Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la coloration d'immunofluorescence pour observer les cellules endothéliales de l'aorte de souris directement. Cette technique est utile lors de l'étude du phénotype cellulaire et moléculaire des cellules endothéliales dans différents schémas de flux et dans le développement de l'athérosclérose.
Abstract
Des changements aberrants dans le phénotype et la morphologie endothéliales sont considérés comme des événements initiaux dans la pathogénie de l'athérosclérose. L'observation directe de l'endothélium intact fournira des informations précieuses pour comprendre les événements cellulaires et moléculaires dans les cellules endothéliales dysfonctionnelles. Ici, nous décrivons une technique modifiée de coloration d'immunofluorescence d'en face qui permet aux scientifiques d'obtenir des images claires de la surface endothéliale intacte et d'analyser les modèles d'expression de molécule in situ. La méthode est simple et fiable pour observer l'ensemble de la monocouche endothéliale à différents sites de l'aorte. Cette technique peut être un outil prometteur pour comprendre la pathophysiologie de l'athérosclérose, particulièrement à un stade précoce.
Introduction
Les premiers changements dans la vascularisation commencent principalement dans l'endothélium, qui fonctionne comme une barrière sélective entre le sang et la paroi du vaisseau avec sescomplexesintercellulaires de jonction serré 1 . Des preuves substantielles indiquent un rôle critique pour les effets mécaniques du flux sanguin dans la modulation de la fonction endothéliale2. Le stress de cisaillement de fluide, une force de frottement produite par le flux sanguin, forme différentiellement la morphologie et la fonction des cellules endothéliales, selon les paradigmes spécifiques de flux à différents emplacements vasculaires2,3. Les lésions athérosclérotiques se produisent préférentiellement aux emplacements du flux sanguin perturbé (d-flow), tels que les courbures de navire, les diviseurs d'écoulement, et les points de branche, comparés aux régions de flux régulier (s-flux), telles que le segment droit de l'artère. Par conséquent, l'observation directe de la morphologie endothéliale et des modèles d'expression de molécule devrait fournir des perspicacités importantes dans les phénotypes structurels et fonctionnels des cellules endothéliales sous des paradigmes variables de flux.
Les cellules endothéliales cultivées peuvent ne pas exprimer le phénotype réel comme elles le font in vivo en partie en raison de la perte de l'impact du stress de cisaillement de fluide, des cytokines environnantes, et des interactions de cellules-cellules-extracellulaires de matrice. Pour faciliter ceci, la monocouche endothéliale intacte de cellules peut être étudiée sur des sections transversales utilisant l'immunohistochemistry classique. Cependant, la monocouche endothéliale est si mince et fragile qu'elle ne peut généralement pas être observée clairement. En face immunohistochemistry a été utilisé pour observer la surface intérieure de l'endothélium, mais est soit compliqué ou erratique dans ses résultats parce que l'endothélium est facilement dépouillé du tissu sous-jacent, ou juste une partie de la paroi artérielle des rats ou des lapins, dont les murs sont épais, est monté4,5.
Les modèles de souris ont des avantages considérables par rapport aux autres animaux à bien des égards. Ici, nous employons une technique modifiée d'immunofluorescence en face pour analyser les cellules endothéliales de l'arc aortique et de l'aorte thoracique dans la souris C57BL/6. Une telle technique a été largement utilisée pour étudier la pathophysiologie endothéliale dans différents schémas de flux et dans le développement de l'athérosclérose6,7,8,9,10. Cette méthode permet aux scientifiques d'observer clairement toute la surface de l'endothélium et de comparer les modèles d'expression d'une protéine donnée dans des régions soumises à différents stress de cisaillement des fluides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux protocoles expérimentaux approuvés par le Comité des ressources animales de l'Université Jiao Tong de Shanghai.
1. Perfusion de l'aorte de souris
- En bref, anesthésier les souris C57BL/6 de 12 semaines avec des injections intrapéritonéales de pentobarbital de sodium (50 mg/kg de poids corporel). Confirmer l'anesthésie appropriée en pinçant doucement la queue.
REMARQUE : Si aucun mouvement n'est observé, l'animal est suffisamment anesthésié pour commencer les expériences. - Tapez les pattes de la souris sur une pile de papier essuie-tout avec des rubans adhésifs.
- Maintenez la peau de la souris avec des forceps et coupez la peau avec une paire de ciseaux de l'abdomen jusqu'au sommet du thorax.
- Ouvrez la cavité abdominale sous la cage thoracique avec une paire de ciseaux pointues.
- Soulevez le sternum avec des forceps et coupez le diaphragme; puis, couper la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique.
- Couper le veau cava juste au-dessus du foie, avec des ciseaux.
- Perfuse de pression (100 mmHg) l'artériel pendant 5 min avec saline normale préréfrigérée contenant 40 unités/mL d'héparine par le ventricule gauche jusqu'à ce que les poumons et le foie deviennent pâles. Ensuite, perfuser avec du paraformaldéhyde préréfrigéré de 4 % dans de la saline tamponnée par phosphate (PBS, pH 7,4) pendant 3 min.
- Enlever tous les muscles, organes et graisses jusqu'à ce que l'aorte soit exposée.
- Placez la souris sous un microscope à disséquer.
2. Dissection et ouverture longitudinale de l'aorte
- Exposer clairement l'aorte sous un microscope à disséquer et enlever les tissus conjonctifs le long de l'aorte aussi propre que possible, avec des forceps délicats et une paire de ciseaux délicats (Figure 1).
- Disséquer l'aorte thoracique du cœur au tronc coeliaque avec une paire de ciseaux délicats et mettre l'aorte dans un plat de culture cellulaire de 6 cm avec PBS. Coupez l'aorte longitudinalement, le long de la courbe inférieure, et le long de la plus grande courbe jusqu'à ce que le segment droit soit rencontré. Ouvrez les trois branches de l'arc aortique, y compris l'innominate, la carotide commune gauche et l'artère sous-clavière gauche, avec des microscissors, comme le montre la figure 2.
3. Prétraitement et immunostaining de l'aorte
- Perméabilize l'aorte avec 0,1% polyoxyéthylène octyl étheroudile dans PBS pendant 10 min et le bloquer avec 10% de sérum de chèvre normal dans Tris tamponné saline (TBS) contenant 2,5% polysorbate 20 pour 1 h à température ambiante dans une plaque de culture de cellules de 12 puits.
- Ensuite, incubez l'aorte avec 5 g/mL lapin anti-VCAM-1 et 5 g/mL rat anti-VE-cadherin dans le tampon de blocage, pendant la nuit à 4 oC.
- Après avoir rincé l'échantillon 3x avec une solution de lavage (TBS contenant 2,5% de polysorbate 20), appliquer les anticorps secondaires conjugués à la fluorescence (1:1,000 dilution, Alexa Fluor 555-étiqueté anti-lapin IgG et Alexa Fluor 488-étiqueté anti-rat IgG) pendant 1 h à la chambre température. Rincer 3x dans la solution de lavage.
- Counterstain l'aorte avec 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 'g/mL) pendant 10 min et le rincer 3x dans la solution de lavage.
4. Montage de l'aorte sur la glissière de verre
- Placez l'aorte sur un bordereau avec la surface luminale vers le bas et déplacez-la lentement vers la solution de montage antifade précédemment tombée sur le bordereau. Étirez délicatement l'aorte pour garder le spécimen à plat.
- Inversez le bordereau et mettez-le sur le verre coulissant. Il faut prendre soin de ne pas laisser les bulles d'air rester entre le spécimen et le verre.
5. Observation de l'aorte
- Examinez l'aorte à l'utilisation d'un microscope confocal à balayage laser.
- Analysez les intensités de couleur de différents canaux de la région souhaitée dans les images en face avec le logiciel Image-Pro Plus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Une souris C57BL/6 de 12 semaines a été euthanasiée et perfisée avec la saline normale contenant 40 unités/mL d'héparine et, ensuite, le paraformaldéhyde préréfrigéré de 4%. L'aorte de souris a été exposée sous un microscope disséquant (Figure 1), disséqué, et coupée longitudinalement ouverte (Figure 2). La coloration d'immunofluorescence de visage des cellules endothéliales vasculaires a été exécutée comme illustré dans la figure 3 et le tableau 1. En face immunofluorescence de la protéine d'adhérence de cellules vasculaires-1 (VCAM-1) expression avec VE-cadherin comme marqueur endothélial a été montré sous différents modèles de flux de différentes régions de l'aorte de souris. DAPI a également été contre-taché pour montrer les noyaux cellulaires pour une meilleure visualisation. Les cellules musculaires endothéliales et lisses peuvent être facilement distinguées de la morphologie des noyaux cellulaires en regardant à travers les z-stacks sous le microscope puisque les noyaux de cellules endothéliales sont ovales et plus grands que les lisses en forme de fuseau noyaux de cellules musculaires. Les images représentatives en face sont montrées dans la figure 4. L'aorte a été examinée par le LSM 710 Laser Scanning Microscope (Table of Materials) avec une lentille d'huile FLUAR 40x/1,3. De la coloration en face immunofluorescence, nous pouvons observer clairement et directement que l'expression de VCAM-1 était plus abondante dans les régions sous le débit perturbé (courbure moindre de l'arc d'aorte) que dans ceux sous le flux régulier (plus grande courbure de l'arc d'aorte et l'aorte thoracique).
Figure 1 : Exposition de l'aorte de souris sous un microscope disséquant. Enlever les tissus conjonctifs le long de l'aorte aussi proprement que possible. une artère innominée; b - artère carotide commune gauche ; c artère sous-clavian gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Dissection de l'aorte thoracique de la souris et la coupe longtemps. (A) L'aorte thoracique du cœur au tronc coeliaque a été coupée le long de la courbe inférieure longitudinalement, et le long de la plus grande courbe, jusqu'à ce que le segment droit a été rencontré. Les trois branches de l'arc aortique, y compris l'innominate, la carotide commune gauche, et l'artère sous-clavian gauche, ont également été coupées ouvertes avec des microscissors. Des lignes pointillées rouges indiquent la ligne de coupe. (B) L'aorte a été ouverte et étalée à plat sur les lames de verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Schema pour la coloration d'immunofluorescence de visage des cellules endothéliales vasculaires. Tout d'abord, perméabiliez l'aorte disséquée avec 0,1% de polyoxyéthylène octyl éthylique dans PBS pendant 10 min et le bloquer avec 10% de sérum de chèvre normal dans le SCT contenant 2,5% polysorbate 20 pour 1 h à température ambiante dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits. Ensuite, incubez l'aorte avec l'anticorps primaire dans le tampon de blocage pendant la nuit à 4 oC, et rincez-le trois fois avec la solution de lavage (TBS contenant 2,5% de polysorbate 20). Ensuite, appliquez des anticorps secondaires conjugués à la fluorescence pendant 1 h à température ambiante et rincez trois fois. Counterstain l'aorte avec DAPI pendant 10 min et le rincer trois fois dans la solution de lavage. Enfin, montez l'aorte sur une lame de verre et observez l'aorte au microscope confocal à balayage laser. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Résultats de coloration en face représentant. (A) En face immunofluorescence analyse de la moindre courbure d'une aorte de souris (zones d'écoulement) et de la plus grande courbure ou aorte thoracique (zones de flux s) pour comparer l'expression endothéliale VCAM-1 sous différents paradigmes de flux. La morphologie des cellules endothéliales est démontrée par la coloration VE-cadherin. (B) Les zones représentatives de débit d (courbure moindre) et les zones de s-flow (plus grande courbure et aorte thoracique) sont indiquées par flèches. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| pas | processus | tampon | température | temps |
| 1 | Perméabilize Permeabilize | 0,1 % d'éther de phényl octoyle polyoxyéthylène dans PBS | température | 10 min |
| 2 | Blocage | Sérum de chèvre normal de 10 % dans la saline tamponnée Tris (TbS) contenant 2,5 % de polysorbate 20 | température | 1 h |
| 3 | Premier anticorps (5 g/mL) | Blocage du tampon | 4 oC | jusqu'au lendemain |
| 4 | rinçage | SCT contenant 2,5 % de polysorbate 20 | température | 5 min, 3 fois |
| 5 | Anticorps secondaires à la fluorescence (1:1000) | Blocage du tampon | température | 1 h |
| 6 | rinçage | SCT contenant 2,5 % de polysorbate 20 | température | 5 min, 3 fois |
Tableau 1 : Informations détaillées sur le visage procédure de coloration d'immunofluorescence.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'endothélium est exposé à de nombreux facteurs proathérogènes, y compris les lipides, les médiateurs inflammatoires, et le stress de cisaillement des fluides1,11,12. L'observation directe des cellules endothéliales in situ fournit les avantages spéciaux pour analyser des changements dans la morphologie de cellules, les jonctions intercellulaires, et les modèles d'expression de molécule en réponse aux stimulus de blessure.
Des études antérieures ont fourni deux différentes techniques immunohistochimiques en face pour observer l'endothélium de la paroi artérielle4,5. La première consiste à obtenir une monocouche endothéliale en dépouillant l'endothélium de la paroi du navire par une technique spéciale, qui est difficile à maîtriser et pourrait entraîner la perte de beaucoup d'endothélium aux sites de ramification de l'artère4. L'autre monte tout le mur artériel comme nous l'avons décrit. La préparation de montage entier est facile à exécuter et peut maintenir la monocouche endothéliale entière dans le lapin et les rats5,13. Cependant, l'épandage de l'ensemble de la souris spécimen aortique plat n'est pas facile, et ne pas le faire peut affecter en grande partie la qualité de l'observation. La préparation du spécimen aortique tel que décrit ici, avec les courbures coupées ouvertes et la surface luminale face vers le bas sur le bordereau, il est plus facile de répandre le spécimen aortique à plat sur le verre coulissant. En outre, un microscope confocal laser-scan est nécessaire pour mieux se concentrer sur la monocouche endothéliale mince de cellules tapissant le vaisseau sanguin.
Un point clé de cette technique est d'étirer le spécimen aortique aussi plat que possible pour obtenir une meilleure observation de l'aorte. En outre, l'héparine doit être ajoutée à la solution saline normale avant la perfusion, et le spécimen aortique doit être traité doucement tout au long du processus. Le paraformaldéhyde doit être fraîchement préparé et conservé à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
Il y a des limites à cette technique. Tout d'abord, la capacité de l'immunofluorescence en face pour détecter la substance subendothéliale, telle que la lipoprotéine de basse densité déposée, est limitée par rapport à l'immunohistochimie régulière des sections de tissu. Deuxièmement, les signaux fluorescents sont facilement blanchis après un balayage par le microscope confocal, particulièrement en effectuant l'analyse dez-axe. De plus, l'expression de la molécule cible ne peut être que semi-quantifiée, en fonction de son intensité fluorescente.
En résumé, cette technique modifiée de coloration d'immunofluorescence d'en face fournit un moyen facile d'analyser le modèlede morphologie et d'expression de protéine des cellules endothéliales vasculaires dans les régions sous différents paradigmes de flux sanguin 6,7 et dans la pathogénie de l'athérosclérose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81670451, 81770430), le Shanghai Rising-Star Program (Grant No. 17QA1403000) et le Science Technology Committee of the Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
