Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En automatiserad metod för att utföra Mikrokärnanalys in vitro med hjälp av Multispektral avbildning flödescytometri

Published: May 13, 2019 doi: 10.3791/59324
Automatic Translation
1
1Biology Department, Luminex Corporation

Summary

Mikrokärnanalysen in vitro är en väletablerad metod för att utvärdera genotoxicitet och cytotoxicitet men poängsättningen av analysen med hjälp av manuell mikroskopi är mödosam och lider av subjektivitet och variabilitet mellan målgörare. Denna uppsats beskriver det protokoll som utvecklats för att utföra en helt automatiserad version av analysen med hjälp av Multispektrala Imaging Flow cytometry.

Abstract

In vitro-analys av mikrokärnor (MN) används ofta för att utvärdera cytotoxicitet och genotoxicitet men scoring analysen via manuell mikroskopi är mödosam och introducerar osäkerhet i resultaten på grund av variationer mellan SCORERS. För att avhjälpa detta har automatiserad bild skanning mikroskopi samt konventionella flödescytometri metoder införts i ett försök att ta bort målskytt bias och förbättra genomströmningen. Emellertid, dessa metoder har sina egna inneboende begränsningar såsom oförmåga att visualisera cytoplasman i cellen och avsaknaden av visuell MN verifiering eller bild datalagring med flödescytometri. Multispektrala Imaging Flow Cytometry (MIFC) har potential att övervinna dessa begränsningar. MIFC kombinerar den högupplösta fluorescerande bilden av mikroskopi med den statistiska robustheten och hastigheten hos konventionell flödescytometri. Dessutom kan alla insamlade bilder lagras i dosspecifika filer. Detta dokument beskriver det protokoll som utvecklats för att utföra en helt automatiserad version av MN-analysen på MIFC. Humana lymfoblastoid TK6 celler utvidgades med hjälp av en hypoton lösning (75 mM KCl), fast med 4% formalin och kärninnehållet färgas med Hoechst 33342. Alla prover kördes i suspension på MIFC, tillåter förvärv av högupplösta bilder av alla viktiga händelser som krävs för analysen (t. ex. binucleated celler med och utan MN samt mononukleerade och polynucleated celler). Bilder identifierades automatiskt, kategoriseras och räknas upp i MIFC dataanalysprogram vara, vilket möjliggör automatiserad bedömning av både cytotoxicitet och genotoxicitet. Resultaten visar att användning av MIFC för att utföra den in vitro-MN-analysen möjliggör statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvens som ska upptäckas vid flera olika nivåer av cytotoxicitet jämfört med kontroller av lösningsmedel efter exponering av TK6-celler för att Och kolkicin, och att inga signifikanta ökningar av MN-frekvensen observeras efter exponering för mannitol.

Introduction

Mikrokärntestet in vitro är ett vanligt förekommande test för att bedöma cytotoxicitet och genotoxicitet som screening verktyg inom flera områden såsom kemisk och farmaceutisk utveckling samt Human biologisk övervakning bland individer som utsätts för olika miljö-, arbets-eller livsstilsfaktorer1,2,3. MN bestå av kromosom fragment eller hela kromosomer som genereras under celldelning som inte ingår i en av de två huvudsakliga dotter kärnor. Efter Telophase bildar detta kromosomala material in i en individuell, rundad kropp inne i cytoplasman som är skild från någon av de viktigaste atomkärnor2. Därför är MN representativa för DNA-skador och har använts i många år som en Endpoint i genotoxicitetstester4. Den lämpligaste metoden för att mäta mn är cytokinesis-blocket mikrokärntest (cbmn)-analysen. Med hjälp av CBMN-analysen kan frekvensen av MN i binucleated Cells (BNCs) poängsätts genom att införliva Cytochalasin B (CYT-B) i provet. CYT-B tillåter Nuclear division men förhindrar cellulära Division och därmed begränsar scoring av MN till BNCs som har delat endast en gång5.

Protokoll som använder både mikroskopi och flödescytometri har utvecklats och validerats och används rutinmässigt för att utföra den in vitro-mn-analysen6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Microscopy fördelar från att kunna visuellt bekräfta att MN är legitima men är tidskrävande och benägna att variationer mellan SCORERS15. För att åtgärda detta utvecklades automatiserade mikroskopi metoder för att skanna bilder och ta bilder av kärnor och mn16,17,18,19, men cytoplasman kan inte visualiseras, vilket gör det svårt att avgöra om ett MN faktiskt är associerat med en specifik cell. Dessutom har dessa metoder svårt att identifiera polynucleated (POLY) celler (inklusive Tri-och quadranucleated celler) som krävs för beräkning av cytotoxicitet vid användning av CYT-B9. Flödescytometrimetoder som utvecklats för att utföra mn-analysen använder fluorescens samt framåt-och sido spridningsnivåer för att identifiera populationer av både atomkärnor och mn som har befriats från cellen efter lysis20,21 ,22. Detta gör att data kan förvärvas från flera tusen celler på några minuter och tillåter automatiserad analys23; men oförmåga att visualisera cellerna gör det omöjligt att bekräfta att poängsatta händelser är äkta. Dessutom, lyseringslösning cellmembranet hämmar användningen av CYT-B samt skapa en suspension som innehåller andra skräp såsom kromosom aggregat eller apoptotiska organ och det finns inget sätt att skilja dessa från MN24.

Mot bakgrund av dessa begränsningar, Multispektrala Imaging Flow Cytometry (MIFC) är ett idealiskt system för att utföra MN-analysen eftersom den kombinerar högupplöst fluorescerande bilder av mikroskopi med statistisk robusthet och hastighet konventionella flödescytometri. I mifc, alla celler introduceras i ett mikroströmning system och sedan hydrodynamiskt fokuserad i mitten av en flöde cell kuvette. Ortogonala belysning av alla celler åstadkoms genom användning av en brightfield (BF) lysdioder (LED), en sida scatter laser och (åtminstone) en fluorescerande laser. Fluorescerande fotoner fångas upp av en av tre (20x, 40x eller 60x) hög numerisk bländare objektiv och sedan passera genom en spektral nedbrytning element. Fotoner är sedan fokuserade på en laddning-kopplad enhet (CCD) kamera för att få högupplösta bilder av alla celler som passerar genom cellen flöde. För att undvika oskärpa eller ränder, fungerar CCD i tidsfördröjning integration (TDI) läge som spårar objekt genom att överföra pixelinnehåll från rad till rad ner CCD i Synchrony med hastigheten på cellen i flödet. Pixel information samlas sedan in från den sista raden med pixlar. TDI-avbildning kombinerat med spektralnedbrytning gör att upp till 12 bilder (2 BF, 10 lysrör) fångas samtidigt från alla celler som passerar genom cellen flöde. Alla tagna bilder lagras i exempelspecifika datafiler, vilket möjliggör analys som ska utföras när som helst med hjälp av MIFC dataanalysprogram vara. Slutligen behåller datafiler länken mellan cellulära bilder och prickar på alla bivariate tomter. Detta innebär att varje prick på en traditionell bivariat tomt kan markeras och dess motsvarande BF och fluorescerande bilder kommer att visas25.

Nyligen har mifc-baserade metoder utvecklats för att utföra mn-analysen för både triage Radiation biodosimetri26,27,28,29,30,31 och genetiska toxikologi32,33 testning. Detta arbete har visat att cellulära bilder av huvudsakliga kärnor, MN och cytoplasman kan avbildas med högre genomströmning än andra metoder26. Alla celltyper som krävs för analys, inklusive MONO celler, BNCs (med och utan MN), och POLY celler, kan identifieras automatiskt i MIFC dataanalysprogram vara, och genomförandet av bedömningskriterier som utvecklats av Fenech et al. åstadkoms genom användningen av olika matematiska algoritmer6,34. Resultaten från biodosimetri visade att kalibreringskurvor för dos reaktion var likartade i storleksordning som de som erhållits från andra automatiserade metoder i litteraturen vid kvantifiering av hastigheten för MN per BNC29. Dessutom, senaste arbete i toxikologi visade att bilder av MONO celler, BNCs (med och utan MN) och POLY celler kan automatiskt fångas, identifieras, klassificeras och räknas med MIFC. Protokollet och dataanalysen möjliggjorde beräkningen av cytotoxicitet och genotoxicitet efter att ha exponerar TK6 celler för flera klastogener och aneugener32.

Det protokoll som presenteras i detta dokument beskriver en metod för att utföra in vitro-MN-analysen med MIFC. Den prov bearbetningsteknik som används i detta arbete kräver mindre än 2 timmar för att bearbeta ett enda prov och är relativt lätt att utföra i jämförelse med andra metoder. Dataanalysen i MIFC-analyprogramvaran är komplicerad, men skapandet av analys mal len kan åstadkommas inom några timmar efter de steg som beskrivs i detta dokument. Dessutom, när mallen har skapats, kan den automatiskt tillämpas på alla insamlade data utan ytterligare arbete. Protokollet beskriver alla steg som krävs för att exponera TK6 celler för clastogener och aneugens, beskrivs hur man odlar, bearbetar och fläcken cellerna, och visar hur man skaffar högupplösta bilder med hjälp av MIFC. Dessutom illustrerar detta papper den nuvarande bästa praxis för att analysera data i MIFC programvara för att automatiskt identifiera och värdering MONO celler, BNCs, och POLY celler för att beräkna både cytotoxicitet och genotoxicitet.

Protocol

1. beredning av odlingssubstrat och odling av TK6 celler

Anmärkning: vissa kemikalier som används i detta protokoll är giftiga. Inandning, sväljning eller kontakt med Cytochalasin B kan vara dödligt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning inklusive en laboratorie kappa och två par nitrilhandskar. Tvätta händerna noggrant efter hantering. Formalin/formaldehyd är giftigt vid inandning eller förtäring; Irriterar ögonen, andningsorganen och huden; och kan orsaka sensibilisering vid inandning eller hudkontakt. Det finns en risk för allvarliga ögonskador. Det är en potentiell carcinogen.

  1. Förbered 565 mL 1x RPMI odlingssubstrat. Tillsätt 5 ml MEM icke-essentiella aminosyror (100x), 5 mL natriumpyruvat (100 mM), 5 mL penicillin-streptomycin-glutamin (100x), och 50 mL fetalt bovint serum (FBS) till en 500 mL flaska 1x RPMI 1640 medium. Förbered mediet i ett biosäkerhetsskåp och förvara vid 2-8 ° c. Värm mediet till 37 ° c innan du lägger till det i TK6 cellerna (se tabell över material).
  2. Tina 1 mL TK6 celler (lagrad vid-80 ° c i DMSO) i 10 mL medium. Centrifugera cellerna vid 200 x g i 8 min och aspirera på supernatanten. Överför cellerna till 50 mL media och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2. Fördubblings tiden för TK6 celler varierar från ~ 12-18 h och några (3 eller 4) passager kommer att krävas för cellerna att nå sin maximala spridnings frekvens (se tabell över material).
  3. Kultur 100 mL celler till en koncentration av ~ 7-8 x 105 celler/ml.

2. beredning av klastogener och/eller aneugener och Cytochalasin B

  1. Bered lämpliga lager koncentrationer av önskade klastogener och aneugener. Till exempel, för mitomycin C, lös upp en hel 2 mg flaska i 10 mL sterilt vatten för att uppnå en slutlig lager koncentration på 200 μg/mL. Mitomycin C kan förvaras vid 4 ° c i tre månader (se tabell över material).
  2. På experiment dagen, Förbered spädningar av de önskade kemikalierna som är antingen 10-faldigt eller 100-faldigt högre än de önskade exponerings koncentrationerna om spädning i sterilt vatten eller DMSO, respektive.
  3. För mitomycin C, Bered 3 mL spädningar i sterilt vatten på 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 och 5,0 μg/mL. För kolkicin, Förbered 3 mL spädningar i sterilt vatten på 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 och 0,5 μg/mL. Slutligen, för mannitol, Förbered 3 mL spädningar i sterilt vatten på 5, 10, 20, 30, 40 och 50 mg/mL.
  4. Bered en 200 μg/mL-lagerkoncentration av Cytochalasin B genom att lösa upp en 5 mg-flaska i 25 mL DMSO. Cytochalasin B kan förvaras vid-20 ° c i flera månader.

3. exponering av celler för klastogener och/eller aneugener

  1. Tillsätt 1 mL av önskad kemikalie (t. ex. mitomycin C) till 9 mL celler vid ~ 7-8x105 celler/ml i en T25 kolv. Tillsätt 1 mL sterilt vatten för kontrollproverna. Placera flaskarna i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator för 3 h.
    Anmärkning: om kemikalier späds i DMSO, tillsätt endast 100 μL av kemikalien i varje kolv och tillsätt 100 μL DMSO till kontroller. Varje kolv bör innehålla 9,900 mL celler.
  2. Efter 3 h, avlägsna flaskarna från inkubatorn och överför cellerna till 15 mL Polypropenrör. Centrifugera vid 200 x g i 8 min, aspirera på supernatanten och överför celler till nya T25 flaskor innehållande totalt 10 ml färskt odlingssubstrat. Tillsätt 150 μL av lager koncentrationen (200 μg/mL) av Cytochalasin B till varje kolv för att uppnå en slutlig koncentration på 3 μg/mL.
  3. Returnera kolvar till 37 ° c, 5% CO2 inkubator för en återhämtningstid som motsvarar 1,5-2,0 fördubblings tider, enligt rekommendationer från OECD: s riktlinjer9. För de TK6 celler som används i detta arbete var återhämtningstiden 24 timmar.
    Obs: fördubblings tiden för de TK6 celler som används här var 15 h och en återhämtningstid på 24 h (1,6 fördubblings tider) användes. Återhämtning gånger mindre än 1,5 dubblering gånger kommer att minska spridningen i prover som utsätts för högre doser som påverkar antalet BNCs. omvänt kommer återhämtningstider på mer än 2,0 att producera ett oproportionerligt stort antal polynucleerade celler i kontrollprover, och skevning cytotoxicitetsberäkningar.

4. beredning av buffertar för fixering och märkning av DNA-innehåll (se tabell över material)

  1. Bered 75 mm kaliumklorid (KCL) genom att tillsätta 2,79 g till 500 ml ultrarent vatten. Rör om lösningen i 5 minuter med en magnetomrörare och ett sterilt filter genom ett 200 μm filter. 75 mM KCl-lösningen kan förvaras vid 4 ° c i flera månader.
  2. Förbered en tillräcklig mängd av 4% formalin för experimentet, förutse att totalt 2,1 mL måste tillsättas till varje prov. Till exempel, för att förbereda 10 mL 4% formalin, tillsätt 4 mL av 10% formalin lager till 6 mL 1x Dulbecco s fosfatbuffrad saltlösning utan ca2 + eller mg2 + (PBS). Denna 4% formalin kan förvaras i rumstemperatur i flera veckor.
  3. Bered 510 mL tvättbuffert (2% FBS i 1X PBS) genom att tillsätta 10 mL FBS till en 500 mL flaska 1x PBS.
  4. Bered 10 mL av en 100 μg/mL koncentration av Hoechst 33342 genom att tillsätta 100 μL av stam koncentrationen (1 mg/mL) till 9 900 μL 1X PBS. Hoechst 33342-lösningen kan förvaras vid 4 ° c i flera månader.

5. provbehandling: hypotonisk svullnad, fixering, cellräkning och märkning DNA-innehåll

  1. Ta bort alla flaskor från inkubatorn i slutet av återhämtningsperioden och överför alla prover till 15 mL Polypropenrör. Centrifugera alla prover på 200 x g i 8 min.
  2. Aspirera på supernatanten, Omsuspendera cellerna och tillsätt 5 mL 75 mM KCl. Blanda försiktigt genom inversion tre gånger och inkubera vid 4 ° c i 7 min.
  3. Tillsätt 2 mL 4% formalin till varje prov, blanda försiktigt med inversion tre gånger och inkubera vid 4 ° c i 10 minuter. Detta steg fungerar som en "mjuk fixering".
  4. Centrifugera alla prover på 200 x g för 8 min. Aspirera supernatanten och Omsuspendera i 100 μl av 4% formalin för 20 min. Detta steg fungerar som en "hård fixering".
  5. Tillsätt 5 mL tvättbuffert och centrifugera vid 200 x g i 8 min. aspirera på supernatanten och Omsuspendera i 100 μl tvättbuffert.
  6. Överför alla prover till 1,5 mL microcentrifug rör.
  7. Utför ett cellantal för varje prov för att bestämma antalet celler per prov. Proverna kommer att vara mycket koncentrerade så en 1:100 spädning i 1x PBS (10 μL prov i 990 μL PBS) kommer sannolikt att krävas för att få en korrekt räkning.
    ANMÄRKNINGAR: på denna punkt är det bäst att utföra cell räkningar med hjälp av en hemocytometer. Lägga KCl ger cytoplasman ett genomskinligt utseende, vilket gör det svårt för automatiserade cell räknare att känna igen dem. Dessutom har automatiserade räknare svårt att göra upp polynucleated celler på grund av sin storlek.
  8. Om proverna inte körs på MIFC omedelbart kan de förvaras vid 4 ° c i flera dagar. När du är redo att köra prover, tillsätt 5 μL 100 μg/mL per 1x106 celler/ml till varje prov. Tillsätt också 10 μL 500 μg/mL RNase per 100 μL prov för en slutlig koncentration på 50 μg/mL. Inkubera proverna vid 37 ° c, 5% CO2 i 30 min.
  9. Mikrocentrifugera alla prover på 200 x g i 8 min och Använd en pipett för att avlägsna supernatanten som lämnar ~ 30 μl. Använd en pipett för att Omsuspendera alla prover innan du kör på MIFC och se till att det inte finns några bubblor i röret. Skaka inte.

6. Starta och kalibrera MIFC

  1. Se till att slidan, system kalibrering reagens, debubbler, Cleanser och autoklav behållare är fulla och avfallstanken är tom. Slå på systemet och dubbelklicka på ikonen för MIFC-programvaran. Klicka på knappen Start och kontrollera att kryssrutan starta alla kalibreringar och tester är markerad. Detta kommer att spola systemet, Last mantel och system kalibrerings reagenser, och kalibrera systemet (se tabell över material).

7. köra prover på MIFC

Obs: detta avsnitt förutsätter användning av en 2 kamera MIFC. Om du använder en 1 kamera MIFC, se tillägg 1-fullt protokoll, avsnitt 7 för skapandet av tomter under förvärvet

  1. Starta programvaran MIFC Data Acquisition (se tabell över material). Bild 1 visar instrumentets inställningar. Slå på 405 nm-lasern och Ställ in lasereffekten på 10 mW (a). Avaktivera alla andra lasrar (inklusive SSC) och Ställ BF till kanalerna 1 och 9 (B). Kontrollera att förstorings reglaget är inställt på 60x (C), hög känslighets läge är valt (D) och att endast kanalerna 1, 7 och 9 visas i bildgalleriet.
  2. Klicka på ikonen scatterplot . Välj all population och välj Area M01 på X-axeln och bildförhållandet M01 på Y-axeln. Klicka på ikonen fyrkantig region och rita en region runt enskilda celler. Namnge den här regionen enstaka celler. Högerklicka på tomten och välj regioner. Markera regionen för enskilda celler och ändra x-koordinaterna till 100 och 900 och ändra y-koordinaterna till 0,75 och 1 (figur 1I).
  3. Klicka på ikonen scatterplot . Välj enstaka celler som överordnad population, Välj gradient RMS M01 på X-axeln och lutningen RMS M07 på Y-axeln. Klicka på ikonen fyrkantig region och rita en region runt majoriteten av cellerna. Namnge regionen fokuserade celler. Högerklicka på tomten och välj regioner. Markera regionen med fokus celler och ändra x-koordinaterna till 55 och 75 och ändra y-koordinaterna till 9,5 och 20 (figur 1J).
  4. Klicka på histogramikonen . Välj populationen med fokuserade celler och välj intensitet M07 som funktion. Klicka på ikonen för den linjära regionen och rita en region över huvudtoppen i histogrammet. Namnge denna region DNA-realitet. Högerklicka på tomten och välj regioner. Markera den DNA-positiva regionen och ändra koordinaterna till 2 x 105 och 2 x 106. Intervallet kan behöva justeras beroende på intensitetstoppen på histogrammet (figur 1K).
  5. Ställ in förvärvs parametrarna (figur 1E). Ange filnamnet och destinationsmappen, ändra antalet händelser till 20 000 och välj den DNA-positiva populationen.
  6. Klicka på load (figur 1F) och placera kontrollprovet i mifc. Klicka på knappen Hämta för att samla in data (figur 1G). När förvärvet är klart, klicka på RETUR -knappen för att returnera provet (figur 1H). Ta bort provröret från instrumentet. Upprepa den här processen för alla återstående prover i experimentet.

8. öppna en datafil i idéer

  1. Starta programvarupaketet MIFC Analysis (se tabellen med material). Klicka på Starta analys för att starta guiden öppna fil. Välj en datafil genom att bläddra till den önskade RAW-avbildningsfilen (. RIF). Klicka på knappen Öppna och klicka på Nästa.
  2. Eftersom detta är en enda färganalys, är kompensation inte nödvändigt så klicka på Nästa för att kringgå kompensations steget. I det här skedet finns ingen analysmall att tillämpa, så klicka på Nästa igen. Om analys mal len har hämtats från tilläggsmaterialet väljer du den nu. Dessa mallar fungerar bara med en 2 kamera MIFC med BF inställd på kanalerna 1 och 9 och nukleära bilder i kanal 7 under förvärvet.
  3. Som standard genereras filnamnen. cif och. DAF automatiskt för att matcha. RIF. Det rekommenderas inte att ändra namnen på. cif och. DAF. Klicka på Nästa. Ställ in bild visningsegenskaperna genom att välja 01 och 07. Klicka på Nästa. Det finns ingen guide för det här programmet, så klicka på Slutför. Det är mycket viktigt att spara dataanalys filen (. DAF) och analys mal len (. AST) ofta under avsnitten 9 – 14 för att undvika förlust av framsteg.

9. skapa masker och funktioner för att identifiera BNCs

  1. Klicka på ikonen Bildgalleri egenskaper (blå/vit ikon). På fliken Bildskärmsegenskaper klickar du på ange intervall till pixel data och ändrar sedan färgen till gult. Klicka på OK. Hoechst bilder är nu lättare att se mot den svarta bakgrunden.
  2. Skapa den icke-apoptotiska celler tomt.
    1. Klicka på fliken analys och sedan på masker. Klicka på ny och sedan på funktion. Under Välj tröskelvärdeför funktion under mask väljer du M07 och anger intensitetsprocenten till 50. Klicka på OK och sedan på OK igen. Klicka på Stäng.
    2. Klicka på fliken analys , klicka på funktioner ochsedan på ny. För funktionstypen Välj område. För mask väljer du tröskelvärdet (M07, Ch07, 50). Klicka på ange standardnamn och klicka på OK. Klicka på Stäng för att börja beräkna funktionsvärdena.
    3. Klicka på dot Plot -ikonen. Välj alla population. För funktionen X-Axis väljer du funktionen Contrast_M01_Ch01 och för Y-Axelfunktionen väljer du Area_Threshold (M07, Ch07, 50). Klicka på OK.
    4. Klicka på knappen fyrkantig region och rita en region runt majoriteten av cellerna. Kalla denna region icke-apoptotiska. Högerklicka på tomten och klicka på regioner. Markera den icke-apoptotiska regionen. Ställ in x-koordinaterna till 0 och 15 och Ställ in y-koordinaterna till 50 och 300. Klicka på Stäng.
  3. Skapa BNC-masken (steg 9.3.1-9.3.5) för att identifiera celler som bara innehåller två kärnor.
    1. Bläddra efter en BNC i bildgalleriet och klicka på den. Detta för att visualisera skapandet av masken i Hoechst kanal.
    2. Klicka på fliken analys och sedan på masker. Klicka på ny och sedan på funktion. Under funktion Välj Levelset, under mask Välj M07, välj alternativknappen mellannivå mask och Ställ in kon tur detalj skalan till 3,00. Klicka på OK och sedan på OK igen.
    3. Klicka på ny och sedan på funktion. Under funktionväljer du Dilateoch under mask väljer du Levelset (M07, Ch07, mitten, 3). Ange att bilden ska visas till Ch07och ange antalet pixlar till 2. Klicka på OK och sedan på OK igen.
    4. Klicka på ny och sedan på funktion. Under funktion Välj vattendelare, och under mask Välj vidga (Levelset (M07, Ch07, mitten, 3) 2). Ange att bilden ska visas till Ch07och Ställ in linjetjockleken på 1. Klicka på OK och sedan på OK igen.
    5. Klicka på ny och sedan på funktion. Under funktion Välj område, under mask Välj vattendelare (vidga (Levelset (M07, Ch07, mitten, 3) 2)). Ange att bilden ska visas på Ch07. Ange lägsta och högsta områdes värden till 115 respektive 5000. Ställ in de lägsta och högsta proportionerna till 0,4 respektive 1. Klicka på OK. I namn fältet ändra texten för att läsa BNC klicka sedan på OK.
  4. Skapa funktioner och tomter för att få den slutliga BNC befolkningen
    1. Spot Count BNC funktion: Klicka på fliken analys , sedan funktioner, sedan ny. För funktionstypen Välj antal spot. För maskväljer du den slutliga BNC-masken som skapats i 9.3.5. Ställ in samhörighet till fyra och ändra namnet till spot Count BNC. Klicka på OK och sedan på Stäng för att beräkna funktionsvärdena.
    2. Fläck räkna BNC histogram. Klicka på histogramikonen . Välj icke-apoptotiska som den överordnade populationen. För X-axelns funktion väljer du funktionen spot Count BNC . Klicka på OK. Klicka på ikonen för den linjära regionen. Rita en region över fack 2. Anropa den här regionen 2n.
      Anmärkning: se avsnitt 9 i tillägg 1-fullt protokoll för att skapa de återstående masker, funktioner och tomter för att identifiera den slutliga BNC populationen

10. skapa masker och funktioner för att identifiera MN inom BNC befolkningen

  1. Skapa MN-masken. Bläddra efter en BNC som innehåller en MN i bildgalleriet och klicka på den. Detta för att visualisera skapandet av MN mask i Hoechst kanalen. Klicka på fliken analys och sedan på masker.
    1. Skapa plats identifierings mask 1:
      1. Klicka på ny och sedan på funktion. Under funktion Välj plats och se till att den ljusa radioknappen är vald. Under mask väljer M07, Ställ in punkten till cell bakgrunds förhållandet till 2,00. Ställ in minsta radie på 2 och den maximala radien till 6. Klicka på OK och sedan på OK igen.
      2. Klicka på ny och sedan på funktion. Under funktion Välj område, och under mask väljer Levelset (M07, Ch07, mitten, 3). Ange att bilden ska visas på Ch07. Ställ in minsta och största område till 80 respektive 5000. Ange det lägsta och högsta bildförhållandet till 0 respektive 1. Klicka på OK och sedan på OK igen.
      3. Klicka på ny och sedan på funktion. Under funktion Välj Dilate, under mask Välj område (levelset (M07, Ch07, mitten, 3), 80-5000, 0-1). Ange att bilden ska visas på Ch07. Ange antalet pixlar till 2. Klicka på OK och sedan på OK igen.
      4. Klicka på ny. Dubbelklicka på platsen (M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) mask för att lägga till den i mask definitionen. Klicka på operatorn och och sedan på operatorn not . Dubbel klick den vidga (spänna (LevelSet (M07, Ch07, mellersta, 3), 80-5000, 0-1), 2) mask till tillägga den till mask definitionen. Klicka på OK.
      5. Klicka på nyoch sedan på Function. Under funktion Välj område och under mask Välj den mask som skapats i 10.1.1.4:
        1. Välj spot (M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2) och inte vidga (intervall (Levelset (M07, Ch07, mitten, 3), 80-5000, 0-1), 2).
        2. Ange att bilden ska visas på Ch07. Ställ in minimum och maximum område till 10 och 80, respektive. Ställ in det lägsta och högsta proportionerna till 0,4 respektive 1. Klicka på OK och sedan på OK igen. Spot Identification mask 1 är klar.
          Anmärkning: se avsnitt 10 i tillägg 1-fullt protokoll för att skapa masker, funktioner och tomter för att identifiera den slutliga MN befolkningen

11. skapa masker, funktioner och tomter för att identifiera Mononukleerade och Polynucleated populationer

  1. Skapa POLY mask. Klicka på analys, sedan masker, sedan ny funktion. Under funktion Välj område, under mask Välj vattendelare (vidga (Levelset (M07, Ch07, mitten, 3), 2)). Ange att bilden ska visas på Ch07. Ange lägsta och högsta områdes värden till 135 respektive 5000. Ställ in de lägsta och högsta proportionerna till 0,4 respektive 1. Klicka på OK. I namn fältet, ändra texten för att läsa Poly klicka sedan på OK och Stängsedan. Den Polynucleated cell masken är klar.
  2. Skapa POLY Komponentmasker.
    1. POLY komponent mask 1: Klicka på fliken analys , sedan masker, sedan ny, sedan funktion. Under funktion Välj komponent, och under mask väljer Poly mask. För rangordning funktionen Välj område, och för sortering ordning Klicka på fallande alternativknapp. Ange Rank till 1. Klicka på OK och sedan på OK igen.
    2. POLY komponent masker 2, 3 och 4: Upprepa alla steg i 11.2.1 utom ange Rank till 2, 3 och 4 för att skapa enskilda komponentmasker.
  3. Spot räkna med POLY mask.
    1. Klicka på fliken analys , sedan på funktioneroch sedan på ny. Välj plats antalför funktionstyp. För mask välja Poly mask och ställa samhörighet vid 4. Klicka på ange standardnamn och klicka på OK och sedan på Stäng för att beräkna funktionvärdena.
    2. Klicka på histogramikonen. Välj den icke-apoptotiska populationen. För funktionen X-Axis väljer du funktionen spot Count_POLY_4 .
    3. MONO spot Count region. Klicka på ikonen för den linjära regionen. Rita en region över fack 1 på histogrammet som skapats i 11.3.2. Anropa denna region 1N.
    4. TRI spot Count region. Klicka på ikonen för den linjära regionen. Rita en region över fack 3 på histogrammet som skapats i 11.3.2. Anropa den här regionen 3N.
    5. Antal QUAD MONO spot Count region. Klicka på ikonen för den linjära regionen. Rita en region över bin 4 på histogrammet som skapats i 11.3.2. Anropa den här regionen 4n.
  4. Identifiera MONO populationen.
    1. Skapa funktionen MONO-proportioner. Klicka på fliken analys , sedan på funktioneroch sedan på ny. Under funktionstypväljer du funktionen Bildbreddsförhållande och under Välj komponent för mask (1, område, Poly, fallande). Klicka på ange standardnamn och klicka sedan på OK.
    2. Skapa funktionen för MONO-cirkularitet. Klicka på nynär funktions hanterarens fönster fortfarande är öppet. Under funktionstypväljer du funktionen cirkularitet och under Välj komponent för mask (1, område, Poly, fallande). Klicka på ange standardnamn och klicka sedan på OK och sedan på Stäng för att beräkna funktionvärdena.
    3. För de cirkulära MONO-cellerna dot Plot, klicka på dot Plot ikonen. Välj 1N som överordnad population. För funktionen X-axel väljer du Circularity_Component (1, Area, Poly, fallande) och för Y-axelns funktion väljer du aspekt Ratio_Component (1, Area, Poly, fallande). Klicka på OK. Klicka på knappen fyrkantig region och rita en region runt cellpopulationen mot den övre högra delen av tomten. Namnge regionen Circular_1N. Högerklicka på tomten och klicka på regioner. Markera regionen Circular_1N . Ändra X-koordinaterna till 20 och 55 och ändra Y-koordinaterna till 0,85 och 1,0. Klicka på Stäng.
    4. Skapa området POLY/Area_M07 funktionen. Klicka på fliken analys , sedan på funktioneroch sedan på ny. Under funktionstypväljer du områdes funktionen och under Välj komponent för mask (1, område, Poly, fallande). Klicka på ange standardnamn och klicka sedan på OK.
    5. När fönstret funktionshanterare fortfarande är öppet klickar du på nytt och sedan under funktionstyp klickar du på den kombinerade alternativknappen. I listan över funktioner markerar du Area_Component (1, Area, Poly, fallande) och klickar på nedåtpilen för att lägga till den i funktionsdefinitionen. Klicka på delningssymbolen (/). Välj funktionen Area_M07 och klicka på nedpilen för att lägga till den i funktionsdefinitionen. Klicka på ange standardnamn och klicka på OK. Klicka på Stäng för att börja beräkna funktionsvärdena.
    6. För den slutliga MONO population dot Plot, klicka på dot Plot ikonen. Välj Circular_1N som överordnad population. För X-Axelfunktionen Välj aspekt Ratio_M07 och för Y-Axelfunktionen Välj Area_Component (1, Area, Poly, fallande)/Area_M07. Klicka på OK. Klicka på knappen fyrkantig region och rita en region runt majoriteten av cellerna. Namnge denna region mononucleated. Högerklicka på tomten och klicka på regioner. Markera den Mononukleerade regionen. Ändra X-koordinaterna till 0,85 och 1,0 och ändra Y-koordinaterna till 0,55 och 1,0. Klicka på Stäng.
      Anmärkning: se avsnitt 11 i tillägg 1-fullt protokoll för att skapa masker, funktioner och tomter för att identifiera den slutliga trinucleated och polynucleated populationer.

12. skapa en anpassad vy för att undersöka BNC-och MN-masker

  1. Klicka på Bildgalleri egenskaper knappen och klicka sedan på utsikt fliken. Klicka på fliken kompositer och klicka sedan på ny. Under namntyp Ch01/Ch07. Klicka på Lägg till bild. Under bild väljer du Ch01 och anger procent till 100. Klicka på Lägg till bild igen, under bild Välj Ch07 och ange procent till 100.
  2. Klicka på ny och under namn typ BNC och mn masker
  3. Klicka på Lägg till kolumn. Under Bildtyp Välj Ch01 och under mask Välj ingen
  4. Klicka på Lägg till kolumn. Under Bildtyp Välj Ch07 och under mask Välj ingen
  5. Klicka på Lägg till kolumn. Under Bildtyp väljer du Ch07 och under mask väljer du BNC
  6. Klicka på Lägg till kolumn. Under Bildtyp Välj Ch07 och under mask väljer mn mask
  7. Klicka på Lägg till kolumn. Klicka på den sammansatta radioknappen under Bildtyp . Den sammansatta bilden Ch01/Ch07 ska automatiskt läggas till i vyn. Klicka på OK för att stänga fönstret Egenskaper för bildgalleriet.

13. skapa en anpassad vy för att undersöka POLY mask

  1. Se avsnitt 13 i tillägg 1-fullt protokoll för att skapa en anpassad vy för att undersöka POLY mask

14. skapa en statistiktabell för att räkna upp viktiga händelser

  1. Klicka på fliken rapporter och klicka sedan på definiera statistikrapport. Klicka på Lägg till kolumneri det nya fönstret.
  2. Lägg till antalet BNC-siffror. Under statistik väljer du antal och under vald population väljer du BNCs -populationen. Klicka på Lägg till statistik för att lägga till statistiken i listan.
  3. Upprepa steg 14,2 för att skapa separata kolumner för mn BNCs, mono, Tri och Poly populationer. Klicka på Stäng och sedan på OK.
  4. Dataanalys mal len är slutförd (figur 2). Spara mallen (fil, Spara som mall). Fullständig mask lista finns i tillägg 2-mask lista.

15. satsvis process experiment filer med hjälp av dataanalys mal len

  1. Under verktyg -menyn klickar du på batchdatafiler och sedan på Lägg till bunt i det nya fönstret.
  2. I det nya fönstret klickar du på Lägg till filer för att välja experimentets filer (. RIF) att lägga till i batchen. Under alternativet Välj en mall eller dataanalys fil (. AST,. DAF) klickar du på ikonen Öppna mapp för att bläddra till och öppna dataanalys mal len (. AST-filen) som sparades i steg 14,4.
  3. Klicka på knappen Förhandsgranska statistikrapport om du vill förhandsgranska statistiktabellen. Inga värden visas här eftersom de ännu inte har beräknats. Det här steget fungerar dock som en kontroll för att säkerställa att rätt analys mal len har valts innan du kör batchen.
  4. Klicka på OK för att stänga det aktuella fönstret. Klicka sedan på Skicka journaler för att starta batchbearbetningen av alla filer.
  5. När batchbearbetningen har slutförts kommer en. txt-fil att vara tillgänglig i mappen som innehåller alla. RIF-filer. Använd denna statistik för att beräkna genotoxicitet och cytotoxicitet.

16. beräkning av parametrarna för genotoxicitet och cytotoxicitet

  1. Beräkning av genotoxicitet: för att beräkna genotoxicitet, Använd statistiktabellen som skapades i 15,5. Dividera antalet celler i MN BNCs-populationen med antalet celler i BNCs-populationen och multiplicera sedan med 100:
    Equation 1
  2. Beräkna cytotoxicitet: Bestäm det totala antalet POLY celler genom att summera antalet TRI och QUAD celler.
    1. Beräkna det Cytokinesis-Blockspridningsindex (CBPI) genom att använda antalet celler i MONO, BNCs och POLY enligt följande:
      Equation 2
    2. Beräkna slutligen cytotoxiciteten för varje kultur genom att använda CBPI-värdena från kontrollkulturerna (C) och den kemiskt exponerade kulturen (T) enligt följande:
      Equation 3

Representative Results

Den analysmetod som beskrivs i detta dokument möjliggör automatisk identifiering och poängsättning av BNCs, med och utan MN, för att beräkna genotoxicitet. Dessutom, MONO och POLY celler identifieras också automatiskt och Poäng för att beräkna cytotoxicitet. Publicerade bedömningskriterier6,34 som måste följas vid bedömning av dessa händelser genomförs i mifc dataanalysprogram vara. De resultat som presenteras här tyder på att statistiskt signifikanta ökningar i MN frekvens med ökande cytotoxicitet kan upptäckas efter exponering av humana lymfoblastoid TK6 celler till välkända MN inducerande kemikalier (mitomycin C och Kolchixin). Liknande resultat för ytterligare testade kemikalier har visats i en separat publikation32. Dessutom visar resultaten från användningen av mannitol att icke-MN-inducerande kemikalier också kan identifieras korrekt med hjälp av MIFC-metoden som beskrivs här. Parametrarna som beskrivs i protokollet för att skapa alla masker, funktioner och områdesgränser kommer sannolikt att behöva justeras om olika celltyper (t. ex. kinesiska hamster celler) används för att utföra analysen.

Figur 3 visar fyra valda paneler för att identifiera BNCs (figur 3A-3D). Här visas ett histogram som gör det möjligt att välja ut celler med två kärnor (figur 3a) och bivariat som gör det möjligt att välja BNCs med liknande cirkulär (figur 3B), liknande områden och intensiteter (figur 3C ) och BNCs som har väl separerade, icke-överlappande kärnor (figur 3D) enligt poängsättningen frågevillkoret6,34. Figur 3 E visar BF och Hoechst bilder samt BNC och mn masker som indikerar att BNCs med en eller flera mn kan identifieras och räknas. Detta gör det möjligt att beräkna genotoxicitet genom att fastställa frekvensen av BNCs med mikrokärnor i den slutliga BNC-populationen. Figur 4 visar tillämpningen av funktionen spot Count med hjälp av poly mask för att identifiera mono, Tri och quad celler. Antalet TRI-och QUAD-celler kan sedan summeras för att erhålla det slutliga antalet POLY-celler (tabell 1). Detta gör det möjligt att beräkna cytotoxicitet med hjälp av formeln som visas i protokollet. Därför kan varje dos punkt i experimentet utvärderas med både genotoxicitet och cytotoxicitetsparametrar.

Figur 5 visar genotoxicitet och cytotoxicitetsvärden för aneugen kolkicin, klastogen Mitomycinc och för en negativ kontroll, mannitol. För kolkicin (figur 5A) gav doserna 0,02 till 0,05 μg/ml statistiskt signifikanta ökningar i mn-frekvens, från 1,28% till 2,44% över lösningsmedels kontrollen (tabell 1). När det gäller mitomycin C (figur 5B) producerade de två översta doserna 0,4 och 0,5 μg/ml statistiskt signifikanta mn-frekvenser jämfört med kontroller av lösningsmedel. Dessa MN-frekvenser var 0,93% vid 0,4 μg/mL och 1,02% vid 0,5 μg/mL (tabell 2). Slutligen, för mannitol (figur 5C), inga testade doser inducera en cytotoxicitet över 30%, inte heller de producerar betydande ökningar i mn frekvens jämfört med lösningsmedel kontroller, som förväntat (tabell 3).

Figure 1
Figur 1 : Inställningar för Mifc-instrument. En skärmbild av MIFC-inställningarna enligt beskrivningen i avsnitt steg 7 i protokollet. A) inställning av 405 nm lasereffekt till 10 MW. (B) ställa in BF kanalerna 1 och 9. (C) välja objektivet 60x förstorings objektiv. (D) välja den långsammaste flödeshastigheten som genererar bilder med den högsta upplösningen. E) specificera antalet händelser som ska samlas in till 20 000. (F) Klicka på knappen load för att påbörja prov laddningsprocessen. (G) Klicka på knappen Hämta för att börja skaffa bilder. (H) Klicka på Return -knappen för att returnera eventuellt oanvänt prov. (I) scatterplot av BF aspektförhållande kontra BF område för val av enstaka celler. (J) scatterplot av Hoechst lutning RMS kontra BF lutning RMS för val av fokuserade celler. (K) histogram över Hoechst intensitet för val av DNA-positiva celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Analysprogramvara gating strategi. En skärmdump av den gating strategi som beskrivs i avsnitt 9 i protokollet. Regioner visas i sekventiell ordning för identifiering av binucleated celler (röd ruta), mikrokärnor (gul ruta), och mono-och polynucleated celler (blå ruta). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Identifiering och poängsättning av BNCs med och utan mn. (A) val av celler som har två distinkta kärnor. B) identifiering av binucleerade celler (BNCs) som har två mycket cirkulära kärnor genom användning av funktionen för proportioner. C) urval av BNCs som har kärnor med liknande områden och intensiteter. Detta åstadkoms genom att beräkna förhållandet mellan området av både kärnor och förhållandet mellan proportionerna av båda kärnor. Danvändning av form kvoten och proportionerna för att identifiera BNCs som har två väl avgränsade kärnor. (E) funktionen spot Count med hjälp av mikrokärnmasken (MN) som visar att BNCs med en eller flera mn kan identifieras och räknas upp. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Identifiering och poängsättning av mono-och Poly-celler. Användning av funktionen spot Count för att identifiera och räkna upp mono-, Tri-och quadranucleated celler. Komponent mask 1 gör det möjligt att identifiera mononukleerade celler (översta bilden). Komponentmasker 1 till 3 gör det möjligt att identifiera trinukleerade celler (mellersta bilden). Komponentmasker 1 till 4 möjliggör identifiering av quadranucleated celler (botten bild). Denna siffra har modifierats från Rodrigues 201832. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Kvantifiering av cytotoxicitet. Cytotoxicitet kvantifieras med hjälp av cytokinesi-blockspridningsindex (svarta cirklar) och genotoxicitet som kvantifierats med hjälp av den procentuella andelen MN (genomskinliga staplar) efter en exponering på 3 timmar och 24 h återhämtning för (a) kolkicin, (B) mitomycinc och ( C) mannitol. Statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvens jämfört med kontroller indikeras med stjärnor (Chi-kvadrattest, *p < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001). Alla kvantiteter är medelvärdet av två replikat vid varje dos punkt. Denna siffra har modifierats från Rodrigues 201832. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Table 1
Tabell 1: De parametrar som krävs för att beräkna cytotoxicitet (antalet mono-, bi-och polynucleated celler) och genotoxicitet (antalet och procent av mikrokärnor binucleated celler) för kolkicin. Alla beräknade kvantiteter är genomsnittet av två replikat vid varje dos punkt.

Table 2
Tabell 2: Deparametrar som krävs för att beräkna cytotoxicitet (antalet mono-, bi-och polynucleerade celler) och genotoxicitet (antal och procent av mikrokärnbaserade binukleerade celler) för mitomycin C. Alla beräknade kvantiteter är genomsnittet av två replikat vid varje dos punkt.

Table 3
Tabell 3: De parametrar som krävs för att beräkna cytotoxicitet (antalet mono-, bi-och polynucleated-celler) och genotoxicitet (antalet och procentandelen av de binucleerade cellerna i mikrokärnor) för mannitol. Alla beräknade kvantiteter är genomsnittet av två replikat vid varje dos punkt.

Tillägg 1: fullständigt protokoll. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Tillägg 2: mask lista. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Discussion

I en nyligen publikation Verma et al. underströk vikten av att utveckla ett system som kombinerar den höga genomströmningen fördelen av flödescytometri med data och bildlagring fördelarna med bildanalys35. Den MIFC in vitro-MN-analysen som beskrivs i detta dokument uppfyller detta citat och har potential att övervinna många av de ovan nämnda utmaningarna i mikroskopi och flödescytometri metoder. Det protokoll som beskrivs här visar att både cytotoxicitet och genotoxicitet kan utvärderas med hjälp av MIFC. Provberedning, cellulär färgning och datainsamling är enkla men det finns några kritiska steg i protokollet som alltid ska implementeras. Tillsats av kaliumklorid (KCl) till cellerna är avgörande för att svälla cellerna, genererar separation mellan de viktigaste kärnor. Detta säkerställer att maskeringsalgoritmen kan identifiera alla enskilda kärnor i BNCs och POLY celler (POLY celler) som är nödvändig för deras uppräkning. Dessutom, KCL ger separation mellan kärnor och MN, vilket är viktigt för noggrann MN maskering och kvantifiering. Dessutom förhindrar användningen av formalin efter tillsats av KCl celler från lyseringslösning under centrifugering. Tillsatsen av Cytochalasin B orsakar TK6 celler som har genomgått mer än en kärnkrafts Division vara ganska stor. Som ett resultat, cytoplasman blir bräcklig och kan lyse om centrifugering utförs omedelbart efter tillsats av KCl. Dessutom är det mycket viktigt att införa Hoechst i provet enligt antalet celler i provet och inte enligt en slutlig koncentration. Till exempel, en slutkoncentration av 10 μg/mL Hoechst kommer jämnt fläcken ett prov av 1 x 106 celler, men kanske inte tillräckligt fläcken ett prov som innehåller 5 x 106 celler och kan resultera i många celler med svagt färgade kärnor, vilket gör analys svårt. Det är också viktigt att notera att Hoechst kan ersättas med en annan DNA-färg som DAPI om MIFC är utrustad med 405 nm excitation laser eller DRAQ5 om MIFC är utrustad med 488 nm och/eller 642nm excitation laser (s). Om du ändrar den nukleära fläcken, är det viktigt att titrera fläcken för att hitta lämplig koncentration för önskad/önskad lasereffekt.

Vid insamling av data på MIFC är det viktigt att fastställa de optimala regions gränserna för Övertoningsfunktionerna i RMS. De gränser som anges i detta protokoll kan kräva justering på grund av vissa smärre variationer mellan MIFC-instrumenten. Tillämpningen av den här funktionen vid datainsamling är viktigt för att säkerställa att mycket fokuserade bilder fångas. Om datafiler innehåller många suddiga eller ofokuserade bilder, är det troligt att maskeringsalgoritmerna i analysprogram varan felaktigt markerar färgning artefakter i suddiga områden, vilket leder till ett stort antal falskt positiva artefakter som görs som MN. Även om den bildbehandling tekniker som beskrivs här kan vara svårt, när en analys mall har utvecklats i MIFC programvara, tillåter batch-bearbetning för datafiler att automatiskt analyseras, vilket eliminerar användarnas ingripande och därför, målskytt Bias. Dessutom, om en cellinjer än TK6 celler används för att utföra analysen, kommer det att bli nödvändigt att ändra masker och regions gränser som de morfologiska egenskaperna (t. ex. storlek) av celler kommer att skilja sig från de i TK6 celler.

De resultat som presenteras här (figur 5) visar statistiskt signifikanta ökningar av mn induktion när de exponerar TK6 celler till olika doser av mitomycin C och Colchicine. Statistiskt signifikanta ökningar av frekvensen av MN jämfört med lösningsmedels kontroller observerades för flera doser i båda kemikalierna. Dessutom inducerade ingen dos av mannitol en cytotoxicitet över 30%, och inte heller en statistiskt signifikant ökning av frekvensen av MN jämfört med kontroller av lösningsmedel, som förväntat. Det protokoll som beskrivs i detta dokument med hjälp av MIFC för att utföra in vitro-MN-analysen ger förväntade resultat från både positiva och negativa kontrollkemikalier. Det är mycket viktigt att utföra ett antal experiment med både lösningsmedels kontroller och negativa kontrollkemikalier för att utveckla utgångsvärden för både frekvensen av MN samt Cytokinesis block proliferation index (CBPI). För genotoxicitet bestäms statistiskt signifikanta ökningar av MN-frekvensen genom jämförelse med MN-frekvenser som måste vara välkända för den celltyp som används. Dessutom baseras alla beräkningar av cytotoxicitet på kontroll provens CBPI och därför måste baslinje frekvenserna för MONO-, BNCs-och POLY-celler vara väl kvantifierade i kontrollerna.

Flera begränsningar och fördelar med att använda mifc i samband med mn-analysen har beskrivits i tidigare arbete29,32. De viktigaste begränsningarna gäller lägre MN frekvenser jämfört med mikroskopi, vilket förmodligen beror både på bristen på flexibilitet vid genomförandet av bedömningskriterierna i analysprogram varan samt det begränsade skärpedjupet av MIFC. Väl konturformade masker kan skapas för att exakt identifiera de viktigaste kärnor men MN som vidrör (eller mycket nära) de viktigaste kärnor kan fångas inom BNC masken. Dessutom mycket små MN som kan vara ganska lätt att göra med hjälp av mikroskopi är förmodligen felaktigt missade när du använder MIFC på grund av den nedre gränsen på området parametern i MN mask för att undvika scoring små artefakter. Förutom de svårigheter som finns i bildbaserad dataanalys, på grund av dess utformning, erhåller MIFC tvådimensionella projicering bilder av tredimensionella cellulära objekt. Detta orsakar sannolikt några MN att fångas på ett annat djup fokus att de två viktigaste MN, vilket gör dem verkar mycket svagt och un-scorable med maskering. Dessutom kan en liten del av MN bor bakom en av de två huvudsakliga kärnor, vilket gör dem omöjliga att visualisera och värdering. Därför, med tanke på dessa svårigheter, försiktighet bör iakttas vid tolkning av betydande ökningar i MN frekvens vid låga doser.

Trots dessa brister, den MIFC metod som beskrivs här erbjuder flera fördelar jämfört med andra tekniker. Fenech et al. förslag till kriterier och riktlinjer som bör övervägas vid utveckling av automatiserade system och metoder för MN-analyser36. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, direkt visualisering av de viktigaste kärnor och cytoplasma, bestämning av frekvensen av MN från olika doser av den kemiska eller medel som testas och förmågan att kvantifiera morfologi och bestämma positionen för alla kärnor och MN för att säkerställa att de är inom cytoplasman. Detta dokument visar att MIFC-metoden som utvecklats för att utföra den in vitro-MN-analysen uppfyller (eller besitter potentialen att tillfredsställa) dessa kriterier. Specifikt, bilder av atomkärnor och MN kan fångas upp av fluorescerande lasrar medan cytoplasmiska bilder kan erhållas genom att använda BF LED. Bilder av celler med normal nukleär morfologi kan automatiskt differentieras från dessa celler med oregelbunden morfologi med hjälp av en kombination av avancerade masker och funktioner. De resultat som presenterats för kolkicin och Mitomycinc (figur 5) visar att både genotoxicitet och cytotoxicitet kan bedömas vid olika doser jämfört med kontroll av lösningsmedel och att statistiskt signifikanta mn-frekvenser observeras där Förväntade. OECD: s testriktlinje 487 rekommenderar dessutom att man bedömer 2 000 BNCs per testkoncentration för att bedöma förekomsten av MN för bestämning av genotoxicitet tillsammans med minst 500 celler per test koncentration för bestämning av cytotoxicitet9. Detta kan ta över 1 h med hjälp av manuell mikroskopi. Protokollet och resultaten i detta dokument visar att ett genomsnitt på cirka 6 000 BNCs, 16 000 MONO celler, och 800 POLY celler fångades och poängsätts per testkoncentration i ca 20 min. Den snabba datainsamling och det stora antalet kandidat celler som görs på så kort tid belysa en annan viktig fördel med att anställa MIFC att utföra in vitro-MN-analysen.

Medan de resultat som presenteras i detta dokument är uppmuntrande, de är representativa för en tidig proof-of-koncept metod. Detta arbete bör följas upp genom en mer grundlig undersökning av en större, mer diversifierad kemikalie uppsättning som omfattar flera klasser och mekanismer för genotoxicitet och cytotoxicitet såsom de som föreslagits av Kirkland et al.37 genomföra sådana studier är tidskrävande och arbetsintensiva, och faller utanför tillämpningsområdet för detta dokument men dessa större skala studier kommer att ge värdefull insikt i förmågan hos metoden att tillförlitligt identifiera svagt genotoxiska agenter. Den metodik som presenteras här har ännu inte miniatyriserats till en mikrobrunn format, vilket skulle möjliggöra en snabbare och effektivare screening över ett större dosintervall. Som sådan, i sin nuvarande form, den MIFC-baserade in vitro-MN-analys som presenteras här kan vara bäst lämpad för arbetsintensiva uppföljningsstudier eller forskning om god laboratoriesed. Metoden kommer dock att fortsätta att optimeras och valideras och ha potential att möjliggöra ökad flexibilitet vid detektering av kemiska specifika händelser relaterade till morfologi, såsom aneugen-exponering som ökar andelen celler med icke-cirkulära kärnor som fortfarande är och38. Slutligen presenterar mifc-metoden en möjlighet att införa ytterligare biomarkörer i mn-analysen (t. ex. Kinetochor-färgning) för att ge en mer heltäckande bild av mekanismen för mn-induktion.

Disclosures

Författaren är anställd av Luminex Corporation, tillverkaren av imagestream Multispektrala Imaging Flow flödescytometerns som användes i detta arbete.

Acknowledgments

Författaren tack Christine Probst (Luminex Corporation) för hennes insatser för att utveckla tidigare former av dataanalys mallen, liksom Dr Haley Pugsley (Luminex Corporation) och Dr Phil Morrissey (Luminex Corporation) för att granska och redigera Manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Falcon 352096
Cleanser - Coulter Clenz  Beckman Coulter 8546931 Fill container with 200 mL of Cleanser.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
Colchicine MilliporeSigma 64-86-8
Corning bottle-top vacuum filter  MilliporeSigma CLS430769 0.22 um filter, 500 mL bottle
Cytochalasin B MilliporeSigma 14930-96-2 5 mg bottle
Debubbler - 70% Isopropanol EMD Millipore 1.3704 Fill container with 200 mL of Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) MilliporeSigma 67-68-5
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X EMD Millipore BSS-1006-B PBS Ca++MG++ Free 
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure Polysciences, Inc. 04018 This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.  Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.  May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.  Potential cancer hazard.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570 10 mg/mL solution
Mannitol MilliporeSigma 69-65-8
MEM Non-Essential Amino Acids 100X HyClone SH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark II EMD Millipore 100220 A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
MIFC analysis software - IDEAS EMD Millipore 100220 The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC software - INSPIRE EMD Millipore 100220 This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycin C MilliporeSigma 50-07-7
NEAA Mixture 100X Lonza BioWhittaker 13-114E
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X Gibco 15070063
Potassium Chloride (KCl) MilliporeSigma P9541
Rinse - Ultrapure water or deionized water NA NA You can use any ultrapure water or deionized water.  Fill container with 900 mL of Rinse.
RNase MilliporeSigma 9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1X HyClone SH30027.01
Sheath - PBS EMD Millipore BSS-1006-B This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X  Ca++MG++ free.  Fill container with 900mL of Sheath.
Sterile water HyClone SH30529.01
Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite VWR JT9416-1 This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.  Fill container with 200 mL of Sterilzer.
System Calibration Reagent - SpeedBead EMD Millipore 400041 Each tube holds ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
T25 flask Falcon 353109
T75 flask Falcon 353136
TK6 cells MilliporeSigma 95111735

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  2. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1-2), 81-95 (2000).
  3. Fenech, M. The Lymphocyte Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome Assay and its Application in Radiation Biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 234-243 (2010).
  4. Hintzsche, H., et al. Fate of micronuclei and micronucleated cells. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 771, 85-98 (2017).
  5. Fenech, M. The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. Mutation Research. 392 (1-2), 11-18 (1997).
  6. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  7. Fenech, M., Holland, N., Chang, W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. The HUman MicroNucleus Project - An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 428 (1-2), 271-283 (1999).
  8. Kirsch-Volders, M., et al. Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 540 (2), 153-163 (2003).
  9. OECD Library. Test No. 487: In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2016).
  10. Aardema, M. J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 61-87 (2006).
  11. Clare, M. G., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 37-60 (2006).
  12. Lorge, E., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 13-36 (2006).
  13. Oliver, J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 125-152 (2006).
  14. Wakata, A., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. IV. Using CHL cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 88-124 (2006).
  15. Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 45-64 (2003).
  16. Decordier, I., et al. Automated image analysis of cytokinesis-blocked micronuclei: an adapted protocol and a validated scoring procedure for biomonitoring. Mutagenesis. 24 (1), 85-93 (2009).
  17. Decordier, I., et al. Automated image analysis of micronuclei by IMSTAR for biomonitoring. Mutagenesis. 26 (1), 163-168 (2011).
  18. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lorch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenetic and Genome Research. 104 (1-4), 383-389 (2004).
  19. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  20. Nüsse, M., Marx, K. Flow cytometric analysis of micronuclei in cell cultures and human lymphocytes: Advantages and disadvantages. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 392 (1-2), 109-115 (1997).
  21. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  22. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1-2), 78-91 (2007).
  23. Bryce, S. M., et al. Flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay with human TK6 cells: Protocol optimization and transferability assessment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 54 (3), 180-194 (2013).
  24. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: to Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research. 607 (1), 9-12 (2006).
  25. Basiji, D. A. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  26. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Automated analysis of the cytokinesis-block micronucleus assay for radiation biodosimetry using imaging flow cytometry. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 273-282 (2014).
  27. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry. Cytometry Part A. 85 (10), 883-893 (2014).
  28. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Validation of the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Health Physics. 110 (1), 29-36 (2016).
  29. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Optimized automated data analysis for the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Cytometry Part A. 89 (7), 653-662 (2016).
  30. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. The effect of an optimized imaging flow cytometry analysis template on sample throughput in the reduced culture cytokinesis-block micronucleus assay. Radiation Protection Dosimetry. 172 (1-3), 223-229 (2016).
  31. Wang, Q., et al. Automated Triage Radiation Biodosimetry: Integrating Imaging Flow Cytometry with High-Throughput Robotics to Perform the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay. Radiation Research. 191 (4), 342-351 (2019).
  32. Rodrigues, M. A. Automation Of The In vitro Micronucleus Assay Using The ImageStream® Imaging Flow Cytometer. Cytometry Part A. 93, 706-726 (2018).
  33. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C., Fenech, M. F. The potential for complete automated scoring of the cytokinesis block micronucleus cytome assay using imaging flow cytometry. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 836, 53-64 (2018).
  34. Fenech, M., et al. HUMN project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 65-75 (2003).
  35. Verma, J. R., et al. Evaluation of the automated MicroFlow® and Metafer™ platforms for high-throughput micronucleus scoring and dose response analysis in human lymphoblastoid TK6 cells. Archives of Toxicology. 91 (7), 2689-2698 (2017).
  36. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  37. Kirkland, D., et al. Updated recommended lists of genotoxic and non-genotoxic chemicals for assessment of the performance of new or improved genotoxicity tests. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 795, 7-30 (2016).
  38. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).

Tags

Bioteknik TK6 celler genotoxicitet cytotoxicitet in vitro mikrokärntest avbildning flödescytometri bildanalys automation Multispektrala Imaging Flow flödescytometrianalys
En automatiserad metod för att utföra Mikrokärnanalys in vitro med hjälp av Multispektral avbildning flödescytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodrigues, M. A. An Automated Method … More

Rodrigues, M. A. An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (147), e59324, doi:10.3791/59324 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter