Summary
Este estudio presenta una estrategia alternativa al método analógico tóxico convencional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos mediante el uso de marcadores ricos en codón raros para lograr precisión, sensibilidad y alto rendimiento simultáneamente.
Abstract
Para satisfacer el creciente mercado de aminoácidos, se necesitan cepas de producción de alto rendimiento. Los aminoácidos sobreproductores se identifican convencionalmente aprovechando las competiciones entre los aminoácidos y sus análogos. Sin embargo, este método analógico es de baja precisión, y los análogos adecuados para aminoácidos específicos son limitados. Aquí, presentamos una estrategia alternativa que permite un cribado preciso, sensible y de alto rendimiento de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros. Esta estrategia se inspira en el fenómeno del sesgo de uso de codón en la traducción de proteínas, para el cual los codones se clasifican en comunes o raros en función de sus frecuencias de ocurrencia en el ADN de codificación. La traducción de codones raros depende de sus ARN de transferencia raras correspondientes (tRNAs), que no pueden ser completamente cargados por los aminoácidos cognados bajo inanición. Teóricamente, los tRNAs raros se pueden cargar si hay un excedente de los aminoácidos después de cargar los isoacceptors comunes sinónimos. Por lo tanto, las traducciones retardadas causadas por codones raros podrían restaurarse mediante la alimentación o las sobreproducciones intracelulares de los aminoácidos correspondientes. Bajo esta suposición, se establece un sistema de selección o cribado para identificar a los sobreproductores de aminoácidos reemplazando los codones comunes de los aminoácidos dirigidos por sus alternativas raras sinónimos en los genes de resistencia a los antibióticos o los genes codificación de proteínas fluorescentes o cromogénicas. Demostramos que las expresiones proteicas pueden verse obstaculizadas en gran medida por la incorporación de codones raros y que los niveles de proteínas se correlacionan positivamente con las concentraciones de aminoácidos. Usando este sistema, los sobreproductores de múltiples aminoácidos pueden ser fácilmente expulsados de las bibliotecas de mutaciones. Esta estrategia basada en codón raro sólo requiere un solo gen modificado, y el huésped es menos propenso a escapar de la selección que en otros métodos. Ofrece un enfoque alternativo para la obtención de aminoácidos sobreproductores.
Introduction
La producción actual de aminoácidos depende en gran medida de la fermentación. Sin embargo, los valoradores y rendimientos para la mayoría de las cepas de producción de aminoácidos están por debajo de las crecientes demandas del mercado global de aminoácidos que vale miles de millones de dólares1,2. La obtención de sobreproductores de aminoácidos de alto rendimiento es fundamental para la actualización de la industria de aminoácidos.
La estrategia tradicional para identificar a los sobreproductores de aminoácidos explotalas competiciones entre los aminoácidos y sus análogos en la síntesis de proteínas 3,4. Estos análogos son capaces de cargar los tRNA que reconocen los aminoácidos correspondientes y así inhibir las elongaciones de las cadenas de péptidos, lo que conduce a un crecimiento detenido o muerte celular5. Una manera de resistir las tensiones analógicas es aumentar las concentraciones de aminoácidos intracelulares. Los aminoácidos enriquecidos superarán a los análogos para los tRNA finitos y asegurarán la síntesis correcta de proteínas funcionales. Por lo tanto, las cepas que sobreviven a los análogos pueden ser seleccionados y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos correspondientes.
Aunque resultó exitoso en la selección de los sobreproductores para aminoácidos como L-leucina6, la estrategia basada en analógico sufren de graves inconvenientes. Una preocupación importante es la resistencia analógica originada por el proceso de mutagénesis o a través de mutaciones espontáneas. Las cepas con resistencia pueden escapar de la selección bloqueando, exportando o degradando los análogos5. Otra preocupación son los efectos secundarios tóxicos de los análogos en otros procesos celulares7. Como consecuencia, las cepas que sobreviven a la selección analógica pueden no ser los sobreproductores de aminoácidos, mientras que los sobreproductores deseados podrían ser falsamente exterminados debido a los efectos secundarios negativos.
Aquí, se presenta una estrategia novedosa basada en la ley del sesgo de codón con el fin de lograr identificaciones precisas y rápidas de los sobreproductores de aminoácidos. La mayoría de los aminoácidos están codificados por más de un triplete de nucleótidos que es favorecido de manera diferente por los organismos huésped8,9. Algunos codones rara vez se utilizan en las secuencias de codificación y se conocen como los codones raros. Sus traducciones en aminoácidos se basan en los tRNAs cognados que llevan los aminoácidos correspondientes. Sin embargo, los arnms que reconocen codones raros suelen tener abundancias mucho más bajas que los arba de los codones comunes10,11. En consecuencia, estos raros tRNAs son menos propensos a capturar los aminoácidos libres en las competiciones con otros isoaceptadores, y las traducciones de las secuencias ricas en codón raro comienzan a desacelerar se o incluso se terminan cuando las cantidades de aminoácidos son limitadas 10. Las traducciones podrían, teóricamente, restaurarse si hay un excedente de aminoácidos después de cargar los TRNA comunes sinónimos debido a sobreproducciones o alimentación adicional de los aminoácidos correspondientes12. Si el gen rico en codón raro codifica un marcador de selección o cribado, las cepas que presentan los fenotipos correspondientes pueden identificarse fácilmente y son probablemente los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos.
La estrategia anterior se aplica para establecer una selección y un sistema de cribado para la identificación de los sobreproductores de aminoácidos. El sistema de selección utiliza genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, kanR) como marcadores, mientras que el sistema de cribado utiliza los genes que codifican las proteínas fluorescentes fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes [GFP]) o cromogénicas (por ejemplo, PrancerPurple). Los genes marcadores en ambos sistemas se modifican reemplazando los números definidos de los codones comunes para el aminoácido dirigido por su rara alternativa sinónima. Las cepas de la biblioteca de mutaciones que albergan el gen marcador rico en codón raro se seleccionan o examinan en condiciones adecuadas, y los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos pueden ser fácilmente identificados. El flujo de trabajo comienza con la construcción del sistema genético marcador rico en codón poco raro, seguido de la optimización de las condiciones de trabajo, y luego la identificación y verificación de los aminoácidos sobreproductores. Esta estrategia independiente del análogo se basa en el dogma en la traducción de proteínas y se ha verificado prácticamente para permitir la identificación precisa y rápida de los sobreproductores de aminoácidos. Teóricamente, podría emplearse directamente a aminoácidos con codones raros y a todos los microorganismos. En total, la estrategia basada en codón raro servirá como una alternativa eficiente al enfoque convencional basado en analógico cuando los análogos adecuados para aminoácidos específicos no están disponibles, o cuando una alta tasa de falsos positivos es la principal preocupación. El siguiente protocolo utiliza leucina rara codón para demostrar esta estrategia en la identificación de los sobreproductores de Escherichia coli L-leucina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Construcción de los plásmidos que expresan los genes marcadores ricos en codón raros
- Seleccione un gen marcador que contenga un número adecuado de codones comunes para el aminoácido dirigido.
NOTA: Para la L-leucina, el gen de resistencia a la kanamicina kanR, que contiene 29 codones de leucina, de los cuales 27 son codones comunes, se utiliza para la construcción del sistema de selección13. El gen gfp, que contiene 17 codones comunes de 19 codones de leucina, o el gen de codificación de proteínas púrpuraprancerpurple (ppg), que alberga 14 codones comunes de leucina, se utiliza para el sistema de cribado (TablaSuplementaria 1 ). - Sustituya los codones comunes en los genes marcadores por el codón raro sinónimo. Para L-leucina, sustituya sus codones en kanR, gfpo ppg por el raro codón CTA, generando kanR-RC, gfp-RCo ppg-RC, respectivamente13 ( Tabla Complementaria 1).
NOTA: La frecuencia del codón raro en los genes marcadores afectará a la rigel del sistema de selección o cribado. En general, aumentar el número de codones raros aumentará la rigeldel del sistema de selección o cribado. Para lograr la selección o la fuerza de cribado adecuada, diseñe una serie de genes marcadores que albergan diferentes números de codones raros y compare sus efectos. - Genere bloques de construcción de los genes marcadores ricos en codón raros utilizando herramientas como GeneDesign14 (http://54.235.254.95/gd/) para la síntesis de genes. Alternativamente, ordene los genes marcadores de los servicios comerciales de síntesis de genes.
- En la página GeneDesign, elija Diseño de bloquesed.
- Pegue las secuencias de los genes marcadores ricos en codón raro en el cuadro Secuencia.
- Defina la longitud de superposición entre los oligos de ensamblaje; tenga en cuenta que el valor predeterminado 40 bp funciona bien para la mayoría de las secuencias.
NOTA: Consulte el manual en línea para obtener más instrucciones sobre la configuración de los demás parámetros. - Haga clic en el botón Diseñar bloques de creación y ordene los oligonucleótidos que aparecen en la página.
- Sintetizar los genes modificados con codón raro mediante la síntesis precisa basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)15.
- Ligar el kan raro-rico en codón R-RC a vector pET-28a, gfp-RC a pSB1C3, y ppg-RC a CPB-37-44116.
NOTA: Los mapas plásmidos pET-28a y pSB1C3 están disponibles en la base de datos de plásmido en línea SnapGene (TablaSuplementaria 1); el mapa de plásmido CPB-37-441 está disponible en el sitio web de proteínacromogénica DE ATUM.- En hielo, agregue el vector y los fragmentos del marcador en una relación molar de 1:1 a 7,5 l de mezcla de ensamblaje (ver Tabla de Materiales)a un volumen total de 10 l. Incubar la muestra a 50oC durante 1 h.
- Transformar 5 ml del producto de montaje en 50 s de celdas competentes (ver la Tabla de Materiales)a 42 oC durante 30 s.
- Recuperar las células en SOC (caldo súper óptimo con represión catabolizada) medio a 37 oC durante 1 h, placarlas en el medio de agar LB (caldo de lisógena), e incubarlas a 37 oC durante la noche.
- Inocular la colonia en medio LB e incubar a 37oC durante 8 h.
- Aísle el plásmido utilizando un kit comercial preferido.
2. Optimización de las condiciones de selección
- Convierta la cepa padre utilizada para la mutagénesis en células competentes17.
- Transformar 50 l de las células competentes con 1 l de plásmido que lleva el kanRde tipo salvaje, y transformar otro conjunto de las células competentes con el plásmido que contiene kanR-RC29 con todo el codón de leucina reemplazado por el raro codón CTA.
- Añadir 950 s l de medio SOC e incubar la muestra en una coctelera a 250 rpm a 37 oC durante 1 h.
- Placa 100 l del cultivo celular en el medio de agar LB que contiene 50 g-ml-1 kanamicina, e incubarla a 37 oC durante aproximadamente 8 h hasta que aparezcan las colonias.
- Escoge las colonias que albergan el kanR de tipo salvaje y el kanR-RC29 rico en codón raro y leucina y úsalas cada una para inocular 5 ml de medio LB diluido cinco (0,2x LB) que contiene 50 g-ml-1 kanamicina. Incubar las muestras en una coctelera a 250 rpm a 37oC.
NOTA: El medio es crucial para el sistema de selección. Debe contener suficiente carbono y nitrógeno para permitir la expresión de la proteína de resistencia a los antibióticos del gen de tipo salvaje en lugar de los derivados modificados con codón raro. En este caso, la concentración de L-leucina en 1x medio LB es demasiado alta para inhibir completamente la expresión proteica de la kanRrica en codón raro. Por lo tanto, un medio LB diluido con un factor de dilución como 5 se utiliza para generar una clara diferencia en las expresiones proteicas del tipo salvaje y los genes ricos en codón raros. - Transfiera 200 ml de cada uno de los cultivos celulares a una placa de 96 pocillos en triplicado en puntos de tiempo definidos (por ejemplo, 8 h, 16 h y 24 h). Mida el OD600 (densidad óptica a 600 nm) utilizando un lector de placas.
NOTA: Si no se puede detectar una disminución en la célula OD600 para las cepas que albergan los genes marcadores ricos en codón poco raros en comparación con la OD600 de la cepa que alberga los genes marcadores de tipo salvaje, trate de aumentar la cantidad de codón raro en el marcadores o utilizar un medio más diluido. - Realizar el ensayo de alimentación de aminoácidos para probar si las expresiones de los genes marcadores ricos en codón raro (por ejemplo, kanR-RC29) se pueden restaurar aumentando la concentración de los aminoácidos dirigidos.
NOTA: Para la selección de sobreproductores de L-leucina, L-leucina se utiliza para la alimentación.- Inocular las cepas que albergan el gen marcador kanR-RC29 en 5 ml de la LB de 0,2x (que contiene 50 g-mL-1 kanamicina) con o sin el suministro de 1 g. L-1 L-leucina. Inocular otros 5 ml del 0,2x LB con cepas que albergan el kanR de tipo salvaje como control. Incubar las muestras en una coctelera a 250 rpm a 37oC.
- Mida el OD600 para cada cultivo en puntos de tiempo definidos (por ejemplo, 15 h, 17 h, 19 h y 22 h).
3. Optimización de las condiciones de cribado
- Transformar 50 l de la cepa padre utilizada para la mutagénesis con 1 l de plásmido (50 ng-L-1) que lleva el gfp de tipo salvaje o el ppgde tipo salvaje. Además, transforma la cepa principal con los derivados ricos en codón raro de los genes marcadores.
- Añadir 950 s l de medio SOC e incubar la muestra en una coctelera a 250 rpm a 37 oC durante 1 h.
- Placa 100 l del cultivo celular en el medio de agar LB que contiene los antibióticos apropiados (25 g-mL-1 cloranfenicol para el plg plásmido que lleva un marcador R cm, o 50 g-mL-1 kanamicina para el ppg plásmido que lleva un marcador kanR) e incubar durante la noche a 37 oC.
- Elija una colonia que alberga el gfp o ppg de tipo salvaje y una colonia que alberga el derivado correspondiente rico en codón raro, y transferirlos a 5 ml del medio LB debidamente diluido individualmente. Incubar las muestras en una coctelera a 250 rpm a 37oC.
NOTA: Para las cepas de E. coli que albergan el gfp-RC o ppg-RCrico en leucina rara-codon, el medio LB sin diluir (1x LB) se puede utilizar para crear diferencias significativas en las expresiones del tipo salvaje y el marcador de codón raro rico en codón Genes. Además, los promotores inducibles se utilizan para impulsar las expresiones de los genes marcadores de cribado. Comience la inducción cuando las células entren en la fase exponencial para lograr mejores discriminaciones. - Para los marcadores de fluorescencia, transfiera 200 ml de cada uno de los cultivos celulares a una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos en triplicado en puntos de tiempo definidos (por ejemplo, 2 h, 4 h y 6 h). Mida el OD600 y la fluorescencia y calcule la intensidad de la fluorescencia (la relación de fluorescencia a600oD). Para marcadores cromogénicos, mida el desarrollo de color de los cultivos celulares.
NOTA: Si no se pueden detectar intensidades de fluorescencia más bajas para las cepas que albergan el gfp-RC en comparación con la de las cepas que albergan el gfpde tipo salvaje, o si no se puede detectar un color más claro para las células que expresan la proteína púrpura del ppg-RC que del gen de tipo salvaje, trate de aumentar el número de codón raro en los genes marcadores o utilice un medio más diluido. - Realice el ensayo de alimentación (véanse los pasos 2.7.1 y 2.7.2). Mida la intensidad de la fluorescencia o el desarrollo del color en los puntos de tiempo definidos (por ejemplo, 12 h, 18 h y 24 h).
4. Identificación de los aminoácidos sobreproductores
- Inocular 100 l de la cultura de los mutantes en 5 ml de medio LB (2% v/v) e incubarlo en una coctelera a 250 rpm a 37 oC hasta que los valores de OD600 alcancen 0,4.
- Convierte a los mutantes en células competentes17.
- Transformar 50 l de las células mutantes con 1 l de plásmido (50 ng-L-1) llevando el marcador de selección kanR-RC29 o los marcadores de cribado gfp-RC o ppg-RC. Añadir 950 sl de medio SOC y girar la muestra en una coctelera de 37 oC durante 1 h.
- Seleccione sobreproductores de aminoácidos.
- Centrifugar el cultivo celular a 4.000 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y añadir 5 ml de medio de 0,2x LB que contenga 50 g-mL-1 kanamicina. Incubar la muestra en una coctelera de 37 oC durante la noche.
- Placa rinde el cultivo nocturno (p. ej., 100 l, depende de la densidad celular del cultivo) en un medio de agar LB de 0,2x que contiene 50 g-mL-1 kanamicina e incubaa a 37 oC durante 12 h.
NOTA: Las colonias desarrolladas son los candidatos de los sobreproductores de aminoácidos dirigidos y, en este caso, los sobreproductores de L-leucina.
- Prueba los aminoácidos sobreproductores.
- Placar el número adecuado de células (p. ej., 100 l) que albergan el marcador de cribado (como se describe en el paso 4.3) en el medio de agar LB que contiene el antibiótico adecuado (25 g-ml-1 cloranfenicol para el cribado con gfp-RC y 50 g-ml -1 kanamicina para cribado con ppg-RC) e incubar a 37oC durante 8 h.
- Inocular el medio DE LB que contiene el antibiótico adecuado (ver paso 4.5.1) con cada colonia de la placa. Incubar las muestras en una coctelera a 250 rpm a 37oC.
- Mida el OD600 y la fluorescencia y calcule la intensidad de la fluorescencia si se utiliza gfp-RC. Mida el desarrollo de color de los cultivos celulares si se utiliza ppg-RC. Tenga en cuenta que las cepas que presentan una mayor intensidad de fluorescencia o un color más profundo que el de la cepa madre son los sobreproductores de aminoácidos candidatos y, en este caso, los sobreproductores de L-leucina.
NOTA: La clasificación celular activada por fluorescencia también es adecuada para identificar a los productores de alta célula de una sola célula cuando se utilizan genes de proteínas fluorescentes ricos en codón raros para el cribado.
- Verificar las productividades de aminoácidos de las cepas candidatas.
- Inocular 5 ml de medio LB con cada una de las cepas candidatas y dejar que las células crezcan durante la noche en una coctelera a 250 rpm a 37 oC.
- Cosecha las células de 1 ml del cultivo celular por centrifugación a 4.000 x g durante 2 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet con 1 ml de agua estéril.
- Inocular 20 ml de medio M9 que contenga un 4% de glucosa con 200 ml de la suspensión celular e incubar en una coctelera de 250 ml a 250 rpm a 37oC durante 24 h.
- Centrífuga 1 ml del medio de cultivo a 4.000 x g durante 5 min. Transfiera 200 l del sobrenadante a un tubo limpio de 1,5 ml. Preparar soluciones de L-leucina (grado HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 y 1 g. L-1 como estándares.
- Añadir 100 l de trietilamina de 1 mM y 100 l de isotiocianato de fenilo de 1 M al sobrenadante y a las normas, mezclarlos suavemente e incubarlos a temperatura ambiente durante 1 h18.
ADVERTENCIA: La trietilamina y el isotiocianato de fenilo pueden causar quemaduras graves en la piel y daños en los ojos y son perjudiciales si se inhalan. Use guantes y una máscara y, si es posible, realice este paso en una campana de humo. - Añadir 400 s de n-hexano al mismo tubo y vórtice durante 10 s. Filtrar la fase inferior que contiene los derivados de aminoácidos a través de una membrana de politetrafluoroetileno de 0,2 m.
ADVERTENCIA: n-hexano puede causar irritación de la piel. Use guantes y ropa protectora. Si entra en contacto con la piel, enjuague la piel con abundante agua. - Preparar la fase móvil A mezclando 0,1 M de acetato de sodio (pH 6,5) y acetonitrilo en una proporción volumétrica de 99,3:0,7. Preparar acetonitrilo (80% v/v) como fase móvil B. Filtrar todas las fases móviles a través de membranas de politetrafluoroetileno de 0,2 m.
ADVERTENCIA: El acetonitrilo es dañino si se inhala y puede causar irritaciones en la piel y los ojos. Use guantes y ropa protectora y realice este paso en una campana de humo. - Ejecutar 1 l de la muestra en un ultra-HPLC equipado con una columna C18 de acuerdo con el programa de elución en la Tabla 1 con un caudal de 0,42 ml-min-1 y una temperatura de columna de 40 oC. Detectar los aminoácidos objetivo a 254 nm con un detector de matriz de diodos y calcular sus concentraciones mediante la asignación de las áreas pico a la curva estándar.
| Tiempo (min) | Fase móvil A (%) | Fase móvil B (%) |
| 0 | 98 | 2 |
| 3.5 | 70 | 30 |
| 7 | 43 | 57 |
| 7.1 | 0 | 100 |
| 11 | 98 | 2 |
Tabla 1: Programa de elución para la cuantificación de aminoácidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para el sistema de selección, se debe observar una fuerte disminución de600 OD para las cepas que albergan el gen de resistencia a los antibióticos ricos en codón poco raros en comparación con la cepa que alberga el gen de resistencia a los antibióticos de tipo salvaje cuando se cultiva en un medio(Figura 1a). En las mismas condiciones, la disminución de la OD600 celular se hace más evidente a medida que aumenta el número de codones raros en el gen de resistencia a los antibióticos (Figura1a). Cabe señalar que la inhibición del codón raro en expresiones proteicas en su mayoría tiene lugar en condiciones de hambre. Por lo tanto, si el medio LB no se diluye adecuadamente, no se observará una disminución significativa de la célula OD600 para la cepa que alberga el gen marcador rico en codón raro en comparación con la cepa que alberga el gen de tipo salvaje (Figura1b). Después de la alimentación adicional del aminoácido correspondiente, la OD600 para la cepa que alberga el gen de resistencia a los antibióticos ricos en codón raro aumentará significativamente y se acercará a la de la cepa que alberga el gen de tipo salvaje (Figura1c).
Figura 1: Efectos del codón raro en las expresiones de los genes marcadores utilizados para la selección y los sistemas de cribado. (a) La célula OD600 para una cepa de E. coli que alberga el gen de resistencia a los antibióticos ( kanR) con 6, 16, 26, y 29 leucina rara-codon (RC6, RC16, RC26, y RC29) reemplazo después de 5 h de incubación. (b) La célula OD600 para una cepa E. coli que alberga el tipo salvaje (WT) y el kan R (RC) rico en codón raro en medios 1x, 0.5x y 0.2x LB después de 5 h de incubación. (c) Efectos de la alimentación de L-leucina en el crecimiento celular de cepas de E. coli que albergan el gen kan R rico en leucoyana rara-codon después de 5 h de incubación. Los valores y las barras de error representan la media y el SD (n . 6). La alimentación de L-leucina aumentó significativamente la OD600 para las células que albergan el kanRrico en codón raro. La única excepción fue la alimentación de 2 g L-1 L-leucina debido a una alta SD en OD600 para el tratamiento de alimentación. (d) Efectos de la alimentación de codón raro y L-leucina en expresiones GFP del tipo salvaje (WT) y los genes ricos en leuconico (RC) después de 16 h de incubación. La alimentación de 0.5–2 L-1 L-leucina aumentó significativamente la intensidad de fluorescencia para las células que albergan el gfp rico en codón raro. Los valores y las barras de error representan la media y el SD (n . 3). **P < 0.01, ***P < 0.001 según lo determinado por la prueba tde dos colas, y sólo se mostraron los resultados más significativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para el sistema de cribado, la intensidad de la fluorescencia y el número de células fluorescentes serán significativamente menores para la cepa que expresa la proteína fluorescente del gen rico en codón raro que del gen de tipo salvaje (Figura1d y Figura 2). Cuando se utiliza la proteína púrpura, el color desarrollado a partir de la ppg rica en codón raro debe ser más claro que el del gen de tipo salvaje cuando se expresa en las mismas condiciones para el mismo período de incubación (Figura3). La alimentación del aminoácido correspondiente restaurará las expresiones proteicas de los genes ricos en codón raro. Para las cepas que albergan el gfprico en codón poco raro , la intensidad de la fluorescencia (Figura1d)y el número de células fluorescentes (Figura2) deben aumentar significativamente y acercarse a la de las cepas que contienen el gfp de tipo silvestre . Cuando se utiliza LB sin diluir, los aminoácidos en el medio serían suficientes para permitir la expresión lenta de la ppg rica en codón raro incluso sin alimentación adicional de L-leucina, y la proteína púrpura expresada se haría visible una vez que las células se peletizarán ( Figura 3). Sin embargo, esto no oculta el hecho de que la expresión génica de la ppg rica en codón raro se mejoró dramáticamente mediante la alimentación de la L-leucina a 2 g L-1, especialmente cuando se observa en cultivo sin líquido (Figura3). Por lo tanto, el cultivo líquido es una mejor opción para el cribado basado en proteínas cromogénicas, y el uso de medio LB diluido traería una diferencia más significativa entre los fenotipos inducidos por el tipo salvaje y los genes ricos en codón raro.
Figura 2: El número de células fluorescentes de E. coli que albergan el gfp de tipo salvaje o el gfp rico en codón poco común(gfp-RC)después de la adición de L-leucina. Las células se cultivaban en 1 x medio LB. Barra de escala a 20 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Desarrollo del color para las células que albergan los genes ppg de tipo salvaje (WT) y leucina rara-rico en codón (RC) que codifican una proteína púrpura en 1 x medio LB (panel izquierdo) y el efecto de la l-leucina que se alimenta en el desarrollo del color del cultivo celular ( panel derecho). Los genes ppg fueron inducidos cuando las células entraron en la fase exponencial y las imágenes fueron capturadas 3 h después de la inducción. La L-leucina se añadió al medio junto con el inductor en el ensayo de alimentación. Los círculos de color se generaron eligiendo los colores de los cultivos celulares y los pellets celulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La estrategia basada en codón raro es capaz de identificar a los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos de la biblioteca de mutaciones, y estos mutantes deben producir cantidades más altas de los aminoácidos dirigidos que las cepas primarias (Figura4).
Figura 4: Aminoácidos producidos por el tipo salvaje y las cepas mutadas identificadas por la estrategia basada en codón raro. (a ) Producciones de L-leucina de cepas De. coli identificadas a partir de bibliotecas de mutaciones por el kanR-RC29 (EL-1 a EL-5) y el gfp-RC que alberga 29 y 19 codones raros de leucina (EL-6 a EL-10), respectivamente. (b) Producciones de L-arginina de Corynebacterium glutamicum cepas seleccionadas por el kanR rara-rico en codón, que contenía ocho codones raros de arginina (AGG). El gen marcador se introdujo en las bibliotecas de mutación de C. glutamicum derivadas de la cepa de tipo salvaje ATCC13032. El medio de selección fue de 0,3x CGIII suministrado con 25 g-ml-1 kanamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El número de codones raros en los genes marcadores y el medio de selección o cribado son críticos para inhibir las expresiones proteicas de los genes marcadores modificados con codón raro. Si no se puede detectar ninguna diferencia significativa entre las expresiones proteicas de los genes marcadores de tipo salvaje y sus derivados, aumentar el número de codones raros o usar un medio limitado por nutrientes puede amplificar las diferencias. Sin embargo, si el efecto de inhibición es demasiado fuerte, las expresiones proteicas no pueden recuperarse incluso mediante la alimentación adicional de los aminoácidos correspondientes. En este caso, el número de codones raros en los genes marcadores debe reducirse para aliviar parte del estrés. Otra forma de afinar la selección o la rigelería de cribado es ajustar los números de copia y los niveles de expresión de los genes marcadores ricos en codón poco raros. Disminuir el número de copia y los niveles de expresión de los genes marcadores generalmente conduce a diferenciaciones más fuertes entre los sobreproductores de aminoácidos y las cepas iniciales. Por lo tanto, se deben utilizar vectores que contengan los orígenes de replicación de número de copia bajo, como p15A o pSC101, así como promotores débiles. Si el gen marcador es impulsado por un promotor inducible, se recomienda una inducción baja.
La estrategia basada en codón raro para la selección o cribado de aminoácidos sobreproductores es una adaptación inversa de la estrategia comúnmente utilizada de "optimización del codón", que tiene como objetivo facilitar las expresiones de proteínas exógenas. En la optimización del codón, los codones raros en los genes dirigidos son reemplazados por los comunes sinónimos con respecto al huésped; por lo tanto, los genes de otros organismos podrían traducirse mucho más rápidamente en proteínas que aquellos genes exógenos con altas proporciones de codones raros19. Por lo tanto, es razonable suponer que la "optimización inversa", que cambia los codones comunes a sus sinónimos raros, debe inhibir las expresiones génicas. Sin embargo, las expresiones génicas deben restaurarse mejorando la carga de los tRNA raros correspondientes cuando los aminoácidos dirigidos se acumulan intracelularmente. La incorporación de codones raros aumenta el umbral de la concentración de aminoácidos en expresiones proteicas, que ofrece una estrategia potencial para seleccionar o detectar sobreproductores de aminoácidos cuando se combina con los genes marcadores adecuados.
Además de los genes de resistencia a los antibióticos, los genes de proteínas fluorescentes y los genes de proteína cromogénica utilizados en el protocolo, se podrían emplear varios genes marcadores para establecer el sistema de selección o cribado basado en codón raro. Por ejemplo, genes letales como tolC20 y sacB21 podrían utilizarse para seleccionar sobreproductores de aminoácidos. En este caso, los codones comunes en los genes que pertenecen al sistema de antídotos deben ser reemplazados por los codones raros sinónimos de los aminoácidos dirigidos. Las cepas que producen en exceso los aminoácidos dirigidos son capaces de lanzar el sistema de antídoto y, por lo tanto, sobrevivir a los efectos tóxicos inducidos por los genes letales.
Cabe señalar que pueden ocurrir efectos secundarios cuando se utilizan altas cantidades de aminoácidos en el ensayo de alimentación. Esto se debe a que algunos aminoácidos son tóxicos para los microorganismos. Por ejemplo, una concentración de alrededor de 100 mg L-1 para L-serina es capaz de inhibir el crecimiento de E. coli22. Sin embargo, aunque es inferior a la del gen de tipo salvaje, encontramos que alimentar hasta 2 g L-1 L-serina todavía podría restaurar las expresiones de genes de resistencia a antibióticos que ricos en serina rara codón13. Por lo tanto, la toxicidad de aminoácidos, al menos para L-serina, no pondría en peligro la fiabilidad del ensayo de alimentación. Para superar los posibles efectos negativos de la toxicidad de aminoácidos en las productidades de las cepas específicas, se podrían aplicar estrategias como la mutagénesis aleatoria y la mejora de las exportaciones de aminoácidos23. De hecho, el método basado en codón raro es adecuado para identificar cepas tolerantes capaces de soportar o sobreproducir aminoácidos por encima de los niveles tóxicos. Las mutaciones clave que confieren tolerancia a aminoácidos podrían ser identificadas e introducidas en las cepas específicas, que serían los anfitriones ideales para las construcciones de los sobreproductores de aminoácidos.
El sistema de selección o cribado basado en codón raro garantiza una alta fidelidad. En otras palabras, las cepas identificadas por el sistema se supone que son los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos. Sin embargo, en algunos casos, los candidatos que sobreviven a la selección de antibióticos no pueden producir cantidades más altas de los aminoácidos dirigidos que la cepa padre. Esto podría atribuirse a la resistencia a los antibióticos adquirida por las cepas a través de la mutagénesis y luego una pérdida del plásmido de selección24. Como consecuencia, las cepas sin productos de aminoácidos mejorados podrían sobrevivir al estrés antibiótico y escapar de la selección. Estas cepas falsas positivas podrían eliminarse insertando otro marcador de selección en el plásmido de selección, como un gen de tipo salvaje que confiere resistencia a otro antibiótico. Las cepas que perdieron el plásmido de selección son menos propensas a obtener doble resistencia a los dos antibióticos y serán eliminadas durante la selección.
Los mutantes identificados por el sistema basado en codón raro deben ser capaces de sobreproducir los aminoácidos dirigidos en comparación con las cepas iniciales. Sin embargo, las productos de aminoácidos para las cepas seleccionadas pueden seguir siendo inferiores a los requisitos industriales. Esto no sugiere un fracaso de la estrategia basada en codón raro, ya que las prestaciones de tensión son independientes del proceso de selección o cribado, pero dependen de factores como las características de la tensión inicial, el enfoque de la mutagénesis, el tamaño de la biblioteca de mutaciones, y las condiciones de fermentación. Con el fin de obtener cepas de alta producción, se debe prestar atención a las estrategias de ingeniería de cepas, como por mutagénesis aleatoria o a través del diseño racional de las vías biosintéticas de aminoácidos. Combinar la evolución adaptativa del laboratorio y la estrategia basada en el codo raro facilitaría la obtención de sobreproductores de aminoácidos.
La metionina y el triptófano no tienen codones alternativos entre los 20 aminoácidos proteinogénicos. Por lo tanto, esta estrategia no puede emplearse directamente a estos aminoácidos. Una posible solución es utilizar tRNAs de ingeniería que son capaces de reconocer los codones de parada para llevar estos aminoácidos. Así, los codones de parada correspondientes podrían adoptarse como los codones raros artificiales de estos aminoácidos25,26.
Una de las mayores deficiencias relativas a la estrategia convencional basada en analógicos para la selección de sobreproductores de aminoácidos es la alta tasa de falsos positivos5,27. Las cepas que pasan por la mutagénesis podrían adquirir fácilmente resistencia hacia los análogos de aminoácidos tóxicos, y la tolerancia puede incluso adquirirse sin la ayuda de mutágenos27. Estas cepas podrían escapar fácilmente de las presiones de selección de los análogos de aminoácidos y, en consecuencia, las cepas seleccionadas no suelen ser los verdaderos sobreproductores de aminoácidos que sacrifican en gran medida la eficiencia del proceso de selección.
Por el contrario, la estrategia basada en el codón raro supera al método tradicional basado en analógicoal al permitir la identificación precisa y rápida de los sobreproductores de aminoácidos. Hasta nuestro conocimiento, esta es la primera estrategia que adopta la ley natural del sesgo de codón. Sólo se basa en un único gen marcador rico en codón raro y, por lo tanto, elimina el uso de análogos tóxicos. Los genes marcadores son generalmente no tóxicos para las cepas anfitrionas, y las expresiones proteicas de genes ricos en codón raros dependen principalmente de las concentraciones intracelulares de los aminoácidos correspondientes debido a la ley universal y estricta de sesgo de codón en todas las especies. Esto evitaría que las cepas escapen de las presiones de selección. Además, debido a la gran diversidad de genes marcadores, la estrategia basada en codón raro podría ofrecer varias opciones tanto para la selección como para el cribado de los sobreproductores de aminoácidos.
Debido al fenómeno universal del sesgo de codón en todos los organismos vivos28, la estrategia de selección o cribado basada en codón raro podría emplearse teóricamente a otros microorganismos además de E.coli, especialmente aquellos con Potenciales. Al cambiar a un host diferente, la elección de codones raros utilizados para diseñar los genes marcadores debe basarse en las frecuencias de uso de codón y las abundancias de los tRNA correspondientes para el host específico. El medio utilizado para la selección o el cribado también debe optimizarse en consecuencia. Un ejemplo es el comúnmente utilizado C. glutamicum en fermentaciones de aminoácidos. Un gen kanR modificado con codón raro-codón modificado con ocho codones raros de arginina (AGG) se ha demostrado eficaz en la selección de C. glutamicum L-arginina sobreproductores por un estudio anterior13 (Figura4b). Las exploraciones de la estrategia basada en el codón raro deben facilitar las construcciones y la comprensión de los sobreproductores de aminoácidos. Además de los aminoácidos, la estrategia basada en codón raro también podría emplearse con isobutanol, 3-metil-1-butanol, 2-metil-1-butanol, y otros productos que comparten las mismas vías biosintéticas con ciertos aminoácidos29. Las cepas identificadas por genes marcadores que albergan los codones raros de estos aminoácidos son capaces de producir en exceso los compuestos precursores, que podrían ser canalizados a la síntesis de los derivados de aminoácidos. Por lo tanto, la estrategia basada en el codón raro podría servir como un método indirecto pero rápido para reflejar el potencial de las cepas en la acumulación de estos productos químicos, ya sea intra o extracelularmente. Las mutaciones clave que confieren mayores productos de aminoácidos de varios sobreproductores podrían identificarse mediante una secuenciación profunda y se introdujeron individualmente o simultáneamente en cepas industriales para mejorar aún más las producciones de aminoácidos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo fue apoyado conjuntamente por la National Natural Science Foundation of China (subvención no 21676026), el Programa Nacional de I+D Clave de China (concesión no 2017YFD0201400) y la China Postdoctoral Science Foundation (concesión no 2017M620643). Las obras en el Instituto de Avance de la UCLA (Suzhou) fueron apoyadas por las subvenciones internas de la provincia de Jiangsu y el Parque Industrial de Suzhou.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
- Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C.
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A.
- Huo, Y. -X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
