Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para a coloração da imunofluorescência para observar diretamente as pilhas endothelial da aorta do rato. Esta técnica é útil ao estudar o phenotype celular e molecular de pilhas endothelial em testes padrões de fluxo diferentes e no desenvolvimento da aterosclerose.
Abstract
As mudanças aberrantes no phenotype e na morfologia endothelial são consideradas ser eventos iniciais na patogénese da aterosclerose. A observação direta do endotélio intacto fornecerá informações valiosas para a compreensão dos eventos celulares e moleculares nas células endoteliais disfuncionais. Aqui, nós descrevemos uma técnica modificada da mancha da imunofluorescência do en-cara que permita que os cientistas obtenham imagens desobstruídas da superfície endothelial intacta e analisem os testes padrões da expressão da molécula in situ. O método é simples e confiável para observar toda a monocamada endotelial em diferentes sítios da aorta. Esta técnica pode ser uma ferramenta promissora para a compreensão da fisiopatologia da aterosclerose, especialmente em um estágio inicial.
Introduction
As primeiras alterações na vasculatura iniciam-se primariamente no endotélio, que funciona como uma barreira seletiva entre o sangue e a parede do vaso com seus complexos juncionais apertados intercelulares1. Evidências substanciais apontam para um papel crítico para os efeitos mecânicos do fluxo sanguíneo na função endotelial moduladora2. O estresse de cisalhamento fluido, uma força de atrito gerada pelo fluxo sanguíneo, diferencia diferencialmente a morfologia e a função da célula endotelial, dependendo dos paradigmas de fluxo específicos em diferentes sítios vasculares2,3. As lesões ateroscleróticas ocorrem preferencialmente em sítios de fluxo sanguíneo perturbado (d-Flow), como curvaturas de vasos, divisores de fluxo e pontos de ramificação, em comparação às regiões de fluxo constante (s-Flow), como o segmento reto da artéria. Portanto, a observação direta da morfologia endotelial e dos padrões de expressão da molécula deve fornecer insights importantes sobre os fenótipos estruturais e funcionais das células endoteliais diferentes paradigmas de fluxo.
As pilhas endothelial cultivadas não podem expressar o phenotype real como fazem in vivo em parte devido à perda de impacto do esforço de tesoura fluido, das citocinas circunvizinhas, e das interações Cell-Cell ou Cell-extracellular da matriz. Para ajudar a isso, a monocamada de células endoteliais intactas pode ser estudada em seções transversais usando imunohistoquímica clássica. No entanto, a monocamada endotelial é tão fina e frágil que geralmente não pode ser observada claramente. A immunohistochemistry do en da cara foi usada para observar a superfície interna do endotélio mas é complicada ou errático em seus resultados porque o endotélio é descascado fàcilmente do tecido subjacente, ou apenas parte da parede arterial dos ratos ou dos coelhos, cujas paredes são grossas, é montado4,5.
Modelos de mouse têm vantagens consideráveis sobre outros animais em muitos aspectos. Aqui, nós empregamos uma técnica modificada da imunofluorescência do en-cara para analisar pilhas endothelial do arco aórtico e da aorta torácica no rato de C57BL/6. Essa técnica tem sido amplamente utilizada para estudar a fisiopatologia endotelial em diferentes padrões de fluxo e no desenvolvimento da aterosclerose6,7,8,9,10. Este método permite que os cientistas observem a superfície inteira do endotélio claramente e comparem os testes padrões da expressão de uma proteína dada nas regiões o esforço de cisalhamento fluido diferente.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos experimentais aprovados pela Comissão de recursos animais da Universidade Shanghai Jiao Tong.
1. perfusão da aorta do rato
- Momentaneamente, anestesiam os ratos 12 week-old C57BL/6 com injeções intraperitoneal do pentobarbital do sódio (50 mgs/quilograma de peso de corpo). Confirme a anestesia apropriada delicadamente beliscando a cauda.
Nota: se não for observado nenhum movimento, o animal é suficientemente anestesiado para iniciar os experimentos. - Tape as patas do mouse para uma pilha de toalhas de papel com fitas adesivas.
- Segure a pele do mouse com fórceps e corte a pele com um par de tesouras do abdômen para o topo do tórax.
- Abra a cavidade abdominal abaixo da nervgaiola com um par afiado de tesouras.
- Levante o esterno com fórceps e corte o diafragma; em seguida, cortar a nervcage para expor a cavidade torácica.
- Corte a veia cava logo acima do fígado, com tesouras.
- Perfuse da pressão (100 mmHg) a árvore arterial por 5 minutos com o soro fisiológico pré-refrigerado normal que contem 40 unidades/mL heparina através do ventrículo esquerdo até que os pulmões e o fígado fiquem pálidos. Em seguida, perfuse com paraformaldeído pré-refrigerado a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) por 3 min.
- Remova todos os músculos, órgãos e gordura até que a aorta seja exposta.
- Coloque o rato um microscópio de dissecação.
2. dissecção e abertura longitudinalmente da aorta
- Expor a aorta claramente um microscópio dissecando e remover os tecidos conectivos ao longo da aorta tão limpo quanto possível, com fórceps delicado e um par de tesouras delicadas (Figura 1).
- Dissecar a aorta torácica do coração ao tronco celíaco com um par de tesouras delicadas e põr a aorta em um prato da cultura da pilha de 6 cm com PBS. Corte a aorta longitudinalmente, ao longo da curva menor, e ao longo da curva maior até que o segmento reto seja atendido. Corte aberto os três ramos do arco aórtico, incluindo o innominado, a carótida comum esquerda e a artéria subclávia esquerda, com Microtesoura, como mostra a Figura 2.
3. pré-tratamento e imunocoloração da aorta
- Permeabilizar a aorta com 0,1% de éter de polioxietileno octil fenil em PBS por 10 min e bloqueá-lo com soro de cabra 10% normal em soro fisiológico com tampão Tris (TBS) contendo 2,5% de polissorbato 20 por 1 h à temperatura ambiente em uma placa de cultura de 12 poços.
- Em seguida, incubar a aorta com 5 g/mL de coelho anti-VCAM-1 e 5 g/mL rato anti-VE-caderina no tampão de bloqueio, durante a noite a 4 ° c.
- Depois de enxaguar a amostra 3x com solução de lavagem (TBS contendo 2,5% de polissorbato 20), aplique os anticorpos secundários conjugados por fluorescência (1:1000 diluição, Alexa fluor 555-rotulado IgG anti-coelho e Alexa fluor 488-rotulado IgG anti-Rat) para 1 h no quarto Temperatura. Enxague 3x na solução de lavagem.
- Contratura a aorta com 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 μg/mL) por 10 min e enxague-a 3x na solução de lavagem.
4. montagem da aorta na corrediça de vidro
- Coloc a aorta em um lamela com a superfície Luminal para baixo e mova-a lentamente à solução de montagem do Antifade deixada cair previamente na lamínula. Esticar suavemente a aorta para manter a amostra plana.
- Inverte a lamínula e coloque-a no vidro deslizante. Deve-se tomar cuidado para não permitir que quaisquer bolhas de ar permaneçam entre a amostra e o vidro.
5. observação da aorta
- Examine a aorta com um microscópio confocal da laser-exploração.
- Analise intensidades de cores de diferentes canais a partir da região desejada nas imagens da face en com o software Image-Pro Plus.
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Representative Results
Um rato de 12 semanas de idade C57Bl/6 foi eutanasiado e perfundidos com soro fisiológico normal contendo 40 unidades/ml de heparina e, em seguida, pré-refrigerados 4% paraformaldeído. A aorta do camundongo foi exposta um microscópio de dissecação (Figura 1), dissecada e cortada longitudinalmente (Figura 2). A coloração da imunofluorescência da face do en das pilhas endothelial vasculares foi executada como ilustrado na Figura 3 e na tabela 1. A imunofluorescência da cara do en da adesão da célula vascular protein-1 (VCAM-1) expressão com VE-cadherin como o marcador endothelial foi mostrada testes padrões de variação do fluxo das regiões diferentes da aorta do rato. DAPI também foi contramanchado para mostrar os núcleos celulares para melhor visualização. As pilhas endothelial e lisas do músculo podem facilmente ser distinguidas da morfologia dos núcleos da pilha ao olhar através do z-Stacks o microscópio desde que os núcleos endothelial da pilha são em forma oval e maior do que o liso Spindle-shaped núcleos de células musculares. As imagens representativas en face são mostradas na Figura 4. A aorta foi examinada pelo microscópio de varredura do laser de LSM 710 (tabela dos materiais) com uma lente fluar de óleo 40x/1,3. Da coloração da imunofluorescência da cara do en, nós podemos claramente e diretamente observar que a expressão de VCAM-1 era mais abundante nas regiões o fluxo perturbado (curvatura menor do arco da aorta) do que naqueles o fluxo constante (maior curvatura do arco da aorta e a aorta torácica).
Figura 1 : Expor a aorta do rato um microscópio de dissecação. Remova os tecidos conectivos ao longo da aorta tão limpa quanto possível. a = artéria innominada; b = artéria carótida comum esquerda; c = artéria subclávia esquerda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Dissecção da aorta torácica do rato e corte aberta longitudinalmente. (A) a aorta torácica do coração ao tronco celíaco foi cortada ao longo da curva inferior longitudinalmente, e ao longo da curva maior, até o segmento reto ser atendido. As três filiais do arco aórtico, incluindo o Innominate, a carótida comum esquerda, e a artéria subclávia esquerda, foram cortadas igualmente abertas com microscissors. Linhas tracejadas vermelhas indicam a linha de corte. (B) a aorta foi aberta e espalhada plana nas lâminas de vidro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Esquema para a mancha da imunofluorescência da cara do en de pilhas endothelial vasculares. Primeiro, permeabilizar a aorta dissecada com 0,1% de éter fenil de polioxietileno octil em PBS por 10 min e bloqueá-lo com soro de cabra 10% normal em TBS contendo 2,5% de polissorbato 20 por 1 h à temperatura ambiente em uma placa de cultura de 12 poços. Em seguida, incubar a aorta com anticorpo primário no tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° c, e enxágüe três vezes com solução de lavagem (TBS contendo 2,5% de polissorbato 20). Em seguida, aplique anticorpos secundários conjugados por fluorescência durante 1 h à temperatura ambiente e enxague três vezes. Contratura a aorta com DAPI por 10 min e enxague três vezes na solução de lavagem. Finalmente, monte a aorta em uma corrediça de vidro e observe a aorta por um microscópio confocal da laser-exploração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Representante en face resultados de coloração. (A) a análise da imunofluorescência da cara do en da curvatura menor de uma aorta do rato (áreas do d-fluxo) e da curvatura maior ou da aorta torácica (áreas do s-fluxo) para comparar a expressão endothelial de VCAM-1 paradigms diferentes do fluxo. A morfologia da célula endotelial é mostrada pela coloração de VE-cadherin. (B) áreas representativas do fluxo d (curvatura menor) e áreas de s-Flow (maior curvatura e aorta torácica) são indicadas por setas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo | Processo | Buffer | Temperatura | Tempo |
| 1 | Permeabilize | 0,1% de polioxietileno octil fenilo éter em PBS | Temperatura ambiente | 10 minutos |
| 2 | Bloqueio | soro de cabra 10% normal em soro fisiológico com tampão Tris (TBS) contendo 2,5% de polissorbato 20 | Temperatura ambiente | 1 h a |
| 3 | Primeiro anticorpo (5 g/mL) | Buffer de bloqueio | 4 ° c | Noite |
| 4 | Enxágüe | TBS contendo 2,5% de polissorbato 20 | Temperatura ambiente | 5 min, 3 vezes |
| 5 | Anticorpo secundário de fluorescência (1:1000) | Buffer de bloqueio | Temperatura ambiente | 1 h a |
| 6 | Enxágüe | TBS contendo 2,5% de polissorbato 20 | Temperatura ambiente | 5 min, 3 vezes |
Tabela 1: informações detalhadas sobre o rosto en procedimento de coloração por imunofluorescência.
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Discussion
O endotélio é exposto a inúmeros fatores pró-aterogênicos, incluindo lipídios, mediadores inflamatórios e estresse de cisalhamento fluido1,11,12. A observação direta de células endoteliais in situ fornece as vantagens especiais para analisar alterações na morfologia celular, junções intercelulares e padrões de expressão de moléculas em resposta aos estímulos de lesão.
Estudos prévios forneceram duas técnicas diferentes de imunohistoquímica en face para observar o endotélio da parede arterial4,5. Uma delas é a obtenção de monocamada endotelial por meio da remoção do endotélio da parede do vaso por uma técnica especial, difícil de dominar, podendo resultar na perda de muito endotélio nos locais de ramificação da artéria4. O outro está montando a parede arterial inteira como nós descrevemos. A preparação da inteiro-montagem é fácil de executar e pode manter a monocamada endothelial inteira no coelho e nos ratos5,13. No entanto, espalhar o rato inteiro do espécime aórtico liso não é fácil, e a falha fazer assim pode pela maior parte afetar a qualidade da observação. A preparação do espécime aórtico como descrito aqui, com as curvaturas cortadas abertas e a superfície Luminal enfrentada para baixo na lamínula, facilita espalhar o espécime aórtico liso no vidro da corrediça. Além disso, um microscópio confocal da laser-exploração é exigido para melhor centrar-se sobre o monocamada endothelial fino da pilha que alinha o vaso sanguíneo.
Um ponto chave desta técnica é esticar o espécime aórtico tão horizontalmente como possível para começ uma observação melhor da aorta. Além disso, a heparina deve ser adicionada à solução salina normal antes da perfusão, e o espécime aórtico deve ser tratado suavemente durante todo o processo. Paraformaldeído deve ser preparado recentemente e mantido a 4 ° c até o uso.
Há limitações a esta técnica. Primeiramente, a capacidade da imunofluorescência do en-cara para detectar a substância subendotelial, tal como a lipoproteína de baixa densidade depositada, é limitada quando comparada à immunohistochemistry regular de seções do tecido. Em segundo, os sinais fluorescentes são descorados prontamente após uma varredura pelo microscópio confocal, especial ao executar a análise do z-Axis. Além disso, a expressão da molécula alvo só pode ser semiquantificada, de acordo com sua intensidade fluorescente.
Em síntese, esta técnica de coloração de imunofluorescência en face modificada proporciona uma maneira fácil de analisar a morfologia e o padrão de expressão protéica das células endoteliais vasculares em regiões diferentes paradigmas de fluxo sanguíneo6,7 e na patogênese da aterosclerose.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (Grant no. 81670451, 81770430), o programa de Xangai Rising-Star (Grant no. 17QA1403000), e o Comitê de tecnologia da ciência do governo municipal de Xangai (Grant no. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
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