Summary

Proyección de imagen confocal vivo de meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas

Published: March 29, 2019
doi:

Summary

Este protocolo presenta cómo viven la imagen y analizar los meristemos apicales de brotes de diferentes especies de plantas mediante microscopía confocal de barrido láser.

Abstract

Las funciones de meristemo apical (SAM) de disparar como un reservorio de células madre conservadas y genera casi todos los tejidos sobre el suelo durante el Desarrollo postembrionario. La actividad y la morfología de SAMs determinan características agronómicas importantes, tales como arquitectura de disparar, el tamaño y número de órganos reproductivos y lo más importante, rendimiento de grano. Presentamos un protocolo detallado para el análisis de la morfología superficial y la estructura celular interna de la vida del SAMs de diferentes especies a través del microscopio confocal de barrido láser. Todo el procedimiento de la preparación de la muestra a la adquisición de imágenes (3D) tridimensionales de alta resolución puede lograrse dentro de tan corto como 20 minutos. Demostramos que este protocolo es muy eficiente para estudiar no sólo la inflorescencia SAMs de la especie modelo, sino los meristemos vegetativos de diferentes cultivos, proporcionando una herramienta simple pero poderosa para estudiar la organización y desarrollo de meristemos en diferentes especies de plantas.

Introduction

El meristemo de la planta contiene una reserva de células madre no diferenciadas y sostiene continuamente la planta órgano crecimiento y desarrollo1. Durante el Desarrollo postembrionario, casi todos los tejidos sobre el suelo de una planta se derivan desde el meristemo apical de brote (SAM). En los cultivos, la actividad y el tamaño del SAM y sus derivados meristemos florales están estrechamente asociadas con muchas características agronómicas tales como disparar arquitectura, producción de frutos y rendimiento de semilla. Por ejemplo, en tomate, un SAM ampliado causa un aumento en el brote y la ramificación de la inflorescencia y así resultados en la generación extra flor y fruta órganos2. En maíz, un aumento de tamaño de SAM lleva a un mayor número de semillas y rendimiento total3,4. En soja, la indeterminación del meristemo también está estrechamente relacionada con la arquitectura de disparar y rendimiento5.

La morfología y anatomía de Sam se caracteriza por varios métodos, incluyendo el seccionamiento, tinción histológica y exploración de la microscopia electrónica (SEM)6, los cuales han avanzado grandemente la investigación meristemo proporcionando la seccional vista o una tridimensional (3D) superficie de Sam. Sin embargo, ambos métodos son lentos, que implica varias medidas experimentales de la preparación de la muestra para la adquisición de datos, y estos métodos dependen principalmente de muestras fijadas. Avances recientes en la técnica de microscopía confocal de escaneo láser han superado estas limitaciones y nos proporcionan una herramienta poderosa para investigar la estructura celular y el proceso de desarrollo de la planta tejidos y órganos7,8. A través de óptica en lugar de tejido físico microscopia confocal, seccionamiento permite la colección de una serie de imágenes z-stack y la posterior reconstrucción 3D de la muestra a través de software de análisis de imagen.

Aquí, describimos un procedimiento eficiente para investigar tanto dentro de estructuras superficiales de la vida del SAMs de diferentes especies y vegetales mediante láser, microscopía confocal, que potencialmente permite a los investigadores para llevar a cabo la experimental proceso dentro de tan corto como 20 minutos. Diferente de otros métodos publicados para la proyección de imagen confocal vivo de Arabidopsis inflorescencia SAMs9,10,11,12,13,14, 15 y Arabidopsis flores12,13, aquí demostramos que este protocolo es muy eficiente para estudiar no sólo los meristemas de inflorescencia de la especie modelo, sino el brote vegetativo meristemos apicales de diferentes cultivos, como tomate y soja. Este método no se basa en marcadores fluorescentes transgénicos y potencialmente se puede aplicar para estudiar los meristems del lanzamiento de muchas especies y cultivares. Además, presentamos los pasos para ver y analizar las diferentes SAMs en una vista 3D de procesamiento de imágenes simple. Tomados en conjunto, este sencillo método facilitará a los investigadores comprender mejor la estructura y el proceso de desarrollo de los meristemos de organismos modelo y cultivos.

Protocol

1. medios de comunicación y proyección de imagen de la preparación de platos Placas de MS: Añadir 0,5 x Murashige y Skoog MS medio, agar al 1% en agua desionizada y luego ajustar el pH a 5,8 con solución de hidróxido de potasio (opcional: agregar sacarosa al 1% para el crecimiento de la planta a largo plazo). Autoclave y vierta las placas. Platos de imagen: llenar de plástico platos de Petri (6 cm de ancho, 1,5 cm de profundidad) a 0.5-0.8 cm con 1.5% de agarosa fundida. <p class="jov…

Representative Results

Para evaluar la eficiencia de nuestro protocolo y explorar la morfología de los meristemos de diferentes especies, hemos realizado los experimentos de imagen vivo confocales en el meristemo de la inflorescencia de Arabidopsis y los meristemos vegetativos de tomate y la soja. En este estudio, ecotipo Landsberg erectade Arabidopsis , cultivar tomate Tom Micro y cultivar soja 82 Williams han utilizado como ejemplos. <p class="jove_content" fo:keep-together.wit…

Discussion

Aquí, describimos un método simple de imágenes que se puede aplicar al estudio de los meristemos apicales de brotes de diversas plantas con modificaciones menores, abriendo una nueva vía para estudiar la regulación del meristemo en etapas vegetativas y reproductivas en plantas modelo y de los cultivos. En contraste con el SEM y los métodos de tinción histológicos, este protocolo puede ayudar a revelar más superficie y estructuras celulares internas de SAMs, sin necesidad de fijación de la muestra de mano de obr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen Purdue Bindley Bioscience Center imagen facilidad para acceder al microscopio confocal de escaneo láser y para el apoyo técnico, y los autores aprecian la ayuda de Andy Schaber en las instalaciones de la proyección de imagen de Bindley de Purdue. Esta actividad fue financiada por la Universidad de Purdue como parte del cruce de AgSEED fondos para apoyar la agricultura y Desarrollo Rural de Indiana.

Materials

Agar Phyto Dot Scientific Inc. DSA20300-1000
Agarose Dot Scientific Inc. AGLE-500
Forceps  ROBOZ RS-4955 Dumont #5SF Super Fine Forceps Inox Tip Size .025 X .005mm, for dissecting shoot apices.
LSM 880 Upright Confocal Microscope  Zeiss
Murashige & Skoog MS medium Dot Scientific Inc. DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 water dipping lens Zeiss
Plastic petri dishes 100 mm X 15 mm CELLTREAT Scientific Products 229694 Use as making MS plates
Plastic petri dishes60 mm X 15 CELLTREAT Scientific Products 229665 Use as imaging dishes
Propagation Mix Sungro Horticulture
Propidium iodide Acros Organics 440300250 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls
Razor blade PERSONNA  62-0179 For cutting shoot apex from plants
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Tissue VWR 82003-820
Zen black Zeiss Image acquisition software

References

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Cite This Article
Geng, Y., Zhou, Y. Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species. J. Vis. Exp. (145), e59369, doi:10.3791/59369 (2019).

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