Summary
ويقدم هذا البروتوكول كيفية العيش الصورة وتحليل الخلايا الإنشائية قمية تبادل لإطلاق النار من الأنواع النباتية المختلفة باستخدام الليزر الفحص المجهري [كنفوكل].
Abstract
وظائف قمية أرض (SAM) تبادل لإطلاق النار كخزان خلايا الجذعية مصانة وأنه يولد تقريبا جميع الأنسجة سطحي أثناء تطوير السماني. بنشاط ومورفولوجية سامز تحديد السمات الزراعية الهامة، مثل الهندسة المعمارية تبادل لإطلاق النار، وحجم وعدد من الأعضاء التناسلية، والأهم من ذلك، إنتاج الحبوب. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لتحليل مورفولوجية السطحية والبنية الخلوية الداخلية معيشة سامز من الأنواع المختلفة من خلال الليزر المسح مجهر [كنفوكل]. الإجراء بأكمله من إعداد نموذج للحصول على صور عالية الدقة (3D) ثلاثي الأبعاد يمكن أن ينجز في غضون قصيرة بقدر 20 دقيقة. نثبت أن هذا البروتوكول ذات كفاءة عالية لدراسة ليس فقط نورات سامز الأنواع النموذجية ولكن أيضا الخلايا الإنشائية الخضري من المحاصيل المختلفة، وتوفير أداة بسيطة لكنها قوية لدراسة تنظيم وتطوير الخلايا الإنشائية عبر الأنواع النباتية المختلفة.
Introduction
يحتوي على مجموعة خلايا الجذعية غير متمايزة أرض المصنع وتحافظ باستمرار بمصنّع الجهاز النمو والتنمية1. أثناء تطوير السماني، تستمد تقريبا جميع الأنسجة سطحي للنبات من أرض قمية تبادل لإطلاق النار (SAM). في المحاصيل، بالنشاط والحجم SAM وبه المشتقة من الخلايا الإنشائية الأزهار ترتبط محكم مع العديد من السمات الزراعية مثل الهندسة المعمارية في تبادل لإطلاق النار، وإنتاج الفاكهة، ومحصول البذور. على سبيل المثال، يسبب سام موسع في الطماطم، زيادة في تبادل لإطلاق النار والمتفرعة من نورات، وبالتالي النتائج في توليد إضافية الزهور والفواكه الأجهزة2. في الذرة، وزيادة في حجم سام يؤدي إلى عدد أكبر من البذور والعائد الإجمالي3،4. وفي فول الصويا، عدم أرض يرتبط أيضا ارتباطاً وثيقا ببنية تبادل لإطلاق النار، وتسفر عن5.
ويمكن وصف مورفولوجيا وتشريح سامز قبل عدة أساليب مختلفة، بما في ذلك تقطيع تلطيخ نسيجية والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)6، اللتين تقدمت إلى حد كبير أرض للبحث من خلال توفير أما عرض الأقسام أو طريقة عرض سطح ثلاثي الأبعاد (3D) من سامز. ولكن كلا الأسلوبين وقتاً طويلاً، التي تنطوي على عدة خطوات تجريبية من إعداد نموذج للحصول على البيانات، وهذه الأساليب تعتمد أساسا على عينات ثابتة. التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفحص المجهري [كنفوكل] تقنية الليزر التغلب على هذه القيود وتزودنا بأداة قوية للتحقيق في البنية الخلوية والعملية التنموية لمصنع الأنسجة والأعضاء7،8. من خلال الضوئية بدلاً من الأنسجة الجسدية مجهرية [كنفوكل]، وتقطيع يتيح جمع سلسلة من الصور z-مكدس وإعادة 3D اللاحقة في العينة من خلال برمجيات تحليل الصورة.
هنا، يمكننا وصف إجراء فعال للتحقيق داخل ومصنع هياكل السطحية للمعيشة سامز من مختلف الأنواع باستخدام الليزر الفحص المجهري [كنفوكل]، الذي يحتمل أن يسمح للباحثين لإنجاز جميع التجريبية العملية داخل قصيرة بقدر 20 دقيقة. يختلف عن الأساليب الأخرى المنشورة لتصوير [كنفوكل] حية من نبات نورات سامز9،،من1011،،من1213،14، 15 و نبات الزهور13من12،، وهنا نثبت أن هذا البروتوكول ذات كفاءة عالية لدراسة ليس فقط في الخلايا الإنشائية نورات من الأنواع النموذجية ولكن أيضا تبادل لإطلاق النار الخضري قمية الخلايا الإنشائية من محاصيل مختلفة، مثل الطماطم، وفول الصويا. هذا الأسلوب لا يعتمد على علامات نيون المحورة وراثيا، ويحتمل أن يمكن تطبيقها على دراسة الخلايا الإنشائية تبادل لإطلاق النار من العديد من مختلف الأنواع والأصناف. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم أيضا صورة بسيطة تجهيز الخطوات لعرض وتحليل سامز مختلفة في عرض ثلاثي الأبعاد. أخذت معا، سيسهل هذا الأسلوب بسيطة الباحثين فهم كل من الهيكل والعملية التنموية للخلايا الإنشائية من طراز الكائنات الحية والمحاصيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-وسائل الإعلام وتصوير إعداد أطباق
- لوحات MS: إضافة 0.5 x Murashige & MS سكوغ أجار 1% متوسطة، إلى المياه. وقم بضبط الأس الهيدروجيني إلى 5.8 باستخدام حل هيدروكسيد البوتاسيوم (اختياري: إضافة السكروز 1% لزراعة النباتات الطويلة الأجل). لوحات اﻷوتوكﻻف وصب.
- تصوير الأطباق: التعبئة البلاستيكية أطباق بتري (6 سم، وعمق 1.5 سم) إلى 0.5-0.8 سم مع 1.5% المنصهر [اغروس].
2. نمو النبات
-
نمو نبات
- زرع بذور معقمة في لوحات MS ووضع لوحات تحت 4 درجة مئوية لمدة يومين. ثم نقل لوحات MS إلى يوم قصيرة (ح 8 الضوء/16 ح الظلام)، عند 22 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
- زراعة الشتلات بالتربة وزراعتها في يوم قصيرة (ح 8 الضوء/16 ح الظلام) عند 22 درجة مئوية لمدة أربعة أسابيع.
- نقل النباتات إلى الضوء المستمر، عند 22 درجة مئوية للحث على الانتقال من الخضري إلى مرحلة الإنجاب والتصوير نورات سامز.
- نمو الطماطم وفول الصويا
- احتضان بذور مغطاة بورق الترشيح الرطب تحت 28 درجة مئوية حتى أنها تنبت.
- زراعة الشتلات بالتربة وزراعتها في يوم طويل (ح 16 الضوء/الظلام 8 ح) عند 25 درجة مئوية لمدة أسبوع أو أكثر للتصوير سامز الخضري.
3-تشريح ابيكس تبادل لإطلاق النار
- تشريح لذروة إطلاق النار نورات
- قطع ذروة نورات تبادل لإطلاق النار مع الجذع الرئيسي 1-2 سم من النباتات نبات انسحب مع شفرة حلاقة. عقد الجزء القاعدي من الساق الرئيسي وإزالة العديد من كبار السن من أجهزة زهرة ممكن من الجذع الرئيسي بتشريح خارجاً بيدونكليس مع الملقط المجوهرات.
تحذير: تجنب قطع الأصابع عند استخدام شفرة حلاقة. التخلص من شفرات الحلاقة المستخدمة إلى حاوية الصحيح للأدوات الحادة. - عقد الجذعية المرفقة من قمة تبادل لإطلاق النار مع الملقط المجوهرات أو الأصابع في ميدان ستيريوميكروسكوبي، مواصلة إزالة بقية الزهور حتى تقريبا يمكن عرض سام كله من العدسات. إزالة بيدونكليس من الواضح عند تقاطع الجذع الرئيسي.
- قطع ذروة نورات تبادل لإطلاق النار مع الجذع الرئيسي 1-2 سم من النباتات نبات انسحب مع شفرة حلاقة. عقد الجزء القاعدي من الساق الرئيسي وإزالة العديد من كبار السن من أجهزة زهرة ممكن من الجذع الرئيسي بتشريح خارجاً بيدونكليس مع الملقط المجوهرات.
- تشريح لذروة الخضري تبادل لإطلاق النار
- لعرض سامز الخضري من الطماطم أو فول الصويا، تشريح خارج كوتيليدونس، يترك، وجذور من النباتات.
- عقد هيبوكوتيلس النباتات تحت ستيريوميكروسكوبي وكذلك تشريح خارج primordia ليف تغطي سامز الخضري باستخدام الملقط المجوهرات.
4-التلوين
- لمباشرة تصور الخلايا في سامز، استخدم الحل (PI) يوديد propidium طازجة لوصمة عار جدران الخلية. حل مسحوق PI في الماء المعقم ومنزوع وجعل الحل المصبوغة 1 مل PI في تركيز 1 ملغ/مل وتخزين الحل PI في أنبوب ميكروسينتريفوجي مغطاة برقائق الألومنيوم.
- "الماصة؛" 50 ميليلتر PI الحل في بيئة نظيفة وطبق بيتري فارغة وتشريح كامل وتراجع إطلاق النار ابيكس في صبغ للحد الأدنى 2 شطف ابيكس الملون تبادل لإطلاق النار مرتين في الماء المعقم ومنزوع. أثناء عملية المصبوغة، تزج نورات كله سام أو سام الخضري في الحل PI تحقيقا لتلطيخ موحدة.
5-صورة جمع
ملاحظة: للحصول على هذا الأسلوب، وجميع بعثات يتم تصويرها باستخدام مجهر [كنفوكل] تستقيم ومع 20 x عدسة غمس المياه. كما هو موضح في الأخرى بروتوكولات9،12،،من1315، من الممكن أيضا للصورة سامز مجهر مقلوب باستخدام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتحقق تصوير مباشر استخدام ماركات مختلفة من مجاهر [كنفوكل]، مع إعداد عينة نفس الخطوات. ويرد في هذه الدراسة، خطوات التصوير بالتفصيل كمثال.
- بيرس حفرة في وسط صحن التصوير استخدام الملقط والعصا ابيكس الملون تبادل لإطلاق النار تستقيم في الأجل المتوسط.
- ملء الطبق التصوير مع المياه المعقمة، منزوع تماما تزج العينة. عرض من المجهر ستيريو، محاصرين ماصة صعودا وهبوطاً لإزالة فقاعات الهواء حولها أرض. ثم ضبط زاوية الجذع في أجار للتأكد من أن سام مرئية بالكامل من مباشرة أعلاه.
- ضع الطبق التصوير على المسرح عينة من المجهر [كنفوكل]. انخفاض عدسة غمس المياه ورفع مرحلة عينة مجهر السماح غيض من عدسة الغطس في الماء.
- فتح برنامج المجهر [كنفوكل] وحدد موقع SAM في برايتفيلد في العدسات. نقل حق سام عينة أدناه العدسة الهدف عن طريق تعديل وحدة تحكم س ص، ثم التركيز على سام من العدسات من خلال ضبط حذر المراقب المالي Z.
- تعمل الدالة اقتناء البرمجيات مجهر [كنفوكل] ابدأ (انظر الجدول للمواد)، يعيش الوضع لعرض العينة من شاشة الكمبيوتر، وإعداد جميع المعلمات لليزر المسح التجربة.
- عند ضبط المعلمات، استخدام نطاق مؤشر الدالة لتحديد ما إذا كانت الإشارة مشبعة أم لا.
- بشكل اختياري، تطبيق الدالة إعادة استخدامها لتحديث كافة إعدادات المعلمة من الملف المحدد [كنفوكل].
ملاحظة: اقترح التصوير المعلمات: الليزر خط (الإثارة): 515 نانومتر أو 561 نانومتر؛ الانبعاثات 570-650 نانومتر؛ الثقب: 1 وحدة مهواة (الاتحاد الأفريقي)؛ الربح: 600-750، وضع المسح الضوئي: الإطار؛ الإطار الحجم: 512 × 512 أو 1024 × 1024؛ سرعة المسح: من 7 إلى الحد الأقصى؛ مسح الاتجاه:-ثنائية الاتجاه؛ العدد المتوسط: 2-4؛ الأسلوب في المتوسط: يعني؛ عمق بت: 16 بت؛ الفاصل الزمني للمسح: 0.5-1 ميكرومتر. علاوة على ذلك، تحسين كل هذه المعايير على أساس طبيعة العينات النباتية المختلفة والاحتياجات الخاصة بالتصوير.
6. معالجة الصور
- لتصور آراء مقطع متعامد وعرضية الضوئية، استخدام نفس البرمجيات التجارية للحصول على التصوير. افتح الملف [كنفوكل] الأصلي، انقر فوق القائمة اورثو، حدد اورثو. ثم حدد أما موقف العاشر، وموقف y و z موضع الصورة، وحفظ الصور كملفات tiff.
- بشكل اختياري تحديد دالة المسافة 3D لتحديد المسافة بين نقطتين التي تم اختيارها من كومة الصور [كنفوكل].
- بدلاً من ذلك، استخدم فيجي/صورة "ياء"، حزمة تجهيز الصورة مورد مفتوح لتمثيل آراء قسم متعامد وعرضية.
- فتح الملف الأصلي [كنفوكل] مع فيجي، وانقر فوق القائمة صورة، حدد مكدسات و طرق متعامدةثم حدد.
- حدد XY, YZ, وطائرات XZ في الموقف الوسط، وحفظ الصور في تنسيق Tiff.
- لتصور إسقاط شفافة ثلاثية الأبعاد، استخدم نفس البرنامج.
- افتح الملف الأصلي [كنفوكل]، وانقر فوق القائمة 3D، وحدد شفاف لإنشاء طريقة عرض 3D إسقاط.
- بشكل اختياري انقر فوق القائمة 3D، حدد مظهر، وثم حدد الشفافية لضبط ثلاثة بارامترات الإسقاط بما في ذلك عتبةو منحدر و الحد الأقصى من الشفافية من 3D الصورة.
- انقر فوق قائمة ثلاثية الأبعاد، حدد المظهر، وحدد الضوء لضبط سطوع الصورة ثلاثية الأبعاد.
- تصدير الصور المسقطة وحفظها كملفات Tiff.
- لتصور إسقاط 3D أقصى شدتها، فتح الملفات [كنفوكل] مع نفس البرنامج، وانقر فوق القائمة 3D.
- حدد القائمة 3D وحدد الحد الأقصى.
- وبدلاً من ذلك، استخدم "ي" فيجي/صورة لتصور إسقاط 3D أقصى شدتها.
- افتح الملف الأصلي [كنفوكل] مع فيجي، وانقر فوق القائمة صورة وحدد مكدسات.
- حدد المشروع ثلاثي الأبعاد وحفظ الصور في تنسيق Tiff.
- لتصور عمق الترميز عرض الصور 3D، استخدم نفس البرنامج.
- انقر فوق القائمة 3D وحدد المظهر.
- حدد الخاصة وتحديد عمق الترميز.
- بدلاً من ذلك، استخدم "ي" فيجي/صورة لتصور عمق الترميز عرض.
- فتح الملفات [كنفوكل]، وانقر فوق القائمة صورة، حدد هايبرستاك.
- حدد رمز اللون الصدغي وحفظها كصور بتنسيق Tiff.
ملاحظة: عمق الترميز z-المكدس أيضا يمكن أن يتحقق من خلال البرنامج المساعد المكدس رمز Z لفيجي.
- لتصور 3D عرض التناوب كما هو مبين (1 الفيلم و الفيلم 2)، استخدام نفس البرنامج (انظر الجدول للمواد).
- فتح الملفات [كنفوكل]، وانقر فوق القائمة 3D، وحدد سلسلة.
- حدد إصدار سلسلة، وحدد أحد الخيارات الأربعة بما في ذلك يستدير xو يستدير y، و بداية ونهايةو موقف قائمة.
- حفظ سلسلة تجعل كملفات AVI.
- بدلاً من ذلك، استخدم "ي" فيجي/صورة لتصور رأي استدارة ثلاثية الأبعاد.
- افتح الملف الأصلي [كنفوكل] مع فيجي وانقر فوق القائمة صورةوحدد مكدسات.
- حدد المشروع ثلاثي الأبعاد وحفظ الفيديو بتنسيق AVI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم فعالية البروتوكول لدينا واستكشاف مورفولوجية الخلايا الإنشائية من مختلف الأنواع، ونحن أدوا تجارب التصوير الحي [كنفوكل] على أرض نورات من نبات والخلايا الإنشائية الخضري من الطماطم وفول الصويا. قد استخدمت في هذه الدراسة، و نبات اكوتيبي لاندسبرغ قائمة، الطماطم الصنف الصغير-توم وفول الصويا المستنبتة 82 ويليامز كأمثلة.
يتبين من القسم الأوسط من نبات سام متعامد، فمن الواضح أن PI قادراً على وصمة عار على الجدران الأفقية من تقريبا جميع الخلايا في خلية متعددة الطبقات (الشكل 1A). يظهر من المقطع عرضية واحدة من خلال مجموعة من نورات سام، الخلايا من الطائرة س ص أيضا وضوح تصويرها (الشكل 1B). في طريقة عرض 3D الإسقاط، أرض نورات أشكال قبة مثل هيكل، وهو محاط primordia زهرة النامي، حيث الخلايا أيضا ملطخة وتصويرها (الشكل 1 ج-د) (1 الفيلم).
يتضح من المقطع متعامد إلى الوسط من الطماطم سام، فمن الواضح أن PI قادراً على وصمة عار على الجدران أفقي من الخلايا في خلية طبقات متعددة، على الرغم من إشارة بي من المنطقة الداخلية العميقة أقل بشكل طفيف. من مقطع واحد عرضية من خلال الطبقات العميقة من سام الخضري، الخلايا من هذه الطائرات س وص يتم تصويرها أيضا بوضوح، والحدود شكلت بين أرض الخضري وليف بريمورديا هو أيضا المصورة (الشكل 2). كذلك يمكن أن توفر عرض المشروع 3D نظرة شاملة للشكل ومنظمة أرض الخضري من الطماطم (الشكل 2 ج-د) (2 الفيلم).
ويرى متعامد إلى الوسط من فول الصويا سام، يمكننا أن نرى أرض الخضري مثل قبة ولها primordia أوراق جديدة مشتقة (الشكل 3A). في رأي 3D الإسقاط، سواء أرض الخضري فول الصويا وأرض الخضري الطماطم شكل قبة مثل هيكل، بيد شكل أرض الخضري فول الصويا يختلف عن أرض الطماطم، والمنظمة وأنماط بريمورديا ليف المحيطة بهذه سامز اثنين هي متميزة (الشكل 3B-جيم).
الشكل 1: يعيش التصوير وتحليل نورات سام من نبات. ألف و ب. متعامد الضوئية (Orth) وعرضية (ترانس) قسم آراء طائرة متوسطة من سام نفسه، PI (يوديد propidium) وصمة عار (الأرجواني). ج-الإسقاط 3D من نفس سام، وصمة عار PI (رمادي). د-عمق الترميز اللوني للإسقاط 3D، مع الأزرق يشير إلى الطبقة السطحية العليا والأحمر الذي يمثل طبقة أعمق. جدران الخلايا كانت ملطخة بي. تغيير حجم أشرطة: 20 ميكرومتر (أ وب)؛ 50 ميكرومتر (ج، د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تصوير حية وتحليل سام الخضري للطماطم. ألف و ب. متعامد الضوئية (Orth) وعرضي (ترانس) الفرع وجهات نظر طائرة المتوسطة من سام نفسه. ج-إسقاط 3D من سام نفسه. د-عمق الترميز اللوني للإسقاط 3D، مع الأزرق يشير إلى الطبقة السطحية العليا والأحمر الذي يمثل طبقة أعمق. جدران الخلايا كانت ملطخة بي. تغيير حجم أشرطة: 20 ميكرومتر (أ وب)؛ 50 ميكرومتر (ج، د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: يعيش التصوير وتحليل سام الخضري من فول الصويا. ألف-عرض مقطع (Orth) بصري متعامد الطائرة الأوسط سام الخضري. ب-إسقاط 3D من سام نفسه. ج-عمق الترميز اللوني للإسقاط 3D، مع الأزرق يشير إلى الطبقة السطحية العليا والأحمر الذي يمثل طبقة أعمق. جدران الخلايا كانت ملطخة بي. تغيير حجم أشرطة: 20 ميكرومتر (A)؛ 50 ميكرومتر (ب، ج). السهم: نبات بريمورديوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1: الاستدارة ثلاثية الأبعاد من أرض نورات نبات في الشكل 1. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 2: الاستدارة ثلاثية الأبعاد من أرض الخضري الطماطم في الشكل 2. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، يمكننا وصف أسلوب تصوير بسيطة التي يمكن تطبيقها لدراسة الخلايا الإنشائية قمية تبادل لإطلاق النار من نباتات مختلفة مع تعديلات طفيفة، فتح سبيلاً جديداً لدراسة لائحة مماثلة في مراحل الخضري والإنجابية سواء في محطات نموذجية و المحاصيل. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول على النقيض من وزارة شؤون المرأة وأساليب المصبوغة النسيجي، تكشف عن عرض السطحية والهياكل الداخلية الخلوية من سامز، دون الحاجة إلى تثبيت عينة كثيفة العمالة و/أو الأنسجة تمزيقها الخطوات. هذا البروتوكول أيضا متوافقة بطريقة التصوير المتبعة للصحفيين fluorescence أساس في سامز، يحتمل أن تقديم قرار جيد خلوية التي تسمح لنا بالحصول على عرض ثلاثي الأبعاد من أنماط التعبير الرئيسية الجينات والبروتينات في سام16 17، ،،من1819. وبالإضافة إلى ذلك، معالجة الإجراء الموضح هنا الصور المرتبطة بها سوف تكون قادرة على يساعد إلى حد كبير الباحثين تحليل ومقارنة بعثات من مختلف الأنواع في 3D، والنهوض بعلم الأحياء التطوري التنموي الدراسات والبحوث الزراعية.
وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول بسيطة. أولاً، إعداد نموذج والتشريح. نبات سام مخفياً عادة بوضع بريمورديا وأجهزة الشباب في تلميح تبادل لإطلاق النار، وأنه لا يمكن تصويرها مباشرة تحت مجهر [كنفوكل]. الصورة سام الخضري، من الضروري إزالة جميع الأوراق وكبار السن بريمورديا ليف التي تغطي على رأس سام استخدام الملقط للمجوهرات. الصورة في نورات سام، من الضروري إزالة جميع الزهور الشباب لفضح سام، أيضا باستخدام الملقط للمجوهرات بعناية.
وثانيا، تلطيخ الخلايا الحية باستخدام الحل بي. في هذا البروتوكول، نستخدم الحل PI الطازجة (1 ملغ/مل) لوصمة عار جدران الخلية مباشرة تصور سامز حية، وسريعة وفعالة وسهلة لتنفيذ. على الرغم من أن الحل PI يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع، حلاً طازجة عادة يعطي أفضل تلطيخ نتيجة للخلايا الإنشائية قمية تبادل لإطلاق النار. على الرغم من أن بي أساسا لا عبر غشاء الخلايا الحية وأنها البقع خلايا سليمة مع مخطط واضح الخلوية، فإنه يمكن بسهولة اختراق الخلايا التالفة/الميت ووصمة عار بشدة النوى وغيرها من نظم الغشاء الداخلي في تلك المناطق المتضررة، يمكن أن تؤثر على نوعية الصور [كنفوكل]. وبالتالي، سيكون من الضروري لتجنب أية أضرار مادية أثناء تحضير SAM عينات لتلطيخ ويعيش التصوير. من ناحية أخرى، PI في تركيز عال يظهر تأثير سمية الخلايا النباتية، وهكذا، يمكن استخدام FM4-64 كبديل ل PI لوصمة عار بالمعيشة خلايا SAM9. ومع ذلك، تسميات FM4-64 غشاء البلازما، مما قد يحتمل أن تؤخذ في الخلية الداخلية عن طريق الالتقام، يجعلها صعبة لوصمة عار العينات مع ارتفاع القرار الخلوية.
وثالثاً، التصوير اقتناء. 1)-فتحات عددية عالية (نا)، عدسة غمس المياه أمر حاسم لتصوير مباشر من بعثات. المياه ارتفاع مؤشر إنكسار من الهواء ويساعد نا عالية للعدسة الهدف جمع الفوتونات الإشارات المتناثرة من خلال طبقات الخلايا العميقة من سامز. 2). يمكن أن تكون إعدادات طاقة الليزر (واط أو وات لكل سطح) اختلافاً كبيرا بين مختلف مجاهر [كنفوكل]. قد تسمح السلطة العليا ليزر أفضل إشارة جمع بل يؤدي إلى مزيد من د/فوتوبليتشينج في العينات. وهناك مفاضلة بين القرار وتبيض والتصوير مرة. وبصفة عامة، تحديد حجم إطار أكبر يؤدي إلى قرار XY أفضل ولكن أكثر وقت التصوير، وتحديد فاصل زمني أصغر من المسح ضوئي ويؤدي إلى قرار Z أفضل ولكن أيضا المزيد من الوقت التصوير. وقت التصوير لم يعد يحتمل أن يسبب د أكثر/فوتوبليتشينج
مع هذا الأسلوب، وفي بعض الأحيان قد لا يكون سهلاً لمراقبة تفاصيل الخلوية في أعمق طبقات الأنسجة، احتمالاً بسبب الحد من الكشف عن [كنفوكل] وتلطيخ PI الكفاءة في الأنسجة الداخلية. استناداً إلى تجربتنا، زيادة تركيز الحل PI و/أو الوقت المصبوغة يمكن أن تساعد في الحصول على وصمة عار أفضل. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء التعديلات إلى إجراء المصبوغة. على سبيل المثال، يعمل الأسلوب يوديد (mPS-PI) معدلة الزائفة-شيف بروبيديوم جيدا ل الأنسجة الثابتة20. ولا يزال من الضروري العثور على الأصباغ البديلة مع تلطيخ أفضل للأنسجة الحية في المستقبل. وباﻹضافة إلى ذلك، كما أنها مثيرة للاهتمام لاختبار ما إذا كان يمكن تطبيق الأسلوب الموصوفة هنا عموما لدراسة سامز من سائر النباتات المزهرة، نظراً لأن بعض الأنواع النباتية الخاصة المحتويات الخلوية أو جدار الخلية مختلفة التراكيب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب تقر "بوردو بندلي العلوم البيولوجية مركز التصوير مرفق" للحصول على ليزر المسح مجهر [كنفوكل]، والدعم التقني، والكتاب نقدر المساعدة من شبير أندي في "مرفق التصوير بندلي بوردو". تم تمويل هذا النشاط بجامعة بوردو كجزء من أجسيد مفترق طرق التمويل لدعم الزراعة والتنمية الريفية في ولاية إنديانا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
- Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
- Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
- Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
- Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
- Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
- Vaughan, J. G., Jones, F. R.
- Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
- Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331 (2006).
- Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
- Heisler, M. G., Ohno, C.
- Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
- Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156 (2017).
- Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).
- Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773 (2017).
- Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
- Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
- Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043 (2015).
- Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23 (2013).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
![[كنفوكل] تصوير مباشر من تبادل لإطلاق النار قمية الخلايا الإنشائية من الأنواع النباتية المختلفة](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/59369.jpg)
