Summary
Это исследование представляет собой альтернативную стратегию к обычным токсичным аналоговым методом в выявлении аминокислотных сверхпроизводителей с помощью редких богатых кодон маркерами для достижения точности, чувствительности и высокой пропускной силы одновременно.
Abstract
Для удовлетворения постоянно растущего рынка аминокислот необходимы высокопроизводительные производственные штаммы. Аминокислоты overproducers условно определены путем использования конкуренции между аминокислотами и их аналогов. Однако этот аналоговый метод имеет низкую точность, а надлежащие аналоги для конкретных аминокислот ограничены. Здесь мы представляем альтернативную стратегию, которая позволяет точно, чувствительный и высокопроизводительный скрининг аминокислот с использованием редких кодон богатых маркеров. Эта стратегия вдохновлена феноменом смещения использования кодона в переводе белков, для которого кодоны классифицируются на общие или редкие на основе их частот возникновения в кодирующей ДНК. Перевод редких кодонов зависит от их соответствующих редких переносных РНК (tRNAs), которые не могут быть полностью заряжены аминокислотами cognate под голодом. Теоретически, редкие tRNAs могут быть заряжены, если есть избыток аминокислот после зарядки синонимов общих изоастежителей. Поэтому отсталые переводы, вызванные редкими кодонами, могут быть восстановлены путем кормления или внутриклеточного перепроизводства соответствующих аминокислот. Согласно этому предположению, система отбора или скрининга для выявления аминокислотных производителей устанавливается путем замены общих кодонов целевых аминокислот их синонимами редких альтернатив в генах устойчивости к антибиотикам или генах кодирование флуоресцентных или хромогенных белков. Мы показываем, что протеиновые экспрессии могут быть значительно затруднены включением редких кодонов и что уровни белков положительно коррелируют с аминокислотными концентрациями. Используя эту систему, перепроизводители нескольких аминокислот можно легко отсеивать из библиотек мутаций. Эта стратегия на основе редкого кодона требует только одного модифицированного гена, и усев с меньшей вероятностью избежит выделения, чем в других методах. Он предлагает альтернативный подход для получения аминокислотных производителей.
Introduction
Нынешнее производство аминокислот в значительной степени зависит от брожения. Тем не менее, титры и дает для большинства штаммов производства аминокислот ниже растущих требований глобального рынка аминокислот, который стоит миллиарды долларов1,2. Получение высокопроизводительных аминокислотных производителей имеют решающее значение для модернизации аминокислотной промышленности.
Традиционная стратегия для выявления аминокислот overproducers использует конкуренции между аминокислотами и их аналогов в синтезе белка3,4. Эти аналоги способны заряжать tRNAs, которые распознают соответствующие аминокислоты и тем самым подавляют удлинение пептидных цепей, что приводит к арестованному росту или смерти клеток5. Одним из способов противостоять аналоговым стрессам является увеличение концентрации внутриклеточных аминокислот. Обогащенные аминокислоты превзойдят аналоги конечной тРНК и обеспечат правильный синтез функциональных белков. Таким образом, штаммы, которые выживают аналоги могут быть выбраны и, вероятно, overproducers соответствующих аминокислот.
Хотя оказался успешным в выборе overproducers для аминокислот, таких как L-лейцин6, аналоговая стратегия страдает от серьезных недостатков. Одной из основных проблем является аналоговое сопротивление, возникает из процесса мутагенеза или через спонтанные мутации. Штаммы с сопротивлением могут избежать выбора, блокируя, экспортируяили унижая аналоги 5. Еще одной проблемой является токсические побочные эффекты аналогов на другие клеточные процессы7. Как следствие, штаммы, которые выживают аналоговый выбор не может быть аминокислоты overproducers, в то время как желаемые overproducers могут быть ложно уничтожены из-за негативных побочных эффектов.
Здесь представлена новая стратегия, основанная на законе о предвзятом отношении кодона, с тем чтобы добиться точной и быстрой идентификации аминокислотных перепроизводителей. Большинство аминокислот кодируются более чем одним нуклеотидным триплетом, которыйпо-разному благоприятствует организмам-хозяину 8,9. Некоторые кодоны редко используются в последовательности кодирования и называются редкими кодонами. Их переводы в аминокислоты опираются на коньяк tRNAs, которые несут соответствующие аминокислоты. Тем не менее, tRNAs, которые признают редкие кодоны обычно имеют гораздо меньше изобилия, чем tRNAs общих кодонов10,11. Следовательно, эти редкие tRNAs менее вероятно, чтобы захватить свободные аминокислоты в соревнованиях с другими изоастои, и переводы редких кодон-богатых последовательностей начинают замедляться или даже прекращаются, когда количество аминокислот ограничено 10. Переводы теоретически могут быть восстановлены, если есть избыток аминокислот после зарядки синонимных общих tRNAs из-за перепроизводства или дополнительных кормлений соответствующих аминокислот12. Если редкий богатый кодоном ген кодирует маркер выбора или скрининга, штаммы, демонстрирующие соответствующие фенотипы, могут быть легко идентифицированы и, вероятно, являются перепроизводителями целевых аминокислот.
Вышеупомянутая стратегия применяется для создания системы отбора и скрининга для идентификации производителей аминокислот. Система отбора использует гены устойчивости к антибиотикам (например, kanR) в качестве маркеров, в то время как система скрининга использует гены, кодирующие флуоресцентные (например, зеленый флуоресцентный белок (GFP) или хромагенные (например, PrancerPurple) белки. Гены маркеров в обеих системах модифицируются путем замены определенных чисел общих кодонов для целевой аминокислоты на ее синонимную редкую альтернативу. Штаммы в библиотеке мутаций, которые гавани редких кодон богатых маркер гена отбираются или скрининга при надлежащих условиях, и overproducers целевых аминокислот могут быть легко определены. Рабочий процесс начинается со построения редко-кодон-богатых маркера генной системы, а затем оптимизации условий труда, а затем выявление и проверка аминокислоты overproducers. Эта аналогово-независимая стратегия основана на догме в переводе белков и была практически проверена для точной и быстрой идентификации аминокислотных перепроизводителей. Теоретически, он может быть непосредственно использован для аминокислот с редкими кодонами и для всех микроорганизмов. В целом стратегия на основе редкого кодона послужит эффективной альтернативой традиционному аналоговому подходу, когда отсутствуют надлежащие аналоги конкретных аминокислот или когда главной проблемой является высокая уровень ложного положительного уровня. Протокол ниже использует лейцин редкий кодон, чтобы продемонстрировать эту стратегию в выявлении Escherichia coli L-leucine overproducers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Конструкция плазмидов, выражающих редко-кодон-богатые гены маркера
- Выберите ген маркера, который содержит соответствующее количество общих кодонов для целевой аминокислоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для L-лейцина, ген резистентности канамицина kanR, который содержит 29 кодонов лейцина, из которых 27 являются общими кодонами, используется для строительства системы отбора13. Ген gfp, который содержит 17 общих кодонов из 19 кодонов лейцина, или фиолетовый белок-кодируя ген prancerpurple (ppg),который гавани 14 leucine общие кодоны, используется для системы скрининга (Дополнительная таблица 1 ). - Замените общие кодоны в генах маркеров синонимом редкого кодона. Для L-лейцин, заменить его кодоны в канR, gfp, или ppg с редкимкодон CTA, генерации кан R-RCs, gfp-RC, или ppg-RC, соответственно13 ( Дополнительная таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота редкого кодона в генах маркера повлияет на строгость системы отбора или скрининга. В целом, увеличение числа редких кодонов повысит строгость системы отбора или скрининга. Для достижения соответствующего отбора или скрининга силы, дизайн серии маркер генов, которые гавани различные номера редких кодонов и сравнить их последствия. - Создавайте строительные блоки редкобогатых кодонами маркерных генов с помощью таких инструментов, как GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/) для синтеза генов. Кроме того, закажите гены маркеров из коммерческих услуг синтеза генов.
- На странице GeneDesign выберите дизайн строительного блока (постоянная перекрытие длины).
- Вставьте последовательности редко-кодон-богатых генов маркера в поле Последовательности.
- Определить длину перекрытия между олиготами сборки; имейте в виду, что по умолчанию 40 bp прекрасно работает для большинства последовательностей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите онлайн-руководство для получения дополнительных инструкций по настройкам других параметров. - Нажмите кнопку дизайн строительных блоков и заказать олигонуклеотиды, перечисленные на странице.
- Синтезировать редко-кодон-модифицированные гены путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе точного синтеза15.
- Ligate редких кодон богатых кан R-RC вектор pET-28a, gfp-RC pSB1C3, и ppg-RC к CPB-37-44116.
ПРИМЕЧАНИЕ: PET-28a и pSB1C3 плазмидные карты доступны на SnapGene онлайн плазмидной базы данных(Дополнительная таблица 1); Карта плазмидирования CPB-37-441 доступна на веб-сайте атум-хромогенного белка.- На льду добавьте вектор и фрагменты маркера в молярном соотношении 1:1 до 7,5 л сборочной смеси (см. Таблица Материалов) к общему объему 10 зл. Инкубировать образец при 50 градусах по Цельсию в течение 1 ч.
- Преобразуйте 5 qL сборочного продукта в 50 л компетентных ячеек (см. ТаблицуМатериалов) при 42 градусах по Цельсию на 30 с.
- Восстановление клеток в SOC (Супер оптимальный бульон с катаболитрепрессии) среды на 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч, пластины их на LB (лизогенный бульон) агар среды, и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
- Привить колонию в среде LB и инкубировать при 37 кс на 8 ч.
- Изолировать плазмид с помощью предпочтительного коммерческого комплекта.
2. Оптимизация условий отбора
- Сделать родительский штамм, используемый для мутагенеза в компетентные клетки17.
- Преобразуйте 50 зл компетентных клеток с 1 зл и плазмида, который несет дикий тип kanR, и преобразовать другой набор компетентных клеток с плазмидом, содержащим канR-RC29 со всеми лейцин кодон заменены редкими кодон CTA.
- Добавьте 950 кл. среды SOC и инкубировать образец в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
- Плита 100 л клеточной культуры на среде агара LB, содержащую 50 мкгл-1 канамицин, и инкубирует его при 37 градусах По Цельсию в течение примерно 8 ч до появления колоний.
- Выберите колонии, которые гавани дикого типа канR и лейцин редких кодон-богатых кан R-RC29 и использовать каждый для привить 5 мл пятиразового разбавленного среднего LB (0,2x LB), содержащий 50 мкгмл-1 канамицин. Инкубировать образцы в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда имеет решающее значение для системы отбора. Он должен содержать достаточно углерода и азота, чтобы позволить экспрессию белка устойчивости к антибиотикам от гена дикого типа, а не от редко-кодон-модифицированных производных. В этом случае концентрация L-лейцина в среде 1x LB слишком высока, чтобы полностью ингибировать экспрессию белка от редкого богатых кодоном канR. Таким образом, разбавленная среда LB с фактором разбавления, таким как 5, используется для генерации явной разницы в выражениях белка от диких и редких генов, богатых кодоном. - Передача 200 л каждой из клеточных культур в 96-пуговую пластину в трипликате в определенных временных точках (например, 8 ч, 16 ч и 24 ч). Измерьте OD600 (оптическая плотность на 600 нм) с помощью считывателя пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если уменьшение в клетке OD600 не может быть обнаружено для штаммов укрывательство редких кодон-богатых маркергенов по сравнению с OD600 штамма укрывательство диких типа маркер генов, попробуйте увеличить количество редких кодон в маркер генов или использовать более разбавленной среде. - Выполните анализ кормления аминокислот, чтобы проверить, могут ли быть восстановлены выражения генов, богатых редкими кодонами маркерами (например, kan R-RC29),путем увеличения концентрации целевых аминокислот.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выбора L-лейцин overproducers, L-лейцин используется для кормления.- Прививать штаммы, укрывающие ген маркера kan R-RC29, в 5 мл 0,2x LB (содержащего 50 мкгл-1 канамицин) с или без поставки 1 г L-1 L-лейцин. Прививать еще 5 мл 0,2x LB с штаммами, которые гавани дикого типа канR в качестве контроля. Инкубировать образцы в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах Цельсия.
- Измерьте OD600 для каждой культуры в определенных точках времени (например, 15 ч, 17 ч, 19 ч и 22 ч).
3. Оптимизация условий скрининга
- Преобразуйте 50 зл родительского штамма, используемого для мутагенеза, с 1 л плазмида (50 нг-Л-1),который несет в себе гпп дикого типа или пигдикого типа. Кроме того, преобразуйте родительский штамм с редко-кодон богатых производных маркергенов.
- Добавьте 950 кл. среды SOC и инкубировать образец в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
- Плита 100 л клеточной культуры на среде агара LB, содержащую соответствующие антибиотики (25 мкгл-1 хлорамфеникол для гfp плазмида, несущего маркер смR, или 50 мкг-мл-1 канамицин для ppg плазмид проведения канR маркер) и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию.
- Выберите одну колонию, которая гавани дикого типа gfp или ppg и одна колония, которая гавани соответствующих редких кодон богатых производных, и передать их на 5 мл правильно разбавленной среде LB индивидуально. Инкубировать образцы в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для E. coli штаммов укрывательство лейцин редких кодон-богатых gfp-RC или ppg-RC, неразбавленный LB среды (1x LB) могут быть использованы для создания значительных различий в выражениях дикого типа и редких кодон-богатых маркера Гены. Кроме того, индуцируемые промоутеры используются для управления экспрессиями генов маркера скрининга. Начните индукцию, когда клетки вступают в экспоненциальную фазу для достижения лучшей дискриминации. - Для флуоресценции, передача 200 л каждой из клеточных культур в 96-хорошо яснодном дне черная пластина в тройной в определенных точках времени (например, 2 ч, 4 ч, и 6 ч). Измерьте OD600 и флуоресценцию и вычислите интенсивность флуоресценции (отношение флуоресценции к OD600). Для хромогенных маркеров измерьте развитие цвета клеточных культур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если нижняя интенсивность флуоресценции не может быть обнаружена для штаммов укрывательство gfp-RC по сравнению с штаммами укрывательство дикого типа gfp, или если более светлый цвет не может быть обнаружен для клеток, выражающих фиолетовый белок от ppg-RC, чем от гена дикого типа, попробуйте увеличить количество редких кодон ов генов маркера или использовать более разбавленную среду. - Выполните асссы кормления (см. шаги 2.7.1 и 2.7.2). Измерьте интенсивность флуоресценции или развитие цвета в определенных временных точках (например, 12 ч, 18 ч и 24 ч).
4. Идентификация производителей аминокислот
- Прививать 100 кл культуры мутантов в 5 мл среды LB (2% v/v) и инкубировать его в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах По Цельсию до тех пор, пока значения OD600 не достигнут 0,4.
- Сделать мутантов в компетентные клетки17.
- Преобразуйте 50 зл из клеток-мутантов с 1 ql плазмидной (No 50 нг-Л-1),неся маркер отбора kan R-RC29 или скрининговые маркеры gfp-RC или ppg-RC. Добавьте 950 кЛ среды SOC и поверните образец в шейкере 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
- Выберите аминокислотные перепроизводители.
- Центрифуги яточной культуры на 4000 х г в течение 5 мин, отбросить супернатант и добавить 5 мл 0,2x LB среды, содержащей 50 мкгмл-1 канамицин. Инкубировать образец в шейкере 37 градусов на ночь.
- Плита ночной культуры (например, 100 л, зависит от плотности клеток культуры) на 0,2x LB агар среды, содержащей 50 мкгл-1 канамицин и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 12 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии разработаны являются кандидатами целевых аминокислоты overproducers и, в данном случае, L-лейцин overproducers.
- Экран аминокислоты overproducers.
- Плита соответствующее количество клеток (например, 100 л) укрывательство маркера скрининга (как описано в шаге 4.3) на агар-среду LB, содержащую соответствующий антибиотик (25 мкгл-1 хлорамфеникол для скрининга с gfp-RC и 50 мкг-мл -1 канамицин для скрининга с ppg-RC) и инкубировать при 37 кв. м на 8 ч.
- Прививать среду LB, содержащую соответствующий антибиотик (см. шаг 4.5.1) с каждой отдельной колонией из пластины. Инкубировать образцы в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах Цельсия.
- Измерьте OD600 и флуоресценцию и вычислите интенсивность флуоресценции, если используется gfp-RC. Измерьте развитие цвета культур клетки если ppg-RC использовано. Обратите внимание, что штаммы, демонстрирующие более высокую интенсивность флуоресценции или более глубокий цвет, чем у родительского штамма, являются аминокислотами-кандидатами и, в данном случае, L-лейцином overproducers.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресценция активированных клеток сортировки также подходит для выявления одноклеточных высокопроизводительных, когда редкие богатые кодон флуоресцентных белковых генов используются для скрининга.
- Проверить аминокислоты productivities штаммов кандидата.
- Прививать 5 мл среды LB с каждым из кандидатов штаммов и пусть клетки растут на ночь в шейкере при 250 об/мин при 37 градусах Цельсия.
- Урожай клетки от 1 мл клеточной культуры центрифугированием при 4000 х г в течение 2 мин. Отбросьте супернатант и отбросите гранулы с 1 мл стерильной воды.
- Прививать 20 мл среды M9, содержащей 4% глюкозы с 200 злицовой суспензии клетки и инкубировать в 250 мл шейкер при 250 об/мин при 37 КС в течение 24 ч.
- Центрифуга 1 мл культуры среды на 4000 х г в течение 5 мин. Передача 200 л супернатанта в чистую трубку 1,5 мл. Подготовка L-лейцинов (HPLC (высокопроизводительная жидкая хроматография) класса 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 и 1 г L-1 в качестве стандартов.
- Добавьте 100 зЛ триэтиламина 1 мМ и 100 л 1 М фенил изотиоцианата в супернатант и стандарты, аккуратно перемешайте их и инкубировать при комнатной температуре 1 ч18.
ВНИМАНИЕ: Триэтиламин и фенил изотиоцианат может вызвать сильные ожоги кожи и повреждения глаз и вредно при вдыхании. Носите перчатки и маску и, если возможно, выполнить этот шаг в дым капюшон. - Добавьте 400 зЛ n-гексана в ту же трубку и вихрем его в течение 10 с. Фильтр нижней фазы, содержащей производные аминокислоты через 0,2 мкм политетрафтотроэтиленовой мембраны.
ВНИМАНИЕ: n-гексан может вызвать раздражение кожи. Носите перчатки и защитную одежду. Если он соприкасается с кожей, промыть кожу большим количеством воды. - Подготовка мобильной фазы А путем смешивания 0,1 М ацетата натрия (pH 6.5) и ацетонитрила в объемном соотношении 99,3:0,7. Подготовка ацетонитрила (80% v/v) в качестве мобильной фазы B. Фильтр всех мобильных фаз через 0,2 мкм политефторетиленовых мембран.
ВНИМАНИЕ: Ацетонитрил вреден при вдыхании и может вызвать раздражение кожи и глаз. Носите перчатки и защитную одежду и выполнять этот шаг в дым капюшон. - Запуск 1 зл и образца на ультра-HPLC оснащен колонкой C18 в соответствии с программой elution в таблице 1 с скоростью потока 0,42 мл-мин-1 и температурой столбца 40 градусов по Цельсию. Обнаружить целевые аминокислоты на уровне 254 нм с помощью детектора диодного массива и рассчитать их концентрации, отображая пиковые области до стандартной кривой.
| Время (мин) | Мобильная фаза A (%) | Мобильная фаза B (%) |
| 0.00 | 98 лет | 2 |
| 3,5 | 70 лет | 30 год |
| 7 (г. | 43 | 57 |
| 7.1 | 0.00 | 100 |
| 11 Год | 98 лет | 2 |
Таблица 1: Программа elution для количественной оценки аминокислот.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для системы отбора, резкое снижение OD600 для штаммов укрывательство редких кодон-богатых антибиотиков устойчивость гена должны наблюдаться по сравнению с штаммом укрывательство дикого типа гена устойчивости к антибиотикам, когда культивируется в подходящих средний(рисунок 1a). В тех же условиях, уменьшение в клетке OD600 становится более очевидным, как число редких кодонов в гене устойчивости к антибиотикам увеличивается(Рисунок 1a). Следует отметить, что ингибирование редкого кодона на белковых экспрессиях в основном происходит в голодных условиях. Таким образом, если среда LB не правильно разбавлена, не будет наблюдаться значительное снижение в клетке OD600 не будет наблюдаться для штамма укрывательство редко-кодон богатых маркер гена по сравнению с штаммом укрывательство дикого типа гена (Рисунок 1b). После дополнительного кормления соответствующей аминокислоты, OD600 для штамма укрывательство редких кодон-богатых антибиотиков устойчивость гена значительно возрастет и приблизиться к штамму укрывательство дикого типа гена (Рисунок 1c).
Рисунок 1: Влияние редкого кодона на выражения генов маркеров, используемых для отбора и скрининговых систем. () Клетка OD600 для штаммов e. coli укрывательство гена устойчивости к антибиотикам (kanR) с 6, 16, 26, и 29 лейцинредко редко-кодон (RC6, RC16, RC26, и RC29) замена после 5 ч инкубации. (b) Ячейка OD600 для штамма кишечной палочки, укрывающего дикий тип (WT) и редко-кодон-богатый кан R (RC) в 1x, 0.5x, и 0.2x LB сми после 5 ч инкубации. (c) Эффекты кормления L-лейцин на рост клеток для штаммов кишечной палочки укрывательство лейцин редких кодон-богатых канR гена после 5 ч инкубации. Значения и бары ошибок представляют среднее значение и SD (n No 6). Кормление L-лейцин значительно увеличило OD600 для клеток, укрывающих редко-кодон-богатых канR. Единственным исключением было для кормления 2 г L-1 L-лейцин из-за высокого SD в OD600 для кормления лечения. (d) Эффекты редких кодон и L-лейцин кормления на GFP выражений из дикого типа (WT) и лейцин редко-кодон-богатых (RC) генов после 16 ч инкубации. Подача 0,5-2 L-1 L-лейцин значительно увеличила интенсивность флуоресценции для клеток, укрывающих редко-кодон богатых gfp. Значения и бары ошибок представляют среднее значение и SD (n No 3). П Злт; 0,01, П.л.; 0,001, как определено двуххвостым т-тестом,и были показаны только самые значительные результаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Для системы скрининга интенсивность флуоресценции и количество флуоресцентных клеток будет значительно ниже для штамма, который выражает флуоресцентный белок из редкого кодон-богатого гена, чем от гена дикого типа (Рисунок 1d и Рисунок 2). При использовании фиолетового белка, цвет, разработанный из редких богатых кодонpp должны быть легче, чем у гена дикого типа, когда выражается в тех же условиях для того же инкубационного периода (Рисунок 3). Кормление соответствующей аминокислоты восстановит протеиновые экспрессии из редко-кодонных богатых генов. Для штаммов укрывательство редких кодон-богатых gfp, интенсивность флуоресценции (Рисунок 1d) и количество флуоресцентных клеток (Рисунок 2) должны значительно увеличиться и приблизиться к штаммов, содержащих дикий тип gfp . Когда используется неразбавленный LB, аминокислот в среде будет достаточно, чтобы медленное выражение редко-кодон-богатых ppg даже без дополнительных L-лейцин кормления, и выраженный фиолетовый белок станет видимым, как только клетки гранулы ( Рисунок 3). Тем не менее, это не скрывает того факта, что экспрессия генов из редкого кодона-богатых ppg была резко усилена путем кормления L-лейцина до 2 г L-1, особенно при наблюдении в жидкой культуре(рисунок 3). Таким образом, жидкая культура является лучшим выбором для скрининга на основе хромогенных белков, и использование разбавленной среды LB принесет более значительную разницу между фенотипами, индуцированными диким типом, и редко-кодонными богатыми генами.
Рисунок 2: Количество флуоресцентных клеток кишечной палочки, которые гавани дикого типа gfp или лейцин редкие кодон богатых gfp (gfp-RC) после добавления L-лейцин. Клетки культивировались в 1x СРЕДе LB. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Развитие цвета для клеток, укрывающих дикий тип (WT) и лейцин редкого кодона богатых (RC) ppg генов, которые кодируют фиолетовый белок в 1x LB среды (левая панель) и влияние L-лейцин кормления на развитие цвета клеточной культуры ( правой панели). Ppg гены были индуцированы, когда клетки вошли в экспоненциальную фазу и изображения были захвачены 3 ч после индукции. L-лейцин был добавлен в среду вместе с индуктором в кормлении асссе. Цветные круги были созданы путем выбора цветов клеточных культур и клеточных гранул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Стратегия на основе редкого кодона способна выявлять перепроизводителей целевых аминокислот из библиотеки мутаций, и эти мутанты должны производить большее количество целевых аминокислот, чем родительские штаммы (Рисунок 4).
Рисунок 4: Аминокислоты, вырабатываемые диким типом, и мутирные штаммы, выявленные в стратегии, основанной на редком кодоне. () L-лейцин производств E. coli штаммов, выявленных из библиотек мутации канR-RC29 (EL-1 до EL-5) и gfp-RC, который гавани 29 и 19 лейцин редких кодонов (EL-6 до EL-10), соответственно. (b) L-аргинин производств Corynebacterium glutamicum штаммов, выбранных редких кодон богатых канR, который содержал восемь аргинин редких кодонов (AGG). Ген маркера был введен в библиотеки мутаций C. glutamicum, полученных из штамма дикого типа ATCC13032. Среда отбора была 0,3x CGIII поставляется с 25 мкгл-1 kanamycin. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Количество редких кодонов в генах маркеров и среда отбора или скрининга имеют решающее значение для ингибирования белковых выражений из редко-кодон-модифицированных генов маркера. Если не может быть обнаружено существенное различие между протеиновыми экспрессиями генов дикого типа и их производными, увеличение числа редких кодонов или использование среды с ограниченным и питательными веществами может усилить различия. Однако, если эффект ингибирования слишком силен, протеиновые выражения не могут быть восстановлены даже путем дополнительного кормления соответствующих аминокислот. В этом случае количество редких кодонов в генах маркеров должно быть уменьшено, чтобы снять часть стресса. Еще один способ точной настройки выбора или скрининга строгости заключается в корректировке числа копий и уровня экспрессии редко-кодон-богатых маркеров генов. Снижение количества копий и уровней экспрессии генов маркеров обычно приводит к более сильной дифференциации между аминокислотными перепроизводителями и первоначальными штаммами. Поэтому следует использовать векторы, содержащие низкое число копий, такие как p15A или pSC101, а также слабые промоутеры. Если ген маркера управляется индуцированным промотором, рекомендуется низкая индукция.
Стратегия, основанная на редком кодоне для отбора или скрининга на аминокислотные производители, является обратной адаптацией широко используемой стратегии «оптимизации кодона», которая направлена на облегчение выражения экзогенных белков. При оптимизации кодона редкие кодоны на целевых генах заменяются синонимами, общими по отношению к хозяину; таким образом, гены из других организмов могут быть переведены гораздо быстрее в белки, чем те экзогенные гены с высокой пропорцией редких кодонов19. Поэтому разумно предположить, что «обратная оптимизация», которая переключает общие кодоны на их синонимические редкие, должна препятствовать экспрессии генов. Тем не менее, экспрессии генов должны быть восстановлены путем повышения заряда соответствующих редких tRNAs, когда целевые аминокислоты накапливаются внутриклеточно. Включение редких кодонов увеличивает порог концентрации аминокислот в выражениях белка, что предлагает потенциальную стратегию по выбору или экрану для аминокислотных перепроизводителей в сочетании с надлежащими генами маркера.
Помимо генов устойчивости к антибиотикам, флуоресцентных белковых генов и хромогенных белковых генов, используемых в протоколе, для создания системы отбора или скрининга на основе редкого кодона могут быть использованы различные маркерные гены. Например, смертельные гены, такие как tolC20 и sacB21, могут быть использованы для выбора аминокислотных производителей. В этом случае общие кодоны на генах, принадлежащих к противоядию системы должны быть заменены синонимами редких кодонов целевых аминокислот. Штаммы, которые перепроизводят целевые аминокислоты способны запустить противоядие системы и, таким образом, выжить токсические эффекты, вызванные смертельными генами.
Следует отметить, что побочные эффекты могут возникнуть при использовании большого количества аминокислот в кормления асссе. Это потому, что некоторые аминокислоты являются токсичными для микроорганизмов. Например, концентрация около 100 мг L-1 для L-серина способен подавлять рост кишечной палочки22. Тем не менее, хотя ниже, чем у гена дикого типа, мы обнаружили, что кормление до 2 г L-1 L-серин все еще может восстановить экспрессии генов устойчивости к антибиотикам, которые богаты серином редким кодоном13. Таким образом, токсичность аминокислот, по крайней мере для L-серина, не поставит под угрозу надежность кормления. Для преодоления потенциального негативного воздействия токсичности аминокислот на продуктивность целевых штаммов могут применяться такие стратегии, как случайный мутагенез и повышение экспорта аминокислот23. На самом деле, метод на основе редкого кодона подходит для выявления толерантных штаммов, способных выдерживать или перепроизводить аминокислоты выше токсичных уровней. Ключевые мутации, которые придают аминокислотной толерантности могут быть определены и введены в целевых штаммов, которые будут идеальными хозяевами для конструкций аминокислоты overproducers.
Система отбора или скрининга на основе редкого кодона обеспечивает высокую точность. Другими словами, штаммы, выявленные системой, должны быть перепроизводителями целевых аминокислот. Однако, в некоторых случаях, кандидаты, которые выживают выбор антибиотиков не может производить большее количество целевых аминокислот, чем родительский штамм. Это может быть связано с устойчивостью к антибиотикам, приобретенных штаммов через мутагенез, а затем потеря выбора плазмиды24. Как следствие, штаммы без повышенной аминокислотной productivities может выжить антибиотик стресс и избежать отбора. Эти ложноположительные штаммы могут быть устранены путем вставки другого маркера выбора в отбор плазмида, таких как ген дикого типа, который придает устойчивость к другому антибиотику. Штаммы, которые потеряли выбор плазмиды имеют меньше шансов получить двойную устойчивость к двум антибиотикам и будут устранены во время отбора.
Мутанты, выявленные системой на основе редкого кодона, должны быть в состоянии перепроизводить целевые аминокислоты по сравнению с первоначальными штаммами. Тем не менее, аминокислотные productivities для выбранных штаммов все еще может быть ниже, чем промышленные потребности. Это не говорит о провале стратегии на основе редкого кодона, поскольку штаммы не зависят от процесса отбора или отбора, но зависят от таких факторов, как характеристики первоначального штамма, подход мутагенеза, размер библиотеки мутаций и условий брожения. Для получения высокопроизводительных штаммов следует обратить внимание на стратегии деформации, такие как случайный мутагенез или рациональное проектирование аминокислот биосинтетических путей. Сочетание адаптивной лабораторной эволюции и стратегии на основе редкого кодона способствовало бы получению аминокислотных перепроизводителей.
Метионин и триптофан не имеют альтернативных кодонов среди 20 белковогенных аминокислот. Таким образом, эта стратегия не может быть использована непосредственно к этим аминокислотам. Одним из возможных решений является использование инженерных tRNAs, которые способны распознавать стоп-кодоны для перевозки этих аминокислот. Таким образом, соответствующие стоп-кодоны могут быть приняты в качестве искусственных редких кодонов этих аминокислот25,26.
Одним из самых больших недостатков, касающихся обычной аналоговой стратегии отборааминокислотных производителей, является высокая ложноположительная норма 5,27. Штаммы, которые проходят через мутагенез может легко приобрести устойчивость к токсичных аминокислот аналогов, и толерантность может быть даже приобретена без помощи мутагенов27. Эти штаммы могут легко избежать давления отбора от аминокислотных аналогов и, следовательно, выбранные штаммы, как правило, не являются истинными аминокислотными перепроизводителями, что значительно жертвует эффективностью процесса отбора.
В отличие от этого, стратегия на основе редкого кодона перебора с традиционным аналоговым методом позволяет точно и быстро идентифицировать производителей аминокислот. Насколько нам известно, это первая стратегия, которая принимает естественный закон codon предвзятости. Он опирается только на один редкий кодон-богатый маркер гена и, таким образом, исключает использование токсичных аналогов. Гены маркера, как правило, нетоксичны для штаммов хозяина, а протеиновые выражения из редко-кодон-богатых генов зависят в первую очередь от внутриклеточной концентрации соответствующих аминокислот из-за универсального и строгого закона о предвзятости кодона всех видов. Это предотвратило бы напряжение от избежания давления выбора. Кроме того, из-за большого разнообразия генов маркеров, редко-кодон основе стратегии может предложить различные варианты для отбора и скрининга аминокислот overproducers.
Из-за универсального явления склонность кодон во всех живых организмов28, редкие кодон основе отбора или скрининга стратегии теоретически могут быть использованы для других микроорганизмов, кроме кишечной палочки, особенно те, с промышленными Потенциалов. При переходе на другой хост выбор редких кодонов, используемых для проектирования генов маркера, должен основываться на частотах использования кодона и изобилии соответствующих тРНК для конкретного хозяина. Среда, используемая для отбора или скрининга, также должна быть оптимизирована соответствующим образом. Одним из примеров является широко используемый C. glutamicum в аминокислотных брожениях. Редко-кодон-модифицированный ген kanR, содержащий восемь аргининов редких кодонов (AGG) было показано эффективным в выборе C. glutamicum L-аргинин overproducers предыдущего исследования13 (Рисунок 4b). Исследования стратегии на основе редкого кодона должны облегчить строительство и понимание аминокислотных перепроизводителей. Помимо аминокислот, редко-кодон основе стратегии также могут быть использованы с изобутантом, 3-метил-1-бутанол, 2-метил-1-бутанол, и другие продукты, которые разделяют те же биосинтетические пути с определенными аминокислотами29. Штаммы, выявленные генами маркеров, которые питают редкие кодоны этих аминокислот, способны перепроизводить соединения-предшественники, которые могут быть направлены на синтез производных аминокислот. Таким образом, стратегия на основе редкого кодона может служить косвенным, но быстрым методом, отражающим потенциал штаммов при накоплении этих химических веществ как внутри, так и внеклеточным. Ключевые мутации, которые дают возможность удваивать аминокислотные productivities от различных производителей могут быть определены путем глубокого секвенирования и быть введены индивидуально или одновременно в промышленных штаммов для дальнейшего улучшения аминокислотных производств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 21676026), Национальной программой научных исследований и разработок Китая (грант No 2017YFD0201400) и Китайским фондом постдокторской науки (грант No 2017M620643). Работы в Институте развития UCLA (Сучжоу) были поддержаны внутренними грантами из провинции Цзянсу и индустриального парка Сучжоу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
- Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C.
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A.
- Huo, Y. -X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
