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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Un modèle orthotopic de cancer de l'endomètre avec lymphadénopathie rétropéritonel fabriqué à partir de cellules VX2 propagées et cultivées

Published: September 12, 2019 doi: 10.3791/59340
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 5,6, 5,7,8, 7,9,11, 10, 5,11
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

Summary

Ce protocole présente une méthode normalisée pour cultiver des cellules VX2 dans la culture et pour créer un modèle orthotopic VX2 du cancer de l'endomètre avec des métastases rétropéritonéales de ganglion lymphatique chez les lapins. Les modèles orthotopiques de cancer de l'endomètre sont importants pour l'étude préclinique des modalités d'imagerie nouvelles pour le diagnostic des métastases de ganglion lymphatique.

Abstract

Le cancer de l'endomètre est la malignité gynécologique la plus courante en Amérique du Nord et l'incidence augmente dans le monde entier. Le traitement consiste en une chirurgie avec ou sans traitement adjuvant en fonction de la participation des ganglions lymphatiques telle que déterminée par lymphadenectomy. Lymphadenectomy est une procédure morbide, qui n'a pas été montrée pour avoir un avantage thérapeutique dans beaucoup de patients, et ainsi une nouvelle méthode pour diagnostiquer des métastases de ganglion lymphatique est exigée. Pour tester de nouveaux agents d'imagerie, un modèle fiable de cancer de l'endomètre avec métastases rétropéritones des ganglions lymphatiques est nécessaire. Le modèle de cancer endomètre vX2 a été décrit fréquemment dans la littérature ; toutefois, il existe des variations importantes en ce qui concerne la méthode d'établissement du modèle. En outre, aucune étude n'a rapporté sur l'utilisation de cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle que seules les cellules propagées in vivo ont été précédemment utilisés. Ici, nous présentons une méthode chirurgicale normalisée et une méthode de surveillance postopératoire pour l'établissement du modèle de cancer de l'endomètre VX2 et rapportons sur la première utilisation des cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle.

Introduction

Le cancer de l'endomètre, ou cancer de la muqueuse de l'utérus, est la deuxième malignité gynécologique la plus commune dans le monde et la malignité la plus commune dans les nations développées1. L'incidence du cancer de l'endomètre n'a cessé d'augmenter, augmentant de 2,3 % par an entre 2005 et 2013, avec une augmentation correspondante de 2,2 % de la mortalité1,2,3. Le diagnostic des métastases de ganglion lymphatique est primordial car la présence des ganglions lymphatiques positifs est un prédicteur négatif fort de la survie4,5,6,7et peut guider l'administration de thérapie adjuvante8,9,10,11,12,13. Les métastases des ganglions lymphatiques sont actuellement diagnostiquées en enlevant chirurgicalement le tissu lymphatique qui recense les principaux vaisseaux sanguins du bassin et de l'abdomen. Cette procédure, connue sous le nom de lymphadenectomy, est controversée en raison des données contradictoires de survie de deux grands essais14,15,16,17,18 et le connu risque de15,19,20 et morbidité postopératoire21,22,23. Comme les modalités actuelles d'imagerie non invasive n'ont pas la sensibilité et la spécificité requises pour remplacer la dissection24des ganglions lymphatiques, il y a eu une poussée pour développer de nouvelles techniques d'imagerie diagnostique. Pour tester ces nouvelles techniques dans un cadre préclinique, un modèle fiable de cancer de l'endomètre avec métastases rétropéritones des ganglions lymphatiques est nécessaire.

Le modèle de tumeur de lapin VX2 est un modèle bien établi qui a été employé intensivement pour étudier les tumeurs pleines humaines multiples d'organe25 comprenant le poumon26,la tête et le cou27,28, foie29,rein30, os31,32, cerveau33, pancréas34 et utérus35,36,37. Le modèle VX2 a été initialement développé en 1940 par Kidd et Rous38 en transplantant avec succès un virus du papillome de lapin à queue de coton découvert par Shope en 193339. Depuis lors, le modèle VX2 a été maintenu in vivo, nécessitant un passage en série dans le muscle quadriceps de lapins blancs de Nouvelle-Zélande40. Plus récemment cependant, plusieurs groupes ont réussi à cultiver des cellules VX2 in vitro40,41,42 et a démontré la tumorigénéité retenue de la lignée cellulaire cultivée31, 42,43. Les tumeurs vX2 sont histologiquement définies comme carcinomes squamous anapicieux de cellules44 et contiennent des dispositifs glandulaires qui ressemblent à l'adénocarcinome26. Les tumeurs sont caractérisées par la facilité d'implantation, la croissance rapide et l'hypervascularité44,45 et métastasé de façon fiable, le plus souvent aux ganglions lymphatiques régionaux et éloignés45. Les similitudes dans l'anatomie vasculaire et lymphatique utérine46 aussi bien que le site de croissance orthotopic assurent que le modèle métastatique du carcinome de Lapin VX2 imite celui du cancer humain d'endomètre, faisant le modèle de VX2 un modèle fiable pour étudier l'humain métastatique. En outre, les dispositifs histologiques tels que la prolifération microvasculaire anormale47, aussi bien que les similitudes immunologiques48 et génétiques49,50 entre les humains et les lapins suggèrent que la tumeur microenvironnement peut refléter celui du cancer de l'endomètre humain.

Plusieurs groupes ont fait rapport sur l'utilisation de VX2 pour créer un modèle de cancer de l'endomètre avec métastases rétropéritoéneavecles avec un taux élevé de réussite signalé36,51,52; cependant, il existe des variations significatives dans la littérature actuelle en ce qui concerne la méthode de création de modèles. Des doses de suspension cellulaire aussi bas que 4 x 105 cellules/corne utérine51 et aussi haut que 5 x 109 cellules/corne utérine37,53 ont été rapportées sans consensus standard sur la dose cellulaire VX2 requise. En outre, une série de méthodes d'inoculation ont été rapportées comprenant l'implantation micro-chirurgicale de la tumeur dans le myometrium utérin36,injection de suspension de cellules de VX237,44,52 , 53 et dans certains cas, l'ajout de la suture de corne utérine avant l'innoculation52. Enfin, aucun groupe n'a signalé l'utilisation de cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle. Ainsi, le but de cette étude est de démontrer une méthode normalisée réussie de création de modèle de VX2 et de rapporter la première utilisation des cellules cultivées de VX2 pour créer un modèle du cancer d'endomètre avec des métastases rétropéritoéines dans un lapin.

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Protocol

Fermeture profonde de la paroi abdominale : Identifiez le sommet de l'incision péritonéale et saisissez le péritoine, le rectus muscle et le fascia avec des forceps de tissu. Toutes les études sur les animaux ont été menées dans des installations approuvées par le Réseau universitaire de santé du Centre de ressources animales (ARC) et conformément aux protocoles approuvés d'utilisation et de soins des animaux (AUP #3994/#4299). La lignée cellulaire VX2 a été obtenue du laboratoire du Dr Aken au Réseau universitaire de santé.

1. Création d'une lignée cellulaire VX2 in vitro

  1. Récoltez la tumeur de VX2 du muscle de quadricep de lapin et la croissance dans le flanc de souris.
    1. Décongeler les blocs tumoraux VX2 congelés (1 cm x 1 cm), hacher sur une plaque de culture à l'aide d'une lame de scalpel et passer à travers un filtre de 70 m en ajoutant de petites quantités de solution de sel équilibrée Hanks (HBSS) séquentiellement pour s'assurer que toutes les cellules sont tendues pour un volume final de 1 ml.
    2. Compter les cellules et diluer avec 0,9% de phosphate tamponné solution saline à une concentration de 1 x 107/mL et placer sur la glace dans un tube stérile.
      REMARQUE : Des blocs de tumeur ont été obtenus d'un collaborateur de laboratoire de la propagation précédente des tumeurs de VX2 dans les muscles de quadriceps de lapin.
    3. Anesthésiez un lapin blanc femelle de Nouvelle-Zélande (poids 2,5-3,5 kg) avec 2-5% d'isoflurane inhalé, retirez la fourrure qui recense le site d'injection et nettoyez le site d'injection avec une solution povidone-iode. Injecter 500 l de la suspension vX2 préparée (5 x 106 cellules/mL) dans le muscle quadriceps du lapin. Surveiller le lapin cliniquement pour la croissance tumorale à partir du jour 10.
    4. Euthanasier les lapins après que les tumeurs atteignent 1-1,5 cm de diamètre (mesuré à l'extérieur avec des étriers) en utilisant une méthode approuvée par le vétérinaire. Confirmer l'euthanasie en vérifiant les signes vitaux, y compris la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire. Accise la tumeur à l'aide d'instruments stériles après le nettoyage de la zone avec la solution de bêtadine.
    5. Dans une armoire de sécurité biologique à l'aide d'instruments stériles, hacher la tumeur en petits morceaux (0,2 cm) sur un plat de culture tissulaire de 10 cm à l'aide d'une lame de scalpel. Passer les fragments de tumeur à travers une passoire de cellules de 70 m à l'aide de 1 ml de HBSS tel que décrit à l'étape 1.1.1. Comptez les cellules et diluez à l'aide d'une solution saline de 0,9 % pour obtenir 7,5 x 105 cellules dans 200 L.
    6. Anesthésier les souris gamma nod scid mâles NOD (poids 25 g) en utilisant 4% d'isoflurane à 1 L/min et maintenir l'anesthésie en utilisant 2% d'isoflurane. Une fois que les souris sont anesthésiées, injectez 200 L de la solution à partir de l'étape 1.1.5 dans le tissu sous-cutané du flanc de la souris à l'aide d'une aiguille de 27 jauges.
  2. Récolte et passage des cellules VX2 in vitro
    1. Surveiller la croissance du xénogreffe cliniquement deux fois par semaine jusqu'à ce que les tumeurs atteignent 1 cm de diamètre à l'aide de calipers.
    2. Euthanasier les souris en plaçant dans une chambre de CO2 ou en effectuant une luxation cervicale après l'anesthésie avec 4% de gaz isoflurane. Exciser les tumeurs dans des conditions stériles dans un coffret de sécurité biologique.
    3. Mince tumeurs avec un scalpel en morceaux de 1-2 mm dans un plat de culture tissulaire de 6 cm contenant 3 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham F12MD 10% fetal bovine serum (FBS) media.
    4. Laissez les fragments tumoraux intacts dans un incubateur de 37 oC avec 5 % de CO2 pendant deux jours jusqu'à ce que les cellules commencent à se développer à partir des morceaux tumoraux. Par la suite, vérifiez quotidiennement les plaques cultivées par microscopie légère pour vérifier la confluence cellulaire. En atteignant 70% de confluence, trypsiniser les cellules en ajoutant 1 ml de trypsine de 0,05% au flacon et en remettant dans l'incubateur de 37 oC pendant 5 min.
    5. Neutraliser la trypsine avec 6 ml de F12 DMEM/Ham , 10% fbS moyen, recueillir les cellules et la centrifugeuse à 4 oC pendant 5 min à 300 x g. Retirez le supernatant et suspendez à nouveau les granulés dans 3,5 mL de nouveaux médias F12 DMEM/Ham,10 % FBS. Graine de collagène frais de 6 cm J'ai enduit les assiettes de 1,6 x 106 cellules par assiette pour atteindre environ 50% de densité d'ensemencement cellulaire.
      REMARQUE : La densité cellulaire de50 % désigne les cellules qui prennent 50 % de la surface de la plaque lorsqu'elles sont fixées.
    6. Passaging précoce : Répétez le processus ci-dessus (trypsinisation, ensemencement) jusqu'à ce que les cellules aient été passages 5 fois, puis évaluez la pureté de la lignée cellulaire avec PCR à l'aide d'un test quantitatif DE PCR pour distinguer l'ADN génomique du lapin de l'ADN génomique de souris (voir l'étape 1.3.1-1.3.4).
      REMARQUE : Après 8 passages, les cellules peuvent être propagées sur les plaques de culture régulière de tissu adhérent de non-collagen enduit.
    7. Passage, trypsiniser et congeler les aliquots des cellules dans DMEM/HAM F12-30% FBS-10%DMSO à une concentration de 2 x 106 par flacon. Conserver les cellules dans de l'azote liquide jusqu'à ce qu'elles soient nécessaires aux expériences.
  3. Confirmation de l'origine VX2 des cellules survivantes :
    1. Créez un traitement standard à partir de l'ADN génomique purifié de souris et de lapin (étape 1.3.2 et étape 1.3.3). Utilisez des amorces qui ciblent des séquences spécifiques aux espèces dans le deuxième cadre de lecture ouverte de l'élément rétrotransposon LINE-1.
      REMARQUE: Les séquences d'apprêt pour CRPV E6 sont: 5'- GATCCTGGACCCAACCAGTGand 5'-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Les éléments de rétrotransposon LINE-1 ont été utilisés. Les séquences d'apprêt pour lapin LINE-1 sont les suivante : 5'-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC et 5'-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT Les séquences d'apprêt pour la souris LINE-1 sont : 5'-AATGGAAAGCCACATTCACGTG et 5'-CCTTCCTTTGAgAgAGAGAGAGAG
    2. Pour créer une courbe standard pour CRPV E6, purifier le lysate de cellule tumorale VX2 (étape 1.1.1) à l'aide d'un kit commercial suivant le protocole du fabricant. Quantifier cet ADN à l'aide d'un test commercial. Effectuez 6 dilutions en série de 225 pg/L à 0,925 pg/L dans un tampon EDTA-TE faible. Pour créer une courbe standard pour l'ADN génomique de la souris, diluer 100 g d'ADN génomique commercial de souris dans un tampon EDTA-TE faible en 5 dilutions de 125 pg/L jusqu'à 0,0125 pg/L.
    3. Placer 4 L de chaque solution diluée à partir des échantillons de l'étape 1.3.2 dans les puits et exécuter des échantillons dans un thermocycler PCR. Utilisez les valeurs Cq de chaque course avec les montants d'ADN par puits pour calculer une courbe standard à l'aide des paramètres de seuil automatique du logiciel thermocycler.
    4. Utilisez des procédures qPCR standard pour effectuer le PCR avec 40 cycles de vélo en 2 étapes (98 oC et 60 oC) sur un thermocycleur. Établissez des valeurs de seuil, et fixez les valeurs delta Ct à 'gt;35 pour s'assurer qu'il y a une contamination minimale de souris dans la lignée cellulaire VX2 du lapin. Le volume total de chaque réaction était de 10 L, soit 5 L de Mastermix 2x, 1 L d'amorces avant et inverses avec une concentration finale d'apprêt en réaction à 250 nM, et 4 l d'échantillon d'ADN.
      REMARQUE: S'il vous plaît voir les références54,55 pour plus de détails sur l'exécution PCR. Les valeurs de seuil sont établies, et les valeurs delta Ct sont fixées à 'gt;35 pour s'assurer qu'il y a une contamination minimale de la souris dans la lignée cellulaire VX2 du lapin. Le niveau recommandé d'ADN VX2 pour une détection fiable par qPCR est de 1-10 pg.

2. Culture cellulaire VX2 et création de suspension cellulaire

  1. Décongeler les flacons contenant des cellules VX2 (congelées à l'étape 1,2,7) dans un bain d'eau à 37 oC pendant 1 minute et transférer les cellules dans un tube conique de centrifugeuse avec 10 ml de milieu de culture (1:1 DMEM/F-12 - 10 % FBS et 1 % pénicilline-streptomycine). Centrifugeuse pendant 8 min à 107 x g,jeter le supernatant et re-suspendre la pastille cellulaire dans 9 ml de support.
  2. Transférer les cellules resuspendues dans un grand flacon de culture. Incuber les cellules sans trembler à 37 oC. Vérifiez les cellules quotidiennement pour la confluence à l'aide de la microscopie légère et changer les médias de culture tous les trois jours.
  3. Création de suspension de cellules VX2 cultivée pour l'injection
    1. Trypsiniser les cellules en ajoutant 3 ml de 0,25% de trypsine à flacon une fois que les cellules ont atteint 80% confluence. Placer le flacon dans un incubateur (37 oC) pendant 5 min. Transférer la solution dans un tube conique de centrifugeuse et une centrifugeuse pendant 8 min à 107 x g, puis retirer le supernatant.
    2. Laver les granulés de cellules 3 fois avec 9 ml de phosphate tamponné saline, centrifugeuse et enlever supernatant comme ci-dessus. Comptez les cellules et diluez avec une solution saline tamponnée de phosphate de 0,9 % à une concentration de 4 x 107 cellules/mL et placez-les dans un tube de centrifugeuse conique stérile sur la glace.
  4. Création d'une suspension cellulaire VX2 progated in vivo pour injection
    1. Décongeler les blocs tumoraux VX2 congelés (1 cm x 1 cm), hacher sur une plaque de culture à l'aide d'une lame de scalpel et passer à travers un filtre de 70 m comme à l'étape 1.1.1. Ajouter de petites quantités de HBSS séquentiellement pour s'assurer que toutes les cellules sont tendues pour un volume final de 1 ml. Compter les cellules et diluer avec 0,9% de phosphate tamponné saline à une concentration de 1 x 107/mL et placer sur la glace dans un tube stérile.
      REMARQUE : Des blocs de tumeur ont été obtenus d'un collaborateur de laboratoire de la propagation précédente des tumeurs de VX2 dans les muscles de quadriceps de lapin.

3. Établissement modèle chirurgical

  1. Établissement de l'anesthésie chirurgicale et de la préparation préopératoire
    1. Prémédicer les lapins blancs de Nouvelle-Zélande (2,5-3,5 kg) 1 h avant l'intervention chirurgicale prévue à l'aide d'injections d'acépromazine (1 mg/kg de MMI) et de méloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anesthésiez un lapin blanc femelle de Nouvelle-Zélande (poids 2,5-3,5 kg) avec 2-5% d'isoflurane inhalé, retirez la fourrure qui recense le site d'injection et nettoyez le site d'injection avec une solution povidone-iode.
    2. Lapins anesthésiés intubants utilisant une voie aérienne de masque laryngé (LMA) et fixent en place avec le ruban adhésif, maintenant l'anesthésie profonde en titrant la dose inhalée d'isoflurane entre 2-5%. Surveiller régulièrement l'anesthésie chirurgicale tout au long de l'intervention en vérifiant les signes vitaux (taux respiratoire, recharge capillaire, saturation en oxygène si disponible) et en surveillant les signes suggérant une douleur (mouvement, sevrage des stimuli, bruits) ou de la lumière anesthésie (mouvement, mastication sur tube LMA).
      REMARQUE: Cela devrait être fait par quelqu'un avec l'expérience de surveillance de l'anesthésie chirurgicale.
    3. Placez un cathéter de 22 calibres dans la veine dorsale marginale. Administrer la cefazolin (20 mg/kg) par voie intraveineuse 10 min avant l'incision chirurgicale de la peau.
    4. Clip cheveux sur le bassin et l'abdomen avant de placer le lapin sur la table d'opération, puis placer les lapins dans une position dorsal sur la table d'opération. Nettoyez le champ chirurgical à l'aide d'une préparation chirurgicale en 3 étapes de la peau (savon de bêtadine, solution de chlorhexidine, solution de bêtadine). Draper le champ chirurgical avec des rideaux de laparotomie après avoir marqué la terre du dessus de l'os pubien, laissant une zone de 5 cm x 5 cm du bas-ventre exposée.
  2. Création de l'incision laparotomie et identification des cornes utérines
    1. Mettez un bonnet chirurgical et un masque facial. Frotter les mains à l'aide de chlorhexidine ou de solution de gommage chirurgical à la bêtadine. À l'aide d'une technique stérile, enfilez une robe stérile et des gants chirurgicaux stériles.
    2. À l'aide d'un scalpel à 11 lames, faire une incision de 2,5 cm de long de 1 cm crânienne au pubis de symphyse à travers la peau et les tissus sous-cutanés de l'abdomen du lapin. Inciser le rectus fascia et disséquer les muscles rectus latéralement pour exposer le péritoine sous-jacent. Entrez dans le péritoine brusquement après s'être assuré que le sous-sol est dégagé de l'intestin ou d'autres organes abdominaux.
    3. Localiser les cornes utérines identifiant la vessie et balayant un doigt ganté de façon supérieure, postérieure et latérale au-dessus de l'apex de la vessie.
      REMARQUE : Si nécessaire, la vessie complète peut être vidée à l'aide d'une pression numérique. Une fois localisé, apportez les cornes utérines par l'incision abdominale pour se reposer sur la paroi abdominale.
    4. À l'aide d'une suture absorbable tressée de 3 à 0, effectuer une seule ligature de suture de chaque corne utérine d'environ 1,5 à 2,0 cm distale pour les cervices. Placez la suture juste médiale aux artères utérines, qui courent le long de l'aspect latéral de chaque corne. Attachez les sutures confortablement pour obstruer les cornes utérines distales (Figure 1).
  3. Inoculation myometrial VX2
    1. À l'aide d'une aiguille de calibre 27, injectez 0,5 ml de la suspension cellulaire VX2 préalablement préparée à partir de l'étape 2.3.2 (pour le modèle VX2 cultivé) ou de 2,4 (pour le modèle VX2 propiedisé in vivo) dans le myometrium de chaque corne utérine proximale au site de suture (entre le site de suture et le col de l'utérus). Injectez plus d'une minute et assurez-vous que les cellules ne sont pas injectées dans la cavité utérine sous-jacente. Anesthésier les animaux à l'isoflurane inhalé (2-5%) et une machine anesthésique avec un circuit Bain.
    2. Appliquer une pression sur le site d'injection myometrial e pendant 30 s après injection pour minimiser les fuites de cellules. Inspectez les sites d'injection et de suture pour l'hémostase et placez les cornes utérines dans l'abdomen.
  4. Fermeture de l'incision chirurgicale
    1. Fermeture profonde de la paroi abdominale : Identifiez le sommet de l'incision péritonéale et saisissez le péritoine, le rectus muscle et le fascia avec des forceps de tissu.
      1. Pour ce faire, ancrer la suture à un sommet de l'incision en suçant superficielle à profonde d'un côté de l'incision et profonde à superficielle de l'autre. Attachez un noeud. À l'aide de la suture attachée, faire des points de course perpendiculaires à l'incision à travers les couches de la paroi abdominale en travaillant pas à pas le long de l'incision d'un côté à l'autre. Attachez la suture et coupez.
    2. Fermeture superficielle de la paroi abdominale : Identifiez le sommet de l'incision cutanée et suturez la peau abdominale à l'aide de sutures sous-cuticulaires sous-cuticulaires 3-0 absorbables enfouies. Appliquer de la colle chirurgicale sur l'incision fermée pour s'opposer aux bords de la peau.
      1. Pour ce faire, ancrer la suture à un sommet de l'incision, en suçant profondément à superficiel d'un côté de l'incision et superficielle à profonde de l'autre. Attachez un noeud. À l'aide des sutures jointes, faire des points de course dans la couche cutanée parallèle à l'incision de travail étape-sage le long de l'incision d'un côté à l'autre. Attachez la suture et coupez.
  5. Soins postopératoires
    1. Réveil de l'anesthésie : Éteignez l'isoflurane une fois l'incision fermée et laissez le lapin respirer de l'oxygène par masque tout en surveillant les signes d'éveil (p. ex., mouvements spontanés, ouverture des yeux et mouvements de mastication sur les voies respiratoires du masque laryngé). Extubez le lapin une fois que ces signes sont notés et fournissez l'oxygène par le masque et une couverture chaude jusqu'à ce que les lapins soient alertes et capables de s'asseoir indépendamment.
    2. Surveillance postopératoire : Surveillez les lapins deux fois par jour pendant 4 jours et tous les jours pendant 10 jours supplémentaires après l'opération. Pour surveiller, évaluer leur état général, leur consommation de nourriture et d'eau, la sortie d'urine et de matières fécales, l'évaluation de la douleur, le poids, les signes vitaux (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire) et leur site chirurgical à la recherche d'enflure, d'érythème, de décharge ou de déhiscence.
    3. Contrôle de la douleur postopératoire : Administrer Meloxicam tous les jours (0,2 mg/kg SQ) pendant 48 h après l'opération, puis au besoin en fonction de l'évaluation de la douleur. Administrer la buprénorphine immédiatement postopératoirement et toutes les 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) pendant 24 h, puis au besoin en fonction de l'évaluation de la douleur
    4. Les antibiotiques (enrofloxacine 5mg/kg IM) peuvent être administrés quotidiennement pendant sept jours après l'opération pour prévenir l'infection des plaies comme recommandé par votre vétérinaire. Administrer des liquides sous-cutanés (15 ml de SQ) deux fois par jour, au besoin, pour la déshydratation et les aliments mous ou d'autres suppléments alimentaires sont fournis quotidiennement au besoin pour la perte de poids.

4. Surveillance de la croissance tumorale

  1. Surveillance clinique : Surveillez les lapins tous les 2 jours pour détecter les signes cliniques de croissance tumorale à partir du jour postopératoire 14. Les signes cliniques de la croissance de tumeur peuvent inclure la prise orale diminuée, la léthargie, la tendresse abdominale, la masse abdominale palpable et la perte de cecotrophy.
  2. Imagerie et surveillance invasive
    1. Imagerie par tot : Le jour postopératoire 21-28, prémédication, anesthésie, et intubé des lapins comme précédemment décrit dans 3.1.1-3.1.2. Placez les lapins dans une position dorsale dans un scanner préclinique et obtenez des images du bassin et de l'abdomen après avoir administré 10 ml d'agent de contraste d'iophéxol intraveineux.
    2. Surveillance chirurgicale : Transférer les lapins à la salle d'opération après l'imagerie alors qu'ils sont encore sous anesthésie générale. Positionner, préparer et draper les lapins comme décrit précédemment à l'étape 3.1.4 et effectuer une incision répétée laparotomie d'environ 1,5 cm de longueur à travers l'incision précédente. Identifiez les cornes et les cornes utérines et examinez soigneusement pour la tumeur. Fermez l'incision et fournissez des soins postopératoires comme décrit précédemment à l'étape 3.5.2-3.5.4.
    3. Utilisation du modèle de lapin : Si les lapins se trouvent pour avoir des tumeurs au moment de la surveillance chirurgicale, emploient des modèles de cancer de l'endomètre de lapin pour des expériences prévues. Utilisez des lapins créés à partir de cellules proéragtées in vivo pour des expériences supplémentaires à 4 semaines après l'inoculation et utilisez des modèles de lapins créés à partir de cellules VX2 cultivées à environ 5-6 semaines après l'inoculation pour tenir compte de la croissance plus lente de la tumeur. Euthanasier les lapins après que les tumeurs atteignent 1-1,5 cm de diamètre (mesuré à l'extérieur avec des étriers) en utilisant une méthode approuvée par le vétérinaire. Confirmer l'euthanasie en vérifiant les signes vitaux, y compris la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire. Accise la tumeur à l'aide d'instruments stériles après le nettoyage de la zone avec la solution de bêtadine.

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Representative Results

Vingt-huit lapins ont été utilisés pour la création du modèle du cancer de l'endomètre. Les lapins avaient un poids moyen de 2,83 kg (2,71-3,58 kg) au moment de l'expérience. Les tumeurs utérines ont avec succès grandi dans 21 lapins pour un taux global de succès de modèle de 75%. Avant l'inclusion de la suture utérine dans le protocole, le taux de réussite était de 57% comparé à 81% après que la suture utérine ait été ajoutée. La suture utérine a été ajoutée au protocole après le 7e lapin en réponse au faible taux de réussite initial du modèle. Cinq modèles ont été créés à partir de cellules VX2 cultivées (tentées chez 8 lapins, taux de réussite de 63 %) et 16 modèles de lapins ont été créés à partir de cellules propagées in vivo (tentées dans un taux de réussite de 22, 73 %). Dans les modèles créés à partir de cellules VX2 propagées in vivo, une dose cellulaire de 5 x 106 par corne utérine a été utilisée chez tous les animaux et le nombre moyen de jours entre l'inoculation et l'expérience était de 29 jours (gamme 24-31). Dans les modèles créés à partir de cellules VX2 cultivées, un protocole de dose croissante a été utilisé pour déterminer la dose d'inoculation appropriée. Les doses de 2,5 x 106 cellules et 5 x 106 cellules par corne utérine ont échoué et une dose de 10 x 106 cellules par corne utérine a été réussie dans un lapin cependant, la croissance de tumeur était lente à 57 jours de l'inoculation à l'expérience. Une dose de 20 x 106 cellules par corne utérine a été réussie dans 4 lapins dans un temps moyen de 45 jours (gamme 36 - 51 jours) de l'inoculation à l'expérience et a donc été déterminée comme dose d'injection optimale. Ces données sont résumées au tableau 1. Lors de l'analyse PCR après le passage 5, les cellules VX2 cultivées étaient très positives pour Rabbit LINE-1 et CRPV-E6 avec seulement des traces de souris LI NE-1 a été identifiée (lt;0,01 pg/L). Les cellules ont été plus tard cultivées dans la culture cellulaire cependant, la croissance a été lente avec un temps moyen de 7 jours (6-9 d) pour réaliser la confluence de flacon.

Tous les modèles ont réussi à entraîner la transformation métastatique des ganglions lymphatiques rétropéritonés (Figure 2). Dix-neuf lapins ont eu les métastases pathologiquement confirmées de ganglion lymphatique et 11 ont eu pathologiquement confirmés les métastases abdominales extra-nodal. Un lapin n'a pas eu les ganglions lymphatiques distincts enlevés ; cependant, il a eu un fardeau élevé de la maladie intra-abdominale dans laquelle des métastases de ganglion lymphatique ont été supposées, et un lapin est mort avant l'expérience. Les tumeurs et les ganglions lymphatiques métastatiques des cellules VX2 cultivées sont apparues semblables aux tumeurs des cellules VX2 propagées in vivo sur l'histologie (Figure 3), avec des cellules tachées d'hématoxylin dense envahissant le muscle et formant des structures glandulaires-comme avec beaucoup figures mitotiques pathologiques.

À l'aide d'un nouvel agent d'imagerie, le Porphysome, 81 ganglions lymphatiques ont été identifiés intraopératoirement et chirurgicalement enlevés pour l'analyse histologique. 74 ganglions lymphatiques ont été laissés ganglions lymphatiques pelviens, 5 étaient les ganglions lymphatiques pelviens droits et 2 étaient les ganglions lymphatiques para-aortiques droits. Les ganglions lymphatiques enlevés des lapins avec les tumeurs vX2 propagées in vivo étaient sensiblement plus grands et plus nécrotiques que ceux enlevés des lapins avec les tumeurs cultivées de VX2 avec un volume moyen de 0.99 cm3 (gamme 0.12 - 3.89) contre 0.59 cm3 (0.01 - 2,92) (p 0,037). En outre, les lapins avec les tumeurs propagées in vivo ont eu de plus grandes tumeurs utérines plus nécrotiques que des lapins avec des tumeurs cultivées de cellules avec une longueur moyenne 5.6cm (4-6.8 cm) et largeur moyenne de 5.2cm (3.3 - 9 cm) contre 3.6cm (2-5 cm) et de 4.56cm (3-7 cm) respectivement. Enfin, les modèles de lapins fabriqués à partir de cellules VX2 propagées in vivo présentaient plus de métastases abdominales extra-nodales que les modèles de lapins fabriqués à partir de cellules cultivées avec 91 % de toutes les métastases trouvées dans les lapins propagés in vivo.

Figure 1
Figure 1 : suturing utérin. Flèche noire , sutures, flèche rouge et cornes utérines. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Tumeur VX2 (A) Tumeur intra-utérine. Flèche noire , tumeur, flèche rouge et cornes utérines (B) Ganglions lymphatiques pelviens gauches métastatiques. Flèche noire et ganglions lymphatiques métastatiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Histologie de la tumeur de VX2 de cellules cultivées (A) La coloration de H et E démontre l'infiltration de tumeur du muscle environnant (grossissement de 10x, barre d'échelle - 300 m) (B) la coloration de Pancytokeratin démontre les cellules de tumeur de coloration dense correspondant aux secteurs de tumeur sur H et E (10x (10x grossissement, échelle de 300 m). Flèche noire - tumeur VX2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Type de modèle Modèle de tumeur In vivo VX2 Modèle de tumeur VX2 cultivé
Nombre de modèles réussis 16 5
Nombre de tentatives de modèles 22* 8
Taux de réussite du modèle 73% 63%
Temps de l'inoculation à l'expérimentation 29 jours (24-31) 45 jours (36-51)
Dose d'injection réussie 1 x 107 40 x 106
(5x106 par corne utérine) (20 x 106 par corne utérine)
Taux de réussite global 75%
Taux de réussite global avant la suture utérine 57%
Taux de réussite global après suture utérine 81%

Tableau 1 : Données du modèle, y compris les conditions expérimentales, le nombre d'animaux utilisés et le taux de réussite. 2 lapins utilisés initialement pour les modèles de tumeurs cellulaires cultivées dans lesquels la croissance a été infructueuse ont ensuite été utilisés pour les modèles tumoraux in vivo

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Discussion

Ici, nous avons rapporté une méthode chirurgicale normalisée pour l'établissement d'un modèle de cancer de l'endomètre VX2 et rapporté sur la première utilisation des cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle. Le taux de prise de tumeur de 75% est inférieur au taux de 100% pour cent précédemment rapporté dans la littérature35,37,53,56; cependant, thw 90% taux de métastases pathologiquement confirmées de ganglion lymphatique est compatible aux études précédentes de ce modèle35,53.

L'inclusion de la suture utérine a considérablement augmenté le taux de réussite du modèle de 57 % à 81 % et nous considérons cette étape comme faisant partie intégrante du protocole chirurgical. La suture utérine n'a pas été au commencement exécutée due aux rapports contradictoires de l'utilisation de suture dans la littérature et des soucis concernant la dévascularisation utérine de corne de la ligature utérine bilatérale. Compte tenu de l'amélioration significative du taux de prise avec l'ajout de suture utérine, nous émettons l'hypothèse que la fuite de la suspension cellulaire loin du site d'injection peut avoir contribué au faible taux de réussite initial. La suspension anatomique de la cellule dans une petite partie de la corne utérine assure qu'une forte concentration locale de cellules est exposée à la vascularisation du myometrium qui améliore probablement l'engraftment tumoral. En outre, aucun cas de nécrose utérine de corne n'a été noté dans l'expérience. Il est également important de s'assurer que la suspension cellulaire est injectée dans le myometrium, car les injections intra-utérines ou extra-myométriales peuvent également augmenter la perte de suspension cellulaire. Le myometrium utérin chez les lapins est extrêmement mince et l'injection intra-myométriale véritable est difficile. Pour cette raison, nous émettons l'hypothèse que l'utilisation d'un échafaudage de matrice cellulaire tel que Matrigel peut améliorer le taux de prise des cellules qui sont injectées par inadvertance dans la cavité utérine. En dépit de ces limitations potentielles, nous croyons que la méthode de suspension de cellules est supérieure aux méthodes microchirurgicales précédemment rapportées36 dans lesquelles des blocs de tumeur sont greffés sur le myometrium utérin car cette méthode est techniquement provocante. En comparaison, la méthode ici est simple, intègre des techniques couramment utilisées et c'est pour ces raisons, nous croyons qu'il est très reproductible.

Les modèles de lapin VX2 propagés in vivo ont été injectés avec une dose standard de 5 x 106 cellules par corne utérine qui était basée sur l'expérience d'un collaborateur avec des modèles de lapin VX2. Cette dose est significativement plus faible que rapportée dans la littérature dans laquelle des doses de cellules aussi élevées que 1 x 108 par Harima et autres52 et 5 x 109 par Huang37,53 et Xu35 ont été employées. Étant donné le court laps de temps dans lequel le modèle a été établi et le taux élevé de ganglions lymphatiques et de métastases extra-nodales, nous ne croyons pas que l'utilisation d'une dose plus élevée aurait amélioré le modèle. Une dose plus élevée peut avoir favorisé la propagation tumorale encore plus rapide et agressive qui altérerait l'utilité du modèle. 83% des modèles VX2 propagés in vivo avaient une maladie extra-nodale au moment de l'expérience et il est surprenant que d'autres groupes n'aient pas signalé le développement de métastases abdominales à 30 jours. Une explication possible pour cette différence pourrait être l'inoculation intra-vasculaire par inadvertance27 due à la haute pression ou à l'injection à grande vitesse qui peut avoir comme conséquence la propagation métastatique éloignée plus rapide. Nous émettons donc l'hypothèse que la vitesse d'injection peut être un facteur dans le taux de métastases, c'est pourquoi nous recommandons une vitesse d'injection lente dans le protocole.

En comparaison, malgré la dose d'injection plus élevée (20 x 106 par corne utérine), seulement 40 % des lapins modèles VX2 cultivés ont développé une maladie extra-nodale et tous les dépôts métastatiques étaient sensiblement plus petits et moins nécrotiques chez ces lapins. Nous n'avons pas de littérature avec laquelle comparer directement les résultats car il s'agit de la première utilisation signalée de cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle. Cependant, les résultats sont compatibles avec des études d'autres tumeurs cultivées de VX2 dans lesquelles des doses élevées d'inoculation ont été exigées et la croissance de tumeur a été notée pour être lente27,31. Grâce à cette expérience, nous avons identifié la dose d'injection optimale de 20 x 106 cellules par corne utérine qui a abouti à une croissance fiable et des métastases chez 80% des lapins en utilisant un protocole de dose croissante. Il est possible qu'une dose encore plus élevée de cellules VX2 cultivées se traduirait par une propagation métastatique plus rapide cependant que les cellules VX2 a grandi lentement dans la culture, il était difficile de la culture suffisamment de cellules pour tenter une dose plus élevée. Il s'agit d'une limitation de l'étude qui a permis de l'identifier comme un domaine potentiel pour une enquête future. Cependant, nous considérons que le taux de croissance plus lent dans le modèle de cellules cultivées est avantageux car nous croyons qu'il peut reproduire le scénario clinique du cancer de l'endomètre de façon plus fiable, car le cancer de l'endomètre est généralement une maladie à croissance lente qui métastase d'abord les ganglions lymphatiques pelviens et a comme conséquence les métastases lointaines en retard. Le choix initial de propager les cellules VX2 chez la souris a permis un redressement plus rapide, et des coûts d'entretien moins coûteux; cependant alternativement, les cellules pourraient avoir été dérivées directement du muscle de quadriceps des lapins.

Nous croyons que la surveillance postopératoire étroite pour des signes et des symptômes de la croissance de tumeur est un aspect important du protocole. Dans notre expérience, une fois que les lapins développent la maladie métastatique, ils progressent rapidement à être médicalement malades, plus particulièrement dans le groupe projugé in vivo. Cette croissance rapide et agressive a été soulignée par la mort d'un lapin de la maladie métastatique après un retard de seulement 2 jours de la date prévue d'expérience. Bien que la vitesse de l'établissement du modèle VX2 ait été considérée comme une force, car des modèles murins similaires (c.-à-d. le modèle de carcinome endométrial HEC-1 avec des métastases de ganglion lymphatique chez les souris) peuvent prendre jusqu'à deux fois plus longtemps pour établir57,ces résultats démontrent également que la détermination du moment expérimental optimal est primordiale. Les résultats sont corrélés avec les études précédentes dans lesquelles la croissance de tumeur et l'agrandissement de ganglion lymphatique ont augmenté de manière significative après jour postopératoire 2137,53; cependant nous croyons qu'il y aura une variabilité en ce qui concerne la lignée cellulaire VX2 utilisée et encourageons les groupes à comprendre leur moment expérimental spécifique. Cette chronologie n'est pas valable pour nos modèles VX2 cultivés et l'a identifié comme un domaine qui nécessite une étude plus approfondie. Pour être certain au sujet de la croissance de tumeur, nous avons choisi d'employer la surveillance non-invasive et envahissante de tumeur pendant le protocole. Cependant, une autre orientation future pourrait être d'affiner le protocole d'imagerie postopératoire afin d'éviter la nécessité d'une deuxième procédure invasive.

Dans l'ensemble, nous avons rapporté une méthode simple et normalisée pour créer un modèle de cancer de l'endomètre avec la lymphadénopathie rétropéritonéale chez les lapins. Grâce à ce protocole, nous avons abordé la variabilité significative dans la littérature VX2 en ce qui concerne la dose cellulaire, la technique chirurgicale et la surveillance du modèle postopératoire. Nous reconnaissons qu'une autre limitation de l'étude est qu'en utilisant une ligne de cellules VX2 au lieu d'un xénogreffe humain nous n'imimons pas complètement la biologie de tumeur et le microenvironnement du cancer humain. Cependant, nous espérons que d'autres groupes utiliseront des cellules VX2 cultivées pour créer leurs modèles car nous croyons que ce type de cellule peut modéliser le cancer de l'endomètre humain de façon plus fiable grâce à sa croissance plus lente et à sa propension à se métastaser. Nous encourageons d'autres groupes à ce modèle rapide et facile des métastases rétropériitonel de ganglion rétroperitoneal dérivées utérines pour étudier de nouvelles thérapies d'imagerie pour aider des patients présentant le cancer métastatique d'endomètre.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Cette étude a été financée par l'Institut de recherche Terry Fox (PPG-1075), l'Institut canadien de recherche en santé (Fondation Grant #154326), l'Institut de recherche de la Société canadienne du cancer (704718), le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada, Fondation pour l'innovation et Fondation Du Cancer Princess Margaret.

Je tiens à remercier le Dr Marguerite Akens d'avoir fourni les cellules VX2 initiales pour l'établissement du modèle VX2 initial et des blocs tumoraux VX2 congelés. Je tiens à remercier Marco DiGrappa pour avoir aidé à effectuer des expériences initiales de culture cellulaire VX2 et Lili Ding pour aider à la culture cellulaire VX2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
11-blade scalpel, Sterile, Disposible Aspen Surgical (VWR) 80094-086
22-gague ear vein catheter CDMV 14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb) Covidien 356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb) Covidien 356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon Falcon 352350
Acepromazine (Atravet) CDMV 1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%) CDMV 4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%) UHN Stores 457955
Buprenorphine McGill University
Cefazolin UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Chlorhexidine solution CDMV 119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes Corning 354450 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates Corning 354408 brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates Corning 354400 brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL Corning 354234
DMEM/HAM F12 1:1 Life Technologies 11320 brand not important
DMSO Caledon Lab Chem 1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable) CDMV 11242
Falcon Tube Corning Centri-Star 430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml Life Technologies 12483020 brand/source not important
Isoflurane UHN in-patient pharmacy No Cat # Needed
Isohexol contrast GE Healthcare 407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%) CDMV 104674
Normal Saline House Brand (UofT Medstore) 1011
PBS Multicell or Sigma 331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin) Corning-Cellgro CA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red) T.C.M.F (Dr Bristow) 28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive) 3M Vetbond 14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics Grade Sigma T-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml Wisent Inc 325-542-EL brand not important

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Recherche sur le cancer Numéro 151 Cancer de l'endomètre modèle de cancer orthotopique lignée cellulaire VX2 lymphadénopathie modèle lapin modèle chirurgical Culture cellulaire
Un modèle orthotopic de cancer de l'endomètre avec lymphadénopathie rétropéritonel fabriqué à partir de cellules VX2 propagées et cultivées
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Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., … More

Philp, L., Chan, H., Rouzbahman, M., Rostami, A., Ding, L., Bratman, S. V., Akens, M. K., Irish, J. C., Bernardini, M. Q., Zheng, G. An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells. J. Vis. Exp. (151), e59340, doi:10.3791/59340 (2019).

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