Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Nadir-Codon zengin Işaretçileri kullanarak amino asit Overüreticiler tanımlama

Published: June 24, 2019 doi: 10.3791/59331
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, 2UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

Summary

Bu çalışmada, aynı anda doğruluk, hassasiyet ve yüksek verim elde etmek için nadir kodon zengin işaretçileri kullanarak amino asit overüreticilerinin belirlenmesi geleneksel toksik analog tabanlı yöntem için alternatif bir strateji sunar.

Abstract

Amino asitler için sürekli büyüyen pazar karşılamak için, yüksek performanslı üretim suşları gereklidir. Amino asit overüreticiler geleneksel olarak amino asitler ve onların analogları arasındaki yarışmalar harnessing tarafından tanımlanır. Ancak, bu analog tabanlı yöntem düşük doğruluk ve spesifik amino asitler için uygun analoglar sınırlıdır. Burada, nadir-Codon zengin işaretçileri kullanan amino asit overüreticilerinin doğru, hassas ve yüksek verim taramasına olanak tanıyan alternatif bir strateji sunuyoruz. Bu strateji, protein çevirisi içinde kodon kullanım önyargı fenomen esinlenerek, hangi kodon ortak veya nadir olanlar kodlama DNA oluşumu onların frekansları dayalı kategorilere ayrılır. Nadir bulunan kodların çevirisi, ilgili nadir transfer RNAs 'larına (tRNAs) bağlıdır ve bu da açlık altında bilat amino asitleri tarafından tam olarak şarj edilemez. Teorik olarak, aynı derecede ortak isoacceptors şarj ettikten sonra amino asitler fazlasının varsa nadir tRNAs şarj edilebilir. Bu nedenle, seyrek kodların neden olduğu geri zekalı Çeviriler, karşılık gelen amino asitlerin beslenme veya hücre içi aşırı üretimleri ile restore edilebilir. Bu varsayımı altında, amino asit overüreticileri tanımlamak için bir seçim veya tarama sistemi hedeflenen amino asitlerin ortak kodon antibiyotik direnci genler veya genler kendi eşanlamlı nadir alternatifleri ile değiştirerek kurulur Floresan veya kromojenik proteinleri kodlama. Biz protein ifadeleri büyük ölçüde nadir kodon birleşmesi ile engellenebilir ve proteinlerin düzeyleri amino asit konsantrasyonları ile olumlu ilişkilendirir gösterir. Bu sistemi kullanarak, birden fazla amino asitlerin overüreticiler kolayca mutasyon kütüphaneleri dışarı ekranlaştırılmış olabilir. Bu nadir kodon tabanlı strateji sadece tek bir değiştirilmiş gen gerektirir ve ev sahibi diğer yöntemlerden daha seçim kaçmak için daha az muhtemeldir. Amino asit overüreticileri elde etmek için alternatif bir yaklaşım sunar.

Introduction

Amino asitler mevcut üretim fermantasyon üzerinde ağır dayanır. Ancak, çoğu amino asit üretim suşları için yazılar ve verimler milyarlarca dolar değerinde küresel amino asit piyasasının yükselen taleplerinin altındadır1,2. Yüksek performanslı amino asit aşırı üreticileri elde etmek için amino asit endüstrisinin yükseltilmesi önemlidir.

Amino asit aşırı üreticileri tanımlamak için geleneksel strateji amino asitler ve protein sentezinde onların analogları arasındaki yarışmalar yararlanırlar3,4. Bu analoglar karşılık gelen amino asitler tanımak ve böylece peptid zincirleri uzaması inhibe tRNAs şarj edebiliyoruz, tutuklandı büyüme veya hücre ölümü5yol. Analog streslere karşı bir yol, hücre içi amino asitlerin konsantrasyonlarını artırmaktır. Zenginleştirilmiş amino asitler sonlu tRNAs için analogları aşacak ve fonksiyonel proteinlerin doğru sentezini sağlamaktır. Bu nedenle, analoglar hayatta suşları seçilebilir ve ilgili amino asitlerin overüreticiler muhtemeldir.

L-leucine6gibi amino asitler için overüreticiler seçiminde başarılı olmasına rağmen, analog tabanlı strateji ciddi dezavantajları muzdarip. Bir büyük endişe analog direnç mutagenez işleminden kaynaklanan veya spontan mutasyonlar yoluyla. Direnç ile suşları engelleme, ihracat veya analoglar5aşağılayıcı tarafından seçim kaçabilir. Başka bir endişe diğer hücresel süreçlerde analogların toksik yan etkileri7. Sonuç olarak, analog seçimden hayatta kalan suşlar amino asit overüreticileri olmayabilir, istenilen overüreticileri olumsuz yan etkileri nedeniyle yanlışlıkla imha olabilir iken.

Burada, kodon önyargı yasasına dayalı bir yeni strateji amino asit overüreticilerinin doğru ve hızlı kimliklere ulaşmak için sunulmuştur. Çoğu amino asitler, ev sahibi organizmaların8,9tarafından farklı bir şekilde tercih edilen birden fazla nükl üçlüsü tarafından kodlanmıştır. Bazı kodlar, kodlama dizilerinde nadiren kullanılır ve nadir kodlar olarak adlandırılır. Amino asitler içine çevirileri ilgili amino asitler taşıyan bilat tRNAs güveniyor. Ancak, nadir codonlar tanıyan trnas genellikle10,11ortak kodon trnas daha fazla düşük fazlalıkları vardır. Sonuç olarak, bu nadir tRNAs diğer isoacceptors ile yarışmalarda ücretsiz amino asitler yakalamak için daha az muhtemeldir, ve nadir-Codon zengin dizileri çevirileri yavaşlama başlar veya amino asitler miktarları sınırlı olduğunda bile sonlandırıldı 10. Çeviriler, teorik olarak, aşırı üretimler veya karşılık gelen amino asitlerin ekstra beslemeleri nedeniyle eş anlamlı ortak tRNAs şarj ettikten sonra bir amino asit fazlaları geri yüklenebilir12. Nadir kodon zengin gen bir seçim veya tarama işaretçisi kodlarsa, karşılık gelen fenotürler sergileme suşları daha sonra kolayca tespit edilebilir ve muhtemelen hedeflenen amino asitlerin overüreticiler.

Yukarıdaki strateji, amino asit overüreticilerinin tanımlanması için bir seçim ve bir tarama sistemi kurmak için uygulanır. Seçim sistemi antibiyotik direnci genleri kullanır (örn., kanR) işaretleme sistemi, floresan (örneğin, yeşil floresan protein [Gfp]) veya kromojenik (örneğin, prancerpurple) proteinleri kodlama genler kullanır iken işaretçileri olarak. Her iki sistemde de Marker genler eş anlamlı nadir alternatif ile hedeflenen amino asit için ortak kodon tanımlanmış sayılar değiştirerek değiştirilir. Nadide-Codon zengin Marker geni limandaki mutasyon kütüphanesinde bulunan suşlar, uygun koşullar altında seçilir veya ekranlanır ve hedeflenen amino asitlerin overüreticileri kolayca tespit edilebilir. İş akışı ender-Codon zengin Marker gen sisteminin inşası ile başlar, çalışma koşullarının optimizasyonu ve ardından amino asit overüreticilerinin tanımlanması ve doğrulanması. Bu analog-bağımsız strateji protein çevirisi dogma dayanır ve pratikte amino asit overüreticisinin doğru ve hızlı tanımlamalarını sağlamak için doğrulanmıştır. Teorik olarak, nadir codonlar ve tüm mikroorganizmalar ile amino asitlere doğrudan istihdam edilebilir. Tüm, nadir-Codon tabanlı strateji, belirli amino asitler için uygun analogları kullanılamıyor, ya da yüksek bir yanlış pozitif oran büyük endişe olduğunda geleneksel analog tabanlı yaklaşımı için etkili bir alternatif olarak hizmet verecektir. Aşağıdaki protokol, Escherichia coli L-lösin overüreticileri tanımlamada bu stratejiyi göstermek için lösin nadir kodon kullanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. nadir-Codon zengin Marker genler ifade plazmidler inşaatı

  1. Hedeflenen amino asit için ortak codonlar uygun sayıda içeren bir işaret geni seçin.
    Not: L-lösin için, hangi 27 yaygın codons olan 29 lösin codons içeren kanamyisin direnç gen kanR, seçim sisteminin inşası için kullanılır13. 19 lösin codondan 17 ortak Codon içeren Gfp geni veya 14 lösin ortak codonların bulunduğu mor protein-kodlama geni prancerpurple (PPG), tarama sistemi için kullanılır (Tamamlayıcı Tablo 1 ).
  2. İşaret genlerinde bulunan ortak kodları, eşanlamlı nadir kodon ile değiştirin. L-leucine için, nadir kodon CTA ile kanr, Gfp, veya PPG kendi kodon değiştirmek, kanr-RCSüreten, Gfp-RC, veya PPG-RC, sırasıyla13 ( Tamamlayıcı Tablo 1).
    Not: Marker genler nadir kodon sıklığı seçim veya tarama sisteminin katı etkileyecektir. Genel olarak, nadir bulunan kodların sayısını artırmak, seçim veya tarama sisteminin gücünü artıracaktır. Uygun seçim veya tarama gücü elde etmek için, nadir kodon farklı sayıda liman ve etkilerini karşılaştırmak Marker genler bir dizi tasarım.
  3. Gen sentezi için GeneDesign14 (http://54.235.254.95/GD/) gibi araçları kullanarak nadir kodon açısından zengin Marker genlerinin yapı taşları oluşturun. Alternatif olarak, ticari gen sentezi hizmetlerinden Marker genler sipariş.
    1. GeneDesign sayfasında, Yapı bloğu tasarımı (sabit uzunlukta çakışma)seçeneğini belirleyin.
    2. Nadir Codon zengin Marker genler sıraları sıra kutusuna yapıştırın.
    3. Montaj oligos arasındaki çakışma uzunluğunu tanımlayın; Varsayılan 40 BP çoğu sıraları için iyi çalıştığını aklınızda bulundurun.
      Not: diğer parametrelerin ayarları hakkında daha fazla yönerge için çevrimiçi el kitabına bakın.
    4. Tasarım yapı taşları düğmesini tıklatın ve sayfada listelenen oligonükleotides sipariş.
  4. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile nadir-Codon-modifiye genler sentezlemek-doğru sentez15.
  5. Nadir-Codon zengin kanR-RC için vektör pET-28A, Gfp-RC pSB1C3 ve ppg-RC için CPB-37-44116ligate.
    Not: pET-28A ve pSB1C3 Plasmid haritaları SnapGene online plazmid veritabanında mevcuttur (Tamamlayıcı Tablo 1); CPB-37-441 plazmid Haritası ATUM kromojenik protein Web sitesinde mevcuttur.
    1. Buzda, vektör ve marker parçaları 1:1 bir molar oranı ekleyin 7,5 μL montaj karışımı (bkz. malzeme tablosu) Toplam hacmine 10 μL. Numuneyi 50 °C ' de 1 saat boyunca inkük.
    2. Montaj ürününün 5 μL değerini, 42 °C ' de 30 s için 50 μL yetkili hücreye dönüştürün ( malzeme tablosunabakın).
    3. SOC hücreleri kurtar (katabolit baskı ile süper optimum suyu) orta 37 °C 1 h için, LB (lysogeny suyu) agar Orta üzerinde plaka, ve bir gecede 37 °C ' de onları inkük.
    4. Koloni LB orta içine inoculate ve 8 h için 37 °C ' de inkübe.
    5. Tercih edilen ticari kiti kullanarak Plasmid yalıtın.

2. seçim koşullarını optimize etme

  1. Mutagenez için kullanılan ebeveyn gerginliği yetkili hücrelere17olun.
  2. Vahşi tip kanrtaşıyan 1 μL Plasmid ile yetkili hücrelerin dönüşüm 50 μL ve nadir tarafından değiştirilen tüm lösin kodon ile kanr-RC29 içeren Plasmid ile yetkili hücrelerin başka bir set dönüşümü kodon CTA.
  3. 950 μL SOC ortamını ekleyin ve numuneyi 37 °C ' de 250 rpm 'de 1 h için bir çalkalayıcı olarak inkük.
  4. Plaka 100 Cell kültürünün μL 'yi 50 μg · mL-1 kanamycin içeren lb agar ortamına yerleştirin ve koloniler ortaya çıkana kadar yaklaşık 8 saat boyunca 37 °c ' de kulbin.
  5. Vahşi tip kanr ve lösin nadir-Codon-zengin kanr-RC29 liman kolonileri seçin ve 5 ml beşli seyreltilmiş lb Orta (0.2 x lb) 50 μg · ml-1 kanamycin içeren aşılamak için kullanın. 250 rpm 'de 37 °C ' de bir çalkalayıcı numuneleri inküd.
    Not: Orta seçim sistemi için çok önemlidir. Nadir-Codon-değiştirilmiş türevleri yerine vahşi tip geni antibiyotik direnci protein ifade izin vermek için yeterli karbon ve azot içermelidir. Bu durumda, 1x LB orta L-leucine konsantrasyonu tamamen nadir-Codon zengin kanRprotein ifadesi inhibe etmek için çok yüksek. Böylece, 5 gibi bir seyreltme faktörü ile seyreltilmiş LB orta vahşi tip ve nadir-Codon zengin genler protein ifadelerde net bir fark oluşturmak için kullanılır.
  6. Hücre kültürlerinin her biri için 200 μL değerini, tanımlanan zaman noktalarında (örn. 8 saat, 16 saat ve 24 saat) bir 96-kuyu plakasına aktarın. Bir plaka okuyucusu kullanarak OD600 (600 Nm 'de optik yoğunluk) ölçün.
    Not: hücre od600 bir azalma, vahşi tip Marker genleri taşıyan gerinim od600 ile karşılaştırıldığında nadir-kodon zengin Marker genleri barındıran suşlar için tespit edilemez, nadir kodon miktarını artırmak için deneyin veya daha seyreltilmiş bir ortam kullanın.
  7. Nadir-Codon zengin Marker genler ifadeleri (örneğin, kanR-RC29) hedeflenen amino asitlerin konsantrasyonu artırarak restore edilebilir eğer test etmek için amino asit besleme assay gerçekleştirin.
    Not: L-leucine overüreticilerinin seçimi Için, L-leucine beslenme için kullanılır.
    1. KanR-RC29 Marker geni 5 ml 'ye 0.2 x lb 'ye (50 μg · ml-1 kanamyisin içeren) 1 g tedarik olmadan ya da tedariki içeren suşları inoculate · L-1 l-leucine. Vahşi tip kanR kontrol olarak liman suşları ile 0.2 x lb başka 5 ml inoculate. 250 rpm 'de 37 °C ' de bir çalkalayıcı numuneleri inküd.
    2. Ölçüm OD600 her kültür için tanımlanan zaman noktalarında (örn., 15 h, 17 h, 19 h ve 22 h).

3. tarama koşullarını optimize etme

  1. Vahşi tip Gfp veya vahşi tip PPG'yi taşıyan 1 μL plazmid (~ 50 ng · μL-1) ile mutagenez için kullanılan ana gerinim 50 μL Transform. Ayrıca, üst gerinim Marker genler nadir-Codon zengin türevleri ile dönüştürün.
  2. 950 μL SOC ortamını ekleyin ve numuneyi 37 °C ' de 250 rpm 'de 1 h için bir çalkalayıcı olarak inkük.
  3. Plaka 100 uygun antibiyotikler içeren lb agar Orta hücre kültürünün μL üzerine (25 μg · ml-1 kloramfenikol bir cmR Marker taşıyan Gfp plazmid, veya 50 μg · ml-1 kanamisin PPG için bir kanR Marker taşıyan Plasmid) ve gece 37 °c ' de inkük.
  4. Wild-tipi Gfp veya PPG ve ilgili nadir-Codon zengin türevi limanlar bir koloni ve doğru seyreltilmiş lb orta bireysel 5 ml onları aktarmak bir koloni seçin. 250 rpm 'de 37 °C ' de bir çalkalayıcı numuneleri inküd.
    Not: lösin nadir-Codon zengin Gfp-RC veya PPG-RC, seyreltilmemiş lb Orta (1x lb) kullanılan E. coli suşları için vahşi tip ve nadir-Codon zengin Marker ifadelerinde önemli farklar oluşturmak için kullanılabilir Gen. Ayrıca, indüklenebilir promotörler tarama Marker genler ifadeleri sürücü için kullanılır. Hücreler daha iyi ayrımcılık elde etmek için üstel faz girdiğinizde indüksiyon başlayın.
  5. Floresan işaretçileri için, hücre kültürlerinin her biri 200 μL değerini, tanımlanan zaman noktalarında (örn. 2 saat, 4 saat ve 6 saat) bir 96-iyi açık dipli siyah plakaya aktarır. OD600 ve floresans ölçmek ve floresan yoğunluğu hesaplamak (floresans oranı od600). Kromojenik belirteçleri için, hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçmek.
    Not: Gfp-RC ' d e k i, vahşi tip Gfp'ye göre kullanılan suşların, veya mor proteini ifade eden hücreler için daha hafif bir renk algılanamazsa, daha düşük floresans yoğunlukları algılanamazsa PPG-RC ' d e k i yaban tipi geni den daha, işaretleme genlerinde nadir bulunan kodon sayısını artırmaya veya daha seyreltilmiş bir ortam kullanmak için çalışın.
  6. Besleme tahlili gerçekleştirin (Steps 2.7.1 ve 2.7.2 bakın). Floresans yoğunluğunu veya tanımlanan zaman noktalarında renk gelişimini ölçün (örn., 12 saat, 18 saat ve 24 saat).

4. amino asit overüreticilerinin tanımlaması

  1. Mutantların kültürünün 5 mL 'ye (% 2 v/v) içine inoculate 100 μL ve 250 rpm 'de 37 °C ' de, OD600 Reach 0,4 değerine kadar bir çalkalayıcı içinde kuluçka.
  2. Mutantları yetkin hücrelere yerleştirin17.
  3. 1 μL Plasmid (~ 50 ng · μL-1) ile mutasyona uğramış hücrelerin dönüştürme 50 μL, seçim Işaretçisi kanR-RC29 veya Gfp-RC veya PPG-RCtarama işaretleyicilerini taşıyor. 950 μL SOC ortamını ekleyin ve numuneyi 1 saat boyunca 37 °C ' lik bir çalkalayıcı olarak döndürün.
  4. Amino asit overüreticileri seçin.
    1. 4.000 x g 'de hücre kültürünü 5 dakika boyunca santrifüjle çıkarın, süpernatant 'ı atın ve 50 μg · ml-1 kanamycin içeren 5 ml 0.2 x lb orta ekleyin. Örnek bir gece 37 °C shaker içinde inkübe.
    2. Gece kültürüne plaka (örn. 100 μL, kültürün hücre yoğunluğuna bağlıdır) 50 μg · ml-1 kanamisin içeren 0.2 x lb agar orta üzerine ve 12 h için 37 °c ' de inkük.
      Not: geliştirilen koloniler, hedeflenen amino asit aşırı üreticilerinin adaylarıdır ve bu durumda L-leucine overüreticileridir.
  5. Amino asit overüreticileri ekran.
    1. Uygun antibiyotikler içeren lb agar ortamına (4,3 adımda açıklandığı gibi) tarama işaretleyicisini (örn. 100 μL) uygun sayıda hücre plakasını içerir (örneğin, Gfp-RC ve 50 μg · ml ile tarama için 25 μg · ml-1 kloramfenikol) - PPG-RCile tarama için 1 kanamisin) ve 8 h için 37 °c ' de inkük.
    2. Uygun antibiyotik içeren LB orta inoculate (bkz: adım 4.5.1) plaka her bir koloni ile. 250 rpm 'de 37 °C ' de bir çalkalayıcı numuneleri inküd.
    3. OD600 ve floresans ölçmek ve Gfp-RC kullanılırsa floresan yoğunluğu hesaplayın. PPG-RC kullanılırsa hücre kültürlerinin renk gelişimini ölçün. Daha yüksek bir floresan yoğunluğu veya ebeveyn gerinim daha derin bir renk sergileme suşları aday amino asit overüreticiler ve bu durumda, L-leucine overüreticiler olduğunu unutmayın.
      Not: floresan aktif hücre sıralama da tek hücreli yüksek üreticileri tanımlamak için uygundur zaman nadir Codon zengin floresan protein genler tarama için kullanılır.
  6. Aday suşlarının amino asit producti, doğrulayın.
    1. Her aday suşları ile LB orta 5 mL inoculate ve hücre 37 °C ' de 250 rpm de bir shaker bir gecede büyümeye izin.
    2. Hücre kültürünün 1 ml 'den hücreleri 2 dakika boyunca 4.000 x g 'de santrifüjleme ile topla. süpernatant atın ve 1 ml steril su ile Pelet pelletini.
    3. Hücre süspansiyonunun 200 μL 'si ile% 4 glikoz içeren 20 mL M9 orta ve 250 rpm 'de 37 °C ' de 24 saat boyunca 250 mL 'Lik bir çalkalayıcı ile inoculate.
    4. Santrifüj 1 ml kültür orta 4.000 x g 5 dk. transfer 200 μL süpernatant için temiz bir 1,5 ml tüp. Hazırlamak L-leucine çözümleri (HPLC (yüksek performanslı sıvı kromatografi) grade) 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, ve 1 g · L-1 standartlar olarak.
    5. 1 mm trietilamin ve 100 μL 1 M fenil isothiocyanate, süpernatant ve standartlara 100 μL ekleyin, yavaşça karıştırın ve 1 saat18için oda sıcaklığında onları inkük.
      Dikkat: trietilamin ve fenil isothiocyanate şiddetli cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir ve solunduğunda zararlı olur. Eldiven ve maske giyin ve mümkünse bu adımı bir duman kaputu içinde gerçekleştirin.
    6. 400 μL 'i aynı tüpten n-hekzan Ekle ve 10 s için Vortex. amino asit türevleri içeren alt fazı 0,2 μm polytetrafloroetilen membrandan filtreleyin.
      DIKKAT: n-hekzan cilt tahrişine neden olabilir. Eldiven ve koruyucu giysiler giyin. Cilt ile temas ederse, cilt bol su ile durulayın.
    7. 0,1 M sodyum asetat (pH 6,5) ve Asetonitril bir 99.3:0.7 Volumetrik oranı karıştırma ile mobil faz hazırlayın. Asetonitril hazırlayın (80% v/v) mobil faz olarak B. 0,2 μm polytetrafloroetilen membranlarla tüm mobil aşamaları filtreleyin.
      DIKKAT: Asetonitril Solunduğunda zararlı ve cilt ve göz tahriş neden olabilir. Eldiven ve koruyucu giysiler giyin ve bu adımı bir duman kaputu içinde gerçekleştirin.
    8. 0,42 mL · min-1 debisi ve 40 °c ' lik bir sütun sıcaklığı olan Tablo 1 ' deki elüsyon programına göre C18 kolon ile donatılmış bir ultra-HPLC üzerinde örnek 1 μL çalıştırın. 254 nm 'de hedeflenen amino asitleri bir diyot dizi dedektörü ile algılayın ve zirve alanlarını standart eğriye eşleştirerek konsantrasyonlarını hesaplayın.
Zaman (dak) Mobil faz A (%) Mobil faz B (%)
0 98 2
3,5 70 30
7 43 57
7,1 0 100
11 98 2

Tablo 1: amino asitlerin ölçülmesi için elüsyon programı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Seçim sistemi için, OD600 nadir-Codon zengin antibiyotik direnci geni barındıran suşları için keskin bir düşüş, uygun bir kültürlü zaman vahşi tip antibiyotik direnci geni barındıran gerinme göre gözlenmelidir (Şekil 1a). Aynı koşullar altında, OD600 hücresindeki azalma, antibiyotik direnci geni içinde nadir bulunan kodların sayısı arttıkça daha belirgin hale gelir (Şekil 1a). Bu protein ifadeleri nadir kodon inhibisyonu çoğunlukla açlık koşulları altında yer alır unutulmamalıdır. Bu nedenle, LB orta düzgün seyreltilmiş değilse, hücre OD600 önemli bir düşüş vahşi tip gen (Şekil 1B) hardelik gerinim ile karşılaştırıldığında nadir kodon zengin Marker geni barındıran gerinim için gözlemlenir. Karşılık gelen amino asit ekstra beslenme sonra, OD600 nadir-Codon zengin antibiyotik direnci geni içeren gerinim için önemli ölçüde artacaktır ve vahşi tip gen (Şekil 1C) taşıyan gerinim yaklaşım.

Figure 1
Şekil 1: seçim ve tarama sistemleri için kullanılan Marker genlerinin ifadelerinde nadir kodon etkileri. (a) hücre od600 , antibiyotik direnci geni (kanR) içeren bir E. coli suşları için 6, 16, 26 ve 29 lösin Rare-Codon (RC6, rc16, RC26, ve RC29) değişimi sonrası 5 h kuluçka. (b) hücre od600 bir E. coli GERINIM için Wild-tipi (WT) ve nadir-Codon-zengin kanR (RC), 1x, 0.5 x ve 0.2 x lb medyaya 5 h kuluçka sonra hardelme için. (c) lösin nadir-Codon-zengin kanR gene 'den sonra 5 h kuluçka sonrası E. coli suşları için hücre büyümesi üzerinde L-lösin besleminin etkileri. Değerler ve hata çubukları ortalama ve SD (n = 6) temsil eder. L-leucine beslenme önemli ölçüde artmış OD600 nadir-Codon zengin kanRbarındıran hücreler için. Tek istisna 2 g yem için oldu · L-1 l-leucine yüksek SD nedeniyle od600 besleme tedavisi için. (d) nadir-kodon ve L-leucinin, 16 h inkübasyon sonrası vahşi Tıp (WT) ve lösin nadir-Codon-RICH (RC) GENLERINDEN Gfp ifadelerinde beslenmesini etkiler. 0.5-2 L-1 l-leucine besleme nadir-Codon zengin Gfp barındıran hücreler için floresan yoğunluğu önemli ölçüde artmıştır. Değerler ve hata çubukları ortalama ve SD (n = 3) temsil eder. * *P < 0,01, * * *p < 0,001 iki kuyruklu t-testi ile belirlendiği gibi, sadece en önemli sonuçlar gösterildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tarama sistemi için, floresans yoğunluğu ve floresan hücrelerin sayısı, vahşi tip genden daha nadir kodon zenginlikte genden floresan proteini ifade eden gerginlik için önemli ölçüde daha düşük olacaktır (Şekil 1D ve Şekil 2). Mor proteini kullanırken, nadir görülen Codon zengin PPG 'den geliştirilen renk, aynı kuluçk dönemi için aynı koşullar altında ifade edildiğinde vahşi tip genden daha hafif olmalıdır (Şekil 3). Karşılık gelen amino asit besleme nadir Codon zengin genler protein ifadeleri geri yükler. Nadir-Codon zengin Gfp, floresan yoğunluğu (Şekil 1D) ve floresan hücrelerin sayısı (Şekil 2) kapsayan suşlar için önemli ölçüde artmalıdır ve vahşi tip Gfp içeren suşların yaklaşımı . Ne zaman seyreltilmiş LB kullanılır, orta amino asitler nadir-Codon zengin PPG bile ekstra L-leucine beslenme olmadan yavaş ifade izin vermek için yeterli olacaktır, ve ifade mor protein hücreler pelleted sonra görünür hale gelir ( Şekil 3). Ancak, bu nadir-Codon zengin PPG gen Ifadesi dramatik L-leucine besleyerek geliştirilmiş olduğu gerçeğini gizlemek değil 2 g · L-1, özellikle sıvı kültüründe gözlenen (Şekil 3). Bu nedenle, sıvı kültürü kromojenik proteinlere dayalı tarama için daha iyi bir seçimdir, ve seyreltilmiş lb orta kullanımı vahşi tip ve nadir-Codon zengin genler tarafından indüklenen fenotipleri arasında daha önemli bir fark getirecek.

Figure 2
Şekil 2: L-lösin eklendikten sonra vahşi tip Gfp veya lösin nadir Codon zengin Gfp (Gfp-RC) liman floresan E. coli hücrelerin sayısı. Hücreler 1x LB orta Kültürlenmiş. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Wild-tipi (WT) ve lösin nadir-Codon-zengin (RC) PPG genleri, 1x lb Orta (sol panel) ve L-lösin beslenme etkisi hücre kültürü renk gelişimi üzerinde mor bir protein kodlamak hücreleri için renk gelişimi ( sağ panel). PPG genleri, hücreler üstel aşamaya girdiğinde ve görüntüleri İndüksiyondan 3 saat sonra yakalanırken indüklenmiş. L-leucine besleme tahlil İndükleme ile birlikte orta eklendi. Renkli daireler hücre kültürlerinin renklerini ve hücre pelletlerini seçerek üretilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Nadir kodon tabanlı strateji mutasyon kütüphanesinden hedeflenen amino asitlerin aşırı üreticilerini tanımlayabilmektir ve bu mutantlar, ana suşlardan daha yüksek miktarlarda hedeflenen amino asitler üretmelidir (Şekil 4).

Figure 4
Şekil 4: nadir-Codon tabanlı strateji tarafından tanımlanan vahşi tip ve mutasyona uğramış suşlar tarafından üretilen amino asitler. (a) kanR-RC29 (el-1-el-5) ve Gfp-RC tarafından mutasyon kütüphanelerinden belirlenen E. coli suşlarının L-lösin üretimleri, sırasıyla 29 ve 19 lösin nadir codonları (el-6-el-10 ' a) barındırmıştır. (b) nadir-Codon zengin kanR tarafından seçilen Corynebacterium glutamat suşlarının L-arginin üretimleri, sekiz arginin nadir kodon (AGG) içeriyordu. Marker gen vahşi tip gerinim ATCC13032 türetilen C. glutamat mutasyon kütüphaneleri içine tanıtıldı. Seçim ortamı 25 μg · mL-1 kanamycin ile birlikte 0,3 x CGııı 'dir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Marker genler ve seçim veya tarama Orta nadir kodon sayısı nadir-Codon-modifiye Marker genler protein ifadeleri inhibe etmek için önemlidir. Vahşi tip Marker genler ve türevlerinden protein ifadeleri arasında önemli bir fark tespit edilemez, nadir codonlar sayısını artırarak veya bir besin sınırlı orta kullanarak farklılıkları güçlendirebilir. Ancak, inhibisyon etkisi çok güçlü ise, protein ifadeleri bile karşılık gelen amino asitlerin ekstra beslenme tarafından kurtarılabilir olmayabilir. Bu durumda, Marker genler nadir kodon sayısı stres bir kısmını rahatlatmak için azaltılmalıdır. Seçim veya tarama katı ince ayar için başka bir yolu kopya numaralarını ve nadir Codon zengin Marker genler ifade düzeylerini ayarlamak için. İşaret genlerinin kopya numarasını ve ifade seviyelerini azaltmak genellikle amino asit overüreticileri ve ilk suşları arasında daha güçlü farklılaşmaları yol açar. Bu nedenle, düşük kopya numarası çoğaltma kökenleri içeren vektörler gibi p15A veya pSC101, yanı sıra zayıf Promoters kullanılmalıdır. Marker gen bir indüklenebilir promotör tarafından tahrik ise, düşük indüksiyon önerilir.

Amino asit overüreticileri için seçim veya tarama için nadir-Codon tabanlı strateji, eksojen proteinlerin ifadelerini kolaylaştırmayı amaçlayan "Codon optimizasyonu", yaygın olarak kullanılan stratejisinin ters uyarlamasıdır. Kodon optimizasyonu, hedeflenen genler nadir kodon ev sahibi ile ilgili eşanlamlı ortak olanlar tarafından değiştirilir; Böylece, diğer organizmaların genler çok daha hızlı proteinler içine nadir kodon19yüksek orantıları ile bu eksojen genleri daha tercüme edilebilir. Bu nedenle, ortak codonları eşanlamlı nadir olanlara geçiş yapan "ters optimizasyon" nın gen ifadelerini inhibe etmesi gerektiğini varsaymak makul bir durumdur. Ancak, gen ifadeler hedeflenen amino asitler hücre içi birikir zaman karşılık gelen nadir tRNAs gelişmiş şarj tarafından restore edilmelidir. Nadir kodon eklenmesi protein ifadelerde amino asit konsantrasyonunun eşiğini artırır, hangi seçmek için potansiyel bir strateji sunuyor veya uygun Marker genler ile kombine edildiğinde amino asit overüreticiler için ekran.

Antibiyotik direnci genler, floresan protein genler ve protokolde kullanılan kromojenik protein genler yanı sıra, çeşitli Marker genler nadir Codon tabanlı seçim veya tarama sistemi kurmak için istihdam edilebilir. Örneğin, Tolc20 ve sacb21 gibi ölümcül genler amino asit overüreticileri seçmek için kullanılabilir. Bu durumda, panzehiri sisteme ait genlerde bulunan ortak codonlar, hedeflenen amino asitlerin eşanlamlı nadir kodonlarının yerine konur. Hedeflenen amino asitler engelleyebilir suşları panzehir sistemi başlatmak ve böylece, ölümcül genler tarafından indüklenen toksik etkileri hayatta edebiliyoruz.

Bu yan etkilerin beslenme tahlil amino asitler yüksek miktarlarda kullanırken ortaya çıkabilir unutulmamalıdır. Bazı amino asitler mikroorganizmalar için toksik olmasıdır. Örneğin, etrafında bir konsantrasyon 100 mg · L-1 l-serine E. coli22büyüme inhibe edebiliyoruz. Ancak, vahşi tip genden daha düşük olsa da, 2 g 'ye kadar beslenme olduğunu bulduk · L-1 l-serin hala antibiyotik direnci genlerin ifadeleri geri olabilir bu zengin serin nadir kodon13. Bu nedenle, amino asit toksisitesi, en azından L-serine için, besleme tahlil güvenilirliğini tehlikeye atmaz. Hedeflenen suşların producti, amino asit toksisitesi potansiyel olumsuz etkilerini aşmak için, rasgele mutagenez ve amino asit İhracatın geliştirilmesi gibi stratejiler23 uygulanabilir. Aslında, nadir-Codon tabanlı yöntem toleranslı suşları toksik düzeylerin üzerinde amino asitler üzerinde veya aşırı üreten yetenekli tanımlamak için uygundur. Amino asit toleransını belirleyen önemli mutasyonlar tespit edilebilir ve hedeflenen suşları içine tanıtıldı, amino asit overüreticilerinin inşaatları için ideal ana olacaktır.

Nadir kodon tabanlı seçim veya tarama sistemi yüksek sadakat sağlar. Başka bir deyişle, sistem tarafından tanımlanan suşlar hedeflenen amino asitlerin overüreticiler olması gerekiyordu. Ancak bazı durumlarda, antibiyotik seçiminden hayatta kalan adaylar, ana gerinenden daha yüksek miktarlarda hedeflenen amino asitlerin üretemez. Bu mutagenez yoluyla suşları tarafından elde edilen antibiyotik direnci ve sonra seçim plazmid24kaybı atfedilen olabilir. Sonuç olarak, gelişmiş amino asit producti. olmayan suşları antibiyotik stres hayatta ve seçim kaçmak olabilir. Bu yanlış pozitif suşlar, başka bir antibiyotiğe direnç sağlayan vahşi tip bir gen gibi, seçim plazmid içine başka bir seçim işaretçisi takarak ortadan kaldırılabilir. Seçimi Plasmid kaybetti suşları iki antibiyotik çift direnç elde etmek için daha az muhtemeldir ve seçim sırasında ortadan kalkacaktır.

Nadir kodon tabanlı sistem tarafından tanımlanan mutantlar, ilk suşları ile karşılaştırıldığında hedeflenen amino asitlerin aşırı üretebilmek gerekir. Ancak, seçilen suşlar için amino asit producti, hala endüstriyel gereksinimlere göre daha düşük olabilir. Bu, gerinim performansları seçim veya tarama işleminden bağımsızdır, ancak ilk gerilimin özellikleri, mutagenez yaklaşımı, büyüklüğü gibi faktörlere bağlı olarak nadir kodon tabanlı stratejinin başarısızlığı önermez mutasyon Kütüphanesi ve fermantasyon koşulları. Yüksek üretim suşları elde etmek için, rastgele mutagenez veya amino asit biyosentetik yolların rasyonel tasarımı ile gibi gerinim Mühendisliği stratejilerine dikkat edilmelidir. Adaptif laboratuar evrim ve nadir-Codon tabanlı strateji birleştirerek amino asit overüreticiler elde kolaylaştırmak olacaktır.

Metiyonin ve triptofan 20 proteinogenik amino asitler arasında alternatif kodon yok. Bu nedenle, bu strateji doğrudan bu amino asitlere istihdam olmayabilir. Olası bir çözüm, bu amino asitleri taşımak için Stop kodon tanıyabilecek mühendislik trnas kullanmaktır. Böylece, ilgili stop kodon bu amino asitler yapay nadir kodon olarak kabul edilebilir25,26.

Amino asit overüretici seçimi için geleneksel analog tabanlı strateji ile ilgili en büyük eksiklikleri biri yüksek yanlış pozitif oranı5,27. Mutagenez geçmesi suşları kolayca toksik amino asit analogları karşı direnç elde edebilir, ve tolerans bile mutajenler yardımı olmadan elde edilebilir27. Bu suşları kolayca amino asit analogları seçim basınçları kaçmak ve, sonuç olarak, seçilen suşları genellikle büyük ölçüde seçim sürecinin verimliliğini feda gerçek amino asit overüreticiler değildir.

Buna karşılık, nadir-Codon tabanlı strateji amino asit overüreticilerinin doğru ve hızlı kimlik sağlayarak geleneksel analog tabanlı yöntemi outcompetes. Bizim bilgi için, bu kodon önyargı doğal Yasası benimser ilk stratejisidir. Sadece tek bir nadir-Codon zengin Marker geni dayanır ve böylece, toksik analogların kullanımını ortadan kaldırır. Marker genler genellikle ana suşları için toksik olmayan, ve nadir-kodon zengin genler protein ifadeleri öncelikle kodon önyargı evrensel ve sıkı yasa nedeniyle karşılık gelen amino asitlerin hücre içi konsantrasyonları bağlıdır tüm türler arasında. Bu seçim basınçları kaçan suşları engeller. Ayrıca, Marker genlerin büyük çeşitliliği nedeniyle, nadir-Codon tabanlı strateji hem seçim ve amino asit overüreticilerin taraması için çeşitli seçimler sunabilir.

Tüm yaşayan organizmalarda kodon önyargı evrensel fenomen nedeniyle28, nadir-kodon tabanlı seçim veya tarama stratejisi teorik olarak E. colidışında diğer mikroorganizmalar için istihdam edilebilir, özellikle endüstriyel Potansiyel. Farklı bir ana bilgisayara değişirken, Marker genleri tasarlamak için kullanılan nadir kodonların seçimi, kodon kullanım frekanslarına ve belirli bir ana bilgisayar için ilgili trnas 'ın fazlalıkları üzerine kurulmalıdır. Seçim veya tarama için kullanılan ortam da buna göre optimize edilmelidir. Bir örnek amino asit fermentasyonlarının yaygın olarak kullanılan C. glutamat . Sekiz arginin nadir kodon (AGG) içeren nadir-Codon-modifiye kanR gene bir önceki çalışmada13 (Şekil 4b) C. glutamat L-arginin overüreticiler seçiminde etkili gösterildi. Nadir kodon tabanlı stratejinin keşifleri, amino asit overüreticilerinin inşası ve anlayışlarını kolaylaştırmalıdır. Amino asitler yanı sıra, nadir-Codon tabanlı strateji de ısobutanol ile istihdam edilebilir, 3-Metil-1-butanol, 2-metil-1-butanol, ve belirli amino asitler ile aynı biyosentetik yolları paylaşan diğer ürünler29. Bu amino asitlerin nadir codonlar liman Marker genler tarafından tanımlanan suşları, amino asit türevleri sentezine kanalize olabilir habercisi bileşikler, aşırı üretebilme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, nadir-Codon tabanlı strateji ya intra veya ekstrellularly Bu kimyasallar biriken suşların potansiyelleri yansıtmak için dolaylı ama hızlı bir yöntem olarak hizmet verebilir. Çeşitli overüreticilerden artan amino asit producti, temel mutasyonlar derin sıralamaları ile tespit edilebilir ve daha fazla amino asit üretimleri geliştirmek için endüstriyel suşları içine bireysel veya eşzamanlı olarak tanıtılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

İş ortaklaşa Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (Grant No. 21676026), ulusal anahtar R & D programı Çin (Grant No. 2017YFD0201400) ve Çin doktora sonrası Bilim Vakfı (Grant No. 2017M620643) tarafından desteklenmektedir. UCLA Gelişim Enstitüsü 'nde (Suzhou) çalışan Jiangsu Eyaleti ve Suzhou Industrial Park iç hibe tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo 51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit Transgen EM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction Kit Transgen EG101-01
Gibson assembly master mix NEB E2611S
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Solarbio I8070
L-leucine Sigma L8000
Microplate reader Biotek Synergy 2
n-hexane Thermo H3061
Phenyl isothiocyanate Sigma P1034
PrancerPurple CPB-37-441 ATUM CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polymerase Transgen AP231-01
Triethylamine Sigma T0886
Ultra-high performance liquid chromatography Agilent 1290 Infinity II
Wild type C. glutamicum ATCC 13032
XL10-Gold E. coli competent cell Agilent 200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column Agilent 959759-902K

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
  2. Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
  3. Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).
  4. Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
  5. Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
  6. Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
  7. Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
  8. Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
  9. Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
  10. Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
  11. Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
  12. Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
  13. Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
  14. Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
  15. Xiong, A. -S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
  16. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  18. Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
  19. Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
  20. Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
  21. Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
  22. Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
  23. Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
  24. Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
  25. Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
  26. Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
  27. Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
  28. Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
  29. Huo, Y. -X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).

Tags

Biyokimya Sayı 148 amino asit overproducer nadir kodon tRNA çeviri tarama seçim floresan protein kromojenik protein antibiyotik direnci geni
Nadir-Codon zengin Işaretçileri kullanarak amino asit Overüreticiler tanımlama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huo, Y. X., Zheng, B., Wang, N.,… More

Huo, Y. X., Zheng, B., Wang, N., Yang, Y., Liang, X., Ma, X. Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers. J. Vis. Exp. (148), e59331, doi:10.3791/59331 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter