Summary
Denne undersøgelse præsenterer en alternativ strategi for konventionel toksisk analog-baseret metode til at identificere aminosyre over producenter ved hjælp af sjældne-codon-rige markører for at opnå nøjagtighed, følsomhed, og høj gennemløb samtidigt.
Abstract
For at tilfredsstille det stadigt voksende marked for aminosyrer er der behov for højtydende produktions stammer. Aminosyren over producenter er konventionelt identificeret ved at udnytte de konkurrencer mellem aminosyrer og deres analoner. Men, denne analoge-baserede metode er af lav nøjagtighed, og korrekt analoner til specifikke aminosyrer er begrænset. Her præsenterer vi en alternativ strategi, der muliggør en nøjagtig, følsom og høj gennemløbs screening af aminosyre over producenter ved hjælp af sjældne-codon-rige markører. Denne strategi er inspireret af fænomenet codon skik bias i protein oversættelse, for hvilke kodon er kategoriseret i fælles eller sjældne dem baseret på deres frekvenser af forekomsten i kodning DNA. Oversættelsen af sjældne kodon afhænger af deres tilsvarende sjældne Transfer RNAs (trnas), som ikke kan oplades fuldt ud af de cognate aminosyrer under hungersnød. Teoretisk kan de sjældne tRNAs oplades, hvis der er et overskud af aminosyrer efter opladning af de synonyme fælles isoacceptorer. Derfor kan retarderede oversættelser forårsaget af sjældne kodon gendannes ved fodring eller intracellulære over produktioner af de tilsvarende aminosyrer. Under denne antagelse etableres et udvælgelses-eller screeningssystem til identificering af aminosyre overproducenter ved at erstatte de almindelige kodon af de målrettede aminosyrer med deres synonyme sjældne alternativer i antibiotikaresistensgener eller gener kodning af fluorescerende eller kromogene proteiner. Vi viser, at protein udtryk kan være stærkt hæmmet af inkorporering af sjældne kodon, og at niveauerne af proteiner korrelerer positivt med aminosyre koncentrationer. Ved hjælp af dette system, over producenter af flere aminosyrer kan let screenes ud fra mutation biblioteker. Denne sjældne-codon-baserede strategi kræver kun et enkelt modificeret gen, og værten er mindre tilbøjelige til at undslippe udvælgelsen end i andre metoder. Det tilbyder en alternativ tilgang til at opnå aminosyre over producenter.
Introduction
Den nuværende produktion af aminosyrer er stærkt afhængig af gæring. Men, titre og udbytter for de fleste aminosyre produktion stammer er under de stigende krav fra det globale aminosyre marked, der er værd milliarder af dollars1,2. Opnåelse af højtydende aminosyre over producenter er afgørende for opgraderingen af aminosyre industrien.
Traditionel strategi til at identificere aminosyre over producenter udnytter konkurrencer mellem aminosyrer og deres analogier i proteinsyntesen3,4. Disse analogerne er i stand til at oplade tRNAs, der genkender de tilsvarende aminosyrer og dermed hæmme forlængelsen af peptidkæder, fører til anholdt vækst eller celledød5. En måde at modstå de analoge belastninger er at øge koncentrationerne af intracellulære aminosyrer. De berigede aminosyrer vil udkonkurrere analoger til finite tRNAs og sikre den korrekte syntese af funktionelle proteiner. Derfor kan stammer, der overlever analoerne vælges og er sandsynligvis over producenter af de tilsvarende aminosyrer.
Selv om det viste sig at være vellykket at udvælge over producenter for aminosyrer som L-leucin6, lider den analoge-baserede strategi af alvorlige ulemper. Et stort problem er den analoge modstand stammer fra processen med mutagenese eller gennem spontane mutationer. Stammer med resistens kan undslippe udvælgelsen ved at blokere, eksportere eller nedværdigende analoner5. En anden bekymring er de giftige bivirkninger af analoerne på andre cellulære processer7. Som en konsekvens, stammer, der overlever den analoge udvælgelse kan ikke være aminosyren over producenter, mens de ønskede over producenter kunne være falsk udryddet på grund af de negative bivirkninger.
Her præsenteres en ny strategi baseret på loven om codon bias for at opnå nøjagtige og hurtige identifikationer af aminosyre over producenter. De fleste aminosyrer er kodet af mere end en nucleotid triplet, der er begunstiget forskelligt af værts organismerne 8,9. Nogle kodon bruges sjældent i kodning sekvenser og omtales som de sjældne kodon. Deres oversættelser til aminosyrer er afhængige af de cognate tRNAs, der bærer de tilsvarende aminosyrer. Men de trnas, der genkender sjældne kodon normalt har meget lavere mængder end trnas af de fælles kodon10,11. Derfor er disse sjældne tRNAs mindre tilbøjelige til at fange de frie aminosyrer i konkurrencerne med andre isoacceptorer, og oversættelser af de sjældne-codon-rige sekvenser begynder at aftage eller endda afsluttes, når mængderne af aminosyrer er begrænset 10. oversættelserne kunne teoretisk set genoprettes, hvis der er en aminosyre overskud efter opladning af de synonyme fælles tRNAs på grund af over produktioner eller ekstra fodring af de tilsvarende aminosyrer12. Hvis det sjældne-codon-rige gen koder et valg eller screening markør, kan stammer, der udviser de tilsvarende fænotyper, så let identificeres og er sandsynligvis over producenterne af de målrettede aminosyrer.
Ovennævnte strategi anvendes til at etablere en udvælgelse og et screening system til identifikation af aminosyre over producenter. Udvælgelsessystemet bruger antibiotikaresistensgener (f. eks. kanR) som markører, mens Screenings systemet bruger de gener, som koder fluorescerende (f. eks. grønt fluorescerende protein [gfp]) eller kromogene (f. eks. prancerpurple) proteiner. Markør generne i begge systemer ændres ved at erstatte definerede numre af de fælles kodon for den målrettede aminosyre med dens synonyme sjældne alternativ. Stammer i mutation biblioteket, der havnen den sjældne-codon-rige markør genet udvælges eller screenes under ordentlige forhold, og over producenter af de målrettede aminosyrer kan let identificeres. Arbejdsprocessen begynder med opførelsen af den sjældne-codon-rige markør gensystem, efterfulgt af optimering af arbejdsvilkårene, og derefter identifikation og verifikation af aminosyren over producenter. Denne analoge-uafhængige strategi er baseret på dogmet i protein oversættelse og er praktisk talt blevet verificeret for at muliggøre præcise og hurtige identifikationer af aminosyre over producenter. Teoretisk, det kunne være direkte ansat til aminosyrer med sjældne kodon og til alle mikroorganismer. I alt vil den sjældne-codon-baserede strategi tjene som et effektivt alternativ til den konventionelle analog-baserede tilgang, når passende analogier til specifikke aminosyrer er utilgængelige, eller når en høj falsk positiv sats er den største bekymring. Nedenstående protokol bruger leucin rare codon til at demonstrere denne strategi for at identificere over producenter af Escherichia coli L-leucin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. konstruktion af plasmider udtrykker de sjældne-codon-rige markørgener
- Vælg en markør gen, der indeholder et passende antal af de fælles kodon for den målrettede aminosyre.
Bemærk: for L-leucin anvendes kanamycin-resistens genet kanR, som indeholder 29 leucin codons, hvoraf 27 er almindeligt codons, til opførelse af udvælgelsessystemet13. Gfp -genet, som indeholder 17 almindelige kodon ud af 19 leucin kodon, eller det lilla protein-kodnings-gen prancerpurple (PPG), som huser 14 leucin Common kodon, anvendes til screening systemet (supplerende tabel 1 ). - Udskift de fælles kodon i markør generne med den synonyme sjældne codon. For L-leucin, erstatte dens kodon i kanR, gfp, eller PPG med den sjældne codon CTA, genererer kanR-RCS, gfp-RC, eller PPG-RC, henholdsvis13 ( Supplerende tabel 1).
Bemærk: hyppigheden af den sjældne codon i markørgener vil påvirke strenghed af udvælgelsen eller screening system. Generelt, øge antallet af sjældne kodon vil øge strenghed af udvælgelsen eller screening system. For at opnå passende udvælgelse eller screening styrke, designe en række markørgener, der Harbor forskellige antal sjældne kodon og sammenligne deres virkninger. - Generer byggeklodser af de sjældne-codon-rige markørgener ved hjælp af værktøjer som GeneDesign14 (http://54.235.254.95/GD/) til gensyntese. Alternativt kan du bestille markørgener fra kommercielle gensyntese tjenester.
- På siden GeneDesign vælger du Building Block design (konstant længde overlap).
- Indsæt sekvenser af de sjældne-codon-rige markørgener i sekvens boksen.
- Definer overlap længden mellem assembly oligos; Husk, at standard 40 BP fungerer fint for de fleste sekvenser.
Bemærk: Se online manualen for at få flere oplysninger om indstillingerne for de andre parametre. - Klik på knappen design byggeklodser , og Bestil de oligonukleotider, der er angivet på siden.
- Syntetisere de sjældne-codon-modificerede gener ved polymerase kædereaktion (PCR)-baseret nøjagtig syntese15.
- Ligate den sjældne-codon-rige kanR-RC til vektor pET-28a, Gfp-RC til PSB1C3, og ppg-RC til CPB-37-44116.
Bemærk: kortene pET-28a og pSB1C3 plasmid er tilgængelige på SnapGene online plasmid database (supplerende tabel 1); CPB-37-441 plasmid-kortet er tilgængeligt på webstedet for ATUM kromogene protein.- På isen tilsættes vektoren og markør fragmenterne i et molært forhold på 1:1 til 7,5 μL samle blanding (Se tabel over materialer) til et samlet volumen på 10 μl. Prøven inkubates ved 50 °C i 1 time.
- 5 μL af montage produktet omdannes til 50 μL af de kompetente celler (Se tabellen over materialer) ved 42 °c i 30 s.
- Gendan cellerne i SOC (Super optimal bouillon med katabolit undertrykkelse) medium ved 37 °C i 1 time, plade dem på LB (lysogeny bouillon) agar medium, og inkubere dem ved 37 °C natten over.
- Kolonien ind i LB-medium og inkubaterer ved 37 °C i 8 timer.
- Isoler plasmid ved hjælp af en foretrukken kommerciel kit.
2. optimering af udvælgelsesbetingelserne
- Gør den Stam stamme, der anvendes til mutagenese, til kompetente celler17.
- Omdanne 50 μL af de kompetente celler med 1 μL plasmid, der bærer vildtypen kanr, og omdanne et andet sæt af de kompetente celler med plasmid, der indeholder kanr-RC29 med alle leucin codon erstattet af den sjældne codon CTA.
- Der tilsættes 950 μL SOC-medium, og prøven inkubates i en shaker ved 250 rpm ved 37 °C i 1 time.
- Plade 100 μL af cellekulturen på LB-agar-mediet, der indeholder 50 μg · mL-1 kanamycin, og Inkuber det ved 37 °c i ca. 8 timer, indtil kolonierne optræder.
- Pick de kolonier, der havnen Wild-type kanr og leucin sjælden-codon-rige kanr-RC29 og bruge hver til at inokulere 5 ml femdoblet fortyndet lb medium (0,2 x lb) indeholdende 50 μg · ml-1 kanamycin. Prøverne inkubates i en shaker ved 250 rpm ved 37 °C.
Bemærk: mediet er afgørende for udvælgelsessystemet. Det bør indeholde lige nok kulstof og kvælstof til at give udtryk for antibiotikaresistens protein fra Wild-type genet snarere end fra de sjældne-codon-modificerede derivater. I dette tilfælde er L-leucin koncentrationen i 1x LB medium for høj til helt at hæmme protein ekspression fra den sjældne-codon-rige kanR. Således anvendes et fortyndet LB-medium med en fortyndingsfaktor som 5 til at generere en klar forskel i protein udtryk fra vildtypen og de sjældne-codon-rige gener. - Overfør 200 μL af hver cellekultur til en 96-brønd plade i tre eksemplarer på definerede tidspunkter (f. eks. 8 timer, 16 timer og 24 timer). Mål OD600 (optisk tæthed ved 600 nm) ved hjælp af en plade læser.
Bemærk: Hvis et fald i cellen OD600 ikke kan påvises for stammer, der harkedeligt de sjældne-codon-rige markørgener i forhold til OD600 af stammen, der harkedeligt Wild-type markørgener, skal du prøve at øge mængden af sjælden codon i eller bruge et mere fortyndet medium. - Udfør aminosyre tilførsels analysen for at teste, om udtrykkene for de sjældne-codon-rige markørgener (f. eks. kan R-RC29) genoprettes ved at øge koncentrationen af de målrettede aminosyrer.
Bemærk: ved udvælgelse af L-leucin over producenter anvendes L-leucin til fodring.- Inokulere stammerne husly af kanR-RC29- markerings genet i 5 ml af 0,2 x lb (indeholdende 50 μg · ml-1 kanamycin) med eller uden tilførsel af 1 g · L-1 l-leucin. Der inokuleres yderligere 5 mL af 0,2 x LB med stammer, som indholder vildtype kanR som kontrol. Prøverne inkubates i en shaker ved 250 rpm ved 37 °C.
- Mål OD600 for hver kultur på definerede tidspunkter (f. eks. 15 timer, 17 timer, 19 timer og 22 timer).
3. optimering af screenings forholdene
- Transformér 50 μL af den Stam stamme, der anvendes til mutagenese med 1 μL plasmid (~ 50 ng · μL-1), der bærer den vilde type gfp eller den vilde type PPG. Også omdanne den overordnede stamme med de sjældne-codon-rige derivater af markørgener.
- Der tilsættes 950 μL SOC-medium, og prøven inkubates i en shaker ved 250 rpm ved 37 °C i 1 time.
- Plade 100 μL af cellekulturen på LB-agar-mediet indeholdende de relevante antibiotika (25 μg · mL-1 chloramphenicol til gfp plasmid med en cmR markør eller 50 μg · ml-1 kanamycin til PPG plasmid, der bærer en kanR -markør) og Inkuber natten over ved 37 °c.
- Vælg en koloni, der huser Wild-typen gfp eller PPG og en koloni, der huser det tilsvarende sjældne-codon-rige derivat, og overføre dem til 5 ml af det korrekt fortyndede lb-medium individuelt. Prøverne inkubates i en shaker ved 250 rpm ved 37 °C.
Bemærk: for E. coli -stammer, der harkedeligt leucin sjælden-codon-Rich gfp-RC eller PPG-RC, kan det ufortyndede lb-medium (1x lb) bruges til at skabe betydelige forskelle i udtrykkene for Wild typen og den sjældne-codon-rige markør Gener. Også, inducerbare promotorer bruges til at drive udtryk for screening markørgener. Begynd induktion, når cellerne ind i eksponentialfasen for at opnå bedre diskrimination. - For fluorescens markører overføres 200 μL af hver cellekultur til en 96-brønd klar, bunden sort plade i tre eksemplarer på definerede tidspunkter (f. eks. 2 timer, 4 timer og 6 timer). Mål OD600 og fluorescensen og Beregn fluorescens intensitet (forholdet mellem fluorescens til OD600). For kromogene markører måles farve udviklingen af cellekulturer.
Bemærk: Hvis der ikke kan påvises lavere fluorescens intensiteter for stammer, som harkedeligt gfp-RC i forhold til de stammer, som harkedeligt Wild-typen gfp, eller hvis der ikke kan påvises en lysere farve for celler, der udtrykker det lilla protein fra PPG-RC end fra Wild-type genet, forsøge at øge antallet af sjældne codon på markørgener eller bruge en mere fortyndet medium. - Udfør fodrings testen (Se trin 2.7.1 og 2.7.2). Mål fluorescens intensitet eller farve udviklingen på definerede tidspunkter (f. eks. 12 timer, 18 timer og 24 timer).
4. identifikation af aminosyren over producenter
- Inokulere 100 μL af mutanternes kultur i 5 mL LB-medium (2% v/v), og Inkuber den i en shaker ved 250 rpm ved 37 °C, indtil værdierne for OD600 når 0,4.
- Gør mutanterne til kompetente celler17.
- Transformér 50 μL af de mutante celler med 1 μL plasmid (~ 50 ng · μL-1), der bærer markerings markøren kanR-RC29 eller Screenings mærkerne gfp-RC eller PPG-RC. Der tilsættes 950 μL SOC-medium, og prøven drejes i en 37 °C shaker i 1 time.
- Vælg aminosyre over producenter.
- Centrifuger cellekulturen ved 4.000 x g i 5 min., kassér supernatanten og tilsæt 5 ml 0,2 x lb-medium indeholdende 50 μg · ml-1 kanamycin. Prøven inkubates i en 37 °C shaker natten over.
- Plade natten kultur (f. eks 100 μL, afhænger af celletætheden af kulturen) på 0,2 x LB agar medium indeholdende 50 μg · mL-1 kanamycin og inkubatat ved 37 °c i 12 h.
Bemærk: de udviklede kolonier er kandidater til de målrettede aminosyre overproducenter og i dette tilfælde L-leucin over producerne.
- Skærm aminosyre over producenter.
- Plade det passende antal celler (f. eks. 100 μL), der harkedeligt Screenings mærket (som beskrevet i trin 4,3) på LB-agar-mediet indeholdende det relevante antibiotikum (25 μg · mL-1 chloramphenicol til screening med GFP-RC og 50 μg · ml -1 kanamycin til screening med PPG-RC) og inkubator ved 37 °c i 8 timer.
- Der inokuleres LB-mediet med det relevante antibiotikum (Se trin 4.5.1) med hver enkelt koloni fra pladen. Prøverne inkubates i en shaker ved 250 rpm ved 37 °C.
- Mål OD600 og fluorescensen, og Beregn fluorescens intensitet, hvis GFP-RC anvendes. Mål farve udviklingen af cellekulturer, hvis PPG-RC bruges. Bemærk, at de stammer, der udviser en højere fluorescens intensitet eller en dybere farve end moderstammen, er kandidat aminosyre overproducerne og i dette tilfælde L-leucin-over producenterne.
Bemærk: fluorescens-aktiverede celle sortering er også velegnet til at identificere enkelt celle-højproducenter, når de sjældne-codon-rige fluorescerende protein gener anvendes til screening.
- Kontrollere de aminosyre-produktiviteter af kandidat stammer.
- Der inokuleres 5 mL LB-medium med hver af kandidat stammerne og lad cellerne vokse natten over i en shaker ved 250 rpm ved 37 °C.
- Cellerne høstes fra 1 mL cellekultur ved centrifugering ved 4.000 x g i 2 min. kassér supernatanten, og genopsæt pellet med 1 ml sterilt vand.
- Der inokuleres 20 mL M9-medium indeholdende 4% glucose med 200 μL af cellesuspensionen og inkubateres i en 250 mL shaker ved 250 rpm ved 37 °C i 24 timer.
- 1 mL af dyrkningsmediet centrifugeres ved 4.000 x g i 5 min. Overfør 200 μl af supernatanten til et rent 1,5 ml rør. Forbered L-leucin opløsninger (HPLC (High-Performance Liquid kromatografi) kvalitet) på 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 og 1 g · L-1 som standarder.
- Tilsæt 100 μL 1 mM triethylamin og 100 μL 1 M phenyl isothiocyanat til supernatanten og standarderne, bland dem forsigtigt, og Inkuber dem ved stuetemperatur i 1 h18.
Forsigtig: triethylamin og phenyl isothiocyanat kan forårsage alvorlige forbrændinger af huden og øjenskader og er skadeligt ved indånding. Bær handsker og en maske og, hvis det er muligt, udføre dette trin i en røg hætte. - Tilsæt 400 μL n-hexan til det samme rør og vortex det i 10 s. Filtrer den nedre fase, der indeholder aminosyre derivater, gennem en 0,2 μm polytetrafluorethylenmembran.
Forsigtig: n-hexan kan forårsage hudirritation. Bær handsker og beskyttelsestøj. Hvis det kommer i kontakt med huden, skyl huden med rigeligt vand. - Forbered Mobil fase A ved at blande 0,1 M natriumacetat (pH 6,5) og acetonitril i et 99.3:0,7 volumetrisk forhold. Forbered acetonitril (80% v/v) som mobil fase B. Filtrer alle mobile faser gennem 0,2 μm polytetrafluorethylenmembraner.
Forsigtig: acetonitril er skadelig ved indånding og kan forårsage irritation af hud og øjne. Bær handsker og beskyttelsestøj, og Udfør dette trin i en Røghætte. - Der køres 1 μL af prøven på en ultra-HPLC, der er udstyret med en C18-kolonne i henhold til elueringsprogrammet i tabel 1 med en strømningshastighed på 0,42 ml · min-1 og en kolonne temperatur på 40 °c. Detektér de målrettede aminosyrer ved 254 nm med en diodearraydetektor og Beregn deres koncentrationer ved at kortlægge spids arealerne til standardkurven.
| Tid (min.) | Mobil fase A (%) | Mobil fase B (%) |
| 0 | 98 | 2 |
| 3,5 | 70 | 30 |
| 7 | 43 | 57 |
| 7,1 | 0 | 100 |
| 11 | 98 | 2 |
Tabel 1: Elueringsprogram til kvantificering af aminosyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For udvælgelsessystemet bør et kraftigt fald i OD600 for stammer, der harkedeligt det sjældne-codon-rige antibiotikaresistens-gen, observeres i forhold til den stamme, der harkedeligt det vilde antibiotikaresistens-gen, når det dyrkes i en egnet medium (figur 1a). Under de samme betingelser, faldet i celle OD600 bliver mere indlysende, da antallet af sjældne kodon i antibiotikaresistens genet stiger (figur 1a). Det skal bemærkes, at hæmning af sjældne codon på protein udtryk for det meste finder sted under sultede betingelser. Derfor, hvis lb medium ikke er korrekt fortyndet, ingen signifikant fald i celle OD600 vil blive observeret for stammen husly det sjældne-codon-rige markør genet i forhold til stammen husly Wild-type genet (figur 1b). Efter ekstra fodring af den tilsvarende aminosyre, OD600 for stammen harkedeligt den sjældne-codon-rige antibiotikaresistens genet vil stige betydeligt og nærmer sig den stamme, der harkedeligt Wild-type genet (figur 1c).
Figur 1: virkninger af sjælden codon på udtrykkene af markørgener, der anvendes til udvælgelse og screeningsystemer. (a) cellen OD600 for en E. coli stammer husly antibiotikaresistens genet (kanR) med 6, 16, 26, og 29 leucin sjælden-codon (RC6, RC16, RC26, og RC29) udskiftning efter 5 h inkubation. (b) cellen OD600 for en E. coli stamme husly Wild-type (WT) og den sjældne-codon-rige kanR (RC) i 1x, 0.5 x, og 0,2 x lb medier efter 5 h inkubation. c) virkninger af fodring af L-leucin på cellevæksten for E. coli -stammer, som harkedeligt leucin sjælden-codon- Richkan R -genet efter 5 h inkubation. Værdierne og fejllinjerne repræsenterer middelværdien og SD (n = 6). Fodring af L-leucin signifikant øget OD600 for celler harkedeligt den sjældne-codon-rige kanR. Den eneste undtagelse var for fodring af 2 g · L-1 l-leucin på grund af en høj SD i OD600 til fodring behandling. d) virkninger af sjælden-codon og L-leucin fodring på gfp udtryk fra Wild-type (WT) og leucin sjælden-codon-rige (RC) gener efter 16 h inkubation. Fodring af 0,5 – 2 L-1 l-leucin signifikant øget fluorescens intensitet for celler harkedeligt den sjældne-codon-rige gfp. Værdierne og fejllinjerne repræsenterer middelværdien og SD (n = 3). * *P < 0,01, * * *p < 0,001 som bestemt af to-sidet t-test, og kun de mest signifikante resultater blev vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For Screenings systemet vil fluorescens intensiteten og antallet af fluorescerende celler være betydeligt lavere for den stamme, der udtrykker det fluorescerende protein fra det sjældne-codon-rige gen end fra det vilde gen (figur 1d og Figur 2). Ved brug af det lilla protein skal den farve, der er udviklet fra den sjældne-codon-rige PPG , være lettere end fra det vildtlevende gen, når den udtrykkes under samme betingelser for samme inkubationsperiode (figur 3). Fodring af den tilsvarende aminosyre vil genskabe protein udtryk fra de sjældne-codon-rige gener. For stammer, der harkedeligt den sjældne-codon-rige gfp, bør fluorescens intensiteten (figur 1d) og antallet af lysstofrør (figur 2) stige markant og nærme sig de stammer, der indeholder Wild-type gfp . Når ufortyndet LB anvendes, vil aminosyrerne i mediet være tilstrækkelige til at tillade langsom ekspression af den sjældne-codon-rige PPG selv uden ekstra L-leucin fodring, og det udtrykte lilla protein vil blive synligt, når cellerne er pelleteret ( Figur 3). Dette skjuler imidlertid ikke det faktum, at genekspression fra den sjældne-codon-rige PPG blev dramatisk forbedret ved fodring af L-leucin til 2 g · L-1, især når de observeres i flydende kultur (figur 3). Derfor er den flydende kultur et bedre valg til screening baseret på kromogene proteiner, og brugen af fortyndet LB-medium ville bringe en mere signifikant forskel mellem fænotyperne induceret af vild-type og de sjældne-codon-rige gener.
Figur 2: Antallet af fluorescerende E. coli -celler, der nærer den vilde gfp eller leucin sjælden codon-Rich GFP (Gfp-RC) efter tilsætning af L-leucin. Celler blev dyrket i 1x LB medium. Skala bjælke = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: farve udvikling for celler, der harkedeligt Wild-typen (WT) og leucin rare-codon-Rich (RC) PPG -gener, som koder et lilla protein i 1x lb-medium (venstre panel) og effekten af L-leucin fodring på cellekultur farve udvikling ( højre panel). PPG -generne blev induceret, da cellerne trådte ind i eksponentialfasen, og billederne blev taget 3 timer efter induktion. L-leucin blev tilsat til mediet sammen med Induceren i fodrings testen. De farvede cirkler blev genereret ved at plukke farverne på cellekulturer og celle pellets. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Den sjældne-codon-baserede strategi er i stand til at identificere over producenter af de målrettede aminosyrer fra mutation biblioteket, og disse mutanter bør producere større mængder af de målrettede aminosyrer end moder stammerne (figur 4).
Figur 4: amino syrer produceret af Wild-typen og de muterede stammer identificeret ved den sjældne-codon-baserede strategi. a) L-leucin produktioner af E. coli stammer identificeret fra mutation biblioteker af kanR-RC29 (El-1 til El-5) og gfp-RC , der huser 29 og 19 leucin sjælden kodon (El-6 til El-10), hhv. (b) L-arginin produktioner af Corynebacterium glutamicum stammer udvalgt af den sjældne-codon-rige kanR, som indeholdt otte arginin sjælden kodon (agg). Markør genet blev introduceret i C. glutamicum mutation biblioteker afledt af Wild-type stamme ATCC13032. Selektions mediet var 0,3 x CGIII leveret med 25 μg · mL-1 kanamycin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antallet af sjældne kodon i markørgener og udvælgelse eller screening medium er afgørende for at hæmme protein udtryk fra de sjældne-codon-modificerede markørgener. Hvis der ikke kan påvises nogen signifikant forskel mellem protein udtryk fra Wild-type markørgener og derivater heraf, kan en forøgelse af antallet af sjældne kodon eller anvendelse af et nærings begrænset medium forstærke forskellene. Men hvis hæmnings effekten er for stærk, kan protein udtrykkene ikke inddrives, selv ved ekstra fodring af de tilsvarende aminosyrer. I dette tilfælde bør antallet af sjældne kodon i markørgener reduceres for at lindre en del af stress. En anden måde at finjustere valget eller screening strenghed er at justere kopi numrene og ekspressions niveauerne for de sjældne-codon-rige markørgener. Faldende kopi nummer og ekspression niveauer af markørgener normalt fører til stærkere differentieringer mellem aminosyre over producenter og de oprindelige stammer. Der bør derfor anvendes vektorer, der indeholder de lave kopier af Replikerings oprindelser såsom p15A eller pSC101, samt svage initiativtagere. Hvis markør genet drives af en inducerbar promotor, anbefales lav induktion.
Den sjældne-codon-baserede strategi for udvælgelse eller screening for aminosyre over producenter er en omvendt tilpasning af den almindeligt anvendte strategi "codon Optimization", som har til formål at lette udtryk for eksogene proteiner. I codon optimering, de sjældne kodon på de målrettede gener er erstattet af de synonyme fælles dem med hensyn til værten; således kan gener fra andre organismer oversættes meget hurtigere til proteiner end de eksogene gener med høje andele af sjældne kodon19. Derfor er det rimeligt at antage, at "reverse optimering", som skifter den fælles kodon til deres synonyme sjældne dem, bør hæmme gen udtryk. Genudtrykkene skal dog genoprettes ved forbedret opladning af de tilsvarende sjældne tRNAs, når de målrettede aminosyrer akkumuleres intracellulært. Inkorporeringen af sjældne kodon øger tærsklen for aminosyre koncentrationen i protein udtryk, som tilbyder en potentiel strategi til at vælge eller screene for aminosyre over producenter, når det kombineres med de korrekte markørgener.
Ud over de antibiotikaresistensgener, de fluorescerende protein gener og de kromogene protein gener, der anvendes i protokollen, kunne forskellige markørgener anvendes til at etablere det sjældne-codon-baserede udvælgelses-eller screeningssystem. For eksempel kan dødbringende gener som Tolc20 og sacb21 bruges til at udvælge aminosyre over producenter. I dette tilfælde, fælles kodon på de gener, der hører til antidot system bør erstattes af de synonyme sjældne kodon af de målrettede aminosyrer. Stammer, der overproducerer de målrettede aminosyrer er i stand til at lancere modgift system og dermed overleve de toksiske virkninger induceret af de dødbringende gener.
Det skal bemærkes, at bivirkninger kan forekomme, når du bruger store mængder af aminosyrer i fodring analyse. Dette skyldes, at nogle aminosyrer er giftige for mikroorganismerne. For eksempel, en koncentration på omkring 100 mg · L-1 for l-Serin er i stand til at hæmme væksten af E. coli22. Men selv om det er lavere end for Wild-type genet, fandt vi, at fodring op til 2 g · L-1 l-Serin kunne stadig genskabe udtrykkene af antibiotikaresistensgener, der er rige på Serin sjælden codon13. Derfor, aminosyre toksicitet, i det mindste for L-Serin, ville ikke bringe pålideligheden af fodring analyse. For at overvinde de potentielle negative virkninger af aminosyre toksicitet på produktiviteterne af de målrettede stammer, strategier såsom tilfældig mutagenese og forbedring af aminosyre udførsel23 kunne anvendes. Faktisk er den sjældne-codon-baserede metode egnet til at identificere tolerante stammer, der kan modstå eller overproducere aminosyrer over de giftige niveauer. De vigtigste mutationer, der giver aminosyre tolerance kunne identificeres og indføres i de målrettede stammer, som ville være den ideelle værter for konstruktioner af aminosyre over producenter.
Den sjældne-codon-baserede udvælgelse eller screening system sikrer høj pålidelighed. Med andre ord, stammer identificeret af systemet formodes at være over producenter af de målrettede aminosyrer. Men i nogle tilfælde, de kandidater, der overlever den antibiotika udvælgelse kan ikke producere større mængder af de målrettede aminosyrer end den forælder stamme. Dette kan tilskrives den antibiotikaresistens erhvervet af stammerne gennem mutagenese og derefter et tab af selektions plasmid24. Som en konsekvens, stammer uden forbedrede aminosyre produktiviteter kunne overleve antibiotika stress og undslippe udvælgelsen. Disse falske positive stammer kan elimineres ved at indsætte en anden markeringsmarkør i selektions plasmid, såsom et vildt lignende gen, der giver resistens over for et andet antibiotikum. Stammer, der mistede udvælgelsen plasmid er mindre tilbøjelige til at opnå dobbelt resistens over for de to antibiotika og vil blive elimineret under udvælgelsen.
Mutanter identificeret ved det sjældne-codon-baserede system bør være i stand til at overproducere de målrettede aminosyrer i forhold til de oprindelige stammer. Aminosyren produktiviteter for de udvalgte stammer kan dog stadig være lavere end de industrielle krav. Dette antyder ikke en fiasko i den sjældne-codon-baserede strategi, da stamme præstationer er uafhængige af udvælgelses-eller screeningsprocessen, men afhænger af faktorer som den oprindelige stamme, tilgangen af mutagenicese, størrelsen af Mutations bibliotek og gærings forholdene. For at opnå høj produktion stammer, bør opmærksomheden rettes mod de strategier for stamme teknik, som ved tilfældig mutagenese eller gennem rationel udformning af aminosyren biosyntetiske veje. Kombinationen af adaptiv laboratorie udvikling og den sjældne-codon-baserede strategi ville gøre det lettere at opnå aminosyre-over producenter.
Methionin og tryptophan har ikke alternative kodon blandt de 20 proteinogeniske aminosyrer. Derfor kan denne strategi ikke være ansat direkte til disse aminosyrer. En mulig løsning er at bruge manipuleret trnas, der er i stand til at genkende stop kodon at bære disse aminosyrer. Således, den tilsvarende stop kodon kunne vedtages som den kunstige sjældne kodon af disse aminosyrer25,26.
En af de største mangler med hensyn til den konventionelle analoge-baserede strategi for udvælgelse af aminosyre over producenter er den høje falske positive sats5,27. Stammer, der går gennem mutagenese kunne nemt erhverve resistens over for de giftige aminosyre analoner, og tolerancen kan endda erhverves uden hjælp af mutagener27. Disse stammer kunne nemt undslippe udvælgelsen pres fra aminosyre analoner og, derfor, de udvalgte stammer er normalt ikke den sande aminosyre over producenter, som i høj grad ofrer effektiviteten af udvælgelsesprocessen.
I modsætning hertil konkurrerer den sjældne-codon-baserede strategi med den traditionelle analoge metode ved at muliggøre præcise og hurtige identifikationer af aminosyre-over producenter. Til vores viden, dette er den første strategi, der vedtager den naturlige lov af codon bias. Det er kun afhængig af en enkelt sjælden-codon-rige markør gen og dermed eliminerer brugen af giftige analover. Markør generne er generelt ikke-giftige for værts stammerne, og protein udtrykkene fra sjældne-codon-rige gener afhænger primært af de intracellulære koncentrationer af de tilsvarende aminosyrer på grund af den universelle og strenge lov af codon bias på tværs af alle arter. Dette ville forhindre, at stammerne flygter fra selektions trykket. Udover, på grund af den store mangfoldighed af markørgener, den sjældne-codon-baserede strategi kunne tilbyde forskellige valgmuligheder for både udvælgelse og screening af aminosyre over producenter.
På grund af det universelle fænomen med codon bias i alle levende organismer28, den sjældne-codon-baserede udvælgelse eller screening strategi teoretisk kunne anvendes til andre mikroorganismer foruden E. coli, især dem med industriel Potentialer. Når du skifter til en anden vært, bør valget af sjældne kodon, der anvendes til at designe markørgener, være baseret på codon-brugs frekvenserne og de tilsvarende trnas-mængder for den specifikke vært. Det medium, der anvendes til udvælgelse eller screening bør også optimeres i overensstemmelse hermed. Et eksempel er den almindeligt anvendte C. glutamicum i aminosyre fermentationer. En sjælden-codon-modificeret kanR gen indeholder otte arginin sjælden kodon (agg) har vist sig effektiv i udvælgelsen C. glutamicum L-arginin over producenter af en tidligere undersøgelse13 (figur 4b). Udforskninger af den sjældne-codon-baserede strategi bør lette konstruktioner og forståelser af aminosyre over producenter. Udover aminosyrer kunne den sjældne-codon-baserede strategi også anvendes med isobutanol, 3-methyl-1-butanol, 2-methyl-1-butanol og andre produkter, der deler de samme biosyntetiske veje med visse aminosyrer29. Stammer identificeret ved markørgener, der havnen de sjældne kodon af disse aminosyrer er i stand til at overproducere forløberen forbindelser, som kunne kanaliseres til syntesen af aminosyre derivater. Derfor kan den sjældne-codon-baserede strategi tjene som en indirekte, men hurtig metode til at afspejle potentialerne af stammerne i at akkumulere disse kemikalier enten intra-eller ekstracellulært. Nøgle mutationer, der giver øget aminosyre produktion fra forskellige over producenter, kan identificeres ved dyb sekvensering og indføres individuelt eller samtidigt i industrielle stammer for yderligere at forbedre aminosyre produktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet blev understøttet af National Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 21676026), det nationale Key R & D program i Kina (Grant No. 2017YFD0201400), og China postdoc Science Foundation (Grant No. 2017M620643). Værker på UCLA Institute of avancement (Suzhou) blev støttet af de interne tilskud fra Jiangsu-provinsen og Suzhou Industrial Park.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Thermo | 51101 | |
| EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit | Transgen | EM111-01 | |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | Transgen | EG101-01 | |
| Gibson assembly master mix | NEB | E2611S | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Solarbio | I8070 | |
| L-leucine | Sigma | L8000 | |
| Microplate reader | Biotek | Synergy 2 | |
| n-hexane | Thermo | H3061 | |
| Phenyl isothiocyanate | Sigma | P1034 | |
| PrancerPurple CPB-37-441 | ATUM | CPB-37-441 | |
| TransStar FastPfu Fly DNA polymerase | Transgen | AP231-01 | |
| Triethylamine | Sigma | T0886 | |
| Ultra-high performance liquid chromatography | Agilent | 1290 Infinity II | |
| Wild type C. glutamicum | ATCC | 13032 | |
| XL10-Gold E. coli competent cell | Agilent | 200314 | |
| ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 column | Agilent | 959759-902K |
References
- Tatsumi, N., Inui, M. Corynebacterium glutamicum: biology and biotechnology. , Springer-Verlag. Berlin and Heidelberg. (2012).
- Tonouchi, N., Ito, H. Present global situation of amino acids in industry. Amino Acid Fermentation. Yokota, A., Ikeda, M. , Springer. 3-14 (2017).
- Gusyatiner, M., Lunts, M., Kozlov, Y., Ivanovskaya, L., Voroshilova, E. DNA coding for mutant isopropylmalate synthase, L-leucine-producing microorganism and method for producing L-leucine. , US6403342B1 (2005).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Current Opinion in Biotechnology. 19 (5), 454-460 (2008).
- Norris, R., Lea, P. The use of amino acid analogues in biological studies. Science Progress. , 65-85 (1976).
- Park, J. H., Lee, S. Y. Fermentative production of branched chain amino acids: a focus on metabolic engineering. Applied Microbiology and Biotechnology. 85 (3), 491-506 (2010).
- Bach, T. M., Takagi, H. Properties, metabolisms, and applications of L-proline analogues. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (15), 6623-6634 (2013).
- Crick, F. H. C.
- Plotkin, J. B., Kudla, G. Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nature Reviews Genetics. 12 (1), 32-42 (2011).
- Dittmar, K. A., Sørensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino‐acid starvation. EMBO Reports. 6 (2), 151-157 (2005).
- Elf, J., Nilsson, D., Tenson, T., Ehrenberg, M. Selective charging of tRNA isoacceptors explains patterns of codon usage. Science. 300 (5626), 1718-1722 (2003).
- Sørensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel+ and Rel− strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. Journal of Molecular Biology. 307 (3), 785-798 (2001).
- Zheng, B., et al. Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers. Nature Communications. 9 (1), 3616 (2018).
- Richardson, S. M., Wheelan, S. J., Yarrington, R. M., Boeke, J. D. GeneDesign: rapid, automated design of multikilobase synthetic genes. Genome Research. 16 (4), 550-556 (2006).
- Xiong, A. -S., et al. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. Nature Protocols. 1 (2), 791-797 (2006).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Cohen, S. A., Bidlingmeyer, B. A., Tarvin, T. L. PITC derivatives in amino acid analysis. Nature. 320 (6064), 769-770 (1986).
- Zhou, J., Liu, W. J., Peng, S. W., Sun, X. Y., Frazer, I. Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage and tRNA availability. Journal of Virology. 73 (6), 4972-4982 (1999).
- Gregg, C. J., et al. Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Research. 42 (7), 4779-4790 (2014).
- Pelicic, V., Reyrat, J. M., Gicquel, B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. Journal of Bacteriology. 178 (4), 1197-1199 (1996).
- Avcilar-Kucukgoze, I., et al. Discharging tRNAs: a tug of war between translation and detoxification in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 44 (17), 8324-8334 (2016).
- Mundhada, H., Schneider, K., Christensen, H. B., Nielsen, A. T. Engineering of high yield production of L-serine in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 113 (4), 807-816 (2016).
- Makosky, P. C., Dahlberg, A. E. Spectinomycin resistance at site 1192 in 16S ribosomal RNA of E. coli: an analysis of three mutants. Biochimie. 69 (8), 885-889 (1987).
- Feng, L., Tumbula-Hansen, D., Toogood, H., Söll, D. Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5676-5681 (2003).
- Naganuma, M., et al. The selective tRNA aminoacylation mechanism based on a single G• U pair. Nature. 510 (7506), 507 (2014).
- Hoesl, M. G., et al. Chemical evolution of a bacterial proteome. Angewandte Chemie International Edition. 54 (34), 10030-10034 (2015).
- Hershberg, R., Petrov, D. A.
- Huo, Y. -X., et al. Conversion of proteins into biofuels by engineering nitrogen flux. Nature Biotechnology. 29, 346 (2011).
