Summary
Her presenterer vi en protokoll for immunofluorescence farging for å observere de endothelial cellene i muse aorta direkte. Denne teknikken er nyttig når du studerer mobilnettet og molekylær fenotype av endothelial celler i ulike strømnings mønstre og i utviklingen av aterosklerose.
Abstract
Avvikende endringer i endothelial fenotype og morfologi anses å være innledende hendelser i patogenesen av aterosklerose. Direkte observasjon av intakt endotelet vil gi verdifull informasjon for å forstå mobilnettet og molekylære hendelser i dysfunksjonelle endothelial celler. Her beskriver vi en modifisert en ansikts immunofluorescence farge teknikk som gjør det mulig for forskere å få klare bilder av den intakte endothelial overflaten og analysere molekyl uttrykks mønstrene in situ. Metoden er enkel og pålitelig for å observere hele endothelial monolag på ulike steder i aorta. Denne teknikken kan være et lovende verktøy for å forstå patofysiologi av aterosklerose, spesielt på et tidlig stadium.
Introduction
Den tidlige endringer i blodkar primært initiere i endotelet, som fungerer som en selektiv barriere mellom blod og fartøyet veggen med sine intercellulære stramt junctional komplekser1. Vesentlige bevis peker på en kritisk rolle for de mekaniske virkningene av blodstrømmen i modulerende endothelial funksjon2. Fluid skjær stress, en friksjons kraft generert av blodstrøm, differensielt former endothelial celle morfologi og funksjon, avhengig av den spesifikke flyten paradigmer på ulike vaskulære nettsteder2,3. Aterosklerotiske lesjoner fortrinnsvis oppstå på områder av forstyrret blodstrøm (d-flow), for eksempel fartøy kurvaturer, flyt skillevegger og gren poeng, i forhold til regioner av jevn flyt (s-flow), for eksempel rett segmentet av arterien. Derfor bør direkte observasjon av endothelial morfologi og molekyl uttrykk mønstre gi viktig innsikt i den strukturelle og funksjonelle fenotyper av endothelial celler under varierende flyt paradigmer.
Kultivert endothelial celler kan ikke uttrykke den faktiske fenotype som de gjør i vivo delvis på grunn av tap av virkningen av væske skjær stress, omkringliggende cytokiner, og celle-celle eller celle-ekstracellulære matrise interaksjoner. For å hjelpe dette, kan den intakte endothelial celle monolag bli studert på tverrgående seksjoner ved hjelp av klassisk immunhistokjemi. Men den endothelial monolag er så tynn og skjør at den vanligvis ikke kan observeres tydelig. En ansikt immunhistokjemi har blitt brukt til å observere den indre overflaten av endotelet, men er enten komplisert eller uberegnelig i sine resultater fordi endotelet er lett strippet fra underliggende vev, eller bare en del av arterieveggen av rotter eller kaniner, Hvis veggene er tykke, er montert4,5.
Mouse modeller har store fordeler fremfor andre dyr på mange måter. Her bruker vi en modifisert en ansikt immunofluorescence teknikk for å analysere endothelial celler av aorta buen og bryst aorta i C57BL/6 mus. En slik teknikk har blitt mye brukt til å studere endothelial patofysiologi i ulike strømnings mønstre og i utviklingen av aterosklerose6, 7,8,9,10. Denne metoden gjør det mulig for forskere å observere hele overflaten av endotelet klart og å sammenligne uttrykket mønstre av et gitt protein i regioner under forskjellige Fluid skjær stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr eksperimenter ble gjennomført i samsvar med eksperimentelle protokoller godkjent av komiteen for Animal Resources av Shanghai Jiao Tong University.
1. å ha en mus aorta
- Kort, bedøve 12-ukers-gamle C57BL/6 mus med intraperitoneal injeksjoner av natrium pentobarbital (50 mg/kg kroppsvekt). Bekreft riktig bedøvelsen ved å knipe halen forsiktig.
Merk: Hvis ingen bevegelse er observert, er dyret tilstrekkelig anesthetized for å starte eksperimentene. - Tape musen poter til en stabel med papirhåndklær med selvklebende kassetter.
- Hold opp huden på musen med pinsett og skjær huden med en saks fra magen til toppen av thorax.
- Åpne bukhulen under brystkasse med en skarp saks.
- Løft brystbenet med pinsett og kutt membranen; deretter, skjær bort brystkasse å utsette bryst hulrommet.
- Klipp av vena cava like over leveren, med saks.
- Trykk perfuse (100 mmHg) arteriell treet i 5 minutter med prechilled normal saltvann som inneholder 40 enheter/mL heparin gjennom venstre ventrikkel til lungene og leveren blir blek. Deretter perfuse med prechilled 4% paraformaldehyde i fosfat-bufret saltvann (PBS, pH 7,4) i 3 min.
- Fjern alle muskler, organer og fett til aorta er eksponert.
- Plasser musen under et dissekere mikroskop.
2. disseksjon og lengderetningen åpning av aorta
- Eksponere aorta tydelig under et dissekere mikroskop og fjerne bindevev langs aorta så ren som mulig, med delikate tang og et par delikate saks (figur 1).
- Analysere bryst aorta fra hjertet til cøliaki trunk med et par delikate saks og sette aorta inn i en 6 cm cellekultur parabolen med PBS. Skjær åpne aorta lengderetningen, langs mindre kurve, og langs større kurve til det rette segmentet er oppfylt. Skjær åpne de tre grenene av aorta buen, inkludert Innominate, venstre felles hals puls og venstre arteria arterie, med microscissors, som vist i figur 2.
3. forbehandling og immunostaining av aorta
- Permeabilize aorta med 0,1% polyoksyetylensorbitanmonooleat oktyl) fenyl Eter i PBS i 10 min og blokkere den med 10% normal geit serum i Tris-bufret saltvann (TBS) som inneholder 2,5% polysorbat 20 for 1 t ved romtemperatur i en 12-brønn cellekultur plate.
- Deretter ruge aorta med 5 g/mL kanin anti-VCAM-1 og 5 g/mL rotte anti-VE-cadherin i blokkerings bufferen, over natten ved 4 ° c.
- Etter skylling prøven 3x med vaskeløsning (TBS inneholder 2,5% polysorbat 20), bruke fluorescens-bøyd sekundære antistoffer (1:1000 fortynning, Alexa fluor 555-merket anti-kanin IgG og Alexa fluor 488-merket anti-rotte IgG) for 1 t på rommet Temperatur. Skyll 3x i vaskeløsningen.
- Counterstain aorta med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 μg/mL) i 10 min og skyll den 3x i vaskeløsningen.
4. montering av aorta på glass Slide
- Plasser aorta på en dekkglass med luminal overflaten nedover og Flytt den langsomt til den Antifade monterings løsningen som tidligere ble sluppet på dekkglass. Strekk forsiktig aorta for å holde prøven flat.
- Inverse dekkglass og legg den på lysbildet glass. Det må utvises forsiktighet for ikke å la noen luftbobler ligge mellom prøven og glasset.
5. observasjon av aorta
- Undersøk aorta med et laser-skanning konfokalmikroskopi mikroskop.
- Analyser farge intensiteten i ulike kanaler fra ønsket region i bildene med bilde-Pro Plus-programvaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En 12-ukers-gammel C57BL/6-mus ble euthanized og perfusert med normal saltvann inneholdende 40 enheter/mL heparin, og deretter prechilled 4% paraformaldehyde. Musen aorta ble eksponert under et dissekere mikroskop (figur 1), dissekert, og kuttet åpen lengderetningen (figur 2). En ansikt immunofluorescence farging av vaskulære endothelial celler ble utført som illustrert i Figur 3 og tabell 1. En ansikt immunofluorescence av vaskulær celle vedheft protein-1 (VCAM-1) uttrykk med VE-cadherin som endothelial markør ble vist under varierende Flow mønstre fra ulike regioner av musen aorta. DAPI ble også counterstained for å vise cellekjerner for bedre visualisering. Endothelial og glatte muskelceller kan lett skilles fra morfologi av cellekjerner når du ser gjennom z-stabler under mikroskopet siden endothelial cellekjerner er oval formet og større enn spindel-formet glatt muskel cellekjerner. Representanten no Face bildene er vist i Figur 4. Aorta ble undersøkt av LSM 710 laser Scanning mikroskop (tabell av materialer) med en FLUAR 40x/1, 3 olje linse. Fra en ansikt immunofluorescence farging, kan vi tydelig og direkte observere at uttrykket av VCAM-1 var mer rikelig i områder under forstyrret flyt (mindre krumning av aorta buen) enn i de under jevn flyt (større krumning av aorta buen og bryst aorta).
Figur 1 : Utsette muse aorta under et dissekere mikroskop. Fjern bindevevet langs aorta så rent som mulig. a = Innominate arterie; b = venstre vanlig hals puls åre; c = venstre arteria arterie. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Disseksjon av musen bryst aorta og kutte den åpne lengderetningen. (A) bryst aorta fra hjertet til cøliaki ble kuttet åpen langs mindre kurve lengderetningen, og langs større kurve, til det rette segmentet ble møtt. De tre grenene av aorta buen, inkludert Innominate, venstre felles hals puls, og venstre arteria arterie, ble også skåret åpne med microscissors. Røde stiplede linjer indikerer skjærelinjen. (B) aorta ble åpnet og spredt flatt på glass lysbilder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Skjema for en Face immunofluorescence farging av vaskulære endothelial celler. Først permeabilize den dissekert aorta med 0,1% polyoksyetylensorbitanmonooleat oktyl) fenyl Eter i PBS i 10 min og blokkere den med 10% normal geit serum i TBS som inneholder 2,5% polysorbat 20 for 1 t ved romtemperatur i en 12-brønn cellekultur plate. Deretter ruge aorta med primær antistoff i blokkerings buffer over natten ved 4 ° c, og skyll den tre ganger med vaskeløsning (TBS inneholder 2,5% polysorbat 20). Påfør deretter fluorescens-bøyd sekundære antistoffer for 1 t ved romtemperatur og skyll tre ganger. Counterstain aorta med DAPI i 10 min og skyll den tre ganger i vaskeløsningen. Endelig montere aorta på et glass lysbilde og observere aorta av en laser-skanning konfokalmikroskopi mikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representative no Face fargeresultater. (A) en Face immunofluorescence analyse av mindre krumning av en mus aorta (d-Flow områder) og større krumning eller bryst aorta (s-Flow områder) for å sammenligne endothelial VCAM-1 uttrykk under forskjellige Flow paradigmer. Endothelial celle morfologi er vist ved VE-cadherin farging. (B) representative d-Flow områder (mindre krumning) og s-Flow områder (større krumning og bryst aorta) er indikert med piler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Prosessen | Buffer | Temperatur | Tid |
| 1 | Permeabilize | 0,1% polyoksyetylensorbitanmonooleat oktyl) fenyl Eter i PBS | Romtemperatur | 10 min |
| 2 | Blokkerer | 10% normal geit serum i Tris-bufret saltvann (TBS) som inneholder 2,5% polysorbat 20 | Romtemperatur | 1 time med |
| 3 | Første antistoff (5 g/mL) | Blokkering buffer | 4 ° c | Overnatting |
| 4 | Skyll | TBS som inneholder 2,5% polysorbat 20 | Romtemperatur | 5 min, 3 ganger |
| 5 | Fluorescens sekundært antistoff (1:1000) | Blokkering buffer | Romtemperatur | 1 time med |
| 6 | Skyll | TBS som inneholder 2,5% polysorbat 20 | Romtemperatur | 5 min, 3 ganger |
Tabell 1: detaljert informasjon om en ansikt immunofluorescence farging prosedyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotelet utsettes for mange proatherogenic faktorer, inkludert lipider, inflammatoriske meglere og væske skjær stress1,11,12. Direkte observasjon av endothelial celler i situ gir de spesielle fordelene til å analysere endringer i celle morfologi, intercellulære kryss og molekyl uttrykks mønstre som svar på skaden stimuli.
Tidligere studier har gitt to forskjellige en Face immunhistokjemiske teknikker for å observere endotelet av arterieveggen4,5. Det ene er å få en endothelial monolag ved å fjerne endotelet fra fartøyets vegg ved en spesiell teknikk, som er vanskelig å mestre og kan føre til tap av mye endotelet ved forgrening områder av arterien4. Den andre er å montere hele arterieveggen som vi beskrev. Hel-montere forberedelse er lett å utføre og kanne vedlikeholde det hele endothelial monolag inne kanin og rotter5,13. Men sprer hele musen aorta prøven flatt er ikke lett, og unnlatelse av å gjøre det kan i stor grad påvirke kvaliteten på observasjon. Utarbeidelse av aorta prøven som beskrevet her, med kurvaturer kuttet åpen og luminal overflaten vendt nedover på dekkglass, gjør det lettere å spre aorta prøven flatt på lysbildet glass. Videre er et laser-skanning konfokalmikroskopi mikroskop nødvendig for å bedre fokusere på den tynne endothelial cellen monolag lining blodkaret.
Et viktig punkt i denne teknikken er å strekke aorta prøven så flat som mulig for å få en bedre observasjon av aorta. I tillegg bør heparin tilsettes til vanlig saltvann før den brukes, og aorta-prøven skal behandles forsiktig gjennom hele prosessen. Paraformaldehyde skal tilberedes og oppbevares ved 4 ° c til bruk.
Det er begrensninger på denne teknikken. For det første, kapasiteten av en ansikt immunofluorescence å merker subendothelial substans, som avsatt lav-tettheten lipoprotein, er begrenset når sammenlignet med stamgjest immunhistokjemi av tissue avdelinger. For det andre er fluorescerende signaler lett bleket etter en skanning av konfokalmikroskopi mikroskop, spesielt når du utfører z-aksen analyse. Videre kan uttrykket av målet molekylet bare være semiquantified, i henhold til sin fluorescerende intensitet.
Oppsummert, Dette endret en Face immunofluorescence farging teknikk gir en enkel måte å analysere morfologi og protein uttrykk mønster av vaskulær endothelial celler i regioner under forskjellige blodstrøm paradigmer og i patogenesen av aterosklerose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (Grant no. 81670451, 81770430), Shanghai Rising-Star-programmet (Grant no. 17QA1403000), og Science Technology Committee av Shanghai Municipal Government (Grant no. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
