanalen.
    2. Klikk på analyse -fanen, og klikk deretter masker. Klikk ny og klikk deretter funksjon. Under funksjon Velg LevelSet, under maske Velg M07, Velg den midterste nivå maske radioknappen, og angi kontur detalj skala til 3,00. Falle i staver OK så OK atter.
    3. Klikk ny og klikk deretter funksjon. Under funksjonvelger du dilate, og under maske Velg LevelSet (M07, Ch07, Middle, 3). Still inn bildet som skal vises til Ch07, og angi antall piksler til 2. Falle i staver OK så OK atter.
    4. Klikk ny og klikk deretter funksjon. Under funksjon Velg vannskille, og under maske velge dilate (LevelSet (M07, Ch07, Middle, 3) 2). Angi at bildet skal vises til Ch07, og angi linjetykkelsen til 1. Falle i staver OK så OK atter.
    5. Klikk ny og klikk deretter funksjon. Under funksjon Velg område, under maske Velg vannskille (dilate (LevelSet (M07, Ch07, Middle, 3) 2)). Still inn bildet som skal vises til Ch07. Angi henholdsvis minimums-og maksimumsverdier for 115 og 5000. Sett verdiene for minimum og maksimum størrelsesforhold til henholdsvis 0,4 og 1. Klikk på OK. I navn -feltet endrer du teksten du vil lese BNC , og deretter klikker du OK.
  4. Lag funksjoner og tomter for å få den endelige BNC-populasjonen
    1. Spot Count BNC-funksjon: Klikk på analyse -fanen, deretter funksjonerog deretter ny. For funksjonstypen Velg spot antall. For maskevelger du den endelige BNC-masken som er opprettet i 9.3.5. Sett tilknytning til fire og endre navnet til spot Count BNC. Klikk OK og deretter Lukk for å beregne funksjons verdiene.
    2. Spot Count BNC histogram. Klikk histogram ikonet. Velg ikke-apoptotisk som overordnet populasjon. For X-Axis-funksjonen velger du spot Count BNC -funksjonen. Klikk på OK. Klikk på ikonet for lineær region. Tegn et område på tvers av bin 2. Ring denne regionen 2n.
      Merk: se avsnitt 9 i tillegg 1-full protokoll for å opprette de resterende maskene, funksjonene og plott for å identifisere den endelige BNC-populasjonen

10. opprette masker og funksjoner for å identifisere MN i BNC-populasjonen

  1. Opprett MN-masken. Bla gjennom etter en BNC som inneholder en MN i bildegalleriet, og klikk på den. Dette er for å visualisere opprettelsen av MN-masken i Hoechst-kanalen. Klikk på analyse -fanen, og klikk deretter masker.
    1. Opprett spot identifikasjons maske 1:
      1. Klikk ny og klikk deretter funksjon. Under funksjon Velg spot og sørg for at den lyse alternativknappen er valgt. Under maske Velg M07setter du spot til cellebakgrunn ratio til 2,00. Angi minimum radius til 2 og maksimal RADIUS til 6. Falle i staver OK så OK atter.
      2. Klikk ny og klikk deretter funksjon. Under funksjon Velg rekkevidde, og under maske Velg LevelSet (M07, Ch07, Middle, 3). Still inn bildet som skal vises til Ch07. Angi henholdsvis minimum-og maksimums område til 80 og 5000. Angi henholdsvis minimum og maksimum størrelsesforhold til 0 og 1. Falle i staver OK så OK atter.
      3. Klikk ny og klikk deretter funksjon. Under funksjon Velg dilate, under Mask Velg Range (LevelSet (M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1). Still inn bildet som skal vises til Ch07. Angi antall piksler til 2. Falle i staver OK så OK atter.
      4. Klikk ny. Dobbel falle i staver på flekk (M07, Ch07, lys, 2, 6, 2) maske å sammenlegge den å masken definisjon. Klikk operatoren and og deretter operatoren not . Dobbeltklikk på dilate (Range (LevelSet (M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2) maske for å legge det til maske definisjonen. Klikk på OK.
      5. Klikk ny, og deretter funksjon. Under funksjon velger du område og under maske velger du masken som er opprettet i 10.1.1.4:
        1. Velg spot (M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) og ikke dilate (Range (LevelSet (M07, Ch07, midten, 3), 80-5000, 0-1), 2).
        2. Still inn bildet som skal vises til Ch07. Angi henholdsvis minimum-og maksimums område til 10 og 80. Angi henholdsvis minimum og maksimum størrelsesforhold til 0,4 og 1. Falle i staver OK så OK atter. Maske 1 for spot identifikasjon er fullført.
          Merk: se avsnitt 10 i tillegg 1-full protokoll for å opprette masker, funksjoner og plott for å identifisere den endelige MN-populasjonen

11. lagmasker, funksjoner og tomter for å identifisere Mononucleated og Polynucleated populasjoner

  1. Opprett POLY masken. Klikk på analyse, deretter masker, deretter ny deretter funksjon. Under funksjon Velg område, under maske Velg vannskille (dilate (LevelSet (M07, Ch07, Middle, 3), 2)). Still inn bildet som skal vises til Ch07. Angi henholdsvis minimums -og maksimumsverdier for området til 135 og 5000. Angi henholdsvis minimums -og maksimumsverdier for størrelsesforhold til 0,4 og 1. Klikk på OK. I navn -feltet, endre teksten til å lese Poly klikk deretter OK så Lukk. Celle masken Polynucleated er fullført.
  2. Opprette POLY komponent masker.
    1. POLY komponent maske 1: Klikk på analyse fanen, deretter masker, deretter ny, og funksjon. Under funksjon Velg komponent, og under maske Velg Poly Mask. For ranking funksjon Velg område, og for sorteringsrekkefølge Klikk på synkende alternativknapp. Sett rang til 1. Falle i staver OK så OK atter.
    2. POLY komponent masker 2, 3 og 4: gjenta alle trinnene i 11.2.1 bortsett fra sett rang til 2, 3 og 4 for å opprette de enkelte komponent maskene.
  3. Spot Count bruker POLY maske.
    1. Klikk på analyse -fanen, deretter funksjonerog deretter på ny. Velg spot antallfor funksjons type. For Mask Velg Poly masken og sett Connected på 4. Falle i staver sette retten navnet og falle i staver OK så slutte å Beregn det ansiktstrekk verdier.
    2. Klikk på histogram ikonet. Velg den ikke-apoptotisk populasjonen. For X-Axis-funksjonen velger du spot Count_POLY_4 -funksjonen.
    3. MONO spot Count regionen. Klikk på ikonet for lineær region. Tegn et område på tvers av hylle 1 i histogrammet som er opprettet i 11.3.2. Ring denne regionen 1N.
    4. TRI spot Count regionen. Klikk på ikonet for lineær region. Tegn et område på tvers av bin 3 i histogrammet som er opprettet i 11.3.2. Ring denne regionen 3N.
    5. KVADRANT MONO flekk greven område. Klikk på ikonet for lineær region. Tegn et område på tvers av bin 4 i histogrammet som er opprettet i 11.3.2. Ring denne regionen 4n.
  4. Identifiser MONO-populasjonen.
    1. Opprett MONO størrelsesforhold funksjonen. Klikk på analyse -fanen, deretter funksjonerog deretter på ny. Under funksjons typevelger du størrelsesforhold funksjonen og under maske Velg komponent (1, areal, Poly, synkende). Klikk på angi standardnavn , og klikk deretter på OK.
    2. Opprett MONO sirkularitet-funksjonen. Velg nymens vinduet funksjonsbehandling fremdeles er åpent. Under funksjons typevelger du sirkularitet -funksjonen og under maske Velg komponent (1, areal, Poly, synkende). Klikk på angi standardnavn , og klikk deretter på OK og deretter på Lukk for å beregne funksjons verdiene.
    3. For den sirkulære MONO-celler prikk plottet, klikker du prikk plot -ikonet. Velg 1N som overordnet populasjon. For X-aksen funksjonen velger Circularity_Component (1, areal, Poly, synkende) og for Y-aksen funksjonen velger ASPEKT Ratio_Component (1, areal, Poly, synkende). Klikk på OK. Klikk knappen for firkant område , og tegn et område rundt celle populasjonen mot øvre høyre del av plottet. Navngi denne regionen Circular_1N. Høyreklikk på plottet og klikk regioner. Uthev Circular_1N -regionen. Endre X-koordinatene til 20 og 55, og endre Y-koordinatene til 0,85 og 1,0. Klikk Lukk.
    4. Opprett området POLY/Area_M07 funksjonen. Klikk på analyse -fanen, deretter funksjonerog deretter på ny. Under funksjons type, velg området funksjon og under maske velger komponent (1, areal, Poly, synkende). Klikk på angi standardnavn , og klikk deretter på OK.
    5. Med Feature Manager-vinduet fremdeles åpent, klikker du ny deretter under funksjons type Klikk den kombinerte alternativknappen. Fra listen over funksjoner uthever du Area_Component (1, areal, Poly, synkende) og klikker på pil ned for å legge det til i funksjonsdefinisjonen. Klikk divisjonssymbolet (/). Velg Area_M07-funksjonen, og klikk pil ned for å legge den til i funksjonsdefinisjonen. Klikk på angi standardnavn , og klikk på OK. Klikk Lukk for å begynne å beregne funksjons verdiene.
    6. For det endelige punkttegnet for MONO-populasjonen klikker du prikk plott -ikonet. Velg Circular_1N som overordnet populasjon. For X-akse-funksjonen velger du aspekt Ratio_M07 og for Y-akse-funksjonen velger Area_Component (1, areal, Poly, synkende)/Area_M07. Klikk på OK. Klikk knappen for firkant område , og tegn et område rundt de fleste cellene. Navngi denne regionen Mononucleated. Høyreklikk på plottet og klikk regioner. Uthev Mononucleated -regionen. Endre X-koordinatene til 0,85 og 1,0, og endre Y-koordinatene til 0,55 og 1,0. Klikk Lukk.
      Merk: se avsnitt 11 i tillegg 1-full protokoll for å lage masker, funksjoner og tomter for å identifisere de endelige trinucleated og polynucleated populasjoner.

12. Opprett en egendefinert visning for å undersøke BNC-og MN-maskene

  1. Klikk på bildegalleri egenskaper knappen klikk deretter på utsikt tab. Klikk på kompositter kategorien og klikk deretter ny. Under navn type Ch01/Ch07. Klikk Legg til bilde. Under bilde velger du Ch01 og angir prosenten til 100. Klikk på Legg til bilde igjen, under bilde Velg Ch07 og angi prosenten til 100.
  2. Klikk ny og under navn type BNC og MN masker
  3. Klikk Legg til kolonne. Under bilde type velger du Ch01 og under maske velger du ingen
  4. Klikk Legg til kolonne. Under bilde type velger du Ch07 og under maske velger du ingen
  5. Klikk Legg til kolonne. Velg Ch07 under bilde type og under maske Velg BNC
  6. Klikk Legg til kolonne. Under bilde type Velg Ch07 og under maske Velg MN maske
  7. Klikk Legg til kolonne. Klikk den sammensatte alternativknappen under bilde type . Det Ch01/Ch07 sammensatt image burde være automatisk addert å det utsikt. Klikk OK for å lukke vinduet Egenskaper for bildegalleri.

13. Lag en egendefinert visning for å undersøke POLY masken

  1. Se avsnitt 13 i tillegg 1-full protokoll for å opprette en egendefinert visning for å undersøke POLY-masken

14. Opprett en statistikktabell for å liste opp viktige hendelser

  1. Klikk på rapporter kategorien og klikk deretter Definer statistikk rapport. Klikk Legg til kolonneri det nye vinduet.
  2. Tilføy statistikken for BNC-telling. Under statistikk velger du antall og under valgt populasjon velger du den BNCs populasjonen. Klikk Legg til statistikk for å legge til statistikken i listen.
  3. Gjenta trinn 14,2 for å opprette separate kolonner for MN BNCs, mono, Tri og Poly populasjoner. Klikk Lukk , og klikk deretter OK.
  4. Dataanalyse malen er fullført (figur 2). Lagre malen (fil, lagre som mal). Hele maske listen finner du i tillegg 2-maske liste.

15. batch prosess eksperiment filer ved hjelp av dataanalyse malen

  1. Under verktøy -menyen klikker du batch data filer klikk deretter Legg batch i det nye vinduet.
  2. I det nye vinduet klikker du Legg til filer for å velge eksperiment filene (. Rif) som skal legges til i bunken. Under alternativet Velg en mal eller dataanalyse fil (. ast,. DAF) klikker du ikonet for åpen mappe for å bla til og åpne dataanalyse malen (ast-fil) som ble lagret i trinn 14,4.
  3. Klikk på knappen Forhåndsvis statistikk rapport for å forhåndsvise statistikktabellen. Ingen verdier vises her siden de ennå ikke er beregnet. Dette trinnet fungerer imidlertid som en kontroll for å sikre riktig analyse malen er valgt før du kjører den satsvise jobben.
  4. Klikk OK for å lukke gjeldende vindu. Klikk deretter Send bunker for å starte satsvis behandling av alle filer.
  5. Når den satsvise behandlingen er fullført, vil en. txt-fil være tilgjengelig i mappen som inneholder alle. Rif filer. Bruk denne statistikken til å beregne gentoksisitet og cytotoksisitet.

16. beregning av gentoksisitet og cytotoksisitet parametre

  1. Beregner gentoksisitet: Hvis du vil beregne gentoksisitet, bruker du statistikktabellen som ble opprettet i 15,5. Del antall celler i MN BNCs-populasjonen med antall celler i BNCs-populasjonen, og Multipliser deretter med 100:
    Equation 1
  2. Beregning av cytotoksisitet: Bestem totalt antall POLY celler ved å summere antall TRI-og QUAD-celler.
    1. Beregn Cytokinesi-Block spredning index (CBPI) ved hjelp av antall celler i MONO, BNCs og POLY som følger:
      Equation 2
    2. Til slutt beregner du cytotoksisitet for hver kultur ved å bruke CBPI-verdiene fra kontroll kulturene (C) og kjemisk eksponert kultur (T) på følgende måte:
      Equation 3

Representative Results

Analysemetoden skissert i dette papiret gjør det mulig for automatisk identifisering og scoring av BNCs, med og uten MN, å beregne gentoksisitet. I tillegg er MONO-og POLY-celler også automatisk identifisert og scoret for å beregne cytotoksisitet. Publiserte poengkriterier6,34 som må overholdes når du skårer disse hendelsene, implementeres i MIFC dataanalyse programvare. Resultatene som presenteres her tyder på at statistisk signifikant økning i MN frekvens med økende cytotoksisitet kan oppdages følgende eksponering av menneskelig lymphoblastoid TK6 celler til velkjente MN inducing kjemikalier (Mitomycin C og Kolkisin). Lignende resultater for ytterligere kjemikalier testet har blitt demonstrert i en egen publikasjon32. Dessuten, resultater fra bruken av mannitol viser det ingen-MN inducing kjemikaliene kanne likeledes være korrekt kjennemerke benytter det MIFC metoden skissert her over. Parametrene beskrevet i protokollen for å opprette alle masker, funksjoner og region grenser vil trolig måtte justeres hvis ulike celletyper (f. eks kinesisk hamster celler) brukes til å utføre analysen.

Figur 3 viser fire utvalgte paneler for å identifisere BNCs (Figur 3A-3D). Vist her er et histogram som gjør det mulig å velge celler med to kjerner (figur 3a) og bivariate tomter som muliggjør valg av BNCs med lignende sirkularitet (Figur 3B), lignende områder og intensitet (Figur 3C ) og BNCs som har godt separerte, ikke-overlappende kjerner (Figur 3D) i henhold til scoring kriteriene6,34. Figur 3 E viser BF og Hoechst bilder samt BNC og MN masker som indikerer at BNCs med én eller flere MN kan identifiseres og nummerert. Dette gjør at gentoksisitet kan beregnes ved å bestemme frekvensen av micronucleated BNCs i den endelige BNC-populasjonen. Figur 4 viser anvendelsen av spot Count funksjonen ved hjelp av Poly masken for å identifisere mono, Tri og Quad celler. Antallet av TRI og kvadrant celler kanne så være summeres å få det final antallet av POLY celler (bord 1). Dette gjør at cytotoksisitet kan beregnes ved hjelp av formelen som vises i protokollen. Derfor kan hvert dose punkt i eksperimentet evalueres av både gentoksisitet og cytotoksisitet parametre.

Figur 5 viser gentoksisitet og cytotoksisitet verdier for aneugen kolkisin, den Clastogen Mitomycin C og for en negativ kontroll, mannitol. For Kolkisin (figur 5A) 0,02 gjennom 0,05 μg/ml doser produsert STATISTISK signifikant økning i MN frekvens, alt fra 1,28% til 2,44% henholdsvis over løsemiddel kontroll (tabell 1). I tilfelle av Mitomycin C (figur 5B) de to øverste dosene på 0,4 og 0,5 μg/ml produserte statistisk signifikante MN frekvenser sammenlignet med løsemiddel kontroller. Disse MN-frekvensene var 0,93% ved 0,4 μg/mL og 1,02% ved 0,5 μg/mL (tabell 2). Til slutt, for mannitol (figur 5C), ingen doser testet indusere en cytotoksisitet over 30%, heller ikke de produserer betydelige økninger i MN frekvens sammenlignet med løsemiddel kontroller, som forventet (tabell 3).

Figure 1
Figur 1 : Innstillinger for MIFC-instrumentet. Et skjermbilde av MIFC-innstillingene som beskrevet i punkt 7 i protokollen. (A) innstilling av 405 NM laser effekt til 10 MW. (B) innstilling av BF-kanalene 1 og 9. (C) valg av 60x forstørrelse objektiv linse. (D) valg av den tregeste strømningshastigheten som genererer bilder med høyest oppløsning. (E) spesifisere antall hendelser som skal samles til 20 000. (F) klikk på Last inn -knappen for å starte prøve belastnings prosessen. (G) klikke på Hent -knappen for å begynne å anskaffe bilder. (H) klikke på Return -knappen for å returnere ubrukt prøve. (I) SCATTERPLOT av BF størrelsesforhold versus BF Area for valg av enkeltceller. (J) Scatterplot av HOECHST gradient RMS versus BF gradient RMS for valg av fokuserte celler. (K) histogram av Hoechst intensitet for valg av DNA-positive celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Analyseprogramvare gating strategi. Et skjermbilde av gating strategien beskrevet i punkt 9 i protokollen. Områder vises i sekvensiell rekkefølge for identifikasjonen av binucleated celler (rød boks), mikronuklei (gul boks) og mono-og polynucleated-celler (blå boks). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Identifisering og scoring av BNCs med og uten MN. (A) valg av celler som har to forskjellige kjerner. (B) identifisering av binucleated celler (BNCs) som har to svært sirkulære kjerner gjennom bruk av funksjonen for sideforhold intensitet. (C) valg av BNCs som har kjerner med lignende områder og intensitet. Dette oppnås ved å beregne forholdet mellom arealet av både kjerner og forholdet mellom størrelsesforholdet mellom begge kjerner. (D) bruk av funksjonene for figur forhold og størrelsesforhold for å identifisere BNCs som har to godt separerte kjerner. (E) det flekk greven ansiktstrekk benytter det MIKRONUKLEUS (MN) maske demonstrasjon det BNCs med enkelt eller mangfoldig MN kan kjennemerke og nummerert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Identifisering og scoring av mono og Poly celler. Bruk av funksjonen for spot telling til å identifisere og liste opp mono-, Tri-og quadranucleated-celler. Komponent maske 1 tillater identifisering av mononucleated celler (øverste bilde). Komponent masker 1 til 3 tillater identifisering av trinucleated celler (midtre bilde). Komponent masker 1 til 4 tillater identifisering av quadranucleated celler (nederste bilde). Dette tallet har blitt modifisert fra Rodrigues 201832. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Kvantifisering av cytotoksisitet. Cytotoksisitet kvantifisert bruker cytokinesi blokk spredning indeks (svart sirkler) og gentoksisitet kvantifisert bruker prosentandelen av MN (klare barer) etter en 3 h eksponering og 24 h Recovery for (a) kolkisin, (B) Mitomycin C og ( C) mannitol. Statistisk signifikant økning i MN frekvens i forhold til kontrollene er indikert av stjerner (chi-kvadrat test; *p < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001). Alle antall er gjennomsnittet av to replikerer ved hvert dose punkt. Dette tallet har blitt modifisert fra Rodrigues 201832. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: Parametrene som kreves for å beregne cytotoksisitet (antall mono-, bi-og polynucleated celler) og gentoksisitet (antall og prosentandel av micronucleated binucleated celler) for kolkisin. Alle beregnede antall er gjennomsnittet av to replikerer ved hvert dose punkt.

Table 2
Tabell 2: Than parametere som kreves for å beregne cytotoksisitet (antall mono-, bi-og polynucleated celler) og gentoksisitet (antall og prosentandel av micronucleated binucleated celler) for Mitomycin C. Alle beregnede antall er gjennomsnittet av to replikerer ved hvert dose punkt.

Table 3
Tabell 3: Parametrene som kreves for å beregne cytotoksisitet (antall mono-, bi-og polynucleated celler) og gentoksisitet (antall og prosentandel av micronucleated binucleated celler) for mannitol. Alle beregnede antall er gjennomsnittet av to replikerer ved hvert dose punkt.

Tillegg 1: full protokoll. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplement 2: maske liste. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I en fersk publikasjon Verma et al. understreket viktigheten av å utvikle et system som kombinerer høy gjennomstrømming fordelen av Flow flowcytometri med data og bilde lagring fordelene med bildeanalyse35. Den MIFC in vitro MN analysen beskrevet i dette papiret tilfredsstiller dette sitatet, og har potensial til å overvinne mange av de nevnte utfordringene i mikroskopi og flyt flowcytometri metoder. Protokollen som beskrives her, viser at både cytotoksisitet og gentoksisitet kan evalueres ved hjelp av MIFC. Prøve forberedelser, mobilnettet farging og datainnsamling er grei, men det er noen kritiske trinn i protokollen som skal alltid implementeres. Tilsetning av kalium klorid (KCl) til cellene er avgjørende for å hovne opp cellene, genererer separasjon mellom de viktigste kjerner. Dette sikrer at maskering algoritmen kan identifisere alle individuelle kjerner i BNCs og POLY celler (POLY celler) som er nødvendig for deres opplisting. I tillegg gir KCL separasjon mellom kjerner og MN, som er avgjørende for nøyaktig MN maskering og kvantifisering. Videre, bruk av formalin etter tilsetning av KCl hindrer celler fra lysering under sentrifugering. Tillegg av Cytochalasin B forårsaker TK6 celler som har gjennomgått mer enn en kjernefysisk divisjon for å være ganske stor. Som et resultat blir cytoplasma skjør og kan lyse hvis sentrifugering utføres umiddelbart etter tilsetning av KCl. Videre er det svært viktig å innføre Hoechst til prøven i henhold til antall celler i prøven og ikke i henhold til en endelig konsentrasjon. For eksempel vil en endelig konsentrasjon på 10 μg/mL av Hoechst bli jevnt flekker på en prøve på 1 x 106 celler, men det kan ikke være tilstrekkelig flekker på en prøve som inneholder 5 x 106 celler og kan resultere i mange celler med svakt fargede kjerner, noe som gjør analysen vanskelig. Det er også viktig å merke seg at Hoechst kan erstattes med en annen DNA fargestoff som DAPI hvis MIFC er utstyrt med 405 NM eksitasjon laser eller DRAQ5 hvis MIFC er utstyrt med 488 NM og/eller 642nm eksitasjon laser (s). Hvis du endrer den kjernefysiske flekken, er det avgjørende å titrere flekken for å finne riktig konsentrasjon for ønsket/ønsket laser kraft.

Når du samler inn data på MIFC, er det viktig å bestemme de optimale område grensene for gradient RMS-funksjonene. Grensene som presenteres i denne protokollen kan kreve justering på grunn av noen små variasjoner mellom MIFC instrumenter. Anvendelsen av denne funksjonen under datainnsamlingen er avgjørende for å sikre at svært fokuserte bilder fanges opp. Hvis datafiler inneholder mange uklare eller ufokusert bilder, er det sannsynlig at maskerings algoritmer i analyseprogramvaren vil feilaktig markere flekker gjenstander i uskarpe områder, fører til et høyt antall falske positive gjenstander blir scoret som MN. Selv om bildebehandling teknikker beskrevet her kan være vanskelig, når en analyse mal er utviklet i MIFC programvare, batch prosessering gjør det mulig for datafiler som skal automatisk analyseres, eliminerer brukermedvirkning og derfor scorer Bias. Også, hvis en cellelinje enn TK6 celler brukes til å utføre analysen, vil det være nødvendig å endre masker og region grenser som morfologiske egenskaper (f. eks størrelse) av celler vil avvike fra de av TK6 celler.

Resultatene som presenteres her (figur 5) viser statistisk signifikant økning i MN induksjon når utsette TK6 celler til ulike doser av Mitomycin C og kolkisin. Statistisk signifikant økning i hyppigheten av MN sammenlignet med løsemiddel kontroller ble observert i flere doser i begge kjemikalier. I tillegg, ingen dose av mannitol indusert en cytotoksisitet over 30%, eller en statistisk signifikant økning i hyppigheten av MN sammenlignet med løsemiddel kontroller, som forventet. Protokollen som er beskrevet i dette dokumentet ved hjelp av MIFC for å utføre in vitro MN-analysen gir forventede resultater fra både positive og negative kontroll kjemikalier. Det er svært viktig å utføre en rekke eksperimenter ved hjelp av både løsemiddel kontroller og negativ kontroll kjemikalier for å utvikle Baseline verdier av både frekvensen av MN samt Cytokinesi Block spredning index (CBPI). For gentoksisitet, statistisk signifikant økning i MN frekvens bestemmes gjennom sammenligning med Baseline MN frekvenser som må være kjent for celletypen som brukes. I tillegg er alle cytotoksisitet beregninger basert på CBPI av kontroll prøvene og derfor må Baseline utbredelsen av MONO-, BNCs-og POLY-celler være godt kvantifisert i kontroller.

Flere begrensninger og fordeler ved å bruke MIFC i sammenheng med MN-analysen har blitt beskrevet i tidligere arbeid29,32. De viktigste begrensningene gjelder lavere MN frekvenser i forhold til mikroskopi, som trolig skyldes både mangel på fleksibilitet ved implementering av scoring kriterier i analyseprogramvare samt begrenset dybdeskarphet av MIFC. Godt profilerte masker kan opprettes for å nøyaktig identifisere de viktigste kjerner, men MN som er rørende (eller svært nær) de viktigste kjerner kan være fanget i BNC maske. I tillegg svært små MN som kan være ganske lett scoret ved hjelp av mikroskopi er trolig feil savnet når du bruker MIFC grunn nedre grense på området parameteren på MN maske for å unngå scoring små gjenstander. I tillegg til vanskelighetene til stede i bilde-basert dataanalyse, på grunn av sin design, MIFC henter todimensjonale projeksjon bilder av tredimensjonale cellulære objekter. Dette sannsynligvis fører til at noen MN å bli fanget på en annen dybde i fokus at de to viktigste MN, noe som gjør dem vises veldig svakt og un-scorable bruker maskering. Videre, en liten brøkdel av MN kunne ligge bak en av de to viktigste kjerner, noe som gjør dem umulig å visualisere og score. Derfor, med tanke på disse vanskelighetene, bør forsiktighet brukes når tolke betydelige økninger i MN frekvens ved lave doser.

Til tross for disse svakhetene, MIFC metoden beskrevet her tilbyr flere fordeler fremfor andre teknikker. Fenech et al. foreslåtte kriterier og retningslinjer som bør vurderes ved utvikling av automatiserte systemer og metoder for MN-analyser36. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, direkte visualisering av de viktigste kjerner og cytoplasma, fastsettelse av hyppigheten av MN fra ulike doser av kjemiske eller agent blir testet og evnen til å quantitate morfologi og bestemme plasseringen av alle kjerner og MN for å sikre at de er innenfor cytoplasma. Dette papiret viser at MIFC metoden utviklet for å utføre in vitro MN analysen tilfredsstiller (eller besitter potensialet for å tilfredsstille) disse kriteriene. Spesielt, bilder av kjerner og MN kan fanges opp av fluorescerende lasere mens cytoplasmatiske bilder kan fås ved hjelp av BF LED. Bilder av celler med normal kjernefysisk morfologi kan automatisk skilles fra disse cellene med uregelmessig morfologi ved hjelp av en kombinasjon av avanserte masker og funksjoner. Resultatene som presenteres for Kolkisin og Mitomycin C (figur 5) viser at både gentoksisitet og cytotoksisitet kan vurderes ved ulike doser sammenlignet med løsemiddel kontroller, og at statistisk signifikante FREKVENSER for MN observeres Forventet. Videre anbefaler OECD test retningslinjen 487 scoring 2 000 BNCs per test konsentrasjon for å vurdere tilstedeværelsen av MN å bestemme gentoksisitet sammen med minst 500 celler per test konsentrasjon for å avgjøre cytotoksisitet9; Dette kan ta over 1 time ved hjelp av manuell mikroskopi. Protokollen og resulterer i dette papiret viser at et gjennomsnitt på ca 6 000 BNCs, 16 000 MONO celler, og 800 POLY celler ble fanget og scoret per test konsentrasjon i ca 20 min. Den raske hastigheten på datainnsamling og det høye antallet kandidat celler scoret på så kort tid markere en annen viktig fordel ved å ansette MIFC å utføre in vitro MN-analysen.

Mens resultatene som presenteres i denne utredningen er oppmuntrende, de er representative for en tidlig proof-of-konsept metode. Dette arbeidet bør følges opp av grundigere undersøkelser av et større, mer mangfoldig kjemisk sett som dekker flere klasser og mekanismer for gentoksisitet og cytotoksisitet slik som de som foreslås av Kirkland et al.37 å gjennomføre slike studier er tidkrevende og arbeidsintensiv, og faller utenfor omfanget av denne utredningen imidlertid disse større skala studier vil gi verdifull innsikt i evnen til metoden for å pålitelig identifisere svakt gentoksisk agenter. Metodikken som presenteres her har ennå ikke blitt miniatyriserte til et mikrotiterplateleser format, noe som ville gi raskere og mer effektiv screening over et større dose område. Som sådan, i sin nåværende form, kan den MIFC-baserte in vitro-analysen som presenteres her, være best egnet for arbeidsintensive oppfølgingsstudier eller forskning på god laboratoriepraksis. Imidlertid vil metoden fortsette å være optimalisert og validert, og besitter potensialet for å gi økt fleksibilitet i å oppdage kjemiske spesifikke hendelser knyttet til morfologi, slik som aneugen eksponering som øker andelen av celler med ikke-sirkulære kjerner som fortsatt scorable38. Til slutt, den MIFC metoden presenterer en mulighet til å innføre flere biomarkører i MN-analysen (f. eks kinetochore farging) for å gi en mer helhetlig visning av mekanismen av MN induksjon.

Disclosures

Forfatteren er ansatt av Luminex Corporation, skaperen av ImageStream multispectral Imaging Flow flowcytometer som ble brukt i dette arbeidet.

Acknowledgments

Forfatteren takket Christine Probst (Luminex Corporation) for sin innsats i utviklingen av tidligere former for dataanalyse mal, samt Dr. Haley Pugsley (Luminex Corporation) og Dr. Phil Morrissey (Luminex Corporation) for gjennomgang og redigering av Manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler - 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath - PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  2. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1-2), 81-95 (2000).
  3. Fenech, M. The Lymphocyte Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome Assay and its Application in Radiation Biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 234-243 (2010).
  4. Hintzsche, H., et al. Fate of micronuclei and micronucleated cells. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 771, 85-98 (2017).
  5. Fenech, M. The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. Mutation Research. 392 (1-2), 11-18 (1997).
  6. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  7. Fenech, M., Holland, N., Chang, W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. The HUman MicroNucleus Project - An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 428 (1-2), 271-283 (1999).
  8. Kirsch-Volders, M., et al. Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 540 (2), 153-163 (2003).
  9. OECD Library. Test No. 487: In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2016).
  10. Aardema, M. J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 61-87 (2006).
  11. Clare, M. G., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 37-60 (2006).
  12. Lorge, E., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 13-36 (2006).
  13. Oliver, J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 125-152 (2006).
  14. Wakata, A., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. IV. Using CHL cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 88-124 (2006).
  15. Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 45-64 (2003).
  16. Decordier, I., et al. Automated image analysis of cytokinesis-blocked micronuclei: an adapted protocol and a validated scoring procedure for biomonitoring. Mutagenesis. 24 (1), 85-93 (2009).
  17. Decordier, I., et al. Automated image analysis of micronuclei by IMSTAR for biomonitoring. Mutagenesis. 26 (1), 163-168 (2011).
  18. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lorch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenetic and Genome Research. 104 (1-4), 383-389 (2004).
  19. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  20. Nüsse, M., Marx, K. Flow cytometric analysis of micronuclei in cell cultures and human lymphocytes: Advantages and disadvantages. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 392 (1-2), 109-115 (1997).
  21. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  22. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1-2), 78-91 (2007).
  23. Bryce, S. M., et al. Flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay with human TK6 cells: Protocol optimization and transferability assessment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 54 (3), 180-194 (2013).
  24. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: to Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research. 607 (1), 9-12 (2006).
  25. Basiji, D. A. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  26. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Automated analysis of the cytokinesis-block micronucleus assay for radiation biodosimetry using imaging flow cytometry. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 273-282 (2014).
  27. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry. Cytometry Part A. 85 (10), 883-893 (2014).
  28. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Validation of the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Health Physics. 110 (1), 29-36 (2016).
  29. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Optimized automated data analysis for the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Cytometry Part A. 89 (7), 653-662 (2016).
  30. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. The effect of an optimized imaging flow cytometry analysis template on sample throughput in the reduced culture cytokinesis-block micronucleus assay. Radiation Protection Dosimetry. 172 (1-3), 223-229 (2016).
  31. Wang, Q., et al. Automated Triage Radiation Biodosimetry: Integrating Imaging Flow Cytometry with High-Throughput Robotics to Perform the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay. Radiation Research. 191 (4), 342-351 (2019).
  32. Rodrigues, M. A. Automation Of The In vitro Micronucleus Assay Using The ImageStream® Imaging Flow Cytometer. Cytometry Part A. 93, 706-726 (2018).
  33. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C., Fenech, M. F. The potential for complete automated scoring of the cytokinesis block micronucleus cytome assay using imaging flow cytometry. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 836, 53-64 (2018).
  34. Fenech, M., et al. HUMN project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 65-75 (2003).
  35. Verma, J. R., et al. Evaluation of the automated MicroFlow® and Metafer™ platforms for high-throughput micronucleus scoring and dose response analysis in human lymphoblastoid TK6 cells. Archives of Toxicology. 91 (7), 2689-2698 (2017).
  36. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  37. Kirkland, D., et al. Updated recommended lists of genotoxic and non-genotoxic chemicals for assessment of the performance of new or improved genotoxicity tests. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 795, 7-30 (2016).
  38. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).

Tags

Bioteknologi TK6 celler gentoksisitet cytotoksisitet in vitro mikronukleus analysen Imaging Flow flowcytometri bildeanalyse automatisering multispectral Imaging Flow flowcytometri
En automatisert metode for å utføre in vitro Mikronukleus analysen bruker multispectral Imaging Flow flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodrigues, M. A. An Automated Method … More

Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter