Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

생체 내 전파 및 배양 VX2 세포에서 만든 후각 성 림프절증을 가진 정형 외 자궁 내막 암 모델

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59340
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 5,6, 5,7,8, 7,9,11, 10, 5,11
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

Summary

이 프로토콜은 배양에서 VX2 세포를 성장시키고 토끼에서 후복막 림프절 전이를 가진 자궁내막암의 정형외 VX2 모델을 생성하는 표준화된 방법을 제시한다. 정형외 자궁내막암 모델은 림프절 전이의 진단을 위한 새로운 이미징 양식의 전임상 연구에 중요하다.

Abstract

자궁내막암은 북미에서 가장 흔한 부인과 악성 종양이며 발병률은 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 치료는 림프절 절제술에 의해 결정된 림프절 침범에 따라 보조 요법의 유무에 관계없이 수술로 구성됩니다. 림프절 절제술은 많은 환자에서 치료 적 이점을 가지고 있는 것으로 나타나지 않은 병적 절차이므로 림프절 전이를 진단하는 새로운 방법이 필요합니다. 새로운 화상 진찰 에이전트를 시험하기 위하여는, retroperitoneal 림프절 전이를 가진 자궁내막암의 믿을 수 있는 모형이 필요합니다. VX2 자궁내막암 모델은 문헌에 자주 기술되어 왔다; 그러나 모델 수립 방법에 대해서는 상당한 차이가 있습니다. 더욱이, 생체 내에서 전파된 세포만이 이전에 사용되었기 때문에 배양된 VX2 세포의 사용에 대한 연구는 보고되지 않았다. 본 명세서에서, VX2 자궁내막암 모델의 확립을 위한 표준화된 수술 방법 및 수술 후 모니터링 방법을 제시하고 이 모델을 생성하기 위해 배양된 VX2 세포의 첫 번째 사용에 대해 보고한다.

Introduction

자궁내막암, 즉 자궁내막암은 전 세계적으로 두 번째로 흔한 부인과 악성종양이며 선진국에서 가장 흔한악성종양입니다 1. 자궁내막암발생률은 2005년부터 2013년까지 매년 2.3% 증가하여 사망률1,2,3의사망률이 2.2% 증가하는 등 꾸준히 증가하고 있다. 림프절 전이의 진단은 양성 림프절의 존재가 생존4,5,6,7의 강한 부정적인 예측변수이기 때문에 가장 중요하며, 보조 요법8,9,10,11,12,13. 림프절 전이는 현재 골반과 복부에 있는 주요 혈관을 덮는 림프 조직을 외과적으로 제거해서 진단됩니다. 림프절 절제술로 알려진이 절차는 두 개의 큰 시험 에서 생존 데이터 충돌로 인해 논란이14,15,16,17, 18 및 알려진 수술 중15,19,20 및 수술 후 이환율21,22,23의위험. 현재 비침습적 영상형형은림프절해부(24)를대체하는 데 필요한 민감도 및 특이성을 갖지 않기 때문에, 새로운 진단 영상 기술을 개발하기 위한 추진이 있었다. 전 임상 환경에서 이러한 새로운 기술을 테스트하려면 복막 림프절 전이를 가진 자궁 내막암의 신뢰할 수있는 모델이 필요합니다.

토끼 VX2 종양 모델은 폐26,두경부27,간29,신장30,등 다중 인간 고형 기관종양(25)을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 온 잘 확립된 모델이다. 뼈31,32,뇌33,췌장34, 자궁35,36,37. VX2 모델은 1940년 키드와 루스38이 1933년39년Shope가 발견한 코튼테일 토끼 유두종 바이러스를 성공적으로 이식하여 개발되었습니다. 그 이후로, VX2 모델은 화이트 뉴질랜드 토끼40의사두근 근육에 직렬 통로를 필요로, 생체 내에서 유지되고있다. 그러나 최근에는, 여러 그룹이 시험관 내 VX2 세포를 성공적으로 성장시켰으며,41,42 및 배양된세포주(31)의유지종양성을입증하였다. 42,43. VX2 종양은 조직학적으로 anaplastic 편평 상피 세포 암종(44)으로 정의되고 선암(26)과유사한 선 특징을 포함합니다. 종양은 이식의 용이성, 급속한 성장 및 하이퍼 혈관(44,45) 및 안정적으로 전이되며, 가장 일반적으로 국부 및 먼 림프절45를특징으로한다. 자궁 혈관 및 림프 해부학46뿐만 아니라 정형 외 성장 부위의 유사성은 토끼 VX2 암종의 전이성 패턴이 인간 자궁 내막암을 모방하여 VX2 모델을 인간 연구에 대한 신뢰할 수있는 모델로 만듭니다. 전이성 질환. 더욱이, 비정상적인 미세혈관증식(47)과 같은 조직학적 특징은 면역학적48 및 유전적 유사성49,인간과 토끼 사이의50이 종양을 시사한다고 제안한다. 미세 환경은 인간의 자궁 내막암을 반영 할 수있다.

여러 그룹은 VX2의 사용에 대한 보고가 성공률이 높은 후복막 전이를 가진 자궁내막암 의 모델을 생성하여36,51,52; 그러나 모델 생성 방법과 관련하여 현재 문헌 내에 상당한 차이가 있습니다. 세포 현탁액 투여량은 4 x 10 5 세포/자궁경적(51)과 5 x 10 9 세포/자궁호른(37) 만큼높으며,53회는 필요한 VX2 세포 투여량에 대한 표준 합의없이 보고되었다. 또한, 자궁 근막내로 종양의 미세 외과이식(36)및 VX2 세포 현탁액37,44,52의 주사를 포함한 다양한 접종 방법이 보고되었다. , 도 53 및 경우에 따라, 접종 전 자궁경적 봉기(52)를 첨가한다. 마지막으로 배양된 VX2 셀을 사용하여 이 모델을 만드는 그룹은 보고되지 않았습니다. 따라서, 본 연구의 목적은 VX2 모델 생성의 성공적인 표준화 방법을 입증하고 배양된 VX2 세포의 첫 번째 사용을 보고하여 토끼에서 복막전이를 이용한 자궁내막암 모델을 생성하는 것이다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

깊은 복벽 폐쇄: 복막 절개의 정점을 확인하고 조직 집게로 복막, 직장 근육 및 근막을 파악합니다. 모든 동물 연구는 대학 보건 네트워크의 동물 자원 센터 (ARC) 승인 된 시설에서 및 승인 된 동물 사용 및 관리 프로토콜 (AUP #3994 / #4299)에 따라 수행되었습니다. VX2 세포주 대학 건강 네트워크에 박사 Aken의 실험실에서 얻은.

1. 체외 VX2 세포주 생성

  1. 토끼 사두근 근육과 마우스 측면의 성장에서 VX2 종양을 수확.
    1. 냉동 VX2 종양 블록(1 cm x 1 cm)을 해동하고, 메스 블레이드를 사용하여 배양 플레이트상에서 다진 70 μm 필터를 통해 소량의 행크스 균형 염액(HBSS)을 순차적으로 첨가하여 모든 세포가 최종 부피에 대해 1 mL의 변형되도록 한다.
    2. 세포를 카운트하고 0.9% 인산완충 식염수로 희석하여 1 x10 7/mL의 농도로 희석하고 멸균 튜브에 얼음위에 놓습니다.
      참고: 종양 블록은 토끼 사두근 근육에서 VX2 종양의 이전 전파로부터 실험실 협력자로부터 수득되었다.
    3. 2-5% 흡입 된 이소플루란으로 여성 흰색 뉴질랜드 토끼 (무게 2.5-3.5 kg)를 마취시키고 주사 부위 위에있는 모피를 제거하고 포비도 요오드 용액으로 주사 부위를 정화합니다. 토끼의 사두근 근육에 제조된 VX2 세포 현탁액(5 x 106 세포/mL)의 500 μL을 주입한다. 10일째부터 종양 성장을 위해 토끼를 임상적으로 모니터링한다.
    4. 종양이 수의사 승인 방법을 사용하여 직경 1-1.5 cm (캘리퍼스로 외부로 측정)에 도달 한 후 토끼를 안락사시하십시오. 심박수와 호흡률을 포함한 활력 징후를 확인하여 안락사를 확인합니다. 베타딘 용액으로 부위를 청소 한 후 멸균 기구를 사용하여 종양을 절제하십시오.
    5. 멸균 기구를 사용하는 생물학적 안전 캐비닛에서 메스 블레이드를 사용하여 10cm 조직 배양 접시에 작은 조각 (0.2 cm)으로 종양을 다듬습니다. 1.1.1단계에서 기재된 바와 같이 1 mL의 HBSS를 사용하여 70 μm 세포 스트레이너를 통해 종양 단편을 전달한다. 세포를 카운트하고 0.9% 식염수 용액을 사용하여 희석하여 200 μL에서 7.5 x 105 세포를 얻었다.
    6. 1 L/min에서 4% 이소플루란을 사용하여 남성 NOD scid 감마 마우스(체중 25 g)를 마취시키고 2% 이소플루란을 사용하여 마취를 유지합니다. 일단 마우스가 마취되면, 27 게이지 바늘을 사용하여 마우스 측면의 피하 조직에 1.1.5 단계에서 용액의 200 μL을 주입합니다.
  2. 시험관내 VX2 세포의 수확 및 통과
    1. 종양이 캘리퍼스를 사용하여 직경 1cm에 도달 할 때까지 임상적으로 두 번 이종이식 성장을 모니터링하십시오.
    2. CO2 챔버에 놓거나 4% 이소플루란 가스로 마취한 후 자궁 경부 탈구를 수행하여 마우스를 안락사시한다. 생물학적 안전 캐비닛의 멸균 조건하에서 종양을 절제합니다.
    3. 메스를 1-2 mm 조각으로 1-2 mm 조각으로 다진 6 cm 조직 배양 접시에 포함 된 3 mL의 덜베코 의 변형 된 독수리 매체 (DMEM)/Ham의 F12+ 10% 태아 소 혈 청 (FBS) 매체.
    4. 세포가 종양 조각에서 자라기 시작할 때까지 2 일 동안 5 %CO2로 37 °C 인큐베이터에서 종양 조각을 방해받지 않고 둡니다. 그 후, 세포 합류를 위한 가벼운 현미경 검사법에 의해 매일 배양된 플레이트를 확인하십시오. 70% 합원에 도달하면, 플라스크에 0.05% 트립신의 1 mL을 추가하고 5분 동안 37°C 인큐베이터에 다시 놓음으로써 세포를 트립시니화한다.
    5. DMEM/Ham의 F12 + 10% FBS 배지로 트립신을 중화하고, 300 x g에서5분 동안 4°C에서 세포와 원심분리기를 수집합니다. 새로운 DMEM/Ham의 F12 + 10% FBS 용지의 3.5 mL에서 상류층 및 재서스펜션 펠릿을 제거합니다. 씨앗 신선한 6 cm 콜라겐 I 는 약 50 % 세포 파종 밀도를 달성하기 위해 플레이트 당 1.6 x 106 세포로 플레이트를 코팅했다.
      참고: 50% 세포 밀도는 부착시 플레이트 표면적의 50%를 차지하는 세포를 말합니다.
    6. 조기 통과: 상기 과정을 반복(트립시니화, 시딩)을 반복하여 세포가 5회 통과될 때까지 반복한 다음 정량적 PCR 분석을 사용하여 PCR로 세포주 순도를 평가하여 토끼 게놈 DNA와 마우스 게놈 DNA를 구별한다(단계 1.3.1-1.3.4 참조).
      참고 : 8 대후, 세포는 비 콜라겐 코팅 일반 부착 조직 배양 플레이트에 전파 될 수있다.
    7. 통로, trypsinize 및 DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO에서 유리병 당 2 x 106의 농도에서 세포의 aliquots를 동결. 실험에 필요할 때까지 세포를 액체 질소에 저장합니다.
  3. 생존 세포의 VX2 기원의 확인:
    1. 정제 된 게놈 마우스와 토끼 DNA (단계 1.3.2 및 단계 1.3.3)에서 표준 치료법을 만듭니다. LINE-1 레트로트랜스포슨 요소의 두 번째 개방 판독 프레임 내에서 종별 시퀀스를 타겟팅하는 프라이머를 사용합니다.
      참고 : CRPV E6에 대한 프라이머 시퀀스는 다음과 같습니다 5'- GATCCTGGACCACCAGTGAnd 5'-CCTGCCGGTCTGATTTAT. LINE-1 레트로트랜스포슨 요소가 사용되었습니다. 토끼 LINE-1에 대한 프라이머 시퀀스는 다음과 같습니다 : 5'-TCAGAACCCCAAAAGATATGC 및 마우스 라인-1에 대한 5'-TTTGATTCTTGAATTGGT 프라이머 시퀀스는 다음과 같습니다 : 5'-AATAGAAAAAAAAAATTCACGTG 및 5'-CCTTCCTTAGAGAGTATTTTTTTTTTTTTTG
    2. CRPV E6에 대한 표준 곡선을 생성하려면 제조업체의 프로토콜에 따른 상용 키트를 사용하여 VX2 종양 세포 용해물(Step 1.1)을 정제합니다. 상업적인 분석법으로 이 DNA를 정량화합니다. 낮은 EDTA-TE 버퍼에서 225 pg/μL에서 0.925 pg/μL까지 6개의 직렬 희석을 수행합니다. 마우스 게놈 DNA에 대한 표준 곡선을 만들려면 125 pg/μL에서 0.0125 pg/μL까지 5개의 희석으로 낮은 EDTA-TE 버퍼에서 상업용 마우스 게놈 DNA 100 μg을 희석합니다.
    3. 1.3.2단계의 시료에서 각 희석된 용액에서 4 μL을 우물에 놓고 PCR 열전자전거에서 샘플을 실행합니다. 각 실행의 Cq 값을 웰당 DNA 양과 함께 사용하여 써모사이클러 소프트웨어 자동 임계값 설정을 사용하여 표준 곡선을 계산합니다.
    4. 표준 qPCR 절차를 사용하여 온도 사이클러에서 40사이클의 2단계 사이클링(98°C 및 60°C)으로 PCR을 수행합니다. 임계값을 설정하고 델타 Ct 값을 >35로 설정하여 토끼 VX2 세포주에서 마우스 오염을 최소화합니다. 각 반응의 총 부피는 10 μL, 2x Mastermix의 5 μL, 250 nM에서의 반응에서 최종 프라이머 농도를 가진 전방 + 역방향 프라이머 1 μL, 및 DNA 샘플의 4 μL로 구성되었다.
      참고: PCR 수행에 대한 자세한 내용은 참조54,55를 참조하십시오. 임계값이 설정되고 델타 Ct 값이 >35로 설정되어 토끼 VX2 세포주에서 마우스 오염을 최소화합니다. qPCR에 의한 신뢰할 수 있는 검출을 위한 VX2 DNA의 권장 수준은 1-10 pg입니다.

2. VX2 세포 배양 및 세포 현탁액 생성

  1. VX2 세포를 함유하는 바이알(1.2.7단계에서 냉동)을 37°C에서 수조에서 1분간 동결하고 10 mL의 배양 배지(1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)를 가진 원심분리관으로 세포를 옮니다. 107 x g에서8 분 동안 원심 분리기를 폐기하고 9 mL의 매체에서 세포 펠릿을 다시 중단시금.
  2. 다시 부유 한 세포를 큰 배양 플라스크로 옮김. 37 °C에서 흔들리지 않고 세포를 배양합니다. 광 현미경 검사법을 사용하여 합류에 대한 매일 세포를 확인하고 3 일마다 배양 배지를 변경하십시오.
  3. 주입을 위한 배양된 VX2 세포 현탁액의 생성
    1. 세포를 추가 하 여 트립시니화 3 mL의 0.25% 플랩신 일단 세포에 도달 한 후 트립신 80% 합류. 플라스크를 인큐베이터(37°C)에 5분 간 놓고 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기를 107 x g에서 8분 간 옮긴 다음 상류를 제거합니다.
    2. 세포 펠릿을 9 mL의 인산완충 식염수, 원심분리기로 3회 세척하고 위와 같이 상층부를 제거합니다. 세포를 계산하고 0.9 % 인산 완충 식염수로 희석하여 4 x 107 세포 / mL의 농도로 얼음에 멸균 원소 원심 분리튜브에 놓습니다.
  4. 주입을 위한 생체 내 전파 VX2 세포 현탁액 생성
    1. 해동 냉동 VX2 종양 블록(1 cm x 1 cm), 메스 블레이드를 사용하여 배양 플레이트상에서 다진 및 1.1.1단계에서와 같이 70 μm 필터를 통해 변형한다. 소량의 HBSS를 순차적으로 추가하여 모든 셀이 최종 부피 1mL에 대해 변형되도록 합니다. 세포를 카운트하고 0.9% 인산완충식염수로 1 x10 7/mL의 농도로 희석하고 멸균 튜브에 얼음 위에 놓습니다.
      참고: 종양 블록은 토끼 사두근 근육에서 VX2 종양의 이전 전파로부터 실험실 협력자로부터 수득되었다.

3. 외과 모델 설립

  1. 외과 마취 및 수술 전 준비의 확립
    1. 사전 치료 여성 흰색 뉴질랜드 토끼 (2.5-3.5 kg) 1 시간 전에 아세프로마진의 주사를 사용하여 계획된 수술 (1 mg / kg IM) 및 멜 록시캄 (0.2 mg / kg SQ). 2-5% 흡입 된 이소플루란으로 여성 흰색 뉴질랜드 토끼 (무게 2.5-3.5 kg)를 마취시키고 주사 부위 위에있는 모피를 제거하고 포비도 요오드 용액으로 주사 부위를 정화합니다.
    2. 후두 마스크 기도 (LMA)를 사용하여 마취 토끼를 삽관하고 테이프로 제자리에 고정, 2-5 % 사이의 흡입 이소플루란 용량을 적정하여 깊은 마취를 유지. 활력 징후 (호흡 속도, 모세관 리필, 산소 포화도)를 확인하고 통증을 암시하는 징후 (운동, 자극, 소음에서 철수) 또는 빛을 모니터링하여 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 외과 마취를 모니터링하십시오. 마취 (운동, LMA 튜브에 체팅).
      참고 : 이것은 외과 마취를 모니터링 경험이있는 사람에 의해 수행되어야합니다.
    3. 22게이지 귀 정맥 카테터를 한계 등쪽 정맥에 놓습니다. 세파졸린을 투여 (20 mg /kg) 정맥 10 수술 피부 절개 전에 분.
    4. 수술대에 토끼를 놓기 전에 골반과 복부에 머리카락을 끼친 다음 수술대에 등도 위치에 토끼를 놓습니다. 3단계 수술용 피부 준비(베타딘 비누, 클로르헨시딘 용액, 베타딘 용액)를 사용하여 수술 분야를 청소합니다. 음부 뼈의 상단을 표시 한 후 개복술 커튼으로 수술 부위를 드레이프하고 하복부의 5cm x 5cm 영역을 노출시소하십시오.
  2. 개복술 절개 및 자궁 경적의 식별의 생성
    1. 수술용 모자와 얼굴 마스크를 착용하십시오. 클로르헨시딘 또는 베타딘 수술 용액을 사용하여 손을 문질러 보시고. 멸균 기술을 사용하여 멸균 가운과 멸균 수술 장갑을 착용하십시오.
    2. # 11 블레이드 메스를 사용하여, 토끼 복부의 피부와 피하 조직을 통해 심형 치피에 2.5 cm 긴 절개 1cm 두개골을 합니다. 직장 근막 절개 및 근본적인 복막을 노출하는 측면으로 직장 근육을 해부. 지하가 창자 또는 다른 복부 장기의 명확한 지 확인 후 급격하게 복막을 입력합니다.
    3. 오줌 방광을 확인하고 장갑을 낀 손가락을 우수하게, 후방 및 방광의 정점에 걸쳐 측면으로 쓸어 자궁 뿔을 찾습니다.
      참고: 필요한 경우 디지털 압력을 사용하여 전체 방광을 비워야 합니다. 일단 위치, 복 부 절개를 통해 자 경 적을 가지고 복 벽에 휴식.
    4. 3-0 편조 흡수성 봉합사를 사용하여, 자궁 경적을 약 1.5-2.0 cm 의 자궁 경적의 단일 봉합을 수행하여 자궁 경부에 원하. 봉합사를 각 뿔의 측면 측면을 따라 달리는 자궁 동맥에 내측을 놓습니다. 봉합사를 단단히 묶어 말단 자궁 뿔을 가리키다(그림 1).
  3. 근심시험 VX2 접종
    1. 27 게이지 바늘을 사용하여, 이전에 준비된 VX2 세포 현탁액의 0.5 mL을 2.3.2 단계 (배양 된 VX2 모델용) 또는 2.4 (생체 내 전파 VX2 모델용)를 봉합 부위 (봉합 부위 간)의 근막에 주입하십시오. 자궁 경부). 1 분 이상 주입하고 세포가 기본 자궁 구멍에 주입되지 않도록하십시오. 흡입된 이소플루란을 사용하여 동물을 마취 (2-5%) 베인 회로가 있는 마취기계.
    2. 세포 누출을 최소화하기 위해 주사 후 30 s에 대한 근심 주사 부위에 압력을 가하십시오. 지혈에 대한 주사 및 봉합 부위를 검사하고 복부에 다시 자궁 경적을 배치합니다.
  4. 외과 절개 닫기
    1. 깊은 복벽 폐쇄: 복막 절개의 정점을 확인하고 조직 집게로 복막, 직장 근육 및 근막을 파악합니다.
      1. 이렇게하려면 절개의 한쪽 에 피상적 인 봉합사를 봉제의 한 쪽에서 절개한 한 쪽의 깊은 부분과 다른 쪽의 피상적 인 부분까지 봉합합니다. 매듭을 묶는다. 부착 된 봉합사를 사용하여, 좌우절개를 따라 단계적으로 작업 복벽의 층을 통해 절개에 수직으로 실행 바늘을합니다. 봉합사를 묶고 잘라냅니다.
    2. 표면 복벽 폐쇄: 피부 절개의 정점을 식별하고 매장 된 실행 피실 3-0 흡수 성 폴리 필라멘트 봉합사를 사용하여 복부 피부를 봉합합니다. 피부 가장자리를 반대로 닫힌 절개에 외과 접착제를 적용합니다.
      1. 이렇게하려면 절개의 한 정점에 봉합사를 고정하고 절개 한 쪽의 한 쪽에서 피상적으로 깊이 봉합하고 다른 쪽은 피상적으로 봉합하십시오. 매듭을 묶는다. 부착 된 봉합사를 사용하여, 절개 작업 좌우절개에 평행 한 진피 층에서 실행 바늘을 합니다. 봉합사를 묶고 잘라냅니다.
  5. 수술 후 치료
    1. 마취에서 각성: 절개가 닫히면 이소플루란을 끄고 각성의 징후를 모니터링하는 동안 토끼가 마스크로 산소를 호흡하게하십시오 (예 : 후두 마스크 기도에서 자발적인 움직임, 눈 개폐 및 체질 운동). 이 징후가 나타나면 토끼를 추방하고 토끼가 경고하고 독립적으로 앉을 수있을 때까지 마스크와 따뜻한 담요로 산소를 제공합니다.
    2. 수술 후 모니터링: 토끼를 하루에 두 번 4일 동안 모니터링하고 매일 10일 동안 추가로 수술 후 모니터링합니다. 모니터링, 그들의 일반적인 상태를 평가, 그들의 음식과 물 섭취, 소변과 배설물 출력, 통증 평가, 무게, 활력 징후 (심장 박동, 호흡 속도) 붓기를 찾고 그들의 수술 사이트, 홍 반, 출력 또는 dehiscence.
    3. 수술 후 통증 조절: 매일 멜록시캄(0.2 mg/kg SQ)을 수술 후 48시간 동안 관리한 다음 통증 평가에 따라 필요에 따라 관리하십시오. buprenorphine즉시 수술 후 관리하고 모든 12 시간 (0.01-0.05 mg/kg SQ) 에 대한 24 시간 다음 통증 평가에 따라 필요에 따라
    4. 항생제 (enrofloxacin 5mg/kg IM) 수 의사에 의해 권장 되는 상처 감염을 방지 하기 위해 수술 후 7 일 동안 매일 관리 될 수 있습니다. 피하 유체를 관리 (15 SQ의 mL) 탈수에 필요한 하루에 두 번 및 부드러운 음식 또는 다른 식이 보조 제 체중 감량을 위해 필요에 따라 매일 제공 됩니다.

4. 종양 성장 모니터링

  1. 임상 모니터링: 수술 후 14일부터 종양 성장의 임상 징후가 나타나기 위해 2일마다 토끼를 모니터링합니다. 종양 성장의 임상 징후는 감소 경구 섭취를 포함 할 수있다, 혼수, 복부 부드러움, 만져 볼 수있는 복부 질량과 cecotrophy의 손실.
  2. 이미징 및 침습적 모니터링
    1. CT 화상 진찰: 수술 후 날 21-28에, 3.1.1-3.1.2에서 기술한 것과 같이, 사전 약, 마취 및 삽관 토끼. 토끼를 전임상 CT 스캐너에서 등지 위치에 놓고 정맥 내 요오헥솔 조영제의 10 mL를 투여한 후 골반 및 복부의 이미지를 얻었다.
    2. 외과 모니터링: 일반 마취 하에 있는 동안 이미징 후 수술실로 토끼를 옮김을 옮김을 옮김을 더합니다. 3.1.4단계에서 설명한 바와 같이 토끼의 위치, 준비 및 드레이프를 이전 절개를 통해 길이 약 1.5 cm의 반복 개복절을 수행한다. 자궁 뿔과 자궁 경적을 확인하고 종양을 주의 깊게 검사하십시오. 절개를 닫고 3.5.2-3.5.4 단계에서 설명한 대로 수술 후 치료를 제공합니다.
    3. 토끼 모형 사용: 토끼가 외과 감시의 때에 종양이 있는 것을 발견되는 경우에, 계획된 실험을 위한 토끼 자궁내막암 모형을 이용하십시오. 생체 내 전파 세포에서 생성된 토끼를 4주 접종 후 추가 실험을 위해 사용하고 접종 후 약 5-6주 동안 배양된 VX2 세포에서 생성된 토끼 모델을 사용하여 종양 성장 둔화를 고려합니다. 종양이 수의사 승인 방법을 사용하여 직경 1-1.5 cm (캘리퍼스로 외부로 측정)에 도달 한 후 토끼를 안락사시하십시오. 심박수와 호흡률을 포함한 활력 징후를 확인하여 안락사를 확인합니다. 베타딘 용액으로 부위를 청소 한 후 멸균 기구를 사용하여 종양을 절제하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

28 마리의 토끼가 자궁내막암 모델의 생성에 사용되었다. 토끼는 실험 당시 평균 체중이 2.83 kg (2.71-3.58 kg)이었다. 자궁 종양은 75%의 전반적인 모형 성공률을 위해 21개의 토끼에서 성공적으로 성장했습니다. 프로토콜에 자궁 봉합을 포함하기 전에, 성공률은 자궁 봉합 후 81 %에 비해 57 %였다. 자궁 봉합은 초기 낮은 모델 성공률에 응하여7th 토끼 후 프로토콜에 첨가되었다. 배양된 VX2 세포(8마리토끼, 63%의 성공률)와 16개의 토끼 모델에서 5개의 모델이 생성되었으며, 16개의 토끼 모델은 생체 내 전파 세포로부터 생성되었다(22, 73% 성공률). 생체 내 VX2 세포로부터 생성된 모델에서, 자궁경적 1회당 5 x 106의 세포 투여량을 모든 동물에서 사용하였고, 접종으로부터 실험까지의 평균 일수는 29일(범위 24-31)이었다. 배양된 VX2 세포로부터 생성된 모델에서, 에스컬레이션 용량 프로토콜은 적절한 접종 용량을 결정하는 데 사용되었다. 자궁경적혈구 당 2.5 x 106세포및 5 x 106세포의 투여량은 성공하지 못했고, 자궁경적10대6세포의 투여량은 1마리토끼에서 성공하였지만, 종양 성장은 57일에서 실험으로 느려졌다. 자궁경적당 20 x 106세포의 투여량은 접종으로부터 실험까지 45일(범위 36-51일)의 평균 시간에서 4개의 토끼에서 성공하였고, 따라서 최적의 주사 용량으로 결정되었다. 이 데이터는 표 1에요약되어 있습니다. 계5 항 후 PCR 분석에서, 배양된 VX2 세포는 마우스 LI NE-1의 미량만을 가진 토끼 LINE-1 및 CRPV-E6 모두에 대해 매우 양성이었다(<0.01 pg/μL). 세포는 이후 세포 배양에서 성장하였지만, 플라스크 컨플루엔성을 달성하기 위해 7일(6-9d)의 평균 시간으로 성장이 느렸다.

모든 모델은 성공적으로 복막 림프절의 전이성 변환을 초래했다(그림 2). 19개의 토끼는 병리학적으로 림프절 전이를 확인했고 11는 병리학적으로 엑스트라 노드 복부 전이를 확인했습니다. 한 토끼는 뚜렷한 림프절을 제거하지 않았습니다. 그러나 림프절 전이를 가정하고 실험 전에 한 마리의 토끼가 사망한 복강 내 질환에 대한 부담이 컸습니다. 배양된 VX2 세포에서 종양과 전이성 림프절은 세포학에 VX2 세포를 전파한 생체 내 종양과 유사하게나타났다(그림 3),조밀한 헤마톡실린 염색 세포가 근육을 침범하고 선과 같은 구조를 형성하고 많은 세포와 함께 병리학 적 유사 분열 수치.

새로운 화상 진찰 에이전트를 사용하여, Porphysome, 81 림프절은 연속적으로 및 외과로 적 분석을 위해 제거되었습니다. 74개의 림프절은 왼쪽 골반 림프절이었고, 5명은 오른쪽 골반 림프절이었고 2명은 우측 파라대동맥 림프절이었다. 생체 내에서 전파된 VX2 종양을 가진 토끼에서 제거된 림프절은 0.99 cm3(범위 0.12 - 3.89)와 0.59 cm 3(0.01- 0.01-0.01-)의 평균 부피를 가진 배양된 VX2 종양을 가진 토끼로부터 제거된 것보다 훨씬 크고 더 괴사적이었습니다. 2.92) (p=0.037). 또한, 생체내 전파 종양을 가진 토끼는 평균 길이 5.6cm (4-6.8 cm)와 5.2cm (3.3 - 9 cm)의 평균 폭5.6cm (2-5 cm) 및 4.56cm (3-7 cm)의 배양 된 세포 종양을 가진 토끼보다 더 큰 괴사 자궁 종양을 가졌다. 마지막으로, 생체 내 전파 VX2 세포로 만든 토끼 모델은 생체 내에서 전파된 토끼에서 발견되는 모든 전이의 91%를 가진 배양된 세포로 만든 토끼 모델보다 더 많은 엑스트라 아웃달 복부 전이를 가졌다.

Figure 1
그림 1: 자궁 봉합. 검은 색 화살표 = 봉합사, 빨간색 화살표 = 자궁 경적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: VX2 종양 (A)자궁 내 종양. 검은 화살표 = 종양, 적색 화살표 = 자궁 경적(B)전이성 왼쪽 골반 림프절. 검은 화살표 = 전이성 림프절. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 배양 된 세포 VX2 종양의 학비학 (A)H&E 염색은 주변 근육의 종양 침투를 입증합니다 (10배 배율, 스케일 바 = 300 μm)(B)팬시토케라틴 염색은 H&E의 종양 부위에 해당하는 조밀하게 염색되는 종양 세포를 보여줍니다(10x 배율, 배율 = 300 μm). 검은 색 화살표 = VX2 종양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

모델 유형 생체 내 VX2 종양 모델 배양 VX2 종양 모델
성공한 모델 수 16 5
시도된 모델 수 22* 8
모델 성공률 73% 63%
접종에서 실험까지의 시간 29일(24~31일) 45일(36-51일)
성공적인 주사 용량 1 x 107 40 x 106
(자궁경적당 5x106) (자궁경적 당 20 x 106)
전반적인 성공률 75%
자궁 봉합 전에 전반적인 성공률 57%
자궁 봉제 후 전반적인 성공률 81%

표 1: 실험 조건, 사용된 동물 수 및 성공률을 포함한 모델 데이터입니다. 성장이 실패한 배양 된 세포 종양 모델에 처음에 사용되는 2 마리의 토끼가 생체 내 종양 모델에 계속 사용되었습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

본 명세서에서, 우리는 VX2 자궁내막암 모델의 확립을 위한 표준화된 수술 방법을 보고하고 이 모델을 생성하기 위해 배양된 VX2 세포의 첫 번째 사용에 대해 보고하였다. 75%의 종양 복용율은 문헌35,37,53,56에이전에 보고된 100% 비율보다 낮다; 그러나 병리학적으로 확인 된 림프절 전이의 thw 90 % 비율은이 모델35,53의이전 연구와 일치합니다.

자궁 봉제의 포함은 모형 성공률을 57%에서 81%로 현저하게 증가시켰고 우리는 이 단계를 외과 프로토콜의 필수적인 부분으로 간주합니다. 자궁 봉합은 양측 자궁 동맥 결찰에서 자궁 뿔 탈동화에 관한 문헌및 관심사에 봉화의 사용의 충돌보고 때문에 처음에 수행되지 않았습니다. 자궁 봉화의 추가와 함께 테이크 레이트에 상당한 개선을 감안할 때, 우리는 주사 부위에서 멀리 세포 현탁액의 누설이 초기 낮은 성공률에 기여 할 수 있다고 가설. 해부학적으로 자궁 경적의 작은 부분에 세포 현탁액을 함유하는 것은 세포의 높은 국소 농도가 종양 생착을 향상시키는 근막의 혈관에 노출되도록 합니다. 더욱이, 자궁 혼 괴사의 아무 케이스도 실험에서 지적되지 않았습니다. 세포 현탁액이 myometrium으로 주입되는 것을 보장하는 것은 또한 자궁 내 또는 근심 증식 주사가 또한 세포 현탁액의 손실을 증가시킬 수 있기 때문에 중요합니다. 토끼의 자궁 근막은 매우 얇고 진정한 근심 증주사가 어렵다. 이 때문에, 우리는 Matrigel와 같은 세포 매트릭스 스캐폴드의 사용이 실수로 자궁 구멍에 주입되는 세포의 복용 속도를 향상시킬 수 있다고 가설. 이러한 잠재적한계에도 불구하고, 우리는 세포 현탁방법이 종양 블록이 자궁 근막상에 이식되는 이전에 보고된 미세수술 방법36보다 우수하다고 믿습니다. 비교에서, 여기에 방법은 간단하고, 일반적으로 사용되는 기술을 통합하고 이러한 이유로, 우리는 매우 재현 할 수 있다고 생각합니다.

생체 내 전파 VX2 토끼 모델은 VX2 토끼 모델과 협력자의 경험을 기반으로 자궁 경적 당 5 x 106 세포의 표준 용량으로 주입되었다. 이 투여량은 하리마외 52 및 5 x 109에 의해 1 x 108로 높은 세포 투여량이 황37,53 및 Xu35 모두에 의해 사용된 문헌에서 보고된 것보다 현저히 낮다. 모델이 확립된 짧은 시간 프레임과 림프절과 여분의 절절 전이의 높은 비율을 감안할 때, 우리는 더 높은 용량의 사용이 모델을 개선했을 것이라고 생각하지 않습니다. 더 높은 복용량 모델의 유용성을 손상 시킬 것 이다 훨씬 더 신속 하 고 공격적인 종양 확산을 촉진 수 있습니다. 생체 내 전파 VX2 모델의 83%는 실험 당시 엑스트라 노달 질환을 앓고 있었으며, 이는 다른 그룹이 30일에 복부 전이의 발병을 보고하지 않았다는 것은 놀라운 일이다. 이러한 차이에 대한 가능한 설명은 고압 또는 고속 주사로 인해 의도하지 않은 혈관 내접종(27)일 수 있으며, 이는 보다 신속한 원거리 전이성 확산을 초래할 수 있다. 따라서 우리는 주입의 속도가 프로토콜에 있는 느린 주입 속도를 추천하는 이유인 전이의 비율에 있는 요인이 될 수 있다는 것을 가설합니다.

비교적, 더 높은 주사 용량에도 불구하고 (자궁 경적 당 20 x 106), 배양 된 VX2 모델 토끼의 40 %만이 초절 질환을 개발했으며 모든 전이성 침전물은 이 토끼에서 눈에 띄게 작고 덜 괴사적이었다. 이 모델을 만들기 위해 배양된 VX2 셀을 처음 사용한 것으로 결과를 직접 비교할 수 있는 문헌은 없습니다. 그러나, 연구 결과는 높은 접종 용량이 요구되고 종양 성장이 느린 것으로 지적된 다른 배양 VX2종양의연구와 일치한다27,31. 이 실험을 통해, 우리는 에스컬레이션 복용량 프로토콜을 사용하여 토끼의 80 %에서 신뢰할 수있는 성장과 전이를 초래 자궁 경적 당 20 x 106 세포의 최적의 주사 용량을 확인했습니다. 배양된 VX2 세포의 더 높은 복용량은 VX2 세포가 배양에서 천천히 증가함에 따라 더 빠른 전이성 확산을 초래할 수 있지만, 더 높은 용량을 시도하기에 충분한 세포를 배양하는 것이 어려웠을 수 있습니다. 이것은 연구 결과의 한계이고 미래 조사를 위한 잠재적인 지역으로 이것을 확인했습니다. 그러나, 우리는 자궁내막암이 일반적으로 전이되는 느린 성장 질병이기 때문에, 자궁내막암의 임상 시나리오를 보다 안정적으로 복제할 수 있다고 믿기 때문에 배양된 세포 모델에서 느린 성장 속도가 유리하다고 생각한다. 골반 림프절및 늦은 먼 전이 결과. 마우스에서 VX2 세포를 전파하는 초기 선택은 더 빠른 처리 및 저렴한 유지 보수 비용을 허용; 그러나 대안적으로, 세포는 토끼의 사두근 근육에서 직접 파생될 수 있었습니다.

우리는 종양 성장의 표시 그리고 현상을 위한 가까운 수술 후 감시가 프로토콜의 중요한 양상이라고 믿습니다. 우리의 경험에서, 일단 토끼가 전이성 질병을 개발하면, 그(것)들은 임상으로, 특히 생체 내 전파 단에서 급속하게 진행합니다. 이 급속하고 공격적인 성장은 계획된 실험 날짜로부터 불과 2 일의 지연 후 전이성 질병에서 한 토끼의 죽음에 의해 강조되었다. VX2 모델 설립의 속도는 강도로 간주되었지만, 유사한 마우스 모델 (즉, 마우스에서 림프절 전이를 가진 HEC-1 자궁 내막 암종 모델)은57을확립하는 데 최대 두 배까지 걸릴 수 있습니다. 최적의 실험 타이밍을 결정하는 것이 가장 중요합니다. 연구 결과는 종양 성장 및 림프절 확대가 수술 후 2137,53후 크게 증가한 이전 연구와 상관 관계가 있습니다. 그러나 우리는 사용된 VX2 세포주에 대하여 가변성이 있을 것이라는 점을 믿고 그들의 특정 실험 타이밍을 이해하기 위하여 단을 격려합니다. 이 타임라인은 배양된 VX2 모델에 대해 사실이 아니며 추가 연구가 필요한 영역으로 확인되었습니다. 종양 성장에 관하여 확실하게 하기 위하여는, 우리는 프로토콜 도중 비침범성 및 침략적인 종양 감시를 둘 다 사용하기로 결정했습니다. 그러나, 또 다른 미래의 방향은 제2 침습적 시술에 대한 필요성을 피하기 위해 수술 후 이미징 프로토콜을 구체화하는 것일 수 있다.

전반적으로, 우리는 토끼에 있는 복회막 림프증을 가진 자궁내막암의 모형을 만드는 간단하고 표준화한 방법을 보고했습니다. 이 프로토콜을 통해, 우리는 세포 복용량, 외과 기술 및 수술 후 모델 모니터링에 관하여 VX2 문헌 내의 중요한 가변성을 해결했습니다. 우리는 연구 결과의 추가 한계가 인간 적인 이종이식 대신VX2 세포주를 사용하여 우리가 인간암의 종양 생물학 그리고 미세 환경을 완전히 모방하지 않는다는 것을 인식합니다. 그러나, 우리는 우리가 이 세포 모형이 그것의 느린 성장을 통해 인간 자궁내막암을 더 안정적으로 모델링할 수 있고 전이하는 경향을 감소시킬 수 있다고 믿기 때문에 다른 단이 배양된 VX2 세포를 사용하여 그들의 모형을 만들기를 희망합니다. 우리는 전이성 자궁내막암 환자를 돕기 위하여 새로운 화상 진찰 치료를 공부하기 위하여 자궁 유래 retroperitoneal 림프절 전이의 이 빠르고 쉬운 모형에 그밖 단을 격려합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 연구는 테리 폭스 연구소에 의해 투자되었다 (PPG # 1075), 건강 연구의 캐나다 연구소 (재단 보조금 #154326), 캐나다 암 학회 연구소 (704718), 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회, 혁신과 공주 마가렛 암 재단에 대한 Сanada 재단.

초기 VX2 모델과 냉동 VX2 종양 블록의 설립을 위한 초기 VX2 세포를 제공한 마거리트 아켄스 박사에게 감사드립니다. 초기 VX2 세포 배양 실험을 수행하고 VX2 세포 배양을 돕는 Lili Ding을 도와준 마르코 디그라파에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-blade scalpel, Sterile, Disposible Aspen Surgical (VWR) 80094-086
22-gague ear vein catheter CDMV 14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) Covidien 356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) Covidien 356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon Falcon 352350
Acepromazine (Atravet) CDMV 1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) CDMV 4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) UHN Stores 457955
Buprenorphine McGill University
Cefazolin UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Chlorhexidine solution CDMV 119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes Corning 354450 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates Corning 354408 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates Corning 354400 brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL Corning 354234
DMEM/HAM F12 1:1 Life Technologies 11320 brand not important
DMSO Caledon Lab Chem 1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable) CDMV 11242
Falcon Tube Corning Centri-Star 430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml Life Technologies 12483020 brand/source not important
Isoflurane UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Isohexol contrast GE Healthcare 407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%) CDMV 104674
Normal Saline House Brand (UofT Medstore) 1011
PBS Multicell or Sigma 331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) Corning-Cellgro CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) T.C.M.F (Dr Bristow) 28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive) 3M Vetbond 14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade Sigma T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml Wisent Inc 325-542-EL brand not important

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109 (2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49 (2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859 (2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Tags

암 연구 문제 151 자궁내막암 직교암 모델 VX2 세포주 림프데노병증 토끼 모델 외과 모델 세포 배양
생체 내 전파 및 배양 VX2 세포에서 만든 후각 성 림프절증을 가진 정형 외 자궁 내막 암 모델
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., … More

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., Rostami, A., Ding, L., Bratman, S. V., Akens, M. K., Irish, J. C., Bernardini, M. Q., Zheng, G. An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells. J. Vis. Exp. (151), e59340, doi:10.3791/59340 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter