Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En automatiseret metode til udførelse af in vitro-Mikronukleusanalysen ved hjælp af multispektral billedbehandlings flow cytometri

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59324
Automatic Translation
1
1Biology Department, Luminex Corporation

Summary

In vitro-mikronukleusanalysen er en veletableret metode til vurdering af genotoksicitet og cytotoksicitet, men det er besværligt at score analysen ved hjælp af manuel mikroskopi, og den lider under subjektivitet og variabilitet mellem scorer. Dette dokument beskriver den protokol, der er udviklet til at udføre en fuldt automatiseret version af analysen ved hjælp af multispektral billedbehandlings flow cytometri.

Abstract

In vitro mikronukleustest (Mn) assay bruges ofte til at evaluere cytotoksicitet og genotoksicitet, men at score analysen via manuel mikroskopi er omstændelig og introducerer usikkerhed i resultaterne på grund af variabilitet mellem scorere. For at afhjælpe dette, automatiseret slide-scanning mikroskopi samt konventionelle flow flowcytometri metoder er blevet indført i et forsøg på at fjerne målscorer bias og forbedre gennemløb. Men, disse metoder har deres egne iboende begrænsninger såsom manglende evne til at visualisere cytoplasmaet i cellen og manglen på visuel MN verifikation eller billede datalagring med flow cytometry. Multispectral imaging flow cytometry (MIFC) har potentialet til at overvinde disse begrænsninger. MIFC kombinerer den høje opløsning fluorescerende billeder af mikroskopi med den statistiske robusthed og hastighed af konventionel flow cytometri. Desuden kan alle indsamlede billeder gemmes i dosis-specifikke filer. Dette dokument beskriver den protokol, der er udviklet til at udføre en fuldt automatiseret version af MN-analysen på MIFC. Humane lymfoblastoid TK6 celler blev forstørret ved hjælp af en hypotonisk opløsning (75 mM KCl), fikseret med 4% formalin, og det nukleare indhold blev plettet med Hoechst 33342. Alle prøver blev kørt i suspension på MIFC, hvilket muliggør erhvervelse af billeder i høj opløsning af alle vigtige hændelser, der kræves til analysen (f. eks. binucleerede celler med og uden MN samt mononukleerede og polynucleerede celler). Billeder blev automatisk identificeret, kategoriseret og optalt i MIFC data analysis software, der giver mulighed for automatiseret scoring af både cytotoksicitet og genotoksicitet. Resultaterne viser, at brug af MIFC til at udføre in vitro-MN-analysen gør det muligt at påvise statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen på flere forskellige niveauer af cytotoksicitet sammenlignet med solvenskontrol efter eksponering af TK6 celler for at Mitomycin C og colchicin, og at der ikke observeres signifikante stigninger i MN-frekvensen efter eksponering for Mannitol.

Introduction

In vitro-mikronukleus (Mn)-analysen er en almindeligt anvendt test til vurdering af cytotoksicitet og genotoksicitet som et screeningsværktøj i flere studieområder såsom kemisk og farmaceutisk udvikling samt Human bioovervågning blandt personer, der udsættes for forskellige miljømæssige, erhvervsmæssige eller livsstilsfaktorer1,2,3. MN består af kromosom fragmenter eller hele kromosomer genereret under celledeling, der ikke er indarbejdet i en af de to vigtigste datter kerner. Efter telophase, dette kromosomale materiale former i en individuel, afrundet krop inde i cytoplasmaet, der er adskilt fra en af de vigtigste kerner2. Derfor er MN repræsentative for DNA-skader og har været anvendt i mange år som et endepunkt i genotoksicitetstest4. Den mest hensigtsmæssige metode til at måle MN er Cytokinesis-Block mikronukleustest (cbmn) assay. Ved anvendelse af CBMN-analysen kan hyppigheden af MN i binucleerede celler (Bnc'er) scores ved at indarbejde Cytochalasin B (Cyt-B) i prøven. Cyt-B tillader nuklear division, men forhindrer cellulær division og dermed begrænser scoring af MN til Bnc'er, der kun har delt en gang5.

Protokoller, der anvender både mikroskopi og flowcytometri, er blevet udviklet og valideret og anvendes rutinemæssigt til at udføre in vitro-MN-analysen6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Mikroskopi fordele ved at være i stand til visuelt at bekræfte, at MN er legitime, men er tidskrævende og tilbøjelige til variation mellem scorers15. For at løse dette, automatiseret mikroskopi metoder blev udviklet til at scanne slides og fange billeder af kerner og MN16,17,18,19, men cytoplasmaet kan ikke visualiseres, hvilket gør det vanskeligt at afgøre, om en MN faktisk er forbundet med en bestemt celle. Desuden har disse metoder svært ved at identificere polynucleerede (POLY) celler (herunder Tri-og kvadranucleerede celler), som er nødvendige for beregningen af cytotoksicitet ved brug af Cyt-B9. Flowcytometri-metoder udviklet til at udføre MN-analysen beskæftiger fluorescens samt fremad-og side scatter intensiteter for at identificere populationer af både kerner og MN, der er blevet befriet fra cellen efter lysis20,21 ,22. Dette gør det muligt at erhverve data fra flere tusinde celler i et par minutter og tillader automatiseret analyse23; men den manglende evne til at visualisere cellerne gør det umuligt at bekræfte, at scoret begivenheder er ægte. Desuden, lyserende cellemembranen hæmmer brugen af Cyt-B samt skabe en suspension, der indeholder andre rester såsom kromosom aggregater eller apoptotiske organer, og der er ingen måde at differentiere disse fra MN24.

I lyset af disse begrænsninger er multispectral imaging flow cytometry (MIFC) et ideelt system til at udføre MN-analysen, da det kombinerer de fluorescerende billeder i høj opløsning af mikroskopi med den statistiske robusthed og hastighed af konventionel strømnings cytometri. I MIFC introduceres alle celler i et fluidics-system og er derefter Hydrodynamisk fokuseret ind i midten af en flowcelle kuvette. Ortogononal belysning af alle celler opnås ved hjælp af en lysfelt (BF) lysemitterende Diode (led), en side scatter laser og (mindst) en fluorescerende laser. Fluorescerende fotoner er fanget af en af tre (20x, 40x eller 60x) høje numeriske blænde objektiv linser og derefter passere gennem en spektral nedbrydning element. Fotoner er derefter fokuseret på et oplader-koblet Device (CCD) kamera for at opnå høj opløsning billeder af alle celler, der passerer gennem flowcellen. For at undgå sløring eller striber fungerer CCD i tilstanden for tidsforsinket integration (TDI), som sporer objekter ved at overføre pixel indhold fra række til række ned i CCD i synkry med hastigheden af cellen i flow. Pixeloplysninger indsamles derefter fra den sidste række af pixel. TDI Imaging kombineret med spektral nedbrydning tillader op til 12 billeder (2 BF, 10 fluorescerende) at blive fanget samtidigt fra alle celler, der passerer gennem flowcellen. Alle optagne billeder gemmes i eksempel specifikke datafiler, hvilket gør det muligt at foretage analyser når som helst ved hjælp af MIFC-dataanalyse softwaren. Endelig bevarer datafiler forbindelsen mellem celle billeder og prikker på alle bivariate plots. Det betyder, at enhver prik på en traditionel bivariate plot kan fremhæves, og dens tilsvarende BF og fluorescerende billeder vil blive vist25.

For nylig er mifc-baserede metoder blevet udviklet til at udføre MN-analysen for både triage stråling biodosimetri26,27,28,29,30,31 og genetisk toksikologi32,33 testning. Dette arbejde har vist, at cellulære billeder af de vigtigste kerner, MN og cytoplasmaet kan afbildet med højere gennemløb end andre metoder26. Alle celletyper, der kræves til analyse, herunder MONO celler, Bnc'er (med og uden MN) og POLY-celler, kan automatisk identificeres i MIFC-dataanalyse softwaren, og implementeringen af scorings kriterierne udviklet af Fenech et al. opnås gennem brugen af forskellige matematiske algoritmer6,34. Resultaterne fra biodosimetri viste, at kalibreringskurverne for dosisrespons var af samme størrelsesorden som dem, der blev opnået fra andre automatiserede metoder i litteraturen ved kvantificering af MN pr. BNC29. Desuden har det seneste arbejde inden for toksikologi påvist, at billeder af MONO celler, Bnc'er (med og uden MN) og POLY-celler automatisk kan optages, identificeres, klassificeres og optælles ved hjælp af MIFC. Protokollen og dataanalysen gjorde det muligt at beregne cytotoksicitet og genotoksicitet efter at have udsat TK6 celler for flere clastogener og aneugener32.

Den protokol, der præsenteres i dette dokument, beskriver en metode til at udføre in vitro-MN-analysen med MIFC. Den prøve forarbejdningsteknik, der anvendes i dette arbejde, kræver mindre end 2 timer til at behandle en enkelt prøve og er relativt let at udføre i forhold til andre metoder. Dataanalysen i MIFC-analysesoftwaren er kompliceret, men oprettelsen af analyse skabelonen kan udføres i et par timer efter de trin, der er skitseret i dette papir. Desuden, når skabelonen er blevet oprettet, kan den automatisk anvendes på alle indsamlede data uden yderligere arbejde. Protokollen skitserer alle trin, der kræves for at eksponere TK6 celler til clastogens og aneugens, beskriver, hvordan man kultur, proces og pletter cellerne, og demonstrerer, hvordan man erhverver billeder i høj opløsning ved hjælp af MIFC. Desuden illustrerer dette dokument den nuværende bedste praksis for analyse af data i MIFC-software til automatisk at identificere og score MONO celler, Bnc'er og POLY-celler med henblik på at beregne både cytotoksicitet og genotoksicitet.

Protocol

1. forberedelse af kulturmedium og dyrkning af TK6 celler

Bemærk: nogle kemikalier, der anvendes i denne protokol, er giftige. Indånding, indtagelse eller kontakt af huden med Cytochalasin B kan være dødelig. Bær passende personlige værnemidler, herunder en laboratorie frakke og to par nitrilhandsker. Vask hænderne grundigt efter håndtering. Formalin/formaldehyd er giftig ved indånding eller indtagelse; er irriterende for øjnene, åndedrætsorganerne og huden; og kan give overfølsomhed ved indånding eller ved kontakt med huden. Der er risiko for alvorlig øjenskade. Det er et potentielt kræftfremkaldende stof.

  1. Forbered 565 mL 1x RPMI-kulturmedium. Der tilsættes 5 mL af ikke-essentielle aminosyrer (100x), 5 mL natriumpyruvat (100 mM), 5 mL penicillin-streptomycin-glutamin (100x) og 50 mL føtal bovint serum (FBS) til en 500 mL flaske 1x RPMI 1640 medium. Forbered mediet i et biosikkerheds kabinet, og opbevar det ved 2-8 °C. Opvarm mediet til 37 °C, før det føjes til de TK6 celler (Se tabel over materialer).
  2. Der tø 1 mL TK6 celler (opbevares ved-80 °C i DMSO) i 10 mL medium. Cellerne centrifugeres ved 200 x g i 8 minutter, og supernatanten aspirerer. Cellerne overføres til 50 mL medier og inkubates ved 37 °C, 5% CO2. Fordoblings tiden for TK6 celler varierer fra ~ 12-18 h og et par (3 eller 4) passager vil være påkrævet for cellerne at nå deres maksimale spredningshastighed (Se tabel over materialer).
  3. Kultur 100 mL celler til en koncentration på ~ 7-8 x 105 celler/ml.

2. fremstilling af clastogener og/eller aneugener og Cytochalasin B

  1. Forbered passende lager koncentrationer af ønskede clastogener og aneugener. For eksempel, for Mitomycin C, opløses en fuld 2 mg flaske i 10 mL sterilt vand for at opnå en endelig bestand koncentration på 200 μg/mL. Mitomycin C kan opbevares ved 4 °C i tre måneder (Se tabel over materialer).
  2. På eksperiment dagen forberedes fortyndinger af de ønskede kemikalier, der enten er 10 gange eller 100 gange højere end de ønskede eksponeringskoncentrationer, hvis de fortyndes i sterilt vand eller DMSO.
  3. For Mitomycin C, Forbered 3 mL fortyndinger i sterilt vand på 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 og 5,0 μg/mL. For colchicin, Forbered 3 mL fortyndinger i sterilt vand på 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 og 0,5 μg/mL. Endelig for Mannitol, Forbered 3 mL fortyndinger i sterilt vand på 5, 10, 20, 30, 40 og 50 mg/mL.
  4. Forbered en 200 μg/mL lager koncentration af Cytochalasin B ved at opløse en 5 mg flaske i 25 mL DMSO. Cytochalasin B kan opbevares ved-20 °C i flere måneder.

3. eksponering af celler for clastogener og/eller aneugener

  1. Der tilsættes 1 mL af det ønskede kemikalie (f. eks. Mitomycin C) til 9 mL celler ved ~ 7-8x105 celler/ml i en T25-kolbe. Tilsæt 1 mL sterilt vand til kontrolprøverne. Kolberne placeres i en 37 °C, 5% CO2 inkubator i 3 timer.
    Bemærk: Hvis kemikalierne fortyndes i DMSO, tilsættes kun 100 μL af kemikaliet til hver kolbe og tilsættes 100 μL DMSO til kontrol. Hver kolbe skal indeholde 9,900 mL celler.
  2. Efter 3 timer fjernes kolberne fra inkubator og overføres cellerne til 15 mL polypropylenrør. Centrifugeres ved 200 x g i 8 min., Aspirér supernatanten og Overfør cellerne til nye T25-kolber, der indeholder i alt 10 ml frisk dyrkningsmedium. Der tilsættes 150 μL af Stam koncentrationen (200 μg/mL) Cytochalasin B til hver kolbe for at opnå en slutkoncentration på 3 μg/mL.
  3. Kolberne returneres til 37 °C, 5% CO2 -inkubator i en restitueringsperiode på 1,5-2,0 fordoblings tider, som anbefalet i oecd's retningslinjer9. For de TK6 celler, der anvendes i dette arbejde, var restitutionstiden 24 timer.
    Bemærk: fordoblings tiden for de TK6 celler, der blev brugt her, var 15 timer, og der blev anvendt en restitutionsperiode på 24 timer (1,6 fordoblings tider). Restitutionstider mindre end 1,5 fordoblings tider vil reducere spredningen i prøver, der udsættes for højere doser, der påvirker antallet af Bnc'er. omvendt vil restitutionstider på mere end 2,0 producere et uforholdsmæssigt stort antal polynucleerede celler i kontrolprøver, skævvridning af cytotoksiske beregninger.

4. klargøring af buffere til fiksering og mærkning af DNA-indhold (se tabel over materialer)

  1. Forbered 75 mm kaliumchlorid (KCl) ved at tilsætte 2,79 g til 500 ml ultrarent vand. Opløsningen omrøres i 5 min. ved hjælp af en magnetisk røremaskine og et sterilt filter gennem et 200 μm filter. 75 mM KCl-opløsningen kan opbevares ved 4 °C i flere måneder.
  2. Der forberedes en tilstrækkelig mængde på 4% formalin til forsøget, og det foregribelse, at i alt 2,1 mL skal tilsættes til hver prøve. For eksempel til tilberedning af 10 mL 4% formalin tilsættes 4 mL 10% formalin-bestand til 6 mL 1x Dulbecco's fosfatbufferopløsning uden ca2 + eller mg2 + (PBS). Denne 4% formalin kan opbevares ved stuetemperatur i flere uger.
  3. Klargør 510 mL vaskebuffer (2% FB'ER i 1X PBS) ved at tilsætte 10 mL FBS til en 500 mL flaske 1x PBS.
  4. Der fremstilles 10 mL 100 μg/mL-koncentration af Hoechst 33342 ved tilsætning af 100 μL af Stam koncentrationen (1 mg/mL) til 9.900 μL 1X PBS. Hoechst 33342-opløsningen kan opbevares ved 4 °C i flere måneder.

5. prøve behandling: hypotonisk hævelse, fiksering, celletælling og mærkning af DNA-indhold

  1. Ved udgangen af restitutionsperioden skal alle kolber fjernes fra inkubator og overføres alle prøver til 15 mL polypropylenrør. Alle prøver centrifugeres ved 200 x g i 8 minutter.
  2. Aspirér supernatanten, resuspension cellerne og tilsæt 5 mL 75 mM KCl. Bland forsigtigt ved inversion tre gange og Inkuber ved 4 °C i 7 min.
  3. 2 mL 4% formalin tilsættes til hver prøve, blandes forsigtigt ved inversion tre gange og Inkuber ved 4 °C i 10 minutter. Dette trin fungerer som en "blød fiksering".
  4. Alle prøver centrifugeres ved 200 x g i 8 min. Aspirér supernatanten og resuspension i 100 μl 4% formalin i 20 min. Dette trin fungerer som en "hård fiksering".
  5. Tilsæt 5 mL vaskebuffer og centrifugeres ved 200 x g i 8 min. Aspirér supernatanten, og genopsæt den igen i 100 μl vaskebuffer.
  6. Alle prøver overføres til 1,5 mL mikrocentrifuge glas.
  7. Udfør et celleantal på hver prøve for at bestemme antallet af celler pr. prøve. Prøverne vil være stærkt koncentrerede, så en 1:100 fortynding i 1x PBS (10 μL af prøven i 990 μL PBS) vil sandsynligvis være påkrævet for at opnå en nøjagtig tælling.
    Bemærk: på dette tidspunkt er det bedst at udføre celletal ved hjælp af en hemocytometer. Tilsætning af KCl giver cytoplasmaet et gennemsigtigt udseende, hvilket gør det vanskeligt for automatiserede celle tællere at genkende dem. Også, automatiserede tællere har svært ved at score polynucleated celler på grund af deres størrelse.
  8. Hvis de ikke kører prøverne på MIFC med det samme, kan de opbevares ved 4 °C i flere dage. Når prøverne er klar til at køre, tilsættes 5 μL 100 μg/mL pr. 1x106 celler/ml til hver prøve. Der tilsættes også 10 μL 500 μg/mL RNase pr. 100 μL prøve for en slutkoncentration på 50 μg/mL. Prøverne inkubates ved 37 °C, 5% CO2 i 30 min.
  9. Mikro-centrifuge alle prøver ved 200 x g i 8 min og brug en pipette til at fjerne supernatanten forlader ~ 30 μl. Brug en pipette til at resuspendere alle prøver, før du kører på MIFC, hvilket sikrer, at der ikke er bobler i røret. Må ikke vortex.

6. start og kalibrering af MIFC

  1. Sørg for, at Sheath, system kalibrerings reagens, debubbler, rense-og sterilisator beholdere er fulde, og at affaldsbeholderen er tom. Tænd for systemet, og dobbeltklik på MIFC-software ikonet. Klik på Start knappen, og sørg for, at afkrydsningsfeltet Start alle kalibreringer og tests er markeret. Dette vil skylle systemet, indlæse kappe og systemkalibrering reagenser, og kalibrere systemet (Se tabel over materialer).

7. køreprøver på MIFC

Bemærk: dette afsnit forudsætter brug af et 2-kamera MIFC. Hvis du bruger et 1 kamera MIFC, se venligst supplement 1-fuld protokol, afsnit 7 for oprettelse af parceller under erhvervelse

  1. Lancere MIFC data Acquisition software (Se tabel over materialer). Figur 1 viser apparatets indstillinger. Tænd for 405 nm-laseren, og Indstil laser effekten til 10 mW (A). Deaktiver alle andre lasere (herunder SSC) og sæt BF til kanal 1 og 9 (B). Bekræft, at forstørrelses skyderen er indstillet til 60x (C), Højfølsom tilstand er valgt (D), og at kun kanaler 1, 7 og 9 vises i Billedgalleriet.
  2. Klik på ikonet scatterplot . Vælg den samlede population, og vælg område M01 på X-aksen og højde-bredde-forholdet M01 på Y-aksen. Klik på ikonet for det firkantede område , og tegn en region omkring de enkelte celler. Navngiv denne region enkeltceller. Højreklik på plottet og vælg regioner. Fremhæv området med enkeltceller , og Skift x-koordinaterne til 100 og 900, og Ændr y-koordinaterne til 0,75 og 1 (figur 1I).
  3. Klik på ikonet scatterplot . Vælg enkeltceller som den overordnede population, Vælg gradient RMS M01 på X-aksen og gradient RMS M07 på Y-aksen. Klik på ikonet firkantet region og tegne en region omkring de fleste af cellerne. Navngiv dette område fokuserede celler. Højreklik på plottet og vælg regioner. Fremhæv området med fokuserede celler , og Skift x-koordinaterne til 55 og 75, og Ændr y-koordinaterne til 9,5 og 20 (figur 1J).
  4. Klik på histogram ikonet. Vælg den fokuserede celle population, og vælg intensitet M07 som funktionen. Klik på ikonet for lineær region , og tegn en region på tværs af hovedtoppen i histogrammet. Navngiv denne region DNA-positiv. Højreklik på plottet og vælg regioner. Fremhæv den DNA-positive region og Skift koordinaterne til 2 x 105 og 2 x 106. Intervallet skal muligvis justeres afhængigt af intensitets højde på histogrammet (figur 1K).
  5. Angiv anskaffelses parametrene (figur 1E). Angiv filnavnet og destinationsmappen, Skift antallet af hændelser til 20.000, og vælg den DNA-positive population.
  6. Klik på Indlæs (figur 1F), og Placer kontrolprøven i mifc. Klik på knappen Hent for at indsamle dataene (figur 1G). Når købet er fuldført, skal du klikke på Returtasten for at returnere prøven (figur 1H). Fjern prøverøret fra instrumentet. Gentag denne proces for alle resterende prøver i eksperimentet.

8. åbning af en datafil i ideer

  1. Lancere MIFC Analysis softwarepakke (Se tabellen over materialer). Klik på Start analyse for at starte guiden Åbn fil. Vælg en datafil ved at søge efter den ønskede RAW-billedfil (. Rif). Klik på knappen Åbn , og klik på næste.
  2. Da dette er en enkelt farveanalyse, er kompensation ikke nødvendig, så klik på næste for at omgå kompensations trinnet. På dette stadie er der ingen analyse skabelon at anvende, så klik på næste igen. Hvis analyse skabelonen er hentet fra det supplerende materiale, skal du vælge den nu. Disse skabeloner kun arbejde med en 2 kamera MIFC med BF indstillet til kanal 1 og 9 og nukleare billeder i Channel 7 under erhvervelse.
  3. Som standard genereres. cif-og. DAF-filnavne automatisk, så de svarer til. Rif. Det anbefales ikke at ændre navnene på. cif og. DAF. Klik på næste. Indstil egenskaberne for billedvisning ved at vælge 01 og 07. Klik på næste. Der er ingen guide til dette program, så klik på Udfør. Det er meget vigtigt at gemme dataanalyse filen (. DAF) og analyse skabelonen (. AST) ofte under afsnit 9 – 14 for at undgå tab af fremskridt.

9. oprettelse masker og funktioner til at identificere BNCs

  1. Klik på ikonet Billedgalleri egenskaber (blåt/hvidt ikon). Klik på Angiv område til pixel data under fanen Egenskaber for skærm , og skift derefter farven til gul. Klik på OK. Det er nu nemmere at se Hoechst-billeder mod den sorte baggrund.
  2. Oprette ikke-apoptotiske celler plot.
    1. Klik på fanen analyse , og klik derefter på masker. Klik på ny , og klik derefter på funktion. Under funktion Vælg tærskelunder maske skal du vælge M07 og indstille intensitets procenten til 50. Klik på OK og derefter på OK igen. Klik på Luk.
    2. Klik på fanen analyse , klik på funktioner, og klik derefter på ny. For feature type Vælg område. For maske skal du vælge tærsklen (M07, Ch07, 50). Klik på Angiv standardnavn , og klik på OK. Klik på Luk for at begynde at beregne funktions værdierne.
    3. Klik på ikonet prik plot . Vælg den samlede population. For X-aksen funktionen vælge Contrast_M01_Ch01 funktion og for Y-aksen funktionen vælge Area_Threshold (M07, Ch07, 50). Klik på OK.
    4. Klik på knappen firkantet område , og tegn et område omkring størstedelen af cellerne. Kald denne region ikke-apoptotic. Højreklik på plottet og klik på regioner. Fremhæv den ikke-apoptotiske region. Indstil x-koordinaterne til 0 og 15, og Indstil y-koordinaterne til 50 og 300. Klik på Luk.
  3. Opret BNC-masken (trin 9.3.1-9.3.5) for at identificere celler, der kun indeholder to kerner.
    1. Søg efter en BNC i Billedgalleriet, og klik på den. Dette er for at visualisere skabelsen af masken i Hoechst-kanalen.
    2. Klik på fanen analyse , og klik derefter på masker. Klik på ny , og klik derefter på funktion. Under funktion Vælg Levelsetunder maske skal du vælge M07, vælge alternativknappen mellemniveau maske og indstille kontur detalje skalaen til 3,00. Klik på OK og derefter på OK igen.
    3. Klik på ny , og klik derefter på funktion. Under funktion, Vælg dilate, og under maske Vælg Levelset (M07, Ch07, Middle, 3). Indstil det billede, der skal vises , til Ch07, og Indstil antallet af pixels til 2. Klik på OK og derefter på OK igen.
    4. Klik på ny , og klik derefter på funktion. Under funktion Vælg Watershed, og under Mask Vælg Dilate (Levelset (M07, Ch07, Middle, 3) 2). Indstil det billede, der skal vises , til Ch07, og Indstil stregtykkelsen til 1. Klik på OK og derefter på OK igen.
    5. Klik på ny , og klik derefter på funktion. Under funktion Vælg område, under maske vælge vandskuret (Dilate (Levelset (M07, Ch07, Middle, 3) 2)). Indstil det billede, der skal vises , til Ch07. Angiv minimum-og maksimumområde værdierne til henholdsvis 115 og 5000. Angiv værdierne for minimum og maksimum for størrelsesforholdet til henholdsvis 0,4 og 1. Klik på OK. I feltet navn skal du ændre teksten for at læse BNC og derefter klikke på OK.
  4. Opret de funktioner og plots for at opnå den endelige BNC befolkning
    1. Spot Count BNC funktion: Klik på fanen analyse , derefter funktioner, derefter ny. For funktionen type Vælg spot Count. For maskeskal du vælge den endelige BNC-maske, som er oprettet i 9.3.5. Indstil forbundethed til fire og ændre navnet til spot Count BNC. Klik på OK og derefter på Luk for at beregne funktions værdierne.
    2. Spot Count BNC histogram. Klik på histogram ikonet. Vælg ikke-apoptotic som den overordnede population. Vælg funktionen spot Count BNC for funktionen X-Axis . Klik på OK. Klik på ikonet for lineær region. Tegn en region på tværs af placering 2. Kald dette område 2n.
      Bemærk: Se afsnit 9 i tillæg 1-fuld protokol for at oprette de resterende masker, funktioner og plot for at identificere den endelige BNC-population

10. oprettelse af masker og funktioner til at identificere MN i BNC-populationen

  1. Opret MN-masken. Søg efter en BNC, der indeholder en MN i Billedgalleriet, og klik på den. Dette er for at visualisere skabelsen af MN-masken i Hoechst-kanalen. Klik på fanen analyse , og klik derefter på masker.
    1. Opret spot identifikations maske 1:
      1. Klik på ny , og klik derefter på funktion. Under funktion Vælg spot og sørg for, at den lyse radio knap er valgt. Under maske skal du vælge M07, indstille stedet til cellens baggrundsforhold til 2,00. Indstil minimum radius til 2 og den maksimale radius til 6. Klik på OK og derefter på OK igen.
      2. Klik på ny , og klik derefter på funktion. Under funktion Vælg område, og under maske vælge Levelset (M07, Ch07, Middle, 3). Indstil det billede, der skal vises , til Ch07. Angiv minimum-og maksimum arealet til henholdsvis 80 og 5000. Indstil minimum -og maksimum størrelsesforholdet til henholdsvis 0 og 1. Klik på OK og derefter på OK igen.
      3. Klik på ny , og klik derefter på funktion. Under funktion Vælg Dilateunder maske Vælg område (Levelset (M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1). Indstil det billede, der skal vises , til Ch07. Indstil antallet af pixels til 2. Klik på OK og derefter på OK igen.
      4. Klik på ny. Dobbeltklik på stedet (M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) maske for at føje den til maske definitionen. Klik på operatoren and og derefter på operatoren not . Dobbeltklik på masken Dilate (interval (LevelSet (M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2) for at føje den til maske definitionen. Klik på OK.
      5. Klik på nyog derefter på funktion. Vælg den maske, som er oprettet i 10.1.1.4, under funktion Vælg område og under maske:
        1. Vælg spot (M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) og ikke Dilate (interval (Levelset (M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2).
        2. Indstil det billede, der skal vises , til Ch07. Angiv minimum-og maksimum arealet til henholdsvis 10 og 80. Indstil minimum-og maksimum størrelsesforholdet til henholdsvis 0,4 og 1. Klik på OK og derefter på OK igen. Spot identifikations masken 1 er fuldført.
          Bemærk: Se afsnit 10 i tillæg 1-fuld protokol for at oprette masker, funktioner og plot til at identificere den endelige MN population

11. Opret masker, funktioner og plots til at identificere Mononucleerede og Polynucleated populationer

  1. Opret POLY masken. Klik på analyse, derefter masker, derefter ny derefter funktion. Under funktion Vælg område, under maske vælge vandskuret (Dilate (Levelset (M07, Ch07, Middle, 3), 2)). Indstil det billede, der skal vises , til Ch07. Angiv minimum -og maksimumområde værdierne til henholdsvis 135 og 5000. Angiv værdierne for minimum og maksimum for størrelsesforholdet til henholdsvis 0,4 og 1. Klik på OK. I feltet navn skal du ændre teksten for at læse poly og derefter klikke på OK og derefter lukke. Den Polynucleated celle maske er færdig.
  2. Opret POLY komponent masker.
    1. POLY komponent maske 1: Klik på fanen analyse , derefter masker, derefter ny, derefter funktion. Under funktion Vælg komponent, og under maske Vælg poly Mask. For ranking funktion Vælg område, og for sortering rækkefølge Klik på faldende radio knap. Indstil rang til 1. Klik på OK og derefter på OK igen.
    2. POLY komponent masker 2, 3 og 4: Gentag alle trin i 11.2.1 undtagen sæt rang til 2, 3 og 4 for at oprette de enkelte komponent masker.
  3. Spot Count ved hjælp af POLY Mask.
    1. Klik på fanen analyse , derefter funktionerog derefter ny. Vælg spot optællingfor funktions type. For maske vælge poly maske og sæt forbundethed på 4. Klik på Angiv standardnavn , og klik derefter på OK og derefter på Luk for at beregne funktions værdierne.
    2. Klik på Histogram ikonet. Vælg den ikke-apoptotiske population. Vælg funktionen spot Count_POLY_4 for funktionen X-Axis .
    3. MONO spot Count region. Klik på ikonet for lineær region. Tegn et område på tværs af placering 1 på det histogram, der er oprettet i 11.3.2. Kald dette område 1N.
    4. TRI spot Count region. Klik på ikonet for lineær region. Tegn et område på tværs af placering 3 på det histogram, der er oprettet i 11.3.2. Kald dette område 3N.
    5. QUAD MONO spot Count region. Klik på ikonet for lineær region. Tegn et område på tværs af placering 4 på det histogram, der er oprettet i 11.3.2. Kald dette område 4n.
  4. Identificere MONO populationen.
    1. Opret funktionen MONO størrelsesforhold. Klik på fanen analyse , derefter funktionerog derefter ny. Under funktions typeskal du vælge funktionen højde-bredde-forhold og under maske Vælg komponent (1, område, poly, faldende). Klik på Angiv standardnavn , og klik derefter på OK.
    2. Opret MONO cirkularitet funktionen. Klik på ny, mens vinduet funktionsstyring stadig er åbent. Under funktions typeskal du vælge funktionen cirkularitet og under maskér Vælg komponent (1, område, poly, faldende). Klik på Angiv standardnavn , og klik derefter på OK , og klik derefter på Luk for at beregne funktions værdierne.
    3. Klik på ikonet prik plot for det cirkulære mono cells dot-plot. Vælg 1N som den overordnede population. For X-aksen funktion Vælg Circularity_Component (1, område, poly, faldende) og for Y-aksen funktionen Vælg aspekt Ratio_Component (1, område, poly, faldende). Klik på OK. Klik på knappen firkantet område , og tegn en region omkring celle populationen mod den øverste højre del af plottet. Navngiv denne region Circular_1N. Højreklik på plottet og klik på regioner. Fremhæv området Circular_1N . Skift X-koordinaterne til 20 og 55, og Skift Y-koordinaterne til 0,85 og 1,0. Klik på Luk.
    4. Skabe den område POLY/Area_M07 indslag. Klik på fanen analyse , derefter funktionerog derefter ny. Under funktions typeskal du vælge område funktionen og under maske vælge komponent (1, område, poly, faldende). Klik på Angiv standardnavn , og klik derefter på OK.
    5. Når vinduet funktionsstyring stadig er åbent, skal du klikke på ny og derefter klikke på den kombinerede alternativknap under funktions type. Fremhæv Area_Component (1, område, poly, faldende) på listen over funktioner, og klik på pil ned for at føje den til Funktionsdefinitionen. Klik på divisionssymbolet (/). Vælg funktionen Area_M07, og klik på pil ned for at føje den til Funktionsdefinitionen. Klik på Angiv standardnavn , og klik på OK. Klik på Luk for at begynde at beregne funktions værdierne.
    6. For den endelige MONO population dot plot, klik på dot plot ikonet. Vælg Circular_1N som den overordnede population. For X-aksen funktion Vælg Aspect Ratio_M07 og for Y-aksen funktionen Vælg Area_Component (1, område, poly, faldende)/Area_M07. Klik på OK. Klik på knappen firkantet område , og tegn et område omkring størstedelen af cellerne. Navngiv denne region Mononucleated. Højreklik på plottet og klik på regioner. Fremhæv det Mononukleerede område. Skift X-koordinaterne til 0,85 og 1,0, og Skift Y-koordinaterne til 0,55 og 1,0. Klik på Luk.
      Bemærk: Se afsnit 11 i tillæg 1-fuld protokol for at oprette masker, funktioner og plots til at identificere de endelige trinucleated og polynucleated populationer.

12. Opret en brugerdefineret visning til at undersøge BNC og MN masker

  1. Klik på knappen Egenskaber for Billedgalleri , og klik derefter på fanen Vis . Klik på fanen kompositter , og klik derefter på ny. Under navn type Ch01/Ch07. Klik på Tilføj billede. Under billede skal du vælge Ch01 og indstille procenten til 100. Klik på Tilføj billede igen under billede Vælg Ch07 , og Angiv procenten til 100.
  2. Klik på ny og under navn type BNC og MN masker
  3. Klik på Tilføj kolonne. Under billed type Vælg Ch01 og under maske Vælg ingen
  4. Klik på Tilføj kolonne. Under billed type Vælg Ch07 og under maske Vælg ingen
  5. Klik på Tilføj kolonne. Under billed type Vælg Ch07 og under maske Vælg BNC
  6. Klik på Tilføj kolonne. Under billed type Vælg Ch07 og under maske Vælg MN Mask
  7. Klik på Tilføj kolonne. Klik på knappen sammensat radio under billed type . Det sammensatte billede Ch01/Ch07 skal føjes automatisk til visningen. Klik på OK for at lukke vinduet Egenskaber for Billedgalleri.

13. Opret en brugerdefineret visning til at undersøge POLY Mask

  1. Se afsnit 13 i tillæg 1-fuld protokol for at oprette en brugerdefineret visning til at undersøge POLY Mask

14. Opret en statistiktabel for at optælle vigtige begivenheder

  1. Klik på fanen rapporter , og klik derefter på Definer statistik rapport. Klik på Tilføj kolonneri det nye vindue.
  2. Tilføj statistikken for BNC-optællingen. Under statistik Vælg Tæl og under valgt population Vælg bncs -populationen. Klik på Tilføj statistik for at føje statistikken til listen.
  3. Gentag trin 14,2 for at oprette separate kolonner til MN BNCs-, mono-, Tri -og poly -populationer. Klik på Luk , og klik derefter på OK.
  4. Skabelonen til dataanalyse er fuldført (figur 2). Gem skabelonen (fil, Gem som skabelon). Den fulde maske liste kan findes i supplement 2-maske liste.

15. batch proces eksperiment filer ved hjælp af dataanalyse skabelon

  1. Klik på batch data filer i menuen funktioner , og klik derefter på Tilføj batch i det nye vindue.
  2. Klik på Tilføj filer i det nye vindue for at vælge de eksperiment filer (. Rif), du vil føje til batchen. Under indstillingen Vælg en skabelon eller dataanalyse (. AST,. DAF) skal du klikke på ikonet Åbn mappe for at søge efter og åbne den dataanalyse skabelon (. AST-fil), der blev gemt i trin 14,4.
  3. Klik på knappen Vis statistik rapport for at få vist statistiktabellen. Der vil ikke blive vist nogen værdier her, da de endnu ikke er beregnet. Dette trin fungerer dog som en kontrol for at sikre, at den korrekte analyse skabelon er valgt, før batchen køres.
  4. Klik på OK for at lukke det aktuelle vindue. Klik derefter på Send batches for at starte batchbehandlingen af alle filer.
  5. Når batchbehandlingen er fuldført, vil en. txt-fil være tilgængelig i den mappe, der indeholder alle. Rif-filerne. Brug disse statistikker til at beregne genotoksicitet og cytotoksicitet.

16. beregning af parametrene for genotoksicitet og cytotoksicitet

  1. Beregning af genotoksicitet: Brug statistiktabellen, som er oprettet i 15,5, til at beregne genotoksicitet. Dividerer antallet af celler i MN BNCs-populationen med antallet af celler i BNCs-populationen og multipliceres med 100:
    Equation 1
  2. Beregning af cytotoksicitet: Bestem det samlede antal POLY celler ved at opsummere antallet af TRI og QUAD-celler.
    1. Cytokinesis-blok sprednings indekset (CBPI) beregnes ved hjælp af antallet af celler i MONO, BNCs og POLY som følger:
      Equation 2
    2. Endelig beregnes cytotoksicitet af hver kultur ved hjælp af CBPI-værdierne fra kontrolkulturer (C) og kemisk eksponeret kultur (T) som følger:
      Equation 3

Representative Results

Den analysemetode, som er skitseret i dette dokument, muliggør automatisk identifikation og scoring af Bnc'er, med og uden MN, til beregning af genotoksicitet. Desuden identificeres MONO-og POLY-celler også automatisk og scoret for at beregne cytotoksicitet. Offentliggjorte scoringskriterier6,34 , der skal overholdes, når du scorer disse begivenheder er implementeret i mifc data analysis software. De viste resultater indikerer, at der kan påvises statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen med stigende cytotoksicitet efter eksponering af humane lymfoblastoid TK6 celler til velkendte MN-inducerende kemikalier (Mitomycin C og colchicin). Tilsvarende resultater for yderligere testede kemikalier er blevet påvist i en særskilt publikation32. Desuden viser resultaterne af anvendelsen af mannitol, at ikke-MN-inducerende kemikalier også kan identificeres korrekt ved hjælp af MIFC-metoden, der er skitseret her. De parametre, der er beskrevet i protokollen for at oprette alle masker, funktioner og område grænser, vil sandsynligvis skulle justeres, hvis der anvendes forskellige celletyper (f. eks. kinesiske hamster celler) til at udføre analysen.

Figur 3 viser fire udvalgte paneler for at identificere bnc'er (figur 3A-3D). Vist her er et histogram, der muliggør udvælgelse af celler med to kerner (figur 3a) og bivariate plots, der muliggør udvælgelse af bnc'er med lignende cirkularitet (figur 3B), lignende områder og intensiteter (figur 3C ) og bnc'er, der har veladskilte, ikke-overlappende kerner (figur 3D) som pr. scorekriterierne6,34. Figur 3 E viser BF-og Hoechst-billederne samt BNC-og MN-maskerne, der angiver, at bnc'er med én eller flere MN kan identificeres og optælles. Dette gør det muligt at beregne genotoksicitet ved at bestemme frekvensen af mikronukleerede Bnc'er i den endelige BNC-population. Figur 4 viser anvendelsen af spot Count funktionen ved hjælp af poly masken til at identificere mono, Tri og quad celler. Antallet af TRI-og QUAD-celler kan derefter opsummeres for at opnå det endelige antal POLY-celler (tabel 1). Dette gør det muligt at udregnes cytotoksicitet ved hjælp af formlen, der er vist i protokollen. Derfor kan hvert dosis punkt i forsøget evalueres ved både genotoksicitet og cytotoksiske parametre.

Figur 5 viser genotoksicitet og cytotoksiske værdier for aneugen colchicin, clastogen Mitomycin C og for en negativ kontrol, Mannitol. For colchicin (figur 5A) producerede 0,02 til 0,05 μg/ml-doser statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen, der spænder fra henholdsvis 1,28% til 2,44% over opløsningsmiddel kontrol (tabel 1). I tilfælde af Mitomycin C (figur 5B) producerede de to topdoser på 0,4 og 0,5 μg/ml statistisk signifikante MN-frekvenser sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol. Disse MN-frekvenser var 0,93% ved 0,4 μg/mL og 1,02% ved 0,5 μg/mL (tabel 2). Endelig for Mannitol (figur 5C) inducerede ingen testede doser en cytotoksicitet på over 30%, og de fremkalder heller ikke signifikante stigninger i MN-frekvensen sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol som forventet (tabel 3).

Figure 1
Figur 1 : Mifc instrument indstillinger. Et skærmbillede af MIFC-indstillingerne som beskrevet i afsnit trin 7 i protokollen. A) indstilling af 405 nm laser effekt til 10 MW. B) indstilling af BF-kanalerne 1 og 9. (C) valg af 60x forstørrelsesobjektiv objektiv. (D) vælge den langsomste strømningshastighed, der genererer billeder med den højeste opløsning. E) angivelse af antallet af hændelser, der skal indsamles til 20.000. (F) Klik på knappen Indlæs for at starte prøve belastnings processen. (G) Klik på knappen Hent for at begynde at hente billeder. (H) ved at klikke på Returtasten for at returnere en ubrugt prøve. (I) scatterplot af BF-størrelsesforhold versus BF-område for udvælgelse af enkeltceller. (J) scatterplot af HOECHST gradient RMS kontra BF gradient RMS for udvælgelse af fokuserede celler. K) et histogram over Hoechsts intensitet for udvælgelse af DNA-positive celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Analyse software gating strategi. Et skærmbillede af den gating strategi, der er beskrevet i afsnit 9 i protokollen. Regioner vises i sekventiel rækkefølge for identifikation af binucleerede celler (rød boks), mikronuclei (gul boks) og mono-og polynucleerede celler (blå boks). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Identifikation og scoring af Bnc'er med og uden MN. (A) udvælgelse af celler, der har to forskellige kerner. B) identifikation af binucleerede celler (bnc'er), der har to meget cirkulære kerner gennem brug af funktionen højde-bredde-intensitet. C) udvælgelse af bnc'er, der har kerner med tilsvarende områder og intensiteter. Dette opnås ved at beregne forholdet mellem arealet af både kerner og forholdet mellem størrelsesforholdet af begge kerner. (D) brug af form forhold og aspekt ratio funktioner til at identificere bnc'er, der har to veladskilte kerner. E) funktionen spot Count ved hjælp af mikronukleus (Mn)-masken, der viser, at bnc'er med en eller flere MN kan identificeres og optælles. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Identifikation og scoring af mono-og poly-celler. Brug af spot Count-funktionen til at identificere og optælle mono-, Tri-og kvadranucleerede celler. Komponent maske 1 gør det muligt at identificere mononukleerede celler (øverste billede). Komponent masker 1 til 3 gør det muligt at identificere trinucleerede celler (mellem billede). Komponent masker 1 til 4 gør det muligt at identificere kvadranucleerede celler (nederste billede). Dette tal er blevet ændret fra Rodrigues 201832. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Kvantificering af cytotoksicitet. Cytotoksicitet kvantificeret ved hjælp af cytokinese-blok sprednings indekset (sorte cirkler) og genotoksicitet kvantificeret ved hjælp af procentdelen af MN (klare søjler) efter en eksponering på 3 timer og 24 timer bedring for (a) colchicin, (B) mitomycin C og ( C) mannitol. Statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen i forhold til kontrollerne indikeres af stjerner (Chi-kvadreret test; *p < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001). Alle mængder er gennemsnittet af to replikater ved hvert dosis punkt. Dette tal er blevet ændret fra Rodrigues 201832. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: De parametre, der kræves for at beregne cytotoksicitet (antallet af mono-, bi-og polynucleerede celler) og genotoksicitet (antallet og procentdelen af mikronucleerede binucleerede celler) for colchicin. Alle beregnede mængder er gennemsnittet af to replikater ved hvert dosis punkt.

Table 2
Tabel 2: Deparametre, der kræves for at beregne cytotoksicitet (antallet af mono-, bi-og polynucleerede celler) og genotoksicitet (antallet og procentdelen af mikronucleerede binucleerede celler) for Mitomycin C. Alle beregnede mængder er gennemsnittet af to replikater ved hvert dosis punkt.

Table 3
Tabel 3: De parametre, der er nødvendige for at beregne cytotoksicitet (antallet af mono-, bi-og polynucleerede celler) og genotoksicitet (antallet og andelen af mikronucleerede binucleerede celler) for Mannitol. Alle beregnede mængder er gennemsnittet af to replikater ved hvert dosis punkt.

Supplement 1: fuld protokol. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplement 2: maske liste. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I en nylig publikation har Verma et al. understreget vigtigheden af at udvikle et system, der kombinerer fordelen ved flow cytometri med høj gennemløb med data-og billed lagrings fordelene ved billedanalyse35. MIFC in vitro-MN-analysen, der er beskrevet i dette dokument, opfylder dette citat og har potentialet til at overvinde mange af de førnævnte udfordringer i mikroskopi og flow cytometri metoder. Den protokol, der er beskrevet her, viser, at både cytotoksicitet og genotoksicitet kan evalueres ved hjælp af MIFC. Prøveforberedelse, cellulær farvning og dataindsamling er ligetil, men der er nogle kritiske trin i protokollen, der bør altid gennemføres. Tilsætning af kaliumchlorid (KCl) til cellerne er afgørende for at svulme cellerne, genererer adskillelse mellem de vigtigste kerner. Dette sikrer, at maskering algoritme kan identificere alle individuelle kerner i BNCs og POLY celler (POLY celler), som er nødvendige for deres optælling. Derudover giver KCL adskillelse mellem kerner og MN, hvilket er afgørende for nøjagtig MN-maskering og kvantitation. Desuden forhindrer anvendelsen af formalin efter tilsætning af KCl celler i at lyserende under centrifugering. Tilsætning af Cytochalasin B forårsager TK6 celler, der har gennemgået mere end én nuklear division at være ganske store. Som et resultat, cytoplasmaet bliver skrøbelig og kan lyse, hvis centrifugering udføres umiddelbart efter tilsætning af KCl. Desuden er det meget vigtigt at introducere Hoechst til stikprøven i henhold til antallet af celler i stikprøven og ikke efter en endelig koncentration. F. eks. vil en endelig koncentration på 10 μg/mL af Hoechst på en ensartet måde plette en prøve på 1 x 106 celler, men kan ikke i tilstrækkelig grad plette en prøve indeholdende 5 x 106 celler og kan resultere i mange celler med svagt farvede kerner, hvilket gør analysen vanskelig. Det er også vigtigt at bemærke, at Hoechst kan udskiftes med et andet DNA-farvestof som DAPI, hvis MIFC er udstyret med 405 nm excitation laser eller DRAQ5, hvis MIFC er udstyret med 488 nm og/eller 642nm excitation laser (s). Hvis du ændrer den nukleare plet, er det afgørende at titrere pletten for at finde den passende koncentration til den ønskede/ønskede laser effekt.

Ved indsamling af data på MIFC er det vigtigt at bestemme de optimale område grænser for gradient RMS-funktionerne. De grænser, der præsenteres i denne protokol, kan kræve justering på grund af nogle små variationer mellem MIFC-instrumenterne. Anvendelsen af denne funktion under dataindsamling er afgørende for at sikre, at meget fokuserede billeder er fanget. Hvis datafiler indeholder mange slørede eller ufokuserede billeder, er det sandsynligt, at maske algoritmerne i analysesoftwaren fejlagtigt vil fremhæve farvnings artefakter i de slørede områder, hvilket fører til et stort antal falske positive artefakter, der bliver scoret som MN. Selv om de billedbehandling teknikker, der er beskrevet her kan være svært, når en analyse skabelon er blevet udviklet i MIFC software, batchbehandling giver mulighed for datafiler, der skal analyseres automatisk, eliminere brugerintervention og derfor, scorer Bias. Også, hvis en anden cellelinje end TK6 celler bruges til at udføre analysen, vil det være nødvendigt at ændre masker og område grænser som de morfologiske egenskaber (f. eks størrelse) af celler vil afvige fra de TK6 celler.

De resultater, der præsenteres her (figur 5), viser statistisk signifikante STIGNINGER i MN-induktion, når TK6 celler eksponerer for forskellige doser af Mitomycin C og colchicin. Der blev observeret statistisk signifikante stigninger i hyppigheden af MN i forhold til opløsningsmiddel kontrol for flere doser i begge kemikalier. Desuden inducerede ingen dosis mannitol en cytotoksicitet på over 30% eller en statistisk signifikant stigning i hyppigheden af MN sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol som forventet. Den protokol, der er beskrevet i dette papir ved hjælp af MIFC til at udføre in vitro MN-analysen, giver forventede resultater fra både positive og negative kontrol kemikalier. Det er meget vigtigt at udføre en række eksperimenter ved hjælp af både opløsningsmiddel kontrol og negative kontrol kemikalier til at udvikle baselineværdier af både hyppigheden af MN samt Cytokinesis blok proliferation Index (CBPI). For genotoksicitet bestemmes statistisk signifikante stigninger i MN-frekvensen ved sammenligning med baseline MN-frekvenser, som skal være velkendte for den anvendte celletype. Desuden er alle cytotoksicitets beregninger baseret på CBPI af kontrolprøverne, og derfor skal basis satserne for MONO, BNCs og POLY celler være velkvantificerede i kontrollerne.

Flere begrænsninger og fordele ved at bruge mifc i forbindelse med MN-analysen er beskrevet i tidligere arbejde29,32. De vigtigste begrænsninger vedrører lavere MN-frekvenser i forhold til mikroskopi, hvilket formentlig skyldes både den manglende fleksibilitet ved gennemførelsen af scorekriterierne i analysesoftwaren samt den begrænsede dybde af feltet i MIFC. Velkurvede masker kan oprettes for præcist at identificere de vigtigste kerner, men MN, der rører (eller meget tæt på) de vigtigste kerner kan blive fanget i BNC masken. Desuden er meget små MN, der kan være temmelig let scoret ved hjælp af mikroskopi sandsynligvis fejlagtigt savnet, når du bruger MIFC på grund af den nedre grænse på området parameter af MN masken for at undgå at score små artefakter. Ud over de vanskeligheder i image-baserede dataanalyse, på grund af dens design, MIFC opnår to dimensionelle projektion billeder af tredimensionelle cellulære objekter. Dette sandsynligvis forårsager nogle MN at blive fanget i en anden dybde af fokus, at de to vigtigste MN, hvilket gør dem synes meget Dim og un-scorable ved hjælp af maskering. Desuden kunne en lille brøkdel af MN opholde sig bag en af de to vigtigste kerner, hvilket gør dem umulige at visualisere og score. I betragtning af disse vanskeligheder bør der derfor udvises forsigtighed ved tolkning af signifikante stigninger i MN-frekvensen ved lave doser.

På trods af disse mangler, MIFC metode beskrevet her giver flere fordele i forhold til andre teknikker. Fenech et al. foreslåede kriterier og retningslinjer, der bør tages i betragtning ved udvikling af automatiserede systemer og metodologier for MN assays36. Disse omfatter, men er ikke begrænset til, direkte visualisering af de vigtigste kerner og cytoplasma, bestemmelse af hyppigheden af MN fra forskellige doser af den kemiske eller agens, der testes, og evnen til at kvantificere morfologi og bestemme positionen af alle kerner og MN for at sikre, at de er inden for cytoplasmaet. Dette dokument viser, at MIFC-metoden, der er udviklet til at udføre in vitro-MN-analysen, opfylder disse kriterier (eller besidder potentialet til at opfylde). Specifikt kan billeder af kerner og MN optages af fluorescerende lasere, mens cytoplasmiske billeder kan opnås ved hjælp af BF LED. Billeder af celler med normal nuklear morfologi kan automatisk skelnes fra de celler med uregelmæssige morfologi ved hjælp af en kombination af avancerede masker og funktioner. De resultater, der præsenteres for colchicin og Mitomycin C (figur 5), viser, at både genotoksicitet og cytotoksicitet kan vurderes ved forskellige doser sammenlignet med opløsningsmiddel kontrol, og at der observeres statistisk signifikante MN-frekvenser, hvor Forventede. Desuden anbefaler OECD Test Guideline 487 at score 2.000 Bnc'er pr. testkoncentration for at vurdere tilstedeværelsen af MN til bestemmelse af genotoksicitet sammen med mindst 500 celler pr. testkoncentration for at bestemme cytotoksicitet9; Dette kan tage over 1 time ved hjælp af manuel mikroskopi. Protokollen og resultaterne i dette dokument viser, at et gennemsnit på omkring 6.000 BNCs, 16.000 MONO celler, og 800 POLY celler blev fanget og scoret pr testkoncentration i omkring 20 min. Den hurtige dataindsamling og det høje antal af kandidat celler, der er scoret på så kort tid, fremhæver en anden vigtig fordel ved at ansætte MIFC til at udføre in vitro-MN-analysen.

Mens de resultater, der præsenteres i dette dokument er opmuntrende, de er repræsentative for en tidlig proof-of-koncept metode. Dette arbejde bør følges op af en mere grundig undersøgelse af et større, mere mangfoldigt kemikalie sæt, der dækker flere klasser og mekanismer for genotoksicitet og cytotoksicitet, såsom dem, der er foreslået af Kirkland et al.37 gennemførelse af sådanne undersøgelser er tidskrævende og arbejdskraftintensiv, og falder uden for rammerne af dette papir men disse større skala undersøgelser vil give værdifuld indsigt i metodens evne til pålideligt at identificere svagt genotoksiske midler. Den metode, der præsenteres her, er endnu ikke blevet miniaturiseret til et strips med mikrobrønde-format, hvilket ville muliggøre en hurtigere og mere effektiv screening på tværs af et større dosisområde. Som sådan, i sin nuværende form, den MIFC-baserede in vitro MN assay præsenteret her kan være bedst egnet til arbejdsintensive opfølgende undersøgelser eller forskning i god laboratoriepraksis. Metoden vil dog fortsat blive optimeret og valideret og har potentialet til at give mulighed for øget fleksibilitet i forbindelse med påvisning af kemiske specifikke hændelser relateret til morfologi, såsom eksponering af aneugen, der øger andelen af celler med ikke-cirkulære kerner, der stadig er scorbare38. Endelig giver MIFC-metoden mulighed for at introducere yderligere biomarkører i MN-analysen (f. eks. kinetochore-farvning) for at give et mere omfattende overblik over mekanismen for MN-induktion.

Disclosures

Forfatteren er ansat af Luminex Corporation, skaberen af imagestream multispektrale Imaging flow flowcytometer, der blev brugt i dette arbejde.

Acknowledgments

Forfatteren tak Christine Probst (Luminex Corporation) for hendes bestræbelser på at udvikle tidligere former for dataanalyse skabelon, samt Dr. Haley Pugsley (Luminex Corporation) og Dr. Phil Morrissey (Luminex Corporation) til gennemgang og redigering af Manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler - 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath - PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  2. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1-2), 81-95 (2000).
  3. Fenech, M. The Lymphocyte Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome Assay and its Application in Radiation Biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 234-243 (2010).
  4. Hintzsche, H., et al. Fate of micronuclei and micronucleated cells. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 771, 85-98 (2017).
  5. Fenech, M. The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. Mutation Research. 392 (1-2), 11-18 (1997).
  6. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  7. Fenech, M., Holland, N., Chang, W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. The HUman MicroNucleus Project - An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 428 (1-2), 271-283 (1999).
  8. Kirsch-Volders, M., et al. Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 540 (2), 153-163 (2003).
  9. OECD Library. Test No. 487: In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2016).
  10. Aardema, M. J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 61-87 (2006).
  11. Clare, M. G., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 37-60 (2006).
  12. Lorge, E., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 13-36 (2006).
  13. Oliver, J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 125-152 (2006).
  14. Wakata, A., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. IV. Using CHL cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 88-124 (2006).
  15. Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 45-64 (2003).
  16. Decordier, I., et al. Automated image analysis of cytokinesis-blocked micronuclei: an adapted protocol and a validated scoring procedure for biomonitoring. Mutagenesis. 24 (1), 85-93 (2009).
  17. Decordier, I., et al. Automated image analysis of micronuclei by IMSTAR for biomonitoring. Mutagenesis. 26 (1), 163-168 (2011).
  18. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lorch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenetic and Genome Research. 104 (1-4), 383-389 (2004).
  19. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  20. Nüsse, M., Marx, K. Flow cytometric analysis of micronuclei in cell cultures and human lymphocytes: Advantages and disadvantages. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 392 (1-2), 109-115 (1997).
  21. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  22. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1-2), 78-91 (2007).
  23. Bryce, S. M., et al. Flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay with human TK6 cells: Protocol optimization and transferability assessment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 54 (3), 180-194 (2013).
  24. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: to Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research. 607 (1), 9-12 (2006).
  25. Basiji, D. A. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  26. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Automated analysis of the cytokinesis-block micronucleus assay for radiation biodosimetry using imaging flow cytometry. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 273-282 (2014).
  27. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry. Cytometry Part A. 85 (10), 883-893 (2014).
  28. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Validation of the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Health Physics. 110 (1), 29-36 (2016).
  29. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Optimized automated data analysis for the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Cytometry Part A. 89 (7), 653-662 (2016).
  30. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. The effect of an optimized imaging flow cytometry analysis template on sample throughput in the reduced culture cytokinesis-block micronucleus assay. Radiation Protection Dosimetry. 172 (1-3), 223-229 (2016).
  31. Wang, Q., et al. Automated Triage Radiation Biodosimetry: Integrating Imaging Flow Cytometry with High-Throughput Robotics to Perform the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay. Radiation Research. 191 (4), 342-351 (2019).
  32. Rodrigues, M. A. Automation Of The In vitro Micronucleus Assay Using The ImageStream® Imaging Flow Cytometer. Cytometry Part A. 93, 706-726 (2018).
  33. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C., Fenech, M. F. The potential for complete automated scoring of the cytokinesis block micronucleus cytome assay using imaging flow cytometry. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 836, 53-64 (2018).
  34. Fenech, M., et al. HUMN project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 65-75 (2003).
  35. Verma, J. R., et al. Evaluation of the automated MicroFlow® and Metafer™ platforms for high-throughput micronucleus scoring and dose response analysis in human lymphoblastoid TK6 cells. Archives of Toxicology. 91 (7), 2689-2698 (2017).
  36. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  37. Kirkland, D., et al. Updated recommended lists of genotoxic and non-genotoxic chemicals for assessment of the performance of new or improved genotoxicity tests. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 795, 7-30 (2016).
  38. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).

Tags

Bioteknik TK6 celler genotoksicitet cytotoksicitet in vitro mikronukleusassay billedbehandlings flow cytometri billedanalyse automatisering multispektral billedbehandlings flow cytometri
En automatiseret metode til udførelse af in vitro-Mikronukleusanalysen ved hjælp af multispektral billedbehandlings flow cytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodrigues, M. A. An Automated Method … More

Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter