Her beskriver vi rev immun præcipitation i nærværelse af HIV-1 replikation for massespektrometri. De beskrevne metoder kan anvendes til identifikation af nukleolarfaktorer, der er involveret i HIV-1-infektions cyklussen, og gælder for andre sygdomsmodeller til karakterisering af under studerede veje.
HIV-1 infektiøse cyklus kræver viral protein interaktioner med værts faktorer for at lette viral replikation, emballering, og frigivelse. Den smitsomme cyklus kræver yderligere dannelsen af virale/Host-protein komplekser med HIV-1-RNA for at regulere splejningen og muliggøre nukleocytoplasmisk transport. HIV-1 rev-proteinet opnår den nukleare eksport af HIV-1 mRNAs gennem multimerisering med intronic CIS-virkende mål-den rev respons element (rre). Et nucleolar lokaliserings signal (NoLS) findes inden for COOH-endestation af det rev arginin-rige motiv (ARM), der tillader akkumulering af rev/RRE komplekser i nucleolus. Nucleolar faktorer er spekuleret til at støtte HIV-1 infektiøse cyklus gennem forskellige andre funktioner ud over at mætte mRNA-uafhængig nuklear eksport og splicing. Vi beskriver en chromatinimmunpræcipitation metode af vild-type (WT) rev i sammenligning med rev nucleolar mutationer (sletning og enkelt-punkt rev-Nols mutationer) i nærværelse af HIV-1 replikation for massespektrometri. Nukleolar faktorer impliceret i nukleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 og nucleolin C23), samt cellulære splejsning faktorer, mister interaktion med rev i nærværelse af rev-Nols mutationer. Forskellige andre nukleolar faktorer, såsom snoRNA C/D box 58, er identificeret til at miste interaktion med rev mutationer, men deres funktion i HIV-1 replikation cyklus forbliver ukendt. Resultaterne præsenteres her demonstrere brugen af denne metode til identifikation af virale/Host nucleolar faktorer, der opretholder HIV-1 infektiøse cyklus. De begreber, der anvendes i denne fremgangsmåde, gælder for andre virale og sygdomsmodeller, som kræver karakterisering af under studerede veje.
Nucleolus postuleres som samspillet jorden af forskellige cellulære vært og virale faktorer, der kræves for viral replikation. Nucleolus er en kompleks struktur inddelt i tre forskellige rum: fibrillar-rummet, det tætte fibrillar-rum og det granulære rum. HIV-1 rev-proteinet lokaliserer specifikt i granulære rum; årsagen til dette lokaliserings mønster er dog ukendt. Ved tilstedeværelse af enkeltpunkts-mutationer inden for NoLS-sekvensen (rev-mutationer 4, 5 og 6) opretholder rev et nukleolært mønster og har tidligere vist sig at redde HIV-1HXB2 -replikation, dog med nedsat effektivitet sammenlignet med WT rev1 . Alle enkeltpunkts-mutationer kan ikke opretholde HIV-1NL4-3- infektions cyklussen. I nærværelse af flere enkeltpunkts-mutationer inden for NoLS-sekvensen (rev-NoLS-mutationer 2 og 9) er rev blevet observeret for at sprede hele kernen og cytoplasmaet og har ikke været i stand til at redde HIV-1HXB2 Replication1. Målet med denne proteomics undersøgelse er at dechifrere nucleolar samt nonnucleolar cellulære faktorer involveret i den rev-medierede HIV-1 infektiøse pathway. Rev chromatinimmunpræcipitation betingelser er optimeret gennem interaktion med nucleolar B23 phosphoprotein, som tidligere har vist sig at miste interaktion med rev i nærværelse af nukleolar mutationer.
Rev cellulære faktorer er blevet grundigt undersøgt i fortiden; Men, dette er sket i fravær af viral patogenese. Et protein, især, der er karakteriseret i denne undersøgelse gennem rev interaktion under HIV-1 replikation er nucleolar glycosyleret B23-også kaldet nucleophosmin (NPM), numatrin, eller NO38 i padder2,3, 4. B23 udtrykkes som tre isoformer (NPM1, NPM2 og NPM3)-alle medlemmer af nukleofsmin/nucleoplasmin Nuclear chaperone-familien5,6. Den NPM1 molekylære chaperone funktioner i den korrekte samling af nukleosomer, i dannelsen af protein/nukleinsyre komplekser involveret i kromatin højere orden strukturer7,8, og i forebyggelsen af aggregering og misfoldning af målproteiner gennem et N-terminal kerneområde (rester 1-120)9. NPM1 funktionalitet strækker sig til ribosom Genesis gennem transport af preribosomale partikler mellem kernen og cytoplasmaet10,11, behandling af preribosomal RNA i den interne transkriberet spacer sekvens 12,13, og arrestere nucleolar aggregering af proteiner under ribosomale assembly14,15. NPM1 er impliceret i hæmning af apoptose16 og i stabilisering af tumor suppressorer ARF17,18 og P5319, afslører sin dobbelte rolle som en onkogen faktor og tumor suppressor. NPM1 deltager i cellulære aktiviteter af genom stabilitet, centrosome replikation, og transskription. NPM1 findes i nucleoli under celle cyklus Interphase, langs den kromosomale periferi under mitose, og i prenucleolar organer (PNB) ved afslutningen af mitose. NPM2 og NPM3 er ikke så godt undersøgt som NPM1, som gennemgår ændrede ekspressionsniveauer under malignitet20.
NPM1 er dokumenteret i nucleocytoplasmic fjer ning af forskellige nukleare/nukleolære proteiner gennem en intern NES og NLS9,21 og blev tidligere rapporteret til at drive den nukleare import af HIV-1 TAT og rev proteiner. I nærværelse af B23-binding-domæne-β-galactosidase fusion proteiner, TAT mislocalizes inden for cytoplasmaet og mister transaktiverende aktivitet; Dette viser en stærk affinitet af TAT for B232. En anden undersøgelse etablerede en rev/B23 stabilt kompleks i fravær af RRE-holdige mRNAs. Ved tilstedeværelse af RRE mRNA dissocieres rev fra B23 og binder fortrinsvis til HIV RRE, hvilket fører til forskydning af B2322. Det er ukendt, hvor, på det subnukleare niveau, TAT transaktiveringen og rev udveksling processen af B23 for HIV mRNA finde sted. Begge proteiner postuleres for at komme ind i nucleolus samtidigt gennem B23 interaktion. Inddragelsen af andre Host cellulære proteiner i HIV-nukleolar pathway forventes. De metoder, der er beskrevet i denne proteomics undersøgelse vil hjælpe belyse samspillet mellem nucleolus med vært cellulære faktorer involveret under HIV-1 patogenese.
Proteomics-undersøgelsen blev indledt gennem ekspression af rev NoLS single-point mutationer (M4, M5 og M6) og flere arginin erstatninger (m2 og M9) for HIV-1HXB2 produktion. I denne model, en Hela cellelinje stabilt udtrykker rev-mangelfuld HIV-1HXB2 (hlfb) er transficeret med WT rev og rev nucleolar mutationer indeholdende en flag tag ved 3 ‘ ende. Tilstedeværelsen af WT rev vil gøre det muligt at forekomme viral replikering i HLfB-kulturen sammenlignet med rev-NoLS-mutationer, der ikke redder rev-mangel (m2 og M9), eller tillader viral replikering at forekomme, men ikke så effektivt som WT rev (M4, M5 og M6)1. Celle lysatet opsamles 48 h senere efter viral proliferation ved tilstedeværelse af rev-ekspression og udsættes for immunopræcipitation med en lyse buffer, der er optimeret til rev/B23-interaktion. Lysis buffer optimering ved hjælp af varierende saltkoncentrationer er beskrevet, og protein elueringsmetoder for HIV-1 rev sammenlignes og analyseres i sølvfarvede eller Coomassie-farvede SDS-side geler. Den første proteomics-tilgang indebærer en direkte analyse af en elueret prøve fra udtrykt WT rev, m2, M6 og M9 ved tandem massespektrometri. En anden fremgangsmåde, hvormed eluaterne af WT rev, M4, M5 og M6 gennemgik en gel ekstraktionsproces, sammenlignes med den første metode. Peptidaffinitet til rev-NoLS-mutationer i forhold til WT rev analyseres, og sandsynligheden for protein identifikation vises. Disse tilgange afslører potentielle faktorer (nucleolar og nonnucleolar), der deltager i HIV-1 mRNA transport og splejning med rev under HIV-1 replikation. Samlet set er celle lysis, IP, og elueringsbetingelser, der er beskrevet, gældende for virale proteiner af interesse for forståelsen af vært cellulære faktorer, der aktiverer og regulerer smitsomme veje. Dette gælder også for studiet af cellulære Host faktorer, der kræves for persistens af forskellige sygdomsmodeller. I denne proteomics model, HIV-1 rev IP er optimeret til B23 interaktion at belyse nukleolar faktorer involveret i nucleocytoplasmic fjer-aktivitet og HIV-1 mRNA binding. Derudover, cellelinjer stabilt udtrykker smitsomme sygdomme modeller, der er mangelfuld for centrale proteiner af interesse kan udvikles, svarende til HLfB cellelinje, at studere infektiøse veje af interesse.
Massespektrometriske analyser, der sammenlignede rev-NoLS-mutationer og WT rev i tilstedeværelse af HIV-1, blev vurderet til at forstå nukleolarfaktorer, der var involveret i viral replikeringscyklussen. Dette vil identificere de nukleolarkomponenter, der er nødvendige for viral infektivitet. Nucleolar B23 har en høj affinitet til rev-NoLS og funktioner i nukleolar lokalisering af rev3 og nucleocytoplasmic transport af rev-bundet hiv mRNAs22. Affiniteten af B23 med rev-…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender Dr. Barbara K. Felber og Dr. George N. Pavlakis for HLfB vedlige kultur fra National Institutes of Health (NIH) AIDS forskning og reference reagens program, division af AIDS, National Institute of allergi og infektiøse Sygdomme (NIAID), NIH. Forfatterne anerkender også finansielle kilder, der leveres af NIH, tilskud AI042552 og AI029329.
Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-212 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-500 | |
Acrylamide:Bisacrylamide | BioRad | 1610158 | |
Ammonium bicarbonate | Fisher Chemical | A643-500 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
ANTI-Flag M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG | Sigma-Aldrich | F3165 | |
BioMax MS film | Carestream | 8294985 | |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL | Bio-Rad | 5000006 | |
B23 mouse monoclonal IgG | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47725 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
Carnation non-fat powdered milk | Nestle | N/A | |
Cell scraper | ThermoFisher Scientific | 179693PK | |
C18IonKey nanoTile column | Waters | 186003763 | |
Corning 100-mm TC-treated culture dishes | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | J1539714 | |
1 x DPBS | Corning | 21-030-CVRS | |
ECL Estern blotting substrate | Pierce | 32106 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Chemical | A409-4 | |
FBS | Gibco | 16000044 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GelCode blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | |
goat-anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2005 | |
Iodoacetamide | ACROS Organics | 122270050 | |
KimWipe delicate task wiper | Kimberly Clark Professional | 34120 | |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
NanoAcuity UPLC | Waters | N/A | |
Pierce Silver Stain Kit | Thermo Scientific | 24600df | |
15-mL Polypropylene conical tube | Falcon | 352097 | |
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Scientific | 26616 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | |
Purified BSA | New England Biolabs | B9001 | |
PVDF Western blotting membrane | Roche | 3010040001 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
10 x TBS | Fisher Bioreagents | BP2471500 | |
TEMED | BioRad | 1610880edu | |
Triton X-100 detergent solution | BioRad | 1610407 | |
Trizaic source | Waters | N/A | |
trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CIS | |
Tween 20 | BioRad | 1706531 | |
Synapt G2 mass spectrometer | Waters | N/A | |
Whatman filter paper | Tisch Scientific | 10427813 |