Summary

Confocal ao vivo de imagens de Shoot sub-apical de diferentes espécies de plantas

Published: March 29, 2019
doi:

Summary

Este protocolo apresenta como viver a imagem e analisar os meristemas apical de tiro de diferentes espécies de plantas usando laser, microscopia confocal.

Abstract

As funções do meristema apical (SAM) de atirar como um reservatório de células-tronco conservada e gera quase todos os tecidos na superfície durante o desenvolvimento pós-embrionário. A atividade e a morfologia dos SAMs determinam traços agronômicos importantes, como arquitetura de atirar, o tamanho e o número de órgãos reprodutivos e o mais importante, rendimento de grãos. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para analisar tanto a morfologia de superfície e a estrutura celular interna dos SAMs vivos de espécies diferentes, através do laser, microscópio confocal de varredura. Todo o processo de preparação da amostra para a aquisição de imagens em alta resolução tridimensionais (3D) pode ser realizado dentro de tão curto quanto 20 minutos. Demonstramos que este protocolo é altamente eficiente para estudar não só a inflorescência SAMs da espécie de modelo, mas também os meristemas vegetativos de diferentes culturas, fornecendo uma ferramenta simples mas poderosa para estudar a organização e o desenvolvimento de meristemas através de diferentes espécies de plantas.

Introduction

A meristema da planta contém um pool de células-tronco indiferenciadas e continuamente sustenta o crescimento de órgãos da planta e desenvolvimento1. Durante o desenvolvimento pós-embrionário, quase todos os tecidos acima do solo de uma planta derivam a meristema apical de tiro (SAM). Nas lavouras, a atividade e o tamanho de SAM e suas derivada os meristemas florais são firmemente associados com muitas características agronômicas como atirar arquitetura, produção de frutos e rendimento de sementes. Por exemplo, no tomate, um alargada SAM provoca um aumento a atirar e a ramificação da inflorescência e, portanto, resultados na geração extra flor e fruta órgãos2. No milho, um aumento no tamanho do SAM leva a um maior número de sementes e rendimento total3,4. Na soja, a indeterminação do meristema também está intimamente associada com a arquitetura de atirar e produzir5.

A morfologia e anatomia de SAMs podem ser caracterizados por diversos métodos, incluindo corte/coloração histológica e digitalização de microscopia eletrônica de varredura (MEV)6, ambos os quais extremamente avançado a pesquisa meristema através do fornecimento de ou a vista secional ou uma visão de superfície tridimensional (3D) de SAMs. No entanto, ambos os métodos são demorados, envolvendo várias etapas experimentais de preparação da amostra para a aquisição de dados, e estes métodos dependem principalmente amostras fixas. Avanços recentes na técnica de microscopia confocal de varredura de laser têm de superar essas limitações e nos fornecem uma poderosa ferramenta para investigar a estrutura celular e processo de desenvolvimento da planta os tecidos e órgãos7,8. Através de óptico ao invés de tecido físico microscopia confocal, corte permite a recolha de uma série de imagens de z-pilha e a subsequente reconstrução 3D da amostra através do software de análise de imagem.

Aqui, descrevemos um procedimento eficiente para investigar ambos dentro e estruturas de superfície dos SAMs vivos de diferentes espécies usando laser, microscopia confocal, que potencialmente permite que pesquisadores realizar todo o experimental de plantas processo no prazo tão curto quanto 20 minutos. Diferente de outros métodos publicados para a imagem latente confocal ao vivo, de Arabidopsis inflorescência SAMs9,10,11,12,13,14, 15 e Arabidopsis flores12,13, aqui nós demonstramos que este protocolo é altamente eficiente para estudar não só os meristemas de inflorescência da espécie de modelo, mas também a filmagem vegetativa de meristemas apical de diferentes culturas, como soja e tomate. Este método não depende de marcadores fluorescentes transgênicos e potencialmente pode ser aplicado para estudo de muitos diferentes espécies e cultivares, os meristemas a atirar. Além disso, também apresentamos a passos para visualizar e analisar diferentes SAMs em uma vista 3D de processamento de imagem simples. Tomados em conjunto, este método simples facilitará os pesquisadores a compreender melhor a estrutura e o processo de desenvolvimento dos meristemas de ambos os organismos modelo e culturas.

Protocol

1. preparação de pratos meios de comunicação e imagem Placas de MS: Adicionar 0,5 x Murashige & Skoog MS médio, ágar de 1% em água desionizada e depois ajustar o pH a 5.8 usando a solução de hidróxido de potássio (opcional: adicionar 1% de sacarose para o crescimento de planta a longo prazo). Placas de autoclave e despeje. Pratos de imagem: encher os pratos de Petri plásticos (6 cm de largura, 1,5 cm de profundidade) para 0,5-0,8 cm com 1,5% de agarose derretido. <p class="jove_t…

Representative Results

Para avaliar a eficiência do nosso protocolo e explorar a morfologia dos meristemas de diferentes espécies, que temos realizado os experimentos de imagiologia confocal ao vivo no meristema inflorescência de Arabidopsis e os meristemas vegetativos de soja e tomate. Neste estudo, Arabidopsis ecótipo Landsberg erecta, cultivar tomate Micro-Tom e cultivar soja 82 Williams têm sido usados como exemplos. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1…

Discussion

Aqui, descrevemos um método simples de imagem que pode ser aplicado ao estudo dos meristemas apical de tiro de diferentes plantas com pequena modificação, abrindo uma nova avenida para estudar o Regulamento de meristema nas fases vegetativas e reprodutivas de plantas do modelo e colheitas. Em contraste com o SEM e métodos de coloração histológicos, este protocolo pode ajudar a revelar tanto vista de superfície e estruturas celulares internas do SAMs, sem a necessidade de fixação da amostra de trabalho intensivo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores reconhecem Purdue Bindley Bioscience Center Imaging facilidade para acessar o microscópio confocal de varredura a laser e para o suporte técnico, e os autores Agradecemos a ajuda de Andy Schaber na instalação de imagens Bindley de Purdue. Esta atividade foi financiada pela Universidade de Purdue, como parte das encruzilhadas AgSEED financiamento para apoiar a agricultura e Desenvolvimento Rural de Indiana.

Materials

Agar Phyto Dot Scientific Inc. DSA20300-1000
Agarose Dot Scientific Inc. AGLE-500
Forceps  ROBOZ RS-4955 Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices.
LSM 880 Upright Confocal Microscope  Zeiss
Murashige & Skoog MS medium Dot Scientific Inc. DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 water dipping lens Zeiss
Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm CELLTREAT Scientific Products 229694 Use as making MS plates
Plastic petri dishes60 mm X 15 CELLTREAT Scientific Products 229665 Use as imaging dishes
Propagation Mix Sungro Horticulture
Propidium iodide Acros Organics 440300250 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
Razor blade PERSONNA  62-0179 For cutting shoot apex from plants
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Tissue VWR 82003-820
Zen black Zeiss Image acquisition software

References

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Cite This Article
Geng, Y., Zhou, Y. Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species. J. Vis. Exp. (145), e59369, doi:10.3791/59369 (2019).

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