Her beskriver vi rev immunutfelling i nærvær av HIV-1 replikering for masse massespektrometri. Metodene som er beskrevet kan brukes for identifisering av nucleolar faktorer involvert i HIV-1 smittsomme syklusen og gjelder for andre sykdoms modeller for karakterisering av lite studert trasé.
Den HIV-1 smittsomme syklusen krever viral protein interaksjoner med verten faktorer for å lette viral replikering, emballasje, og slipp. Den smittsomme syklusen ytterligere krever dannelsen av viral/vert protein komplekser med HIV-1 RNA å regulere skjøting og aktivere nucleocytoplasmic transport. HIV-1 rev protein oppnår kjernefysisk eksport av HIV-1 mRNAs gjennom multimerization med intronic CIS-fungerende mål-rev respons element (RRE). En nucleolar lokalisering signal (NoLS) finnes innenfor COOH-Terminus av rev Arginine-rike motiv (ARM), slik at akkumulering av rev/RRE komplekser i nucleolus. Nucleolar faktorer er spekulert å støtte HIV-1 smittsomme syklus gjennom ulike andre funksjoner i tillegg til formidling mRNA-uavhengig kjernefysisk eksport og skjøting. Vi beskriver en immunutfelling metode av vill-type (WT) rev i forhold til rev nucleolar mutasjoner (sletting og single-point rev-NoLS mutasjoner) i nærvær av HIV-1 replikering for masse massespektrometri. Nucleolar faktorer innblandet i nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 og nucleolin C23), samt cellulære skjøting faktorer, mister interaksjon med rev i nærvær av rev-NoLS mutasjoner. Ulike andre nucleolar faktorer, for eksempel snoRNA C/D-boksen 58, er identifisert for å miste interaksjon med rev mutasjoner, men deres funksjon i HIV-1 replikering syklusen forblir ukjent. Resultatene som presenteres her demonstrere bruken av denne tilnærmingen for identifisering av viral/vert nucleolar faktorer som opprettholder HIV-1 smittsomme syklusen. Begrepene som brukes i denne tilnærmingen er gjeldende for andre viral og sykdom modeller som krever karakterisering av lite studert trasé.
Den nucleolus er postulert som samspillet bakken av ulike mobilnettet vert og viral faktorer som kreves for viral replikering. Nucleolus er en kompleks struktur inndelt i tre forskjellige rom: fibrillær rommet, det tette fibrillær rommet og det detaljerte rommet. HIV-1 rev protein lokaliseres spesielt innenfor kornet avdelinger; årsaken til dette lokaliserings mønsteret er imidlertid ukjent. I nærvær av single-point mutasjoner innenfor NoLS sekvensen (rev mutasjoner 4, 5 og 6), rev opprettholder et nucleolar mønster og har tidligere vist å redde HIV-1HXB2 replikering, men med redusert effektivitet i forhold til WT rev1 . Alle single-point mutasjoner er ikke i stand til å opprettholde HIV-1NL4-3 smittsomme syklusen. I nærvær av flere single-point mutasjoner innenfor NoLS sekvensen (rev-NoLS mutasjoner 2 og 9), rev har blitt observert å spre hele kjernen og cytoplasma og har ikke vært i stand til å redde HIV-1HXB2 Replication1. Målet med denne Proteomikk studien er å dechiffrere nucleolar så vel som nonnucleolar cellulære faktorer involvert i rev-mediert HIV-1 smittsomme veien. Rev immunutfelling forhold er optimalisert gjennom interaksjon med nucleolar B23 phosphoprotein, som tidligere har vist å miste interaksjon med rev i nærvær av nucleolar mutasjoner.
Rev cellulære faktorer har blitt grundig studert i det siste; Men, dette har blitt gjort i fravær av viral patogenesen. Ett protein, spesielt, som er karakterisert ved denne studien gjennom rev interaksjon under HIV-1 replikering er nucleolar phosphoprotein B23-også kalt nucleophosmin (NPM), numatrin eller NO38 i amfibier2,3, 4. B23 uttrykkes som tre isoformene (NPM1, NPM2 og NPM3)-alle medlemmer av nucleophosmin/nucleoplasmin kjernefysiske Anstandsdame familie5,6. Den NPM1 molekylære Anstandsdame funksjoner i riktig montering av nucleosomes, i dannelsen av protein/nukleinsyre acid komplekser involvert i kromatin høyere orden strukturer7,8, og i forebygging av aggregering og misfolding av mål proteiner gjennom et N-Terminal kjerne domene (rester 1-120)9. NPM1 funksjonalitet strekker seg til ribosom Genesis gjennom transport av preribosomal partikler mellom kjernen og cytoplasma10,11, behandling av preribosomal RNA i den interne transkribere spacer sekvensen 12,13, og arrestere den nucleolar aggregering av proteiner under ribosomal forsamlingen14,15. NPM1 er innblandet i Hemming av apoptose16 og i stabilisering av tumor Suppressors Arf17,18 og p5319, avslører sin dual rolle som en kreftfremkallende faktor og tumor Suppressor. NPM1 deltar i mobilnettet aktiviteter av Genova stabilitet, centrosome replikering, og transkripsjon. NPM1 er funnet i nucleoli under celle syklus Interphase, langs kromosom periferien under mitose, og i prenucleolar organer (PNB) ved avslutningen av mitose. NPM2 og NPM3 er ikke så godt studert som NPM1, som gjennomgår endrede uttrykks nivåer under kreft20.
NPM1 er dokumentert i nucleocytoplasmic skytteltrafikk av ulike kjernefysiske/nucleolar proteiner gjennom en intern NES og NLS9,21 og ble tidligere rapportert å drive kjernefysisk import av HIV-1 TAT og rev proteiner. I nærvær av B23-bindende-domene-β-galaktosidase Fusion proteiner, TAT mislocalizes innenfor cytoplasma og mister transactivation aktivitet; Dette demonstrerer en sterk affinitet av TAT for B232. En annen studie etablerte en rev/B23 stabilt kompleks i fravær av RRE-inneholder mRNAs. I nærvær av RRE mRNA, rev dissociates fra B23 og binder fortrinnsvis til HIV RRE, fører til forskyvning av B2322. Det er ukjent hvor, på subnuclear nivå, TAT transactivation og rev utveksle prosessen med B23 for HIV mRNA finner sted. Begge proteinene er postulert å gå inn i nucleolus samtidig gjennom B23 interaksjon. Involvering av andre vert cellulære proteiner i HIV nucleolar veien er forventet. Metodene som er beskrevet i denne Proteomikk undersøkelsen vil bidra til å belyse samspillet mellom nucleolus med verts cellulære faktorer involvert under HIV-1-patogenesen.
Den Proteomikk etterforskningen ble initiert gjennom uttrykk for rev NoLS enkelt punkt mutasjoner (M4, M5, og M6) og flere Arginine erstatninger (M2 og M9) for HIV-1HXB2 produksjon. I denne modellen, en jakten cellelinje stabilt uttrykker rev-mangelfull HIV-1HXB2 (HLfB) er TRANSFEKTERTE med WT rev og rev nucleolar mutasjoner som inneholder et flagg merke på 3 ‘ end. Tilstedeværelsen av WT rev vil tillate viral replikering til å skje i HLfB kultur, i forhold til rev-NoLS mutasjoner som ikke redde rev mangel (M2 og M9), eller tillate viral replikering til å skje, men ikke så effektivt som WT rev (M4, M5, og M6)1. Cellen lysat samles 48 h senere etter viral spredning i nærvær av rev uttrykk og utsatt for immunutfelling med en lyseringsbuffer optimalisert for rev/B23 interaksjon. Lyseringsbuffer optimalisering ved hjelp av varierende salt konsentrasjoner er beskrevet, og protein eluering metoder for HIV-1 rev blir sammenlignet og analysert i sølv-farget eller Coomassie-farget SDS-PAGE gels. Den første Proteomikk tilnærmingen innebærer direkte analyse av en eluert prøve fra uttrykt WT rev, m2, M6 og M9 ved tandem masse massespektrometri. En annen tilnærming der eluates av WT rev, M4, M5 og M6 gjennomgikk en gel utvinningsprosess sammenlignes med den første tilnærmingen. Peptid affinitet til rev-NoLS mutasjoner i forhold til WT rev analyseres og protein identifikasjon sannsynlighet vises. Disse tilnærmingene avslører potensielle faktorer (nucleolar og nonnucleolar) som deltar i HIV-1 mRNA transport og skjøting med rev under HIV-1 replikering. Total, cellen lyse, IP, og eluering vilkårene beskrevet er anvendelig på viral protein av interesse for forståelsen av vert Cellular faktorene det aktivere og regulere infeksjon trasé. Dette gjelder også for studiet av mobilnettet vert faktorer som kreves for utholdenhet av ulike sykdoms modeller. I denne Proteomikk modellen, HIV-1 rev IP er optimalisert for B23 interaksjon til belyse nucleolar faktorer involvert i nucleocytoplasmic skytteltrafikk aktivitet og HIV-1 mRNA bindende. I tillegg, cellelinjer stabilt uttrykker smittsomme sykdommer modeller som er mangelfull for viktige proteiner av interesse kan utvikles, ligner på HLfB cellelinje, for å studere smittsomme stier av interesse.
Masse spectrometric analyser sammenligne rev-NoLS mutasjoner og WT rev i nærvær av HIV-1 ble vurdert til å forstå nucleolar faktorer involvert i viral replikering syklus. Dette vil identifisere nucleolar komponenter som kreves for viral infectivity. Nucleolar B23 har en høy affinitet til rev-NoLS og funksjoner i Nucleolar lokalisering av rev3 og nucleocytoplasmic transport av rev-bundet HIV mRNAs22. Affinitet av B23 med rev-NoLS mutasjoner, som inneholdt én eller fler…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner Dr. Barbara K. Felber og Dr. George N. Pavlakis for HLfB tilhenger kulturen som tilbys av National Institutes of Health (NIH) AIDS forskning og referanse reagens programmet, Division of AIDS, National Institute of allergi og smittsomme Sykdommer (NIAID), NIH. Forfatterne erkjenner også finansielle kilder gitt av NIH, Grants AI042552 og AI029329.
Acetic acid | Fisher Chemical | A38S-212 | |
Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-500 | |
Acrylamide:Bisacrylamide | BioRad | 1610158 | |
Ammonium bicarbonate | Fisher Chemical | A643-500 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
ANTI-Flag M2 affinity gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG | Sigma-Aldrich | F3165 | |
BioMax MS film | Carestream | 8294985 | |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL | Bio-Rad | 5000006 | |
B23 mouse monoclonal IgG | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47725 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
Carnation non-fat powdered milk | Nestle | N/A | |
Cell scraper | ThermoFisher Scientific | 179693PK | |
C18IonKey nanoTile column | Waters | 186003763 | |
Corning 100-mm TC-treated culture dishes | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | J1539714 | |
1 x DPBS | Corning | 21-030-CVRS | |
ECL Estern blotting substrate | Pierce | 32106 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Chemical | A409-4 | |
FBS | Gibco | 16000044 | |
Formic Acid | Fisher Chemical | A117-50 | |
GelCode blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | |
goat-anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2005 | |
Iodoacetamide | ACROS Organics | 122270050 | |
KimWipe delicate task wiper | Kimberly Clark Professional | 34120 | |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
NanoAcuity UPLC | Waters | N/A | |
Pierce Silver Stain Kit | Thermo Scientific | 24600df | |
15-mL Polypropylene conical tube | Falcon | 352097 | |
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo Scientific | 26616 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | |
Purified BSA | New England Biolabs | B9001 | |
PVDF Western blotting membrane | Roche | 3010040001 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | |
10 x TBS | Fisher Bioreagents | BP2471500 | |
TEMED | BioRad | 1610880edu | |
Triton X-100 detergent solution | BioRad | 1610407 | |
Trizaic source | Waters | N/A | |
trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CIS | |
Tween 20 | BioRad | 1706531 | |
Synapt G2 mass spectrometer | Waters | N/A | |
Whatman filter paper | Tisch Scientific | 10427813 |