Summary
Ce protocole présente comment vivre image et analyser les méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.
Abstract
Les fonctions de méristème apical (SAM) pousse comme un réservoir des cellules souches conservées et il génère presque tous les tissus hors sol pendant le développement post-embryonnaire. L’activité et la morphologie des SAMs déterminent des caractéristiques agronomiques importants, tels que l’architecture de shoot, taille et nombre d’organes reproducteurs et surtout, le rendement en grain. Ici, nous fournissons un protocole détaillé permettant d’analyser aussi bien la morphologie de la surface et la structure cellulaire interne du vivant SAMs provenant de différentes espèces par le biais de microscope confocal à balayage laser. Tout le processus depuis la préparation de l’échantillon à l’acquisition d’images de haute résolution en trois dimensions (3D) peut être accompli au sein aussi court que 20 minutes. Nous démontrons que ce protocole est très efficace pour l’étude non seulement l’inflorescence SAMs de l’espèce modèle, mais aussi les méristèmes végétatives de différentes cultures, fournissant un outil simple mais puissant pour étudier l’organisation et le développement de méristèmes dans différentes espèces de plantes.
Introduction
Le méristème de la plante contient un réservoir de cellules souches indifférenciées et maintient en permanence la croissance des organes végétaux et développement1. Pendant le développement post-embryonnaire, presque tous les tissus hors sol d’une plante sont dérivés de méristème apical (SAM). Dans les cultures, l’activité et la taille de la SAM et ses dérivées méristèmes floraux sont étroitement associées aux nombreuses caractéristiques agronomiques telles que shoot architecture, production de fruits et rendement en graines. Par exemple, chez la tomate, un SAM élargi entraîne une augmentation de la pousse et l’inflorescence ramification et donc des résultats dans la production d’appoint fleurs et fruits organes2. Chez le maïs, une augmentation de taille de SAM mène à un plus grand nombre de graines et le rendement total3,4. Chez le soja, l’indétermination de méristème est également étroitement associée à l’architecture de shoot et rendement5.
La morphologie et l’anatomie de SAMs peuvent être caractérisés par plusieurs méthodes différentes, y compris la coupe/coloration histologique et le scanning electron microscopy (SEM)6, qui ont grandement contribué à améliorer la recherche de méristème en fournissant la vue en coupe ou une vue de surface tridimensionnelle (3D) de SAMs. Toutefois, les deux méthodes prennent beaucoup de temps, impliquant plusieurs étapes expérimentales de la préparation de l’échantillon à l’acquisition de données, et ces méthodes dépendent principalement des échantillons fixes. Les progrès récents en microscopie confocale à balayage laser ont réussi à surmonter ces limitations et nous fournissent un outil puissant pour étudier la structure cellulaire et les processus de développement de l’usine tissus et organes7,8. Par optique plutôt que le tissu physique sectionnement, confocale microscopie permet la collecte d’une série d’images de z-pile et la reconstruction 3D subséquente de l’échantillon par le biais de logiciels d’analyse image.
Ici, nous décrivons une procédure efficace pour étudier à l’intérieur et des structures superficielles des vivants SAMs de différents plant des essences à l’aide de laser, microscopie confocale, qui potentiellement permet aux chercheurs d’accomplir tous les expérimentale processus au sein aussi court que 20 minutes. Différente des autres méthodes publiées pour l’imagerie confocale direct d’Arabidopsis inflorescence SAMs9,10,11,12,13,14, 15 et Arabidopsis fleurs12,13, nous démontrons que ce protocole est très efficace pour l’étude non seulement les méristèmes d’inflorescence de l’espèce modèle mais aussi de la pousse végétative méristèmes apicaux de différentes cultures, telles que la tomate et le soja. Cette méthode ne repose pas sur des marqueurs fluorescents transgéniques et peut potentiellement être appliquée afin d’étudier les méristèmes de beaucoup de différentes espèces et cultivars. En outre, nous présentons également l’étapes permettant d’afficher et d’analyser les différentes SAMs dans une vue 3D de traitement d’image simple. Pris ensemble, cette méthode simple facilitera les chercheurs à mieux comprendre la structure et le processus de développement des méristèmes d’organismes modèles et des récoltes.
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Protocol
1. préparation de plats médias et imagerie
- Plaques de MS : ajouter 0,5 x milieu de Murashige et Skoog MS moyen, 1 % d’agar dans l’eau désionisée et ensuite ajuster le pH de 5,8 à l’aide de la solution d’hydroxyde de potassium (facultatif : ajouter 1 % de saccharose pour la culture de plantes à long terme). Plaques d’autoclave et verser.
- Imagerie des plats : remplir des boîtes de pétri en plastique (6 cm de large, 1,5 cm de profondeur) de 0,5 à 0,8 cm avec 1,5 % agarose fondu.
2. croissance de la plante
-
Croissance d’Arabidopsis
- Semer les graines stérilisées sur plaques de MS et placer les plaques sous 4 ° C pendant deux jours. Déplacez-vous MS plaques pour une courte journée (8 h lumière / 16 h d’obscurité), à 22 ° C pendant deux semaines.
- Transplanter dans le sol, les semis et cultivez-les dans une journée courte (8 h lumière / 16 h d’obscurité) à 22 ° C pendant quatre semaines.
- Transférer les plantes de lumière continue, à 22 ° C pour induire le passage de la végétative à la phase de reproduction et d’imagerie de l’inflorescence SAMs.
- Croissance de tomate et de soja
- Incuber les graines recouvertes de papier filtre mouillé en dessous de 28 ° C jusqu'à ce qu’elles germent.
- Transplanter dans le sol, les semis et cultivez-les dans une longue journée (16 h lumière / obscurité de 8 h) à 25 ° C pendant une semaine ou plus pour l’imagerie des SAMs végétatives.
3. dissection de l’apex caulinaire
- Dissection de l’apex caulinaire inflorescence
- Couper l’apex inflorescence avec tige principale 1-2 cm de la plante Arabidopsis boulonnée avec une lame de rasoir. Tenez la partie basale de la tige principale et prélever des organes de fleur anciennes autant que possible de la tige principale en disséquant sur le pédoncule avec une pince de bijoux.
Attention : Évitez les doigts coupe lorsque vous utilisez une lame de rasoir. Jeter les lames de rasoir usagées contenant un bon pour objets tranchants. - Tenir la tige attachée de l’apex de la tige avec une pince de bijoux ou de doigts dans le domaine de la stéréomicroscope, continuer à retirer le reste des fleurs jusqu'à ce que presque l’ensemble SAM peut considérer des oculaires. Retirez les pédoncules clairement à la jonction de la tige principale.
- Couper l’apex inflorescence avec tige principale 1-2 cm de la plante Arabidopsis boulonnée avec une lame de rasoir. Tenez la partie basale de la tige principale et prélever des organes de fleur anciennes autant que possible de la tige principale en disséquant sur le pédoncule avec une pince de bijoux.
- Dissection de l’apex de la pousse végétative
- Pour afficher les SAMs végétatives de tomate ou de soja, disséquer les cotylédons, les feuilles et les racines des plantes.
- Tenez l’hypocotyle des plantes sous le stéréomicroscope et disséquer davantage sur les primordiums foliaires couvrant les SAMs végétatives à l’aide de pinces à bijoux.
4. coloration
- Pour visualiser directement les cellules dans Sam, utilisez fraîchement préparé propidium solution d’iodure (PI) pour colorer les parois cellulaires. Dissoudre la poudre dans l’eau désionisée stérile PI, faire la solution colorante 1mL PI à la concentration de 1 mg/mL et stocker la solution de PI en tubes de microcentrifuge recouvert de papier d’aluminium.
- Pipetter 50 µL de solution de PI dans un endroit propre et vide de Pétri et trempette toute disséqué shoot apex en colorant pendant 2 min. rincer l’apex colorés deux fois dans l’eau désionisée stérile. Pendant le processus de coloration, immergez l’inflorescence entière SAM ou SAM végétatif dans la solution de PI pour réaliser la coloration uniforme.
5. collection d’images
Remarque : pour cette méthode, tous les Sam sont imagées à l’aide d’un microscope confocal vertical et avec un 20 x lentille de pendage vers l’eau. Comme décrit dans d’autres protocoles9,12,13,15, il est également possible de l’image à l’aide d’un microscope inversé de SAMs. En outre, l’imagerie direct est possible à l’aide de différentes marques de microscopes confocaux, avec les mêmes étapes de préparation d’échantillon. Dans cette étude, les étapes d’imagerie sont décrites en détail à titre d’exemple.
- Percer un trou au centre d’un plat d’imagerie avec une pincette et coller l’apex caulinaire colorées dressées dans le milieu.
- Remplissez le plat d’imagerie d’eau déionisée stérile afin d’immerger complètement l’échantillon. Visualisation du microscope stéréo, pipette de haut en bas pour enlever les bulles d’air piégées autour du méristème. Ensuite, réglez l’angle de la tige dans la gélose pour s’assurer que le SAM est entièrement visible de directement au-dessus.
- Placez le plat d’imagerie sur la scène de l’échantillon du microscope confocal. Lentille d’eau à pendage et descendre la platine du microscope échantillon pour laisser l’extrémité de la lentille tremper dans l’eau.
- Ouvrez le logiciel de microscope confocal et recherchez le SAM dans le fond clair dans les oculaires. Déplacer la SAM échantillon droite au-dessous de l’objectif en ajustant le contrôleur XY, puis se concentrer sur la SAM d’oculaires en ajustant avec prudence le contrôleur Z.
- Activer la fonction de l’acquisition du logiciel de microscope confocal (voir Table des matières), démarrer le mode direct pour afficher l’exemple de l’écran d’ordinateur et configurer tous les paramètres de l’expérience de balayage au laser.
- Lors du réglage des paramètres, utilisez Gamme indicateur fonction pour définir si le signal est saturé ou non.
- Éventuellement, appliquez la fonction réutiliser pour recharger tous les paramètres depuis le fichier sélectionné confocal.
NOTE : A suggéré d’imagerie paramètres : Laser ligne (excitation) : 515 nm ou 561 nm ; Émission 570-650 nm ; sténopé : 1 unité aérée (UA) ; Gain : 600-750, mode de numérisation : encadrer ; Taille d’image : 512 X 512 ou 1024 X 1024 ; vitesse de numérisation : du 7 au Max ; Direction de numérisation : bidirectionnelle ; Numéro de l’établissement d’une moyenne : 2-4 ; Avec une moyenne de méthode : moyenne ; Profondeur de couleur : 16 bits ; Intervalle de balayage : 0,5 à 1 µM. De plus, optimiser tous ces paramètres selon la nature des échantillons de plantes différentes et aux besoins spécifiques d’imagerie.
6. traitement de l’image
- Pour visualiser les vues de coupe transversale et orthogonales optique, utilisez le même logiciel commercial pour l’acquisition d’imagerie. Ouvrez le fichier original confocal, cliquez sur le menu ortho, sélectionnez ortho. Puis sélectionnez soit la position x, z et y position position de l’image et enregistrer les images que les fichiers tiff.
- Éventuellement, sélectionnez distance 3D fonction pour définir la distance physique entre deux points qui ont été sélectionnés par la cheminée de l’images confocales.
- Vous pouvez également utiliser Fidji/Image J, le paquet de traitement image ressource ouverte pour visualiser les vues de la section transversale et orthogonales.
- Ouvrez le fichier confocal original avec les îles Fidji, cliquez sur le menu image, sélectionnez piles et puis sélectionnez vues orthogonales.
- Sélectionnez XY, YZet XZ avions en position médiane et enregistrez sous les images au format Tiff.
- Pour visualiser une projection 3D transparente, utilisez le même logiciel.
- Ouvrez le fichier original confocal, cliquez sur le menu 3Det sélectionnez Transparent pour générer une vue de projection 3D.
- Éventuellement, cliquez sur menu 3D, sélectionnez apparenceet sélectionnez transparence pour ajuster les trois paramètres de la projection dont seuil, rampe et Maximum pour la transparence de la 3D image.
- Cliquez sur le menu 3D, sélectionnez apparence, puis lumière pour régler la luminosité de l’image 3D.
- Exporter les images projetées et les enregistrer comme des fichiers Tiff.
- Pour visualiser une projection 3D d’intensité maximale, ouvrez les fichiers confocal avec le même logiciel et cliquez sur le menu 3D.
- Sélectionnez le menu 3D et maximale.
- Également utiliser J Fidji/Image pour visualiser une projection 3D d’intensité maximale.
- Ouvrez le fichier confocal original avec les îles Fidji, cliquez sur le menu de l’Image et sélectionnez piles.
- Sélectionnez le projet 3D et enregistrez sous les images au format Tiff.
- Pour la visualisation de la profondeur de codage d’afficher des images 3D, utilisez le même logiciel.
- Cliquez sur le menu 3D , puis sélectionnez apparence.
- Sélectionnez spécial , puis sélectionnez la Profondeur de codage.
- Également utiliser J Fidji/Image pour visualiser la profondeur vue de codage.
- Ouvrez les fichiers confocale, cliquez sur le menu image, sélectionnez Hyperstack.
- Sélectionnez le code temporel-couleur et enregistrer en tant que des images au format Tiff.
NOTE : La profondeur de codage z-pile aussi est possible via le plugin Z Code Stack pour Fidji.
- Pour visualiser la 3D rotation vue tel qu’indiqué (film 1 et 2 de film), utiliser le même logiciel (voir la Table des matières).
- Ouvrir les fichiers confocale, cliquez sur le menu 3Det sélectionnez série.
- Sélectionnez rendu sérieet sélectionnez l’une des quatre options notamment tourner autour de x, y faire demi-tour, début et finet liste Position.
- Enregistrer la série de rendu que les fichiers AVI.
- Également utiliser J Fidji/Image pour visualiser la vue 3D rotation.
- Ouvrez le fichier confocal original avec les îles Fidji, cliquez sur le menu de l’Imageet sélectionnez Stacks.
- Sélectionnez le projet 3D et enregistrer des vidéos au format AVI.
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Representative Results
Pour évaluer l’efficacité de notre protocole et d’étudier la morphologie des méristèmes de différentes espèces, nous avons effectué des expériences d’imagerie confocale direct sur le méristème de l’inflorescence de l’Arabidopsis et les méristèmes végétatives de tomate et soja. Dans cette étude, Arabidopsis écotype Landsberg erecta, cultivar de tomate Micro-Tom et le cultivar de soja Williams 82 ont été utilisés comme exemples.
À partir de la section orthogonale au milieu de l' Arabidopsis SAM, il est clair que PI a su teinter les parois horizontales de presque toutes les cellules dans les multiples couches de cellules (Figure 1 a). Illustré d’une section transversale à travers le corpus de l’inflorescence SAM, les cellules du plan XY sont également clairement imagés (Figure 1 b). Selon la projection 3D, le méristème de l’inflorescence forme un dôme comme structure et est entouré par les primordia de fleur en voie de développement, où les cellules sont également colorées et imagé (Figure 1 C-D) (film 1).
À partir de la section orthogonale au milieu de la tomate SAM, il est clair que PI a pu souiller les parois horizontales des cellules aux multiples couches de cellules, bien que la PI du signal de la région intérieure profonde est légèrement inférieure. D’une section transversale à travers les couches profondes du SAM végétatif, les cellules des plans XY sont également clairement imagés, et la frontière entre le méristème végétatif et les primordiums foliaires est aussi imagés (Figure 2 b). La vue du projet 3D peut fournir également une vue d’ensemble de la forme et l’organisation du méristème végétatif de tomate (Figure 2C-D) (film 2).
Dans la vue orthogonale au milieu du soya SAM, nous pouvons voir le méristème végétatif du dôme et ses dérivés nouveaux feuille primordiums (Figure 3 a). Selon la projection 3D, les deux du méristème végétatif de soja et le méristème végétatif tomate forment le dôme comme structure, cependant, la forme du méristème végétatif soja est différente de celle du méristème tomate et de l’organisation et les modèles de les primordiums foliaires entourant ces deux SAMs sont distinctes (Figure 3 b-C).
Figure 1 : Vivre d’imagerie et d’analyse l’inflorescence SAM d’Arabidopsis. A et B. optique orthogonal (Orth) et transversale (Trans) vues de section du plan médian du même SAM, PI (iodure de propidium) tachent (violets). C. une projection 3D du même SAM, la tache de PI (gris). D. profondeur codage couleur de la projection 3D, avec le fil bleu indiquant la couche de surface supérieure et le rouge qui représente la couche la plus profonde. Parois cellulaires ont été colorées avec PI. Barreaux de l’échelle : 20 µm (A, B) ; 50 µm (C, D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : L’imagerie Live et analysant le SAM végétatif de la tomate. A et B. optique orthogonal (Orth) et transversal (Trans) section vues du plan médian du même SAM. C. une projection 3D du même SAM. D. profondeur codage couleur de la projection 3D, avec le fil bleu indiquant la couche de surface supérieure et le rouge qui représente la couche la plus profonde. Parois cellulaires ont été colorées avec PI. Barreaux de l’échelle : 20 µm (A, B) ; 50 µm (C, D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Live d’imagerie et d’analyser le SAM végétatif du soja. A. une optique vue en coupe (Orth) orthogonal au plan moyen du SAM végétatif. B. une projection 3D du même SAM. C. profondeur codage couleur de la projection 3D, avec le fil bleu indiquant la couche de surface supérieure et le rouge qui représente la couche la plus profonde. Parois cellulaires ont été colorées avec PI. Barreaux de l’échelle : 20 µm (A) ; 50 µm (B, C). Flèche : primordium foliaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : rotation 3D du méristème inflorescence Arabidopsis dans la Figure 1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 2 : rotation 3D du méristème végétatif tomates à la Figure 2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Nous décrivons ici une méthode d’imagerie simple qui peut être appliquée à l’étude des méristèmes apicaux de différentes plantes avec une modification mineure, ouvrant une nouvelle voie pour étudier la régulation de méristème à des stades végétatifs et reproducteurs de plantes modèles et cultures. Contrairement à la SEM et les méthodes de coloration histologiques, ce protocole peut aider à révéler la surface vue tant les structures cellulaires internes des SAMs, sans la nécessité d’une fixation de l’échantillon à forte main-d'oeuvre et/ou de tissu sectionnant les étapes. Ce protocole est également compatible avec la méthode d’imagerie établie pour les journalistes de fluorescence basé dans les Sam, fournissant potentiellement une bonne résolution cellulaire qui nous permet d’obtenir une vue 3D des modèles d’expression de gènes clés et de protéines dans la SAM16 ,17,18,19. En outre, la procédure décrite ici de traitement d’image associé pourront grandement aider les chercheurs à analyser et comparer les SAMs provenant de différentes espèces en 3D, faire progresser les études de biologie évolutive à l’évolution et la recherche agricole.
Il y a quelques étapes cruciales dans le présent protocole simple. Tout d’abord, préparation des échantillons et dissection. Une usine de SAM est habituellement cachée en développant les primordiums et organes jeunes, à l’extrémité de la pousse, et il ne peut pas être copié directement sous un microscope confocal. Pour le SAM végétatif de l’image, il est nécessaire d’enlever toutes les feuilles et les primordiums foliaires plus âgés qui couvrent sur le dessus de la SAM à l’aide de pinces de haute joaillerie. Pour l’image de l’inflorescence SAM, il faut soigneusement enlever toutes les fleurs jeunes pour exposer le SAM, également à l’aide de pinces de haute joaillerie.
Deuxièmement, la coloration de cellules vivantes à l’aide de la solution de PI. Dans ce protocole, nous utilisons la solution fraîchement préparée de PI (1 mg/mL) pour colorer les parois cellulaires afin de visualiser directement les SAMs direct, qui est rapide, efficace et facile à exécuter. Bien que la solution de PI peut être conservée à 4 ° C pendant plusieurs semaines, une solution fraîchement préparée donne généralement le meilleur résultat pour les méristèmes apicaux. Bien que principalement les PI ne franchit pas la membrane des cellules vivantes et il les taches des cellules intactes avec le contour clair cellulaire, il peut facilement pénétrer dans les cellules endommagées/morts et tacher fortement les noyaux et autres systèmes de membranes internes dans les zones endommagées, pouvant affecter la qualité de l’images confocales. Ainsi, il sera indispensable d’éviter tout dommage physique tout en préparant le SAM échantillons pour la coloration et l’imagerie en direct. En revanche, PI à une concentration élevée montre un effet toxique pour les cellules végétales, et ainsi, FM4-64 peut être utilisé comme un substitut à la PI pour colorer la vie SAM cellules9. Cependant, FM4-64 étiquettes membrane plasmique, qui peut potentiellement être repris dans la cellule intérieur par endocytose, rendant difficile pour colorer les échantillons à haute résolution cellulaire.
Troisièmement, acquisition d’imagerie. 1). grande ouverture numérique (NA), la lentille d’eau à pendage est critique pour l’imagerie webcam live des SAMs. L’eau a un indice de réfraction plus élevé que l’air et la NA haut du porte-objectif aide à rassembler les photons de signal dispersés à travers des couches de cellules profondes de SAMs. 2). les paramètres de puissance de laser (watts ou watts par surface) peuvent être très variables entre différents microscopes confocaux. La cheftaine laser peut permettre d’améliorer la collecte de signal mais mène au photovieillissement plus / Photoblanchiment sur les échantillons. Il y a des compromis entre la résolution, de blanchiment et d’imagerie de temps. En règle générale, en sélectionnant une taille d’image plus grande et conduit à la meilleure résolution XY, mais le plus temps d’imagerie et en sélectionnant un intervalle plus petit balayage conduit à une meilleure résolution de Z, mais aussi plus de temps d’imagerie. Temps plus d’imagerie causes potentiellement plus photovieillissement / Photoblanchiment
Avec cette méthode, parfois il ne peut pas être facile d’observer les détails cellulaires dans les couches profondes des tissus, probables en raison de la limitation de la détection confocale et la coloration de PI inefficace dans les tissus internes. Selon nos expériences, augmentation de la concentration de la solution de PI et/ou le temps de coloration peut aider à obtenir une meilleure coloration. Par ailleurs, les modifications apportées à la procédure de marquage est possible. Par exemple, la méthode de (mPS-PI) de l’iodure de propidium mis à jour le pseudo-Schiff fonctionne bien pour les tissus fixés à20. Et il faut encore trouver des colorants alternatives meilleure coloration pour les tissus vivants à l’avenir. En outre, il est également intéressant de vérifier si la méthode décrite ici peut être appliquée à l’étude de SAMs généralement de toutes les autres plantes à fleurs, compte tenu du fait que certaines espèces végétales ont contenu cellulaire particulière ou différent pariétaux compositions.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Purdue Bindley Bioscience Center Imaging Facility pour accéder aux microscope confocal à balayage laser et le support technique, et les auteurs apprécient l’aide de Andy Schaber dans les installations d’imagerie Purdue Bindley. Cette activité a été financée par l’Université de Purdue dans le cadre du carrefour de AgSEED pour soutenir l’Agriculture et du développement Rural de l’Indiana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
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