Summary
Este protocolo apresenta como viver a imagem e analisar os meristemas apical de tiro de diferentes espécies de plantas usando laser, microscopia confocal.
Abstract
As funções do meristema apical (SAM) de atirar como um reservatório de células-tronco conservada e gera quase todos os tecidos na superfície durante o desenvolvimento pós-embrionário. A atividade e a morfologia dos SAMs determinam traços agronômicos importantes, como arquitetura de atirar, o tamanho e o número de órgãos reprodutivos e o mais importante, rendimento de grãos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para analisar tanto a morfologia de superfície e a estrutura celular interna dos SAMs vivos de espécies diferentes, através do laser, microscópio confocal de varredura. Todo o processo de preparação da amostra para a aquisição de imagens em alta resolução tridimensionais (3D) pode ser realizado dentro de tão curto quanto 20 minutos. Demonstramos que este protocolo é altamente eficiente para estudar não só a inflorescência SAMs da espécie de modelo, mas também os meristemas vegetativos de diferentes culturas, fornecendo uma ferramenta simples mas poderosa para estudar a organização e o desenvolvimento de meristemas através de diferentes espécies de plantas.
Introduction
A meristema da planta contém um pool de células-tronco indiferenciadas e continuamente sustenta o crescimento de órgãos da planta e desenvolvimento1. Durante o desenvolvimento pós-embrionário, quase todos os tecidos acima do solo de uma planta derivam a meristema apical de tiro (SAM). Nas lavouras, a atividade e o tamanho de SAM e suas derivada os meristemas florais são firmemente associados com muitas características agronômicas como atirar arquitetura, produção de frutos e rendimento de sementes. Por exemplo, no tomate, um alargada SAM provoca um aumento a atirar e a ramificação da inflorescência e, portanto, resultados na geração extra flor e fruta órgãos2. No milho, um aumento no tamanho do SAM leva a um maior número de sementes e rendimento total3,4. Na soja, a indeterminação do meristema também está intimamente associada com a arquitetura de atirar e produzir5.
A morfologia e anatomia de SAMs podem ser caracterizados por diversos métodos, incluindo corte/coloração histológica e digitalização de microscopia eletrônica de varredura (MEV)6, ambos os quais extremamente avançado a pesquisa meristema através do fornecimento de ou a vista secional ou uma visão de superfície tridimensional (3D) de SAMs. No entanto, ambos os métodos são demorados, envolvendo várias etapas experimentais de preparação da amostra para a aquisição de dados, e estes métodos dependem principalmente amostras fixas. Avanços recentes na técnica de microscopia confocal de varredura de laser têm de superar essas limitações e nos fornecem uma poderosa ferramenta para investigar a estrutura celular e processo de desenvolvimento da planta os tecidos e órgãos7,8. Através de óptico ao invés de tecido físico microscopia confocal, corte permite a recolha de uma série de imagens de z-pilha e a subsequente reconstrução 3D da amostra através do software de análise de imagem.
Aqui, descrevemos um procedimento eficiente para investigar ambos dentro e estruturas de superfície dos SAMs vivos de diferentes espécies usando laser, microscopia confocal, que potencialmente permite que pesquisadores realizar todo o experimental de plantas processo no prazo tão curto quanto 20 minutos. Diferente de outros métodos publicados para a imagem latente confocal ao vivo, de Arabidopsis inflorescência SAMs9,10,11,12,13,14, 15 e Arabidopsis flores12,13, aqui nós demonstramos que este protocolo é altamente eficiente para estudar não só os meristemas de inflorescência da espécie de modelo, mas também a filmagem vegetativa de meristemas apical de diferentes culturas, como soja e tomate. Este método não depende de marcadores fluorescentes transgênicos e potencialmente pode ser aplicado para estudo de muitos diferentes espécies e cultivares, os meristemas a atirar. Além disso, também apresentamos a passos para visualizar e analisar diferentes SAMs em uma vista 3D de processamento de imagem simples. Tomados em conjunto, este método simples facilitará os pesquisadores a compreender melhor a estrutura e o processo de desenvolvimento dos meristemas de ambos os organismos modelo e culturas.
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Protocol
1. preparação de pratos meios de comunicação e imagem
- Placas de MS: Adicionar 0,5 x Murashige & Skoog MS médio, ágar de 1% em água desionizada e depois ajustar o pH a 5.8 usando a solução de hidróxido de potássio (opcional: adicionar 1% de sacarose para o crescimento de planta a longo prazo). Placas de autoclave e despeje.
- Pratos de imagem: encher os pratos de Petri plásticos (6 cm de largura, 1,5 cm de profundidade) para 0,5-0,8 cm com 1,5% de agarose derretido.
2. planta de crescimento
-
Crescimento de Arabidopsis
- Semear sementes esterilizadas em placas de MS e colocar placas abaixo de 4 ° C por dois dias. Em seguida, mover placas MS para um dia curto (8 h luz / escuro 16 h), a 22 ° C, durante duas semanas.
- Transplante de mudas para o solo e cultivá-las em um dia curto (8 h luz / escuro 16 h) a 22 ° C, durante quatro semanas.
- Transferi as plantas para luz contínua, a 22 ° C, para induzir a transição entre a vegetativa para a fase de reprodução e de imagem a inflorescência SAMs.
- Crescimento de soja e tomate
- Incube as sementes cobertas com papel de filtro molhado abaixo de 28 ° C, até que germinam.
- Transplante de mudas para o solo e cultivá-las em um dia (16 h luz / escuro 8 h) a 25 ° C, durante uma semana ou mais para as SAMs vegetativos de imagem.
3. dissecação do ápice de fotos
- Dissecação do ápice atirar inflorescência
- Corte o ápice de tiro de inflorescência juntamente com a haste principal de 1-2 cm das plantas Arabidopsis aparafusadas com uma lâmina de barbear. Segure a parte basal do caule principal e retire como muitos órgãos de flor mais velhos quanto possível a haste principal dissecando fora os pedúnculos com fórceps de joias.
Atenção: Evite os dedos de corte quando usando uma lâmina de barbear. Elimine as lâminas de barbear usadas para recipiente de uma adequada para objectos cortantes. - Segure a haste anexada do ápice de fotos com joias fórceps ou dedos no campo do microscópio estereoscópico, continuar retirando o resto das flores até quase o SAM todo pode ser visto a partir das oculares. Retire os pedúnculos claramente na junção da haste principal.
- Corte o ápice de tiro de inflorescência juntamente com a haste principal de 1-2 cm das plantas Arabidopsis aparafusadas com uma lâmina de barbear. Segure a parte basal do caule principal e retire como muitos órgãos de flor mais velhos quanto possível a haste principal dissecando fora os pedúnculos com fórceps de joias.
- Dissecação do ápice vegetativo de fotos
- Para exibir as SAMs vegetativos de tomate ou de soja, dissecar para fora os cotilédones, folhas e raízes de plantas.
- Segure o hipocótilo das plantas sob o microscópio estereoscópico e dissecar mais fora o primordia folha cobrindo as SAMs vegetativas usando fórceps de joias.
4. coloração
- Para visualizar diretamente as células no SAMs, use solução de iodeto (PI) recentemente preparada propidium manchar paredes celulares. Dissolver o pó de PI em água desionizada estéril, fazer PI de 1mL de solução de coloração na concentração de 1 mg/mL e armazenar a solução de PI em microcentrifuga tubo coberto com papel alumínio.
- Adicionar 50 µ l de solução de PI em um ambiente limpo e vazio de Petri e mergulho todo dissecado atirar ápice em tintura de 2 min. Enxágue o ápice manchada de atirar duas vezes em água desionizada estéril. Durante o processo de coloração, mergulhe a inflorescência inteira SAM ou vegetativa SAM para a solução de PI para atingir a coloração uniforme.
5. coleção de imagens
Nota: para este método, todos as SAMs são fotografados usando um microscópio confocal na posição vertical e com uma água-mergulho lente de 20x. Conforme descrito em outros protocolos9,12,13,15, também é viável para imagem SAMs usando um microscópio invertido. Além disso, a imagem ao vivo pode ser conseguida usando marcas diferentes de microscópios confocal, com as mesmas etapas de preparação de amostra. Neste estudo, as etapas de geração de imagens são descritas em detalhes como um exemplo.
- Furar um buraco no centro de um prato de imagem usando fórceps e enfiar o ápice manchada de fotos vertical no meio.
- Encha o prato de imagem com água desionizada estéril de imergir completamente a amostra. Visualizando o microscópio estéreo, pipeta de cima e para baixo para remover as bolhas de ar preso em volta da meristema. Em seguida, ajuste o ângulo do tronco em agar para certificar-se que o SAM é totalmente visível da diretamente acima.
- Coloque o prato de imagem no palco amostra do microscópio confocal. Baixar água-mergulho lente e levantar o estágio de amostra de microscópio para permitir que a ponta da lente de imersão na água.
- Abra o software do microscópio confocal e localize o SAM no brightfield nas oculares. Mover para a direita de amostra SAM abaixo da lente objetiva, através do ajuste do controlador XY, em seguida, focar o SAM de oculares através de cautelosamente, ajuste o controlador Z.
- Operar a função de aquisição do software microscópio confocal (ver Tabela de materiais), iniciar o modo de viver para ver a amostra da tela do computador e configurar todos os parâmetros para o experimento de exploração do laser.
- Ao ajustar os parâmetros, use a função de Indicador de escala para definir se o sinal está saturado ou não.
- Opcionalmente, aplica a função de reutilizar para recarregar todas as configurações de parâmetro do arquivo selecionado confocal.
Nota: Sugeriu parâmetros de imagem: Laser de linha (excitação): 515 nm ou 561 nm; Emissão 570-650 nm; pinhole: 1 unidade arejada (AU); Ganho: 600-750, modo de digitalização: Frame; Tamanho de quadro: 512 X 512 ou 1024 X 1024; velocidade de digitalização: de 7 a Max; Direção de digitalização: bi-direção; Número médio: 2-4; Uma média de método: quer dizer; Profundidade de bit: 16 bits; Intervalo de varredura: 0,5-1 µM. Além disso, otimize todos estes parâmetros baseados sobre a natureza das amostras de plantas diferentes e as necessidades específicas de imagem.
6. processamento de imagem
- Para poder visualizar vistas de seção transversal e ortogonais ótica, use o mesmo software comercial para a aquisição de imagens. Abra o arquivo original confocal, clique menu orto, selecione orto. Em seguida, selecione qualquer posição x, z e y posição posição da imagem e salve as imagens como arquivos tiff.
- Opcionalmente, selecione distância 3D função para definir a distância física entre dois pontos selecionados da pilha das imagens confocal.
- Como alternativa, use Fiji/Image J, o pacote de processamento de imagem aberto recurso Visualizar as vistas de seção transversal e ortogonais.
- Abra o arquivo original confocal com Fiji, clique imagem menu, selecione pilhas e selecione vistas ortogonais.
- Selecione XY, YZe XZ aviões na posição intermédia e salve como imagens em formato Tiff.
- Para visualizar uma projeção 3D transparente, use o mesmo software.
- Abra o arquivo original confocal, clique menu 3De selecione transparente para gerar uma visualização de projeção em 3D.
- Opcionalmente, clique em menu 3D, selecione aparênciae selecione transparência para ajustar três parâmetros da projeção incluindo limiar, rampa e máxima para a transparência do 3D imagem.
- Clique menu 3D, selecione a aparência e selecione luz para ajustar o brilho da imagem 3D.
- Exportar imagens projetadas e salvá-los como arquivos Tiff.
- Para a visualização de uma projeção de intensidade máxima 3D, abra os arquivos confocal com o mesmo software e clique no menu 3D.
- Selecione o menu 3D e máxima.
- Como alternativa, use Fiji/Image J Visualizar uma projeção 3D de intensidade máxima.
- Abra o arquivo original confocal com Fiji, clique imagem menu e selecione a pilhas.
- Selecione o projeto 3D e salvar como imagens em formato Tiff.
- Para visualizar a profundidade de exibição das imagens 3D de codificação, use o mesmo software.
- Clique menu 3D e selecione aparência.
- Selecione especial e Profundidade de codificação.
- Como alternativa, use J Fiji/imagem para visualizar a profundidade vista de codificação.
- Abra os arquivos confocal, clique em menu de imagem, selecione Hyperstack.
- Selecione o código Temporal-cor e salve como imagens em formato Tiff.
Nota: A codificação profundidade z-pilha também pode ser alcançada através do plugin Pilha de código Z para Fiji.
- Para poder visualizar o 3D vista de rotação como mostrado (filme 1 e 2 do filme), usar o mesmo software (consulte a Tabela de materiais).
- Abra os arquivos confocal, clique menu 3De selecione a série.
- Selecione processar a sériee selecione uma das quatro opções incluindo vira x, vire y, inicial e finale lista de posição.
- Salve a série render como os arquivos AVI.
- Como alternativa, use Fiji/Image J Visualizar o modo de exibição de rotação 3D.
- Abra o arquivo original confocal com Fiji, clique imagem menue selecione Stacks.
- Selecione o projeto 3D e salvar como vídeos em formato AVI.
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Representative Results
Para avaliar a eficiência do nosso protocolo e explorar a morfologia dos meristemas de diferentes espécies, que temos realizado os experimentos de imagiologia confocal ao vivo no meristema inflorescência de Arabidopsis e os meristemas vegetativos de soja e tomate. Neste estudo, Arabidopsis ecótipo Landsberg erecta, cultivar tomate Micro-Tom e cultivar soja 82 Williams têm sido usados como exemplos.
Visto na seção ortogonal no meio da SAM a Arabidopsis , é evidente que o PI foi capaz de manchar as paredes horizontais de quase todas as células com as várias camadas de células (figura 1A). De uma secção transversal através do corpus da inflorescência SAM, as células do plano XY são mostrados também claramente fotografada (figura 1B). Em vista da projeção em 3D, a meristema de inflorescência forma uma cúpula como estrutura e está rodeada pelo primordia flor em desenvolvimento, onde as células também estão manchadas e criação da imagem (Figura 1 C-D), (1 filme).
Visto da seção ortogonal no meio do tomate SAM, é evidente que o PI foi capaz de manchar as paredes horizontais de células para as várias camadas de células, embora o PI sinal da região interior profundo é um pouco menor. De uma secção transversal através das camadas profundas do SAM vegetativo, as células dos planos XY são também claramente, e foi o limite formado entre o meristema vegetativa e folha primordia também é imagem (Figura 2B). A vista do projeto 3D mais pode fornecer uma visão abrangente da forma e organização do meristema vegetativa de tomate (Figura 2-C-D), (filme 2).
Na vista ortogonal no meio da soja SAM, podemos ver a meristema vegetativa como cúpula e sua derivada nova folha primordia (Figura 3A). Em vista da projeção em 3D, tanto a meristema vegetativo da soja e a meristema vegetativo tomate formam a cúpula como estrutura, no entanto, a forma do meristema vegetativo de soja é diferente do que o meristema do tomate, e a organização e os padrões de a folha primordia em torno destes dois SAMs são distintas (Figura 3B-C).
Figura 1: Ao vivo de imagens e analisando a inflorescência SAM de Arabidopsis. A e B. ótica ortogonal (Orth) e vistas de seção transversais (Trans) do plano médio do mesmo SAM, PI (iodeto de propidium) mancham (roxas). C. uma projeção em 3D do mesmo SAM, mancha de PI (cinza). D. profundidade a codificação de cores da projeção 3D, com azul, indicando que a camada de superfície superior e vermelho que representa a camada mais profunda. Paredes celulares estavam manchadas com PI. Barras de escala: 20 µm (A, B); 50 µm (C, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de Live e analisando o SAM vegetativo de tomate. A e B. ótica ortogonal (Orth) e transversal (Trans) secção vistas do plano médio do SAM mesmo. C. uma projeção 3D do SAM mesmo. D. profundidade a codificação de cores da projeção 3D, com azul, indicando que a camada de superfície superior e vermelho que representa a camada mais profunda. Paredes celulares estavam manchadas com PI. Barras de escala: 20 µm (A, B); 50 µm (C, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ao vivo de imagens e analisando o SAM vegetativo da soja. A. ótica ortogonal (Orth) seção vista do plano médio do SAM vegetativo. B. uma projeção 3D do SAM mesmo. C. profundidade a codificação de cores da projeção 3D, com azul, indicando que a camada de superfície superior e vermelho que representa a camada mais profunda. Paredes celulares estavam manchadas com PI. Barras de escala: 20 µm (A); 50 µm (B, C). Seta: folha Primórdio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Video 1: rotação 3D de Arabidopsis meristema inflorescência na Figura 1. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 2: rotação 3D do meristema vegetativo tomate na Figura 2. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Aqui, descrevemos um método simples de imagem que pode ser aplicado ao estudo dos meristemas apical de tiro de diferentes plantas com pequena modificação, abrindo uma nova avenida para estudar o Regulamento de meristema nas fases vegetativas e reprodutivas de plantas do modelo e colheitas. Em contraste com o SEM e métodos de coloração histológicos, este protocolo pode ajudar a revelar tanto vista de superfície e estruturas celulares internas do SAMs, sem a necessidade de fixação da amostra de trabalho intensivo e/ou medidas de corte de tecido. Este protocolo também é compatível com o método estabelecido de imagem para os repórteres de fluorescência com base nas SAMs, potencialmente, proporcionando uma boa resolução de celular que nos permite obter uma vista 3D de testes padrões da expressão de genes-chave e proteínas na MCS16 ,17,18,19. Além disso, a imagem associada processamento procedimento descrito aqui será capaz de grandemente ajudar os pesquisadores a analisar e comparar as SAMs de espécies diferentes em 3D, avançando tanto estudos de biologia evolutiva do desenvolvimento e pesquisa agrícola.
Existem alguns passos críticos neste protocolo simples. Primeiro, a preparação da amostra e dissecação. Uma planta SAM é geralmente escondida por desenvolvimento primordia e órgãos jovens na ponta do tiro, e isso não pode ser fotografado diretamente sob um microscópio confocal. Para o SAM vegetativo de imagem, é necessário remover todas as folhas e os mais velho primordia de folha que cobrem em cima o SAM usando fórceps de joias finas. Para a inflorescência SAM de imagem, é necessário remover cuidadosamente todas as flores jovens para expor o SAM, também usando fórceps de joias finas.
Segundo, a célula viva coloração usando a solução de PI. Neste protocolo, usamos solução recentemente preparada de PI (1 mg/mL) para manchar paredes celulares para visualizar diretamente ao vivo SAMs, que é rápido, eficiente e fácil de executar. Embora a solução de PI pode ser armazenada a 4 ° C durante várias semanas, uma solução recentemente preparada, geralmente, dá o melhor resultado para os meristemas apical de atirar a coloração. Embora a PI principalmente não atravessa a membrana das células vivas e mancha intactas células com contorno claro celular, pode facilmente penetrar as células danificadas/mortos e fortemente manchar os núcleos e outros sistemas de membrana interna nessas áreas danificadas, potencialmente afetar a qualidade das imagens confocal. Assim, será essencial para evitar danos físicos ao preparar o SAM amostras para a coloração e vive de imagem. Por outro lado, PI, em uma concentração elevada mostra um efeito tóxico às células vegetais, e assim, FM4-64 pode ser usado como um substituto para o PI para manchar a vida de SAM células9. No entanto, FM4-64 etiquetas de membrana plasmática, que pode potencialmente ser retomada em célula interior através de endocitose, tornando-se desafiador para manchar as amostras com alta resolução de celular.
Terceiro, a aquisição de imagem. 1). altas aberturas numéricas (NA), a lente de imersão de água é fundamental para a geração de imagens ao vivo das SAMs. Água tem um maior índice de refração do ar e a alta da lente objetiva ajuda a coletar fótons sinal espalhados através de camadas de células profundas do SAMs. 2). as configurações de poder do laser (watts ou watts por superfície) podem ser altamente variáveis entre diferentes microscópios confocal. Maior potência do laser pode permitir a melhor coleção de sinal mas leva a mais Fotodano / fotobranqueamento sobre as amostras. Existem trade-offs entre resolução, branqueamento e imagem tempo. Em geral, selecionar um tamanho de quadro maior leva a melhor resolução XY, mas a mais tempo de imagem e selecionar um intervalo de varredura menores leva a uma melhor resolução de Z, mas também mais tempo de imagem. Tempo mais de imagem faz com que potencialmente mais Fotodano / fotobranqueamento
Com este método, às vezes pode não ser fácil observar detalhes celulares em camadas de tecido mais profundas, provavelmente devido à limitação da detecção confocal e a coloração de PI ineficiente em tecidos internos. Com base em nossas experiências, aumentando a concentração da solução de PI e/ou o tempo de coloração pode ajudar a tirar uma mancha de melhor. Alternativamente, as modificações para o procedimento de coloração podem ser feitas. Por exemplo, o método de iodeto (mPS-PI) pseudo-Schiff modificados propidium funciona bem para os tecidos fixo20. E é ainda necessário encontrar alternativas corantes com melhor coloração para os tecidos vivos no futuro. Além disso, também é interessante testar se o método descrito aqui pode ser geralmente aplicado ao estudo dos SAMs de todas as outras plantas, considerando o fato de que algumas espécies de plantas têm conteúdo celular especial ou diferente de parede celular composições.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem Purdue Bindley Bioscience Center Imaging facilidade para acessar o microscópio confocal de varredura a laser e para o suporte técnico, e os autores Agradecemos a ajuda de Andy Schaber na instalação de imagens Bindley de Purdue. Esta atividade foi financiada pela Universidade de Purdue, como parte das encruzilhadas AgSEED financiamento para apoiar a agricultura e Desenvolvimento Rural de Indiana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Phyto | Dot Scientific Inc. | DSA20300-1000 | |
| Agarose | Dot Scientific Inc. | AGLE-500 | |
| Forceps | ROBOZ | RS-4955 | Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices. |
| LSM 880 Upright Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog MS medium | Dot Scientific Inc. | DSM10200-50 | |
| Plan APO 20x/1.1 water dipping lens | Zeiss | ||
| Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm | CELLTREAT Scientific Products | 229694 | Use as making MS plates |
| Plastic petri dishes60 mm X 15 | CELLTREAT Scientific Products | 229665 | Use as imaging dishes |
| Propagation Mix | Sungro Horticulture | ||
| Propidium iodide | Acros Organics | 440300250 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
| Razor blade | PERSONNA | 62-0179 | For cutting shoot apex from plants |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Tissue | VWR | 82003-820 | |
| Zen black | Zeiss | Image acquisition software |
References
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