Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-Codon-מסמנים עשירים

Published: June 24, 2019 doi: 10.3791/59331
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Molecular Medicine and Biotherapy, School of Life Sciences, Beijing Institute of Technology, 2UCLA Institute for Technology Advancement (Suzhou)

Summary

מחקר זה מציג אסטרטגיה חלופית לשיטה הקונבנציונלית הרעילה האנטי-אנלוגית בזיהוי מפיקי מיתר של חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-מאוד עשירים להשגת דיוק, רגישות ותפוקה גבוהה בו זמנית.

Abstract

כדי לספק את השוק הצומח אי פעם עבור חומצות אמינו, זנים הייצור ביצועים גבוהים נחוצים. חומצות אמינו מפיקים מאוד מזוהים על ידי רתימת התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם. עם זאת, שיטה מבוססת-אנלוגי זו היא בדיוק נמוכה, והאנלוגי המתאים לחומצות אמינו ספציפיות מוגבל. כאן, אנו מציגים אסטרטגיה חלופית המאפשרת הקרנת מדויק, רגיש, תפוקה גבוהה של יצרני מיתר חומצות אמינו באמצעות סמנים נדירים-העשירים. אסטרטגיה זו היא בהשראת התופעה של הטיית השימוש של קודון בתרגום חלבונים, אשר מסווגים ביניהם לבין הנפוצים או נדירים מבוסס על התדרים שלהם של התרחשות ה-DNA קידוד. התרגום של מגנטים נדירים תלוי ב-rnas המקביל (trnas) נדיר שלהם, אשר לא ניתן לטעון במלואה על ידי חומצות אמינו קנצוני מתחת לרעב. באופן תיאורטי, tRNAs נדיר יכול להיות מחויב אם יש עודף של חומצות אמינו לאחר הטעינה של איזומקובלים משותפים נרדף. לכן, תרגומים מפגרים הנגרמים על ידי הקודונים נדירים יכולים להיות משוחזרים על ידי האכלה או הפקות יתר של חומצות האמינו המתאימות. תחת הנחה זו, מערכת בחירה או סינון לזיהוי מפיקי חומצות אמינו מוקמת על ידי החלפת הפחם המשותף של חומצות אמינו ממוקדות עם חלופות נדירות שלהם נרדף גנים עמידות לאנטיביוטיקה או את הגנים הצפנה או חלבונים כרומוגניים. אנו מראים כי ביטויי החלבון יכולים להיות מאוד מפריע בשילוב של הידרודונים נדירים וכי רמות החלבונים לתאם באופן חיובי עם ריכוזי חומצת אמינו. באמצעות מערכת זו, יצרני יתר של חומצות אמינו מרובות יכול להיות מוקרן בקלות מספריות מוטציה. האסטרטגיה הנדירה המבוססת על המחשב מחייבת רק גן אחד שהשתנה, והמארח פחות סביר להימלט מהבחירה מאשר בשיטות אחרות. הוא מציע גישה חלופית להשגת מפיקי יתר של חומצות אמינו.

Introduction

הייצור הנוכחי של חומצות אמינו מסתמך בכבדות על תסיסה. עם זאת, מגדל ותשואות עבור רוב חומצות אמינו זנים הייצור הם מתחת הדרישות העולות של שוק חומצות אמינו גלובלי כי הוא שווה מיליארדי דולרים1,2. קבלת ביצועים גבוהים חומצת אמינו מפיקי הם קריטיים לשדרוג תעשיית חומצת האמינו.

אסטרטגיה מסורתית לזיהוי מפיקי חומצת אמינו מנצלת את התחרויות בין חומצות אמינו לבין האנלוגיות שלהם בסינתזה החלבונים3,4. אנלוגיות אלה מסוגלים לחייב את tRNAs כי להכיר את חומצות אמינו המקביל ובכך לעכב את elongations של רשתות פפטיד, המוביל הצמיחה נעצר או מוות התאים5. דרך אחת להתנגד הלחצים האנלוגיים היא להגביר את ריכוזי חומצות אמינו תאיים. חומצות האמינו המועשרת יתחרו את האנלוגיות עבור tRNAs הסופיים ויבטיחו את הסינתזה הנכונה של חלבונים פונקציונליים. לכן, זנים השורדים את האנלוגיות ניתן לבחור ונוטים להיות מפיקי היתר של חומצות האמינו המתאימות.

למרות שהוא הצליח להצליח בבחירת יצרני מיתר עבור חומצות אמינו כגון L-leucine6, האסטרטגיה מבוסס אנלוגי סובל מחסרונות חמורים. דאגה אחת גדולה היא ההתנגדות האנלוגית מקורו בתהליך של מוטגנזה או באמצעות מוטציות ספונטניות. זנים עם התנגדות יכול להימלט מהבחירה על ידי חסימת, ייצוא, או משפיל את האנלוגיות5. דאגה נוספת היא תופעות הלוואי הרעילות של האנלוגיות על תהליכים סלולריים אחרים7. כתוצאה מכך, זנים השורדים את הבחירה האנלוגית לא יכול להיות חומצות אמינו overproducers, בעוד מפיקי יתר הרצוי יכול להיות מושמד בטעות בשל תופעות לוואי שליליות.

כאן, אסטרטגיה הרומן המבוססת על החוק של קודון הטיה מוצגת על מנת להשיג זהויות מדויקות ומהירה של מפיקים יתר של חומצות אמינו. חומצות אמינו רוב מקודדים על ידי יותר מאשר שלישיה נוקלאוטיד אחד כי הוא המועדף באופן שונה על ידי אורגניזמים המארחים8,9. מספר משתמשים מסוימים משמשים לעתים רחוקות ברצפי הקידוד ומכונים הקודונים נדירים. התרגומים שלהם לתוך חומצות אמינו מסתמכים על trnas קנצוני לשאת את חומצות האמינו המתאימות. עם זאת, tRNAs המכירים בקודונים נדירים יש בדרך כלל הרבה יותר מחולות מאשר tRNAs של הקודונים המשותפים10,11. כתוצאה מכך, tRNAs נדירים אלה פחות סביר ללכוד את חומצות האמינו חינם בתחרויות עם איזוזמינים אחרים, ותרגומים של הרצפים נדיר-codon-עשיר מתחילים להאט או אפילו מסתיימים כאשר כמויות של חומצות אמינו מוגבלות 10. התרגומים יכולים, תיאורטית, להיות משוחזר אם יש עודף חומצת אמינו לאחר הטענת tRNAs משותף נרדף בשל הפקות יתר או ההאכלה נוספת של חומצות אמינו המקביל12. אם הגנטי נדיר-codon-עשיר מקודד בחירה או סמן ההקרנה, זנים המציגות פנוטיפים המתאימים יכול להיות מזוהה בקלות וכנראה המפיקים יתר של חומצות אמינו ממוקדות.

האסטרטגיה הנ ל מיושמת על מנת ליצור מבחר ומערכת הקרנה לזיהוי מפיקי יתר של חומצות אמינו. מערכת הבחירה משתמשת גנים עמידות לאנטיביוטיקה (g., KanR) כמו סמנים בעוד מערכת ההקרנה משתמשת הגנים הקידוד פלורסנט (למשל, חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) או כרומוגניים (למשל, פראנצרסגול) חלבונים. הגנים סמן בשתי המערכות משתנים על ידי החלפת מספרים מוגדרים של הקודונים המשותפים עבור חומצת האמינו הממוקדת עם חלופה נדירה נרדפת. זנים בספריית מוטציה כי הנמל הגן נדיר-codon-עשיר סמן בחרו או הוקרן בתנאים הנכונים, ואת מפיקי היתר של חומצות אמינו ממוקדות ניתן לזהות בקלות. זרימת העבודה מתחילה עם בניית מערכת גנטית נדיר codon-עשיר סמן, ואחריו אופטימיזציה של תנאי עבודה, ולאחר מכן זיהוי ואימות של חומצות אמינו מפיקים יתר. זו אסטרטגיה בלתי תלויה אנלוגי מבוסס על הדוגמה בתרגום חלבונים ומאומת למעשה כדי לאפשר זהויות מדויקות ומהירה של מפיקי חומצות אמינו. תיאורטית, זה יכול להיות מועסק ישירות עם חומצות אמינו עם מיקרודונים נדירים ועל כל המיקרואורגניזמים. בסך הכל, האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס ישמש חלופה יעילה לגישה המקובלת מבוססי אנלוגי כאשר אנלוגי הנכון עבור חומצות אמינו ספציפיות אינן זמינות, או כאשר שיעור חיובי שווא גבוה הוא הדאגה העיקרית. הפרוטוקול שלהלן משתמש לאוצין נדיר קודון להפגין את האסטרטגיה הזאת בזיהוי es, coli קולי L-לאוצין מפיקי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הקמת הפלמידים המבטאים את הגנים הנדירים של הסמן

  1. בחרו גן סימון המכיל מספר מתאים של הקודונים המשותפים לחומצת האמינו הממוקדת.
    הערה: עבור L-לאוצין, הקנאמיצין התנגדות גן , אשר מכיל 29 לוקיונים, שמהם 27 הם משמשים משותפים, משמש לבניית מערכת הבחירה13. הגן gfp , אשר מכיל 17 הגנודונים משותפים מתוך 19 לאוצין לוקיונים, או סגול חלבון קידוד הגנים פראנצרסגול (ppg), אשר הנמלים 14 לאוצין משותף, משמש עבור מערכת ההקרנה (טבלה משלימה 1 ).
  2. החלף את הקודונים המשותפים בגנים הסמן עם הקודון הנדיר הנרדף. עבור L-leucine, להחליף את הקשר שלה ב- kan, gfp, או ppg עם codons נדיר cta, יצירת קןr-rcs, gfp-rc, או ppg-rc, בהתאמה13 ( טבלה משלימה 1).
    הערה: תדירות הקודון הנדירה בגנים הסמן תשפיע על הצפיפות של מערכת הבחירה או ההקרנה. באופן כללי, הגדלת מספר הקודונים הנדירים תגדיל את הדרך של מערכת הבחירה או ההקרנה. כדי להשיג את הבחירה המתאימה או חוזק ההקרנה, לעצב סדרה של גנים סמן כי הנמל מספרים שונים של הקוטדונים נדירים להשוות את ההשפעות שלהם.
  3. ליצור אבני בניין של גנים נדירים-codon עשיר סמן באמצעות כלים כגון גנדיזיין14 (http://54.235.254.95/gd/) עבור סינתזה גנטית. לחלופין, להזמין את הגנים סמן מסחרי שירותי סינתזה הגנים.
    1. בדף ' עיצוב גננט ', בחר באפשרות ' עיצוב אבני בניין ' (חפיפה באורך קבוע).
    2. הדבק את רצפי הגנים הנדירים של הסמן בתיבת הרצף .
    3. הגדירו את אורך החפיפה בין ההרכבה. זכור כי ברירת המחדל 40 bp עובד בסדר עבור רוב רצפים.
      הערה: עיין במדריך המקוון לקבלת הוראות נוספות לגבי ההגדרות של הפרמטרים האחרים.
    4. לחץ על הלחצן אבני בניין עיצוב ולהזמין את האוליונואודים המפורטים בדף.
  4. לסנתז את הגנים נדירים-codon-שונה על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססי סינתזה מדויקת15.
  5. Ligate הנדיר-codon-עשיר קאןR-rc לחיות מחמד וקטור-28a, Gfp-rc ל pSB1C3, ו -ppg-rc ל cpb-37-44116.
    הערה: מפות pET-28a ו-pSB1C3 הינם זמינים במסד הנתונים המקוון SnapGene (טבלה משלימה 1); מפת ה-CPB-37-441 פלאמיד הינה זמינה באתר האינטרנט של החלבון כרומוגניים.
    1. על הקרח, להוסיף את הווקטור ואת שברי סמן ביחס טוחנת של 1:1 כדי 7.5 μL של ערבוב ההרכבה (ראה טבלת חומרים) לנפח כולל של 10 μl. מודאת הדגימה ב50. מעלות צלזיוס לשעה אחת
    2. המרה 5 μL של מוצר ההרכבה לתוך 50 μL של תאים מוכשרים (ראה את הטבלה של חומרים) ב 42 ° c עבור 30 s.
    3. לשחזר את התאים SOC (ציר מיטבי במיוחד עם דיכוי catabolite) בינוני ב 37 ° צ' עבור 1 h, צלחת אותם ב-LB (ציר לילה) אגר בינוני, ו הדגירה אותם ב 37 ° c ללילה.
    4. איחסן את המושבה לתוך מדיום LB ו-דגירה ב 37 ° c עבור 8 h.
    5. בודד את הפלביניים באמצעות ערכת מסחרית מועדפת.

2. מיטוב תנאי הבחירה

  1. הפוך את זן האב המשמש עבור מוטגנזה לתאים מוכשרים17.
  2. לשנות את 50 μl של התאים המוסמכים עם 1 μl של פלאבין כי נושאת את הסוג הפראי קאןr, ולהפוך קבוצה נוספת של התאים המוסמכים עם הפלס1 המכיל את קןr-RC29 עם כל האוצין קודון הוחלף על ידי נדיר .
  3. הוסף 950 μL של SOC בינונית ו-דגירה את המדגם ב שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עבור 1 h.
  4. צלחת 100 μL של התרבות התא על LB אגר בינונית המכיל 50 μg · mL-1 kanamycin, ו מודקת אותו ב 37 ° צ' עבור כ 8 h עד המושבות מופיעות.
  5. לבחור את המושבות כי הנמל הפראי סוג של קן ולאוצין נדיר-Codon-עשיר kanR-RC29 ולהשתמש בכל החיסונים 5 מ ל של חמישה מדולל בינונית LB (0.2 x Lb) המכיל 50 μg · mL-1 kanamycin. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.
    הערה: המדיום הינו חיוני עבור מערכת הבחירה. זה צריך להכיל רק פחמן מספיק חנקן כדי לאפשר ביטוי של חלבון עמידות לאנטיביוטיקה מן הגנים מסוג פראי ולא מן הנגזרים נדירים השתנה-codon. במקרה זה, הריכוז L-leucine ב-1x ליברות בינונית הוא גבוה מדי כדי לעכב לחלוטין את ביטוי החלבון מן הנדיר-codon-עשיר-האור. לפיכך, מדיום LB מדולל עם גורם דילול כגון 5 משמש כדי ליצור הבדל ברור ביטויי חלבון מסוג פראי ואת נדיר codon-עשיר גנים.
  6. העברת 200 μL של כל אחת מתרבויות התא לצלחת 96-באר בטריליטה בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 8 h, 16 h, ו 24 שעות). למדוד את OD600 (צפיפות אופטית ב 600 nm) באמצעות קורא צלחת.
    הערה: אם ירידה בתא OD600 לא ניתן לזהות עבור זנים מחסה את הגנים נדירים-קודון-עשיר סמן בהשוואה ל-OD600 של המתח מחסה גנים סמן בסוג פראי, לנסות להגדיל את כמות קודון נדיר ב סמן גנים או להשתמש בינוני מדולל יותר.
  7. לבצע את שיטת האכלה חומצות אמינו כדי לבדוק אם הביטויים של הגנים נדיר-codon עשיר סמן (g., KanR-RC29) ניתן לשחזר על ידי הגברת הריכוז של חומצות אמינו ממוקדות.
    הערה: לבחירת מפיקי היתר של L-leucine, L-leucine משמש להזנה.
    1. איחסן את הזנים מחסה לג R-RC29 סמן גן לתוך 5 מ ל של 0.2 x LB (המכיל 50 μg · mL-1 kanamycin) עם או בלי האספקה של 1 גרם · . א-ל-לאוצין האיחסן אחר 5 מ ל של 0.2 x LB עם זנים כי הנמל הפראי בסוג קןR כמו בקרה. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.
    2. למדוד את OD600 עבור כל תרבות בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 15 h, 17 h, 19 h, ו -22 שעות).

3. מיטוב תנאי ההקרנה

  1. המרה 50 μL של זן האב משמש עבור מוטזיס עם 1 μL של פלאבין (~ 50 ng מסוג · μL-1) שנושאת את הסוג הפראי של gfp או את הפראי- ppg. כמו כן, לשנות את המתח ההורה עם הנגזרים נדירים העשירים של הגנים סמן.
  2. הוסף 950 μL של SOC בינונית ו-דגירה את המדגם ב שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עבור 1 h.
  3. צלחת 100 μL של תרבות התא על ליברות אגר בינונית המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה (25 μg · mL-1 כלוראמניול עבור gfp בעלי מרקר בגובה cmR , או 50 μg · ml-1 kanamycin עבור ppg פלסמיד לשאת את הסמן KanR ) ו הדגירה לילה ב 37 ° c.
  4. בחר מושבה אחת כי הנמלים מסוג פראי gfp או ppg ומושבה אחת כי הנמלים המקבילה המקביל נדיר codon-עשיר, ולהעביר אותם 5 מ ל של מדיום מדולל כראוי LB בנפרד. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.
    הערה: עבור ה-E. coli זנים מחסה לאוצין נדיר-codon-עשיר gfp-rc או ppg-rc, בינונית ליברות הולות דולל (1x lb) ניתן להשתמש כדי ליצור הבדלים משמעותיים בביטויים של סוג פראי ו-נדיר codon-עשיר סמן גנים. גם, inducible יזמים משמשים לכונן את הביטויים של גנים סמן ההקרנה. התחילו בגיוס כאשר התאים מזינים את השלב האקספוננציאלי כדי להשיג מבדיל טוב יותר.
  5. עבור סמנים פלואורסצנט, העבר 200 μl של כל אחת מתרבויות התא לתוך 96-באר שחור התחתית ברורה בטריפליכאט בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 2 h, 4 h, ו 6 h). למדוד את OD600 ואת הזריחה ולחשב את עוצמת הקרינה (היחס של הזריחה כדי OD600). לסמני כרומוגניים, מדדו את פיתוח הצבע של תרביות התא.
    הערה: אם עוצמות נמוכות יותר של כוונות זריחה לא ניתן לזהות עבור זנים מחסה gfp-RC בהשוואה לזה של זנים מחסה gfpמסוג פראי, או אם צבע בהיר לא ניתן לזהות עבור תאים המבטאים את החלבון הסגול מ -ppg-RC מאשר מהגן פראי סוג, לנסות להגדיל את מספר קודון נדיר על הגנים סמן או להשתמש בינוני מדולל יותר.
  6. בצע את שיטת ההזנה (ראה שלבים 2.7.1 ו-2.7.2). למדוד את עוצמת הקרינה או את התפתחות הצבע בנקודות זמן מוגדרות (למשל, 12 h, 18 h, ו 24 h).

4. זיהוי מפיקי היתר של חומצת אמינו

  1. איחסן 100 μL של התרבות של המוטציות לתוך 5 מ ל ליברות (2% v/v) ו-דגירה אותו שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עד הערכים של OD600 להגיע 0.4.
  2. להפוך את המוטציות. לתאים מוכשרים17
  3. שינוי 50 μL של תאים מוטציה עם 1 μL של הפלבאמצע (~ 50 ng · μL-1) נושאת את סמן בחירה kanR-RC29 או סמנים ההקרנה gfp-rc או ppg-rc. הוסף 950 μL של SOC בינוני וסובב את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס שייקר עבור 1 h.
  4. בחר מפיקי יתר של חומצות אמינו.
    1. צנטריפוגה את תרבות התא ב 4,000 x g עבור 5 דקות, למחוק את supernatant ולהוסיף 5 מ ל של 0.2 x ליברות בינונית המכילה 50 μg · mL-1 kanamycin. מודטה את המדגם ב 37 ° c שייקר לילה.
    2. צלחת התרבות לילה (למשל, 100 μL, תלוי בצפיפות התא של התרבות) על 0.2 x LB אגר בינונית המכילה 50 μg · mL-1 kanamycin ו מארג ב 37 ° צ' עבור 12 h.
      הערה: המושבות שפותחו הן המועמדים של מפיקי חומצת אמינו ממוקדות ובמקרה זה, מפיקי היתר של L-leucine.
  5. . להקרין את מפיקי חומצת האמינו
    1. צלחת את המספר המתאים של תאים (למשל, 100 μL) מחסה את סמן ההקרנה (כמתואר בשלב 4.3) אל ליברות אגר בינונית המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה (25 μg · mL-1 כלוראמניול עבור הקרנה עם GFP-RC ו 50 μg · ml -1 kanamycin עבור הקרנה עם ppg-RC) ו-הדגירה ב 37 ° c עבור 8 h.
    2. איחסן את המדיום LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (ראה שלב 4.5.1) עם כל מושבה אחת מן הצלחת. מודאת דגימות בשייקר ב 250 rpm ב 37 ° c.
    3. למדוד את OD600 ואת הזריחה ולחשב את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית אם GFP-RC משמש. מדדו את פיתוח הצבע של תרביות התא אם נעשה שימוש ב -ppg-RC . שימו לב כי זנים המציגות את עוצמת הזריחה גבוהה יותר או צבע עמוק יותר מאשר זה של זן האב הם חומצות אמינו המועמד מפיקים יתר, במקרה זה, מפיקי היתר L-leucine.
      הערה: מיון התא המופעל על-ידי הקרינה הפלואורסצנטית מתאים גם לזיהוי מפיקים בעלי תא בודד, כאשר הגנים של חלבון הפלורסנט הנדירים משמשים להקרנה.
  6. ודאו שחומצות האמינו מיצרניות. את הזנים של המועמדים
    1. האיחסן 5 מ ל של LB בינונית עם כל אחד מזני המועמדים ולתת לתאים לצמוח לילה בשייקר ב 250 סל ד ב 37 ° c.
    2. לקצור את התאים מ-1 מ ל של תרבות התא על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g עבור 2 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את הגלולה עם 1 מ ל של מים סטריליים.
    3. האיחסן 20 מ ל של M9 בינונית המכילה 4% גלוקוז עם 200 μL של ההשעיה התא ו דגירה ב 250 mL שייקר ב 250 rpm ב 37 ° צ' עבור 24 h.
    4. צנטריפוגה 1 מ ל של מדיום התרבות ב 4,000 x g עבור 5 דקות. העברה 200 μl של סופרנטנט לצינור 1.5 נקי ממדי. הכנת פתרונות L-leucine (כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים) של 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 ו-1 g · . אני-1 כסטנדרט
    5. הוסף 100 μL של 1 מ"מ triethylamine ו 100 μL של 1 מ ' פניקסיל isothiocyanate אל supernatant ואת הסטנדרטים, לערבב אותם בעדינות, ו מקרין אותם בטמפרטורת החדר עבור 1 h18.
      התראה: Triethyine ו פנאיל isothiocyanate יכול לגרום כוויות עור חמורות נזק העין והוא מזיק אם שאפה. לבש כפפות ומסכה, ואם אפשר, בצע את השלב הזה בתוך מכסה המנוע.
    6. הוסף 400 μl של n-הקסאן לאותה צינורית ומערבולת אותו עבור 10 s. לסנן את השלב התחתון המכיל את נגזרות חומצות אמינו באמצעות קרום 0.2 יקרומטר polyטטראואתילן.
      התראה: n-הקסאן יכול לגרום לגירוי בעור. לבש כפפות וביגוד מגן. אם זה בא במגע עם העור, לשטוף את העור עם הרבה מים.
    7. הכנת השלב הנייד A על ידי ערבוב 0.1 M נתרן אצטט (pH 6.5) ו acetonitrile ב 99.3:0.7 יחס נפחי. הכינו את הצ (80% v/v) כשלב נייד B. מסנן את כל השלבים הניידים באמצעות ממברנות הפוליציטיאואתילן של 0.2 יקרומטר.
      התראה: Acetonitrile מזיק אם השאיפה והוא יכול לגרום גירויים בעור ובעיניים. לבש כפפות וביגוד מגן ובצע את הצעד הזה בתוך מכסה המנוע.
    8. הפעל 1 μL של המדגם על בדיקת אולטרה מצויד בעמודה סי18 בהתאם לתוכנית להתחמק בטבלה 1 עם קצב הזרימה של 0.42 mL · min-1 וטמפרטורת עמודה של 40 ° c. לזהות את חומצות אמינו ממוקדות ב 254 ננומטר עם גלאי מערך דיודה ולחשב ריכוזים שלהם על ידי מיפוי אזורי שיא לעיקול רגיל.
זמן (מזערי) שלב נייד A (%) שלב נייד B (%)
0 98 2
3.5 70 30
7 43 57
7.1 0 100
11 98 2

שולחן 1: תוכנית הימנעות עבור כימות של חומצות אמינו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עבור מערכת הבחירה, ירידה חדה ב-OD600 עבור זנים מעניקה נדיר-codon-עשיר עמידות לאנטיביוטיקה הגן צריך להיות נצפתה בהשוואה למתח מחסה את הגן מסוג פראי התנגדות לאנטיביוטיקה כאשר תרבותי בצורה מתאימה בינונית (איור 1a). תחת אותם התנאים, הירידה בתא OD600 הופך להיות ברור יותר כמו מספר של הפחם נדיר ב עמידות לאנטיביוטיקה הגנים מגביר (איור 1a). יש לציין כי עיכוב של התבטאויות נדירות על ביטויי חלבון מתרחש בעיקר תחת תנאים מורעבים. לכן, אם בינונית LB לא מדולל כראוי, אין ירידה משמעותית בתא OD600 יהיה לצפות את המתח מעניקה את גן נדיר codon-עשיר סמן בהשוואה לזן מחסה הגן מסוג פראי (איור 1b). לאחר האכלה נוספת של החומצה האמינית המקבילה, OD600 עבור המתח הנותן מחסה הגנטי נדיר codon-עשיר עמידות לאנטיביוטיקה יגדל באופן משמעותי וגישה זה של המתח מחסה גן פראי סוג (איור 1c).

Figure 1
איור 1: ההשפעות של קודון נדיר על הביטויים של גנים סמן המשמש את הבחירה ואת מערכות ההקרנה. (א) התא OD600 עבור זנים E. coli מחסה הגן עמידות לאנטיביוטיקה (kanR) עם 6, 16, 26, ו -29 לאוצין נדיר-CODON (RC6, RC16, RC26, ו RC29) החלפת לאחר 5 h של דגירה. (ב) התא OD600 עבור זן E. coli מחסה את הפראי (WT) ואת נדיר codon-העשיר של קן ( RC ) ב 1X, 0.5 x, ו-0.2 x ליברות מדיה לאחר 5 h של דגירה. (ג) השפעות של האכלה L-לאוצין על צמיחת התאים של E. coli זנים מעניקה ללוצין נדיר-codon-עשיר קאןR גן לאחר 5 שעות של דגירה. הערכים וקווי השגיאה מייצגים את הממוצע ואת ה-SD (n = 6). האכלה של L-leucine הגדילה באופן משמעותי את OD600 עבור תאים הנותנים מחסה הנדיר-codon-העשירים קן. החריג היחיד היה עבור האכלה של 2 גרם · L-1 l-לאוצין בשל SD גבוה ב-OD600 עבור טיפול האכלה. (ד) ההשפעות של נדיר-codon ו-L-לאוצין האכלה על הבעות gfp מסוג פראי (WT) ו לאוצין נדיר-codon-עשיר (RC) גנים לאחר 16 h של דגירה. האכלה של 0.5 – 2 L-1 l-לאוצין הגדילה באופן משמעותי את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית עבור תאים מחסה נדיר-codon-עשיר העשירים . הערכים וקווי השגיאה מייצגים את הממוצע ואת ה-SD (n = 3). * *P < 0.01, * * *p < 0.001 כפי שנקבע על ידי דו מבחן t-זנבית, ורק התוצאות המשמעותיות ביותר הוצגו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

עבור מערכת ההקרנה, עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ומספר תאי פלורסנט יהיה נמוך באופן משמעותי עבור זן המבטא את חלבון הפלורסנט מן הגנים נדירים-codon-עשיר מאשר מן הגן מסוג פראי (איור 1d ו איור 2). כאשר משתמשים בחלבון הסגול, הצבע שפותח מתוך ppg נדיר-עשיר, צריך להיות בהיר יותר מהגן מסוג פראי כאשר מבוטא תחת אותם תנאים לאותה תקופת דגירה (איור 3). האכלה של חומצת האמינו המתאימה תשחזר את ביטויי החלבון מהגנים הנדירים והעשירים ביותר. עבור זנים מעניקה מחסה נדירים codon-עשיר gfp, את עוצמת הקרינה (איור 1d) ואת מספר תאי פלורסנט (איור 2) צריך להגדיל באופן משמעותי וגישה זה של זנים המכילים את הפראי סוג gfp . כאשר ליברות ללא מדולל משמש, חומצות האמינו במדיום יהיה מספיק כדי לאפשר ביטוי איטי של- ppg נדיר-codon עשיר גם ללא האכלה נוספת L-leucine, ואת חלבון סגול ביטא יהפוך להיות גלוי לאחר התאים הם מפלטד ( איור 3). עם זאת, זה לא להסתיר את העובדה כי הביטוי הגנטי מן הנדיר codon-עשיר ppg היה משופר באופן דרמטי על ידי האכלה של L-leucine 2 גרם · L-1, במיוחד כאשר נצפתה בתרבות הנוזלית (איור 3). לכן, התרבות הנוזלית היא בחירה טובה יותר עבור הקרנה על בסיס חלבונים כרומוגניים, והשימוש של מדיום LB מדולל יביא הבדל משמעותי יותר בין פנוטיפים המושרה על ידי סוג פראי ואת הגנים נדיר-codon-עשיר.

Figure 2
איור 2: מספר התאים של פלורסנט E. coli הנמל הפראי-סוג gfp או לאוצין נדיר codon-עשיר gfp (gfp-RC) לאחר התוספת של L-לאוצין. תאים היו מתורבתים בינונית 1x ליברות. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: פיתוח צבע עבור תאים מחסה את פראי סוג (WT) ואת לאוצין נדיר-codon-עשיר (RC) ppg גנים לקודד חלבון סגול ב 1x LB בינונית (הפאנל השמאלי) ואת ההשפעה של L-לאוצין האכלה על תרבות התא פיתוח צבע ( לוח הימני). הגנים ppg המושרה כאשר התאים נכנסו לשלב האקספוננציאלי ואת התמונות נלכדו 3 h לאחר האינדוקציה. ה-L-leucine התווסף למדיום יחד עם הסליל בתוך שיטת האכלה. העיגולים הצבעוניים נוצרו על ידי בחירת הצבעים של תרביות תאים וכדורי התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס מסוגל לזהות מפיקי יתר של חומצות אמינו ממוקדות מספריית מוטציה, ומוטציות אלה צריכים לייצר כמויות גבוהות יותר של חומצות אמינו ממוקדות מאשר זנים ההורה (איור 4).

Figure 4
איור 4: חומצות אמינו המיוצר על ידי סוג פראי וזנים מוטציה שזוהו על ידי האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס. (א) הפקות לאוצין של החיידק של E. coli מזוהה מספריות מוטציה על ידי kanR-RC29 (el-1 אל-5) ו -gfp-RC כי הנמלים 29 ו 19 לאוצין נדיר (el-6 אל 10), בהתאמה. (ב) L-ארגינין הפקות של glutamicum זנים של corynebacterium שנבחרו על ידי נדיר-codon-עשיר , הכיל שמונה מקורין נדיר (agg). הגן סמן הוצג לתוך הספריות המוטציה C. glutamicum נגזר זן פראי ATCC13032. בינונית הבחירה היתה 0.3 x CGIII שסופקו עם 25 μg · mL-1 kanamycin. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר המקורות הנדירים בגנים הסמן והבחירה או הסינון הם קריטיים לעכב את ביטויי החלבון מהגנים הנדירים של הסמן השונה-codons. אם לא ניתן לזהות הבדל משמעותי בין ביטויי חלבון מן הגנים סמן פראי ונגזרות שלהם, הגדלת מספר החומרים הנדירים או שימוש במדיום מוגבלת מזינים עשוי להגביר את ההבדלים. עם זאת, אם אפקט העיכוב חזק מדי, לא ניתן לשחזר את ביטויי החלבון גם על ידי האכלה נוספת של חומצות האמינו המתאימות. במקרה זה, מספר הדונים נדירים בגנים סמן צריך להיות מופחת כדי להקל על חלק מהלחץ. דרך נוספת לכוונן את הבחירה או הסינון היא לכוונן את מספרי העותקים ואת רמות הביטוי של הגנים הנדירים של הסמן העשיר. הפחתת מספר ההעתקה ואת רמות הביטוי של הגנים סמן בדרך כלל מוביל החלקה חזקה יותר בין מפיקי חומצות אמינו מפיקים הראשונית זנים. לכן, יש להשתמש בווקטורים המכילים את מקורות השכפול של מספרי העותקים הנמוכים כגון p15A או pSC101, כמו גם יזמים חלשים. אם הגן סמן מונע על ידי מקדם inducible, אינדוקציה נמוכה מומלץ.

האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס על הבחירה או ההקרנה של מפיקי חומצות אמינו מפיקים הוא הסתגלות הפוכה של האסטרטגיה בשימוש נפוץ של "codon אופטימיזציה", אשר מטרתו להקל על ביטויים של חלבונים אקסוגני. ב מיטוב קודון, הדונים נדירים על הגנים ממוקדות מוחלפים אלה משותף נרדף ביחס למארח; כך, הגנים של אורגניזמים אחרים יכול להיות מתורגם במהירות רבה יותר לתוך חלבונים מאשר אלה גנים אקסוגני עם בממדים גבוהים של codons נדירים19. לכן, סביר להניח כי "מיטוב הפוך", אשר מחליף את הקודונים המשותפים לאלה נדירים שלהם נרדף, צריך לעכב את הביטויים הגנים. עם זאת, את הביטויים גנים יש לשחזר על ידי טעינה משופרת של tRNAs נדיר המתאים כאשר חומצות אמינו ממוקדות לצבור intracellularly. השילוב של הקודונים נדירים מגביר את הסף של הריכוז חומצת אמינו בביטויי חלבון, אשר מציעה אסטרטגיה פוטנציאלית לבחור או מסך עבור מפיקי חומצות אמינו כאשר בשילוב עם הגנים סמן הנכון.

מלבד הגנים עמידות לאנטיביוטיקה, הגנים חלבון פלורסנט, ואת הגנים חלבון כרומוגניים המשמשים בפרוטוקול, גנים סמן שונים יכול להיות מועסק כדי לבסס את נדיר-codon מבוססי בחירה או מערכת הקרנה. למשל, גנים קטלניים כגון Tolc20 ו- sacb21 יכול לשמש כדי לבחור מפיקי יתר של חומצות אמינו. במקרה זה, לדונים משותפים על הגנים השייכים למערכת הנוגדן צריך להיות מוחלף על ידי הפחם נדיר נרדף חומצות אמינו ממוקדות. זנים כי יתר לייצר את חומצות אמינו ממוקדות מסוגלים להשיק את מערכת הנוגדן, ובכך, לשרוד את ההשפעות הרעילות הנגרמת על ידי הגנים הקטלניים.

יש לציין כי תופעות לוואי עלולות להתרחש בעת שימוש בכמויות גבוהות של חומצות אמינו בתוך שיטת ההזנה. זאת משום שחומצות אמינו מסוימות רעילות למיקרואורגניזמים. למשל, ריכוז של סביב 100 מ"ג · L-1 עבור l-סרין מסוגל לעכב את הצמיחה של E. coli22. עם זאת, למרות שנמוך מזה של הגן מסוג פראי, מצאנו כי האכלה עד 2 גרם · L-1 l-סרין עדיין יכול לשחזר את הביטויים של גנים עמידות לאנטיביוטיקה כי עשיר סרין קודון נדיר13. לפיכך, רעילות חומצת האמינו, לפחות עבור ל-סרין, לא תסכן את האמינות של שיטת ההזנה. כדי להתגבר על ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של רעילות חומצות אמינו על המוצרים של זנים ממוקדים, אסטרטגיות כגון מוטגנזה אקראית ושיפור של הייצוא חומצות אמינו23 יכול להיות מיושם. למעשה, השיטה נדירה-codon מבוסס מתאים לזיהוי זנים עמידים מסוגלים לשאת או לייצר יתר חומצות אמינו מעל רמות רעילות. מוטציות מפתח המקנים עמידות חומצות אמינו יכול להיות מזוהה והוכנסו לתוך זנים ממוקדים, אשר יהיו מארחים אידיאלי עבור מבנים של חומצות אמינו מפיקים יתר.

הבחירה הנדירה המבוססת על מערכת הסינון או ההקרנה מבטיחה אמינות גבוהה. במילים אחרות, זנים המזוהים על ידי המערכת אמורים להיות מפיקי היתר של חומצות אמינו ממוקדות. עם זאת, במקרים מסוימים, המועמדים ששרדו את הבחירה אנטיביוטי לא יכול לייצר כמויות גבוהות יותר של חומצות אמינו ממוקדות מאשר זן האב. זה יכול להיות מיוחס עמידות לאנטיביוטיקה שנרכשו על ידי זנים דרך מוטגנזה ולאחר מכן הפסד של בחירת פלבאמצע24. כתוצאה מכך, זנים ללא הפקות חומצות אמינו משופרות יכול לשרוד את הלחץ אנטיביוטי לברוח הבחירה. אלה זנים חיוביים שווא יכול להיות מסולק על ידי הוספת סמן בחירה נוספת לתוך פלבאמצע הבחירה, כגון גן פראי מסוג כי התנגדות לאנטיביוטיקה אחרת. זנים שאיבדו את הפלבאמצע בחירה פחות סביר לקבל עמידות כפול לשני אנטיביוטיקה ויושמדו במהלך הבחירה.

מוטציות המזוהים על ידי מערכת נדירה-codon מבוסס צריך להיות מסוגל יתר על המידה חומצות אמינו ממוקדות בהשוואה זנים ראשוניים. עם זאת, חומצות אמינו היצרניות עבור זנים שנבחרו עשוי עדיין להיות נמוך יותר מאשר הדרישות התעשייתיות. זה לא מציע כישלון של האסטרטגיה נדירה-מבוססת מבוסס כמו הופעות המתח אינן תלויות בבחירה או תהליך ההקרנה, אבל תלוי בגורמים כגון המאפיינים של הנבג הראשוני, הגישה של מוטזיס, הגודל של ה ספריית המוטציות ותנאי התסיסה. כדי להשיג זנים בעלי ייצור גבוה, יש לשלם לאסטרטגיות של הנדסת מתח, כגון על-ידי מוטגנזה אקראית או באמצעות תכנון רציונלי של מסלולים ביולוגיים מסוג חומצת אמינו. שילוב האבולוציה מעבדה אדפטיבית נדיר-codon מבוסס אסטרטגיה יהיה להקל על קבלת מפיקים יתר של חומצות אמינו.

המטיוצין והטריפטופן אינם כוללים מקוונים חלופיים בין 20 חומצות האמינו הפרוטגניות. לכן, אסטרטגיה זו אינה יכולה להיות מועסק ישירות על חומצות אמינו אלה. פתרון אפשרי אחד הוא להשתמש tRNAs מהונדסים כי הם מסוגלים לזהות את הקטדונים לעצור לשאת חומצות אמינו אלה. לפיכך, הקולדונים המקבילים יכולים להיות מאומצים כמו הקודונים המלאכותיים הנדירים של חומצות אמינו אלה25,26.

אחד החסרונות הגדולים ביותר לגבי האסטרטגיה האנלוגית מבוססי אנלוגי עבור הבחירה של מפיקי חומצות אמינו גבוה שיעור חיובי שווא5,27. זנים העוברים דרך מוטגנזה יכולים בקלות לרכוש התנגדות כלפי מקבילים חומצת אמינו רעילים, והסובלנות יכולה אפילו להיות מועברת ללא סיוע של מוטגנים27. זנים אלה יכולים בקלות להימלט לחצים בחירה מן האנלוגית חומצות אמינו, וכתוצאה מכך, זנים שנבחרו הם בדרך כלל לא חומצות אמינו האמיתי מפיקים יתר אשר מאוד מקריב את היעילות של תהליך הבחירה.

לעומת זאת, האסטרטגיה הנדירה המבוססת על מבוססת האנלוגי מתחרה בשיטה האנלוגית המסורתית על-ידי הפעלת זהויות מדויקות ומהירות של יצרני מיתר של חומצות אמינו. לידיעתך, זוהי האסטרטגיה הראשונה שאמצת את החוק הטבעי של הטיה. הוא מסתמך רק על גן נדיר חד-codon-עשיר סמן, ולכן, מבטלת את השימוש של אנלוגיות רעילים. הגנים סמן בדרך כלל לא רעילים הזנים המארחים, ואת הביטויים חלבון מן נדיר-קודון-עשיר גנים תלויים בעיקר על ריכוזי תאיים של חומצות אמינו המקביל בגלל החוק האוניברסלי והקפדני של הטיית הטיה על פני כל המינים. זה ימנע את הזנים לברוח לחצים הבחירה. חוץ מזה, בשל המגוון הגדול של גנים סמן, האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס יכול להציע בחירות שונות הן הבחירה והן ההקרנה של מפיקי חומצות אמינו.

בשל התופעה האוניברסלית של הטיית הטיה בכל האורגניזמים החיים28, בחירה נדירה-קודון מבוסס או אסטרטגיית הקרנה יכול תיאורטית להיות מועסק למיקרואורגניזמים אחרים מלבד E. coli, במיוחד אלה עם התעשייה פוטנציאל. בעת שינוי למארח אחר, הבחירה של משתמשים נדירים לעצב את הגנים סמן צריך להיות מבוסס על תדרי השימוש codons ואת הריקודים של tRNAs המתאים עבור המארח הספציפי. המדיום המשמש לבחירה או להקרנה צריך גם להיות מיטבי בהתאם. דוגמא אחת היא ה -C glutamicum הנפוץ ביותר בfermentations חומצות אמינו. נדיר-codon-שונה קאןR גן המכיל שמונה ארגינין נדירים (agg) הוכח יעיל בבחירת C. glutamicum L-ארגינין מפיקים יתר על ידי מחקר הקודם13 (איור 4b). מחקרים של האסטרטגיה נדיר-codon מבוסס צריך להקל על מבנים והבנות של חומצות אמינו מפיקים יתר. מלבד חומצות אמינו, האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס יכול גם להיות מועסק עם isobutanol, 3-מתיל-1-butanol, 2-מתיל-1-butanol, ומוצרים אחרים החולקים את אותו מסלולים biosynthetic עם חומצות אמינו מסוימות29. זנים שזוהו על ידי סמן גנים כי הנמל הcodons נדירים של חומצות אמינו אלה מסוגלים לייצר את תרכובות קודמן, אשר יכול להיות מועבר לסינתזה של נגזרות חומצת אמינו. לכן, האסטרטגיה נדירה-codon מבוסס יכול לשמש כשיטה עקיפה אך מהירה כדי לשקף את הפוטנציאל של זנים בצבירת כימיקלים אלה או פנים או extracellularly. מוטציות מפתח כי מעניקה מוגבר חומצת אמינו הפקות מיצרני יתר שונים יכול להיות מזוהה על ידי רצף עמוק להיות הציג בנפרד או במקביל לתוך זנים תעשייתיים כדי לשפר עוד יותר את הפקות חומצות אמינו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

העבודה היתה נתמכת במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט no. 21676026), המפתח הלאומי R & D תוכנית של סין (להעניק no. 2017YFD0201400), ואת הקרן פוסט דוקטורט בסין (להעניק no. 2017M620643). עבודות במכון לקידום באוניברסיטת UCLA (סאזהאו) תמכו על ידי מענקים פנימיים מפרובינצית ג'יאנגסו ופארק התעשייה סאזהאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Thermo 51101
EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit Transgen EM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction Kit Transgen EG101-01
Gibson assembly master mix NEB E2611S
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Solarbio I8070
L-leucine Sigma L8000
Microplate reader Biotek Synergy 2
n-hexane Thermo H3061
Phenyl isothiocyanate Sigma P1034
PrancerPurple CPB-37-441 ATUM CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polymerase Transgen AP231-01
Triethylamine Sigma T0886
Ultra-high performance liquid chromatography Agilent 1290 Infinity II
Wild type C. glutamicum ATCC 13032
XL10-Gold E. coli competent cell Agilent 200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column Agilent 959759-902K

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
  2. Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
  3. Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).
  4. Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
  5. Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
  6. Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
  7. Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
  8. Crick, F. H. C. On the genetic code. Science. 139 (3554), 461-464 (1963).
  9. Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
  10. Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
  11. Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
  12. Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
  13. Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
  14. Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
  15. Xiong, A. -S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
  16. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  18. Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
  19. Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
  20. Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
  21. Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
  22. Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
  23. Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
  24. Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
  25. Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
  26. Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
  27. Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
  28. Hershberg, R., Petrov, D. A. Selection on codon bias. Annual Review of Genetics. 42, 287-299 (2008).
  29. Huo, Y. -X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).

Tags

ביוכימיה סוגיה 148 חומצת אמינו מפיקת יתר codon נדירים tRNA תרגום הקרנה בחירה חלבון פלורסנט חלבון כרומוגניים גנים עמידות לאנטיביוטיקה
זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-Codon-מסמנים עשירים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huo, Y. X., Zheng, B., Wang, N.,… More

Huo, Y. X., Zheng, B., Wang, N., Yang, Y., Liang, X., Ma, X. Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers. J. Vis. Exp. (148), e59331, doi:10.3791/59331 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter