Formazione immagine confocal Live dei meristemi apicali riprese da diverse specie di piante
Summary
Questo protocollo presenta come immagine live e analizzare i meristemi apicali di sparare da specie diverse di piante mediante microscopia confocale a scansione laser.
Abstract
Le funzioni del meristema apicale (SAM) di sparare come un serbatoio di cellule staminali conservate ed esso genera aboveground quasi tutti i tessuti durante lo sviluppo postembrionale. L’attività e la morfologia dei Mas determinare importanti caratteristiche agronomiche, quali sparare architettura, dimensioni e numero di organi riproduttivi e soprattutto, la produzione di granella. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per analizzare sia la morfologia superficiale e la struttura cellulare interna del vivente SAMs da specie diverse attraverso il microscopio confocale a scansione laser. L’intera procedura dalla preparazione del campione per l’acquisizione di immagini tridimensionali ad alta risoluzione (3D) può essere eseguita entro 20 minuti più breve. Dimostriamo che questo protocollo è altamente efficiente per studiare non solo l’infiorescenza SAMs delle specie modello ma anche meristemi vegetativi da colture diverse, fornendo uno strumento semplice ma potente per studiare l’organizzazione e lo sviluppo di Meristemi attraverso diverse specie vegetali.
Introduction
Il meristema pianta contiene un pool di cellule staminali indifferenziate e continuamente sostiene la crescita delle piante dell’organo e sviluppo1. Durante lo sviluppo postembrionale, quasi tutti i tessuti fuori terra di un impianto sono derivati da sparare meristema apicale (SAM). Nelle colture, l’attività e la dimensione del database SAM e sua derivati meristemi floreali sono strettamente associati con molte caratteristiche agronomiche come sparare architettura, produzione di frutta e il rendimento della semente. Ad esempio, nel pomodoro, una SAM allargato causa un aumento le riprese e la ramificazione di infiorescenza e così risultati nel generare extra fiore e frutta organi2. Nel mais, un aumento nella dimensione di SAM conduce ad un più alto numero di inizializzazione e la resa totale3,4. Nella soia, l’indeterminatezza del meristema è anche strettamente associato con l’architettura di sparare e resa5.
La morfologia e l’anatomia dei Mas può essere caratterizzate da diversi metodi, tra cui sezionamento/colorazione istologica e scansione microscopia elettronica (SEM)6, entrambi i quali notevolmente hanno avanzato la ricerca di meristema fornendo la vista in sezione o una vista tridimensionale (3D) superficie SAMs. Tuttavia, entrambi i metodi sono molto tempo, che coinvolge diversi passaggi sperimentale dalla preparazione del campione per l’acquisizione di dati, e questi metodi dipendono principalmente da campioni fissati. Gli avanzamenti recenti nella tecnica di microscopia confocale a scansione laser hanno superato questi limiti e ci forniscono un potente strumento per indagare la struttura cellulare e il processo di sviluppo di pianta tessuti e organi7,8. Attraverso ottico piuttosto che fisico tessuto microscopia confocale, sezionamento consente la raccolta di una serie di immagini dello stack z e le successive ricostruzioni 3D del campione attraverso software di analisi di immagine.
Qui, descriviamo una procedura efficace per indagare sia all’interno e strutture superficiali del vivente SAMs da diverse piante mediante microscopia confocale, che potenzialmente permette ai ricercatori di compiere la sperimentale di scansione laser processo all’interno di più breve 20 minuti. Diverso da altri metodi pubblicati per live imaging confocale di Arabidopsis infiorescenza SAMs9,10,11,12,13,14, 15 e Arabidopsis fiori12,13, Qui dimostriamo che questo protocollo è altamente efficiente per studiare non solo i meristemi infiorescenza delle specie modello, ma anche la ripresa vegetativa Meristemi apicali da diverse colture, come il pomodoro e soia. Questo metodo non si basa su marcatori fluorescenti transgenici e potenzialmente può essere applicato per studiare i meristemi sparare da molte diverse specie e cultivar. Inoltre, presentiamo anche passaggi per visualizzare e analizzare diverse SAMs in una vista 3D di elaborazione delle immagini semplici. Presi insieme, questo semplice metodo faciliterà i ricercatori a comprendere meglio la struttura e il processo di sviluppo di meristemi da organismi modello e colture.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un semplice metodo di imaging che possa essere applicato allo studio dei meristemi apicali di sparare da diverse piante con piccole modifiche, aprendo una nuova strada per studiare la regolazione del meristema in fasi sia vegetativi e riproduttivi in piante modello e colture. In contrasto con il SEM e metodi di colorazione istologici, questo protocollo può aiutare a rivelare sia vista di superficie e interne strutture cellulari di SAMs, senza la necessità di alta intensità di lavoro esempio fissazione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono Purdue Bindley Bioscience centro Imaging Facility per accedere al microscopio confocale a scansione laser e per il supporto tecnico, e gli autori apprezzano l’aiuto da Andy Schaber nella Purdue Bindley Imaging struttura. Questa attività è stata finanziata dalla Purdue University come parte di crocevia di AgSEED fondi per sostenere l’agricoltura e lo sviluppo rurale dell’Indiana.
Materials
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
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