Summary
Här presenterar vi ett protokoll för immunofluorescensfärgning att observera endotelcellerna i musens aorta direkt. Denna teknik är användbar när man studerar cellulära och molekylära fenotyp av endotelceller i olika flödesmönster och i utvecklingen av åderförkalkning.
Abstract
Avvikande förändringar i endotelial fenotyp och morfologi anses vara initiala händelser i patogenesen av åderförkalkning. Direkt observation av intakt endotelet kommer att ge värdefull information för att förstå cellulära och molekylära händelser i dysfunktionella endotelceller. Här beskriver vi en modifierad immunofluorescensfärgningsteknik som ger forskarna möjlighet att få tydliga bilder av intakt endotelyta och analysera molekyl uttrycks mönstren på plats. Metoden är enkel och tillförlitlig för att observera hela endotelceller enskiktslager på olika platser i aorta. Denna teknik kan vara ett lovande verktyg för att förstå patofysiologi av åderförkalkning, särskilt i ett tidigt skede.
Introduction
De tidiga förändringarna i vasulaturen initieras främst i endotelet, som fungerar som en selektiv barriär mellan blodet och kärlväggen med dess intercellulära snäva av komplex1. Betydande bevis pekar på en kritisk roll för de mekaniska effekterna av blodflödet i modulerande endotelfunktion2. Fluid skjuvning stress, en friktionskraft som genereras av blodflödet, differentially former endotelceller morfologi och funktion, beroende på de specifika flödesparadigmer på olika vaskulära platser2,3. Aterosklerotiska lesioner förekommer företrädesvis på platser av störd blodflöde (d-Flow), såsom fartyg krökningar, flödes avdelare, och gren punkter, jämfört med regioner med stadigt flöde (s-flöde), såsom den raka segment av artären. Därför bör direkt observation av endotelmorfologi och molekyl uttrycksmönster ge viktiga insikter i de strukturella och funktionella fenotyperna av endotelceller under varierande flödes paradigm.
Odlade endotelceller kan inte uttrycka den faktiska fenotyp som de gör in vivo delvis på grund av förlust av påverkan av vätska skjuvning stress, omgivande cytokiner, och cell-cell eller cell-extracellulära matris interaktioner. För att underlätta detta kan den intakt endotelcellmonolayer studeras på tvärgående sektioner med hjälp av klassisk immunohistokemi. Emellertid, den endotelceller enskiktslager är så tunn och bräcklig att det vanligtvis inte kan observeras tydligt. En Face immunohistokemi har använts för att observera den inre ytan av endotelet, men är antingen komplicerat eller oberäkneligt i dess resultat eftersom endotelet är lätt strippad från den underliggande vävnaden, eller bara en del av arteriell vägg av råttor eller kaniner, vars väggar är tjocka, är monterad4,5.
Musmodeller har stora fördelar jämfört med andra djur i många avseenden. Här använder vi en modifierad en Face immunofluorescensteknik för att analysera endotelceller i aortabågen och bröstkorg aorta i C57BL/6 mus. En sådan teknik har använts i stor utsträckning för att studera endotelial patofysiologi i olika flödesmönster och i utvecklingen av åderförkalkning6,7,8,9,10. Denna metod gör det möjligt för forskare att observera hela ytan av endotelet tydligt och att jämföra uttrycksmönster av ett givet protein i regioner under olika vätska skjuvning stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med experimentella protokoll som godkänts av kommittén för djur resurser i Shanghai Jiao Tong University.
1. perfusion av musens aorta
- Kortfattat, söva 12-veckors-gamla C57BL/6 möss med intraperitoneala injektioner av natrium pentobarbital (50 mg/kg kroppsvikt). Bekräfta ordentlig bedövningsmedel genom att försiktigt klämmande svansen.
Anmärkning: om ingen rörelse observeras, djuret är tillräckligt sövda för att starta experimenten. - Tejpa musens tassar till en bunt pappershanddukar med tejp.
- Håll upp huden på musen med pintippar och skär huden med ett par sax från buken till toppen av bröstkorgen.
- Öppna bukhålan under bröstkorgen med en vass sax.
- Lyft bröstbenet med pinps och skär membranet; sedan skära bort bröstkorgen för att exponera thorakal hålighet.
- Skär av Vena Cava strax ovanför levern, med sax.
- Tryckperfuse (100 mmHg) arteriellt träd i 5 min med prekyld normal saltlösning som innehåller 40 enheter/mL heparin genom vänster kammare tills lungorna och levern blir bleka. Sedan, parfymera med prekyld 4% PARAFORMALDEHYD i fosfat-buffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) för 3 min.
- Ta bort alla muskler, organ och fett tills aorta exponeras.
- Placera musen under en dissekera Mikroskop.
2. dissektion och longitudinellt öppnande av aorta
- Exponera aorta klart under en dissekera Mikroskop och ta bort den bindväv längs aorta så ren som möjligt, med delikat tång och ett par fina saxar (figur 1).
- Dissekera bröstkorg aorta från hjärtat till celiaki stammen med ett par fina saxar och sätta aorta i en 6 cm cellkultur skålen med PBS. Klipp öppna aorta längsled, längs den mindre kurvan, och längs den större kurvan tills det raka segmentet är uppfyllt. Klipp öppna de tre grenarna av aortabågen, inklusive Innominate, vänster gemensamma halspulsådern och vänster subclavia, med mikrosax, som visas i figur 2.
3. förbehandling och immunofärgning av aorta
- Permeabilize aorta med 0,1% polyoxyetylen oktylalkohol fenyleter i PBS i 10 min och blockera den med 10% normalt get serum i Tris-buffrad saltlösning (TBS) som innehåller 2,5% polysorbat 20 för 1 h vid rumstemperatur i en 12-brunn cellkultur tallrik.
- Därefter Inkubera aorta med 5 g/mL kanin anti-VCAM-1 och 5 g/mL råtta anti-VE-cadherin i blockeringsbuffert, över natten vid 4 ° c.
- Efter sköljning av provet 3x med tvättlösning (TBS innehållande 2,5% polysorbat 20), tillämpa fluorescenskonjugerade sekundära antikroppar (1:1000 utspädning, Alexa fluor 555-märkt anti-kanin IgG och Alexa fluor 488-märkt anti-råtta IgG) för 1 h vid rums Temperatur. Skölj 3x i tvättlösningen.
- Motfärga aorta med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 μg/mL) för 10 min och skölj den 3x i tvättlösningen.
4. montering av aorta på glas bilden
- Placera aorta på en täckslip med luminala ytan nedåt och flytta den långsamt till AntiFade monteringslösning tidigare sjunkit på täckslip. Sträck försiktigt aorta för att hålla preparatet plant.
- Invertera täckglassen och Lägg den på glid glaset. Man måste vara försiktig så att inga luftbubblor hålls mellan preparatet och glaset.
5. observation av aorta
- Undersök aorta med ett Laser-scanning konfokala Mikroskop.
- Analysera färgintensiteter av olika kanaler från önskad region i en Face bilder med Image-Pro plus programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En 12-veckors gammal C57BL/6 mus var euthanized och parfymera med normal saltlösning som innehåller 40 enheter/mL heparin och sedan, förkyld 4% PARAFORMALDEHYD. Musen aorta exponerades under en dissekera Mikroskop (figur 1), dissekeras, och skära öppna longitudinellt (figur 2). Sv ansikte immunofluorescensfärgning av de vaskulära endotelcellerna utfördes enligt illustrationen i figur 3 och tabell 1. Sv ansikte immunofluorescens av vaskulär cell adhesion protein-1 (VCAM-1) uttryck med VE-cadherin som endotelmarkör visades under varierande flödesmönster från olika regioner i musens aorta. DAPI var också motstod att Visa cellkärnor för bättre visualisering. De endoteliala och glatta muskelceller kan lätt skiljas från morfologin av cellkärnor när man tittar genom z-stackar under mikroskopet eftersom endotelceller kärnor är ovala och större än den spindel-formade slät muskel cellkärnor. Företrädaren en Face images visas i figur 4. Aorta undersöktes av LSM 710 laser scanning Mikroskop (tabell över material) med en fluar 40x/1,3 olja lins. Från en Face immunofluorescensfärgning, kan vi tydligt och direkt Observera att uttrycket av VCAM-1 var mer rikligt i regioner under störd flöde (mindre krökning av aortabågen) än i de under steady Flow (större krökning av aortabågen och bröstkorg).
Figur 1 : Utsätta musen aorta under en dissekera Mikroskop. Ta bort bindväv längs aorta så rent som möjligt. a = Innominate artär; b = vänster gemensam halspulsådern; c = vänster subclavia artär. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Dissektion av musen bröstkorg aorta och skära den öppna longitudinellt. (A) bröstkorg aorta från hjärtat till celiaki stammen klipptes öppna längs den mindre kurvan längsled, och längs den större kurvan, tills det raka segmentet möttes. De tre grenarna av aortabågen, inklusive Innominate, vänster gemensamma halspulsådern, och vänster subclavia, var också skära öppna med mikrosax. Röda streckade linjer indikerar skär linjen. (B) aorta öppnades och spred sig platt på glas rutschbanorna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Schema för en Face immunofluorescens färgning av vaskulära endotelceller. Först permeabilize dissekerade aorta med 0,1% polyoxyetylen oktylalkohol fenyl eter i PBS för 10 min och blockera den med 10% normal get serum i TBS som innehåller 2,5% polysorbat 20 för 1 h vid rumstemperatur i en 12-brunn cellkultur plattan. Därefter Inkubera aorta med primär antikropp i blockeringsbufferten över natten vid 4 ° c, och skölj den tre gånger med tvättlösning (TBS innehållande 2,5% polysorbat 20). Applicera sedan fluorescenskonjugerade sekundära antikroppar för 1 h vid rumstemperatur och skölj tre gånger. Motfärga aorta med DAPI för 10 min och skölj den tre gånger i tvättlösningen. Äntligen, montera aorta på ett glas glida och observera aorta av en laser-scanning konfokala Mikroskop. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativ en ansikts färgning resultat. (A) en Face immunofluorescensanalys av den mindre krökning av en mus aorta (d-flöde områden) och större krökning eller bröstkorg aorta (s-flöde områden) att jämföra ENDOTELIAL VCAM-1 uttryck under olika flöde paradigm. Endotelcellmorfologi visas av VE-cadherinfärgning. B) representativa d-flödesområden (mindre krökning) och s-flödesområden (större krökning och bröstkorg) indikeras med pilar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Steg | Process | Buffert | Temperatur | Tid |
| 1 | Permeabilize | 0,1% polyoxyetylen octylfenyleter i PBS | Rumstemperatur | 10 min |
| 2 | Blockera | 10% normalt get serum i Tris-buffrad saltlösning (TBS) innehållande 2,5% polysorbat 20 | Rumstemperatur | 1 h |
| 3 | Första antikroppen (5 g/mL) | Blockerande buffert | 4 ° c | Övernattning |
| 4 | Skölj | MSK innehållande 2,5% polysorbat 20 | Rumstemperatur | 5 min, 3 gånger |
| 5 | Fluorescenssekundär antikropp (1:1000) | Blockerande buffert | Rumstemperatur | 1 h |
| 6 | Skölj | MSK innehållande 2,5% polysorbat 20 | Rumstemperatur | 5 min, 3 gånger |
Tabell 1: detaljerad information om en Face immunofluorescensteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotelet utsätts för många proatherogenic faktorer, inklusive lipider, inflammatoriska mediatorer, och Fluid skjuvning stress1,11,12. Direkt observation av endotelceller på plats ger speciella fördelar för att analysera förändringar i cellmorfologi, intercellulära korsningar, och molekyler uttrycksmönster som svar på skadan stimuli.
Tidigare studier har gett två olika en ansikte immunohistokemiska tekniker för att observera endotelet i arteriell vägg4,5. En är att få en endotelial enskiktslager genom strippning endotelet från kärlväggen med en speciell teknik, vilket är svårt att behärska och kan resultera i förlusten av mycket endotel vid förgrening platser i artären4. Den andra är att montera hela arteriell vägg som vi beskrev. Hel-Mount beredning är lätt att utföra och kan upprätthålla hela endotelceller enskiktslager på kanin och råttor5,13. Men att sprida hela musen aorta preparatet platt är inte lätt, och underlåtenhet att göra det kan i stor utsträckning påverka kvaliteten på observationen. Beredningen av aorta provet som beskrivs här, med krökningar skära öppna och luminala ytan inför nedåt på täckglas, gör det lättare att sprida aorta preparatet platt på glid glaset. Dessutom krävs en laserskanning konfokal Mikroskop för att bättre fokusera på den tunna endotelceller enskiktslager foder i blodkärlet.
En viktig punkt i denna teknik är att sträcka aorta provet så platt som möjligt för att få en bättre observation av aorta. Dessutom, heparin bör tillsättas till normal saltlösning före perfusion, och aorta provet bör behandlas försiktigt under hela processen. PARAFORMALDEHYD ska vara nyberedd och förvaras vid 4 ° c fram till användning.
Det finns begränsningar för denna teknik. Först, kapaciteten hos en Face immunofluorescens att upptäcka subendotelial substans, såsom deponerade low-density lipoprotein, är begränsad jämfört med regelbunden immunohistokemi av vävnad sektioner. För det andra är de fluorescerande signalerna lätt blekt efter en skanning av det konfokala mikroskopet, särskilt när man utför z-axelanalys. Dessutom kan uttrycket av målmolekylen endast semikvantifieras, enligt dess fluorescerande intensitet.
Sammanfattningsvis, denna modifierade en Face immunofluorescensfärgning teknik ger ett enkelt sätt att analysera morfologi och protein uttrycksmönster av vaskulära endotelceller i regioner under olika blodflöde paradigm6,7 och i patogenesen av åderförkalkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr 81670451, 81770430), Shanghai Rising-Star program (Grant No. 17QA1403000), och Science Technology kommittén för Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
