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Biochemistry

Strutture a livello molecolare interfacciale di polimeri e biomacromolecole rivelate tramite spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59380
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

Summary

Essendo ampiamente utilizzata, la spettroscopia vibrazionale della generazione di frequenza della somma (SFG) può aiutare a rivelare l'ordine conformazionale della catena e il cambiamento strutturale secondario che avviene nelle interfacce polimeriche e biomacromolecolari.

Abstract

Come spettroscopia ottica non lineare di secondo ordine, la spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza della somma (SFG) è stata ampiamente utilizzata nello studio di varie superfici e interfacce. Questa tecnica ottica non invasiva può fornire le informazioni locali a livello molecolare con sensibilità monostrato o submonostrato. Qui stiamo fornendo una metodologia sperimentale su come rilevare selettivamente l'interfaccia sepolta sia per le macromolecole che per le biomacromolecole. Con questo in mente, vengono discusse le strutture secondarie interfacciali della fibroina di seta e delle strutture idriche intorno al modello short-chain oligonucleotide duplex. Il primo mostra una sovrapposizione a catena o un effetto di confinamento spaziale e il secondo mostra una funzione di protezione contro gli ioni Ca 2 opiù risultanti dalla sovrastruttura del colonna vertebrale chirale dell'acqua.

Introduction

Lo sviluppo della spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma (SFG) può essere datato al lavoro svolto da Shen et al. trent'anni fa1,2. L'unicità della selettività interfacciale e della sensibilità sub-monostrato rende la spettroscopia vibrazionale SFG apprezzata da un gran numero di ricercatori nei campi della fisica, della chimica, della biologia e della scienza dei materiali, ecc.3,4 ,5. Attualmente, un'ampia gamma di questioni scientifiche relative alle superfici e alle interfacce è in fase di studio utilizzando SFG, in particolare per interfacce complesse rispetto ai polimeri e alle biomacromolecole, come le strutture a catena e il rilassamento strutturale interfacce polimeriche sepolte, le strutture secondarie delle proteine e le strutture dell'acqua interfacciale9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

Per le superfici e le interfacce polimeriche, i campioni di pellicola sottile sono generalmente preparati mediante rivestimento a spin per ottenere le superfici o le interfacce desiderate. Il problema sorge a causa dell'interferenza del segnale dalle due interfacce dei film così preparati, che porta a disagi per l'analisi degli spettri SFG raccolti27,28,29. Nella maggior parte dei casi, il segnale vibrazionale solo da una singola interfaccia, sia pellicola / substrato o pellicola / l'altro mezzo, è auspicabile. In realtà, la soluzione a questo problema è abbastanza facile, vale a dire, per massimizzare sperimentalmente i campi di luce presso l'interfaccia desiderabile e ridurre al minimo i campi di luce presso l'altra interfaccia. Pertanto, i coefficienti di Fresnel o i coefficienti di campo locali devono essere calcolati tramite il modello a pellicola sottile e devono essere convalidati rispetto ai risultati sperimentali3,9,10,11, 12,13,14,15,30.

Con il background di cui sopra in mente, alcune interfacce polimeriche e biologiche potrebbero essere studiate al fine di comprendere la scienza fondamentale a livello molecolare. Di seguito, prendendo come esempi tre problemi interfacciali: sondare la superficie poli(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) e l'interfaccia sepolta con il substrato9, formazione di fibrosi seta (SF) strutture secondarie sulla superficie del polistirolo (PS) e strutture idriche che circondano modello a catena corta oligonucleotide duplex16,21, mostreremo come la spettroscopia vibrazionale SFG aiuta a rivelare le strutture a livello molecolare interfacciale in connessione con la scienza sottostante.

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Protocol

1. SFG sperimentale

  1. Utilizzare un sistema SFG picosecondo commerciale (Table of Materials), che fornisce un fascio fondamentale di 1064 nm con una larghezza dell'impulso di 20 ps e una frequenza di 50 Hz, basata su un laser Nd:YAG.
  2. Convertire il fascio fondamentale da 1064 nm in un fascio da 532 nm e in un fascio di 355 nm utilizzando il secondo e il terzo modulo armonico. Guidare direttamente il fascio di 532 nm come un fascio di luce di ingresso e generare l'altro fascio a infrarossi (IR) di ingresso che copre l'intervallo di frequenza da 1000 a 4000 cm-1 attraverso la generazione parametrica ottica (OPG)/amplificazione parametrica ottica (OPA)/ processo di generazione della frequenza di differenza (DFG).
  3. Impostare gli angoli di incidente di due travi di ingresso in modo che siano rispettivamente di 53 gradi (IR) e di 64 gradi (visibili), rispetto alla normale alla superficie.
  4. Per rilevare le strutture interfacciali interfacciali polimeriche (interfaccia pellicola/substrato o pellicola/altra interfaccia media), utilizzare ssp (fascio di frequenza a somma polarizzata s-polarizzato , fascio visibile polarizzato s e fascio infrarosso p-polarizzato) e combinazioni di polarizzazione ppp.
  5. Per rilevare le strutture secondarie delle proteine interfacciali e le strutture idriche che circondano il DNA, oltre a ssp e ppp, sono state utilizzate combinazioni di spp chirale e psp polarizzazione.
  6. Per garantire che i campioni non fossero danneggiati, controllare le energie dell'impulso infrarosso e visibile in modo che siano rispettivamente di 70 e 30 mJ. Uno schema del processo SFG con il diagramma del livello di energia è stato mostrato nella Figura 1. Figura 2 Mostra il sistema SFG nella nostra camera pulita.

2. Coefficienti Fresnel

  1. Utilizzare prismi ad angolo retto come substrati per tutti gli esperimenti discussi qui. Esistono due interfacce per una pellicola polimerica sul substrato solido, cioè la superficie polimerica nell'aria e l'interfaccia polimerica/substrato. Entrambi possono generare segnali SFG poiché la simmetria di inversione è interrotta in entrambe le interfacce. Pertanto, uno spettro SFG raccolto è interferito. Tuttavia, i coefficienti di campo locale o i coefficienti Fresnel alle due interfacce possono essere regolabili variando gli angoli dell'incidente o lo spessore della pellicola uno alla volta o contemporaneamente31,32. Questo ci offre l'opportunità di sondare il segnale vibrazionale SFG da una sola interfaccia. Qui, il film PHEMA sul prisma CaF2 è stato preso come esempio9.
  2. Come mostrato nella Figura 3, impiegare la geometria del prisma ad angolo retto per rilevare i segnali SFG generati dalla pellicola PHEMA inferiore. L'intensità di uscita SFG nella modalità riflessa è espressa come
    Equation 1(1)
    dove Equation 2 indica l'efficace tensore di suscettibilità non lineare di secondo ordine.
    Equation 2è costituito da tre parti, vale a dire l'interfaccia prism/polimero, l'interfaccia media polimero/inferiore (il mezzo inferiore comprende gas, liquido o solido.) e lo sfondo non risonante, come mostrato nell'equazione seguente.
    Equation 3(2)
    Qui il mezzo inferiore potrebbe essere aria, acqua o qualcos'altro. F rappresenta il coefficiente Fresnel corrispondente responsabile della correzione del campo locale.
  3. In questo caso, applicare un modello a pellicola sottile per calcolare i coefficienti di Fresnel. Qui vengono presentate solo brevi procedure di calcolo.
    1. Per l'interfaccia prism/polymer, utilizzare
      Equation 4(3)
      Equation 5(4)
      Equation 6(5)
      Il significato di ogni parametro mostrato è presentato di seguito.
      1. i indica la frequenza del fascio.
      2. tp e ts denotano i coefficienti di trasmissione complessivi e possono essere espressi come
        Equation 7(6)
        Equation 8(7)
      3. tp12 e ts12 denotano i coefficienti di trasmissione lineare del fascio di luce all'interfaccia prisma/polimero.
      4. rp23 e rs23 denotano i coefficienti di riflessione lineare del fascio di luce nell'interfaccia polimerica/media.
      5. rappresenta la differenza di fase tra un fascio riflettente e il suo fascio riflettente secondario dopo che si propaga attraverso la pellicola sottile polimerica e poi riflette indietro, che può essere espressa come
        Equation 9(8)
      6. rappresenta la lunghezza d'onda del fascio di luce e d è lo spessore della pellicola polimerica.
      7. Gli n. 1 e i n. 2 rappresentano gli angoli degli incidenti rispettivamente nell'interfaccia prism/polimero e nell'interfaccia polimero/medio.
      8. n1 e n2 rappresentano rispettivamente gli indici di rifrazione della pellicola prisma e polimerica.
      9. n12 rappresenta gli indici refrattivi degli strati interfacciali polimerici per il prisma/polimero.
    2. Per l'interfaccia polimerica/media, utilizzare
      Equation 10(9)
      Equation 11(10)
      Equation 12(11)
      1. La differenza di fase dei campi elettrici leggeri in due interfacce.
      2. Poiché la larghezza dell'impulso per le nostre travi di input è di 20 ps, l'errore del ritardo temporale associato all'effetto di dispersione può essere trascurato.
      3. L'espressione di tale differenza di fase per l'uscita SFG, l'ingresso visibile e le travi a infrarossi di ingresso possono essere scritte separatamente come
        Equation 13(12)
        Equation 14(13)
        Equation 15(14)
         
  4. Dalla discussione precedente, per il sistema prism-poliomer film-medium (1-2-3), esprimere i coefficienti Fresnel totali per le interfacce prism/polimero e polimero/medio come le seguenti equazioni, per le seguenti equazioni, per le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp . Naturalmente, entrambe le interfacce sono considerate azimuthally isotropico.
    1. Per l'interfaccia prism/polimero, le espressioni dei coefficienti totali di Fresnel per entrambe le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp sono presentate come segue.
      1. Per ssp, l'equazione è
        Equation 16(15)
      2. E per ppp, l'equazione è
        Equation 5(16)
        Equation 5(17)
        Equation 5(18)
        Equation 5(19)
         
      3. t10 e t01 denotano i coefficienti di trasmissione lineare rispettivamente alle interfacce aria/prisma e prisma/aria.
    2. Per l'interfaccia polimero/medio, le espressioni dei coefficienti totali di Fresnel per entrambe le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp sono descritte di seguito.
      1. Per ssp, l'equazione è
        Equation 21(20)
      2. Per ppp, le equazioni sono
        Equation 5(21)
        Equation 5(22)
        Equation 5(23)
        Equation 5(24)
           
         
  5. Dopo aver calcolato i coefficienti di Fresnel utilizzando il modello sandwich, tracciarli in funzione dello spessore della pellicola, come illustrato nella Figura 4.
    NOTA: In questo caso, esiste una gamma di spessore per la raccolta del segnale SFG dall'interfaccia CaF2 prism/PHEMA con contributo trascurabile dall'altra interfaccia, che è di circa 150 nm. Allo stesso modo, uno spessore adatto può essere scelto per il rilevamento dell'interfaccia media PHEMA/inferiore con contributo trascurabile dall'interfaccia CaF2 prism/PHEMA.

3. Ccombinazione di polarizzazione SFG

  1. Per l'interfaccia achirale normale, in genere, utilizzare la simmetria di C. v in termini di media dell'insieme33,34. Con il funzionamento della simmetria di inversione, è possibile dedurre i componenti del tensore non lineare non lineare non-lineare non zero, che sono cxxz, cxzx, czxx, cyyz, cyzy, czyy e czzz (il termini esistenti possono essere ulteriormente ridotti se si assume un'interfaccia isotropica, il che significa che x e y sono uguali). Tuttavia, per l'interfaccia chirale, la situazione sarà diversa. L'interfaccia chirale possiede la simmetria di C, è consentita solo l'operazione di simmetria di rotazione. In questo caso, oltre ai normali termini achirali, più suscettibilità non lineari di secondo ordine sarà diverso da zero, che può essere definito come i termini chirali, vale a dire, czyx, czxy e cyzx sotto la considerazione di non elettronici Risonanza. Pertanto, utilizzando psp, pps e combinazioni di polarizzazione spp, gli spettri SFG chirali possono essere raccolti33,34.

4. Preparazione del campione

  1. Preparazione del film PHEMA
    1. Sciogliere la polvere di PHEMA (vedi Tabella deimateriali) in etanolo anidrio soro per preparare la soluzione rispettivamente con 2 wt% e 4 wt%.
    2. Prima della deposizione dei film PHEMA, immergere le prismi dell'angolo retto CaF2 nel solvente toluene prima di tutto e poi lavate con etanolo e acqua ultrapura (18,2 M .
    3. Successivamente, esporre i substrati (prismi ad angolo retto CaF 2) al plasma di ossigeno per rimuovere eventuali contaminanti organici dal pulitore di plasma (vedere Tabella dei materiali).
      1. Per prima cosa accendi il detersiva al plasma e mettici dentro i substrati.
      2. Quindi accendere la pompa del vuoto per aspirare il pulitore. Inserire l'ossigeno in esso.
      3. Infine impostare 4 minuti per la pulizia. Dopo di che, conservare i substrati puliti per la preparazione sequenziale della pellicola PHEMA.
      4. Quindi preparare le pellicole PHEMA sul CaF2 prismi da uno spin-coater (vedi Tabella dei materiali). Regolare gli spessori della pellicola in base alla concentrazione della soluzione e alla velocità di rotazione.
        1. Immobilizzare il prisma CaF2 sul disco da suzione di spin-coater.
        2. Eliminare una goccia della soluzione PHEMA preparata prima sui substrati puliti a 1.500 giri/mm per 1 min (spessore della pellicola 2 wt% per 100 nm e 4 wt% per 200 nm).
      5. Anneal tutte le pellicole PHEMA preparate in un forno a vuoto a 80 gradi durante la notte.
  2. Preparazione della fibroina di seta (SF)
    NOTA: È stato adottato il protocollo suggerito da Kaplan et al.35.
    1. Mettere 7,5 g di bozzoli di seta di B. mori nel carbonato di sodio bollente (Na2CO3, 0,02 M) soluzione aqueous (3 L) per 30 m. Rimuovere il fibroso SF in un contenitore pulito.
    2. Lavare la SF fibrosa ottenuta con acqua deionizzata per tre volte sotto agitazione al fine di rimuovere le molecole di sericina e lasciare solo le molecole SF nel campione fibroso.
    3. Asciugare il campione fibroso di SF in un forno sottovuoto a 60 gradi centigradi durante la notte.
    4. Successivamente, sciogliere il campione fibroso degummed SF in un bromo di litio (LiBr, 9,3 M) soluzione aquesa (1 g di SF è stato risolto in 4 mL di soluzione LiBr.) e incubarlo a 60 gradi centigradi per 2 h sotto mescolando.
    5. Diallyze la soluzione SF contro l'acqua deionizzata (3.500 sacchetti di dialisi Da) per 3 giorni per rimuovere il disciolto LiBr. Cambiare nuova acqua deionizzata tre volte al giorno. Infine, conservare la soluzione SF elaborata a 4 gradi centigradi per i successivi esperimenti SFG.
  3. Preparazione di oligonucleotide duplex a catena corta
    1. Ordina il campione di oligonucleotide a filamento singolo con il suo glicole a 3'fine modificato da colesterolo-trietilene (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') da una società commerciale (vedi Tabella dei materiali) e da quella complementare. Per ogni singolo filamento, sciogliere 10 nmol della polvere campione in acqua ultrapura da 0,5 ml. Quindi mescolare insieme per formare la soluzione oligonucleotide duplex (10 nmol/mL).
    2. Mescolare 2 mg di 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) e 2 mg di DPPC detererated (d-DPPC) e scioglierli in 1 mL di cloroformio per preparare la soluzione lipidica.
    3. Preparazione del mostrato DPPC e d-DPPC da parte di un trogolo Langmuir-Blodgett (LB)
      1. Fissare il prisma CaF2 ad angolo retto a un supporto campione fatto in casa con una faccia di prisma perpendicolarmente immersa nell'ambiente acquoso della depressione LB.
      2. Successivamente, iniettare la soluzione di lipidi mista preparata prima sulla superficie dell'acqua fino a quando la pressione superficiale ha raggiunto un certo valore al di sotto di 34 mN-m.
      3. Dopo che la pressione superficiale si sta spegnendo, usate due barriere di Teflon per comprimere il monostrato lipidico con un rapporto di 5 mm/min fino a raggiungere una pressione superficiale di 34 mn.m.
      4. Sollevare il prisma con un monostrato lipidico fuori dall'acqua ad una velocità di 1 mm / min verticalmente.
    4. Preparazione dell'altro strato di lipidi
      1. Per facilitare l'assemblaggio dell'oligonucleotide duplex e delle molecole lipidiche attraverso l'interazione idrofobica (colesterolo e una catena alchile lipidica), mescolare la soluzione oligonucleotide duplex con la soluzione lipidica in un rapporto molare di 1:100 (olinucleotide a lipidi).
      2. Iniettare la soluzione oligonucleotide mista lipidica e duplex sulla superficie dell'acqua in un contenitore di Teflon fatto in casa fino a raggiungere una pressione superficiale di 34 mN-m 1.
    5. Infine, mettere il mostrato lipidico nella parte inferiore del prisma a contatto con il monotema lipidico con oligonucleotidi duplex inseriti sulla superficie dell'acqua per formare il campione finale per la misurazione SFG.
  4. Equazione di Lorentz
    1. Utilizzare l'equazione Lorentz per adattarsi agli spettri SFG per estrarre le informazioni vibrazionali per una specifica modalità vibrazionale.
      Equation 26(25)
      dove Equation 27 rappresenta l'intensità della modalità Equation 28 qth vibrazionale, Equation 29 rappresenta la frequenza di risonanza, Equation 30 indica la metà della larghezza a metà massima (HWHM) e rappresenta la frequenza di scansione del fascio IR incidente.

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Representative Results

Nella parte del coefficiente Fresnel della Sezione Protocollo, abbiamo dimostrato che, teoricamente, è possibile rilevare selettivamente una sola interfaccia alla volta. Qui, sperimentalmente, abbiamo confermato che questa metodologia è fondamentalmente corretta, come illustrato nella Figura 5 e Figura 6.

Figura 5 Mostra la struttura PHEMA interfacciale sepolta dopo l'intrusione dell'acqua con una pellicola idrogel PHEMA da 150 nm e Figura 6 mostra la struttura superficiale in acqua con una pellicola idrogel PHEMA da 430 nm. I pannelli A e B corrispondono rispettivamente alle gamme CH e CO per entrambe le cifre. All'interfaccia sepolta, tutti i picchi vibrazionali osservati sono nitidi e chiari. La ragione è che il substrato CaF2 è liscio e non può essere penetrato dalle molecole PHEMA, portando ad un'interfaccia netta CaF2/ PHEMA. Tuttavia, in superficie, poiché le molecole d'acqua possono interagire con PHEMA e diffondersi nella massa, l'interfaccia PHEMA/acqua non sarebbe così affilata come quella sepolta. Pertanto, vengono osservati profili spettrali diversi per queste due interfacce.

Figure 1
Figura 1 . Presentazione schematica del processo SFG (pannello sinistro) con il diagramma di transizione energetica (pannello destro). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Il sistema SFG in laboratorio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Schematico mostra il percorso di propagazione della luce in prisma per l'esperimento SFG. I numeri 0, 1, 2 e 3 rappresentano rispettivamente l'aria, il prisma, il PHEMA e il medio inferiore (il mezzo inferiore può essere aria, solido o liquido). Riprodotto da Li, X.; Li, B.; X.; Li, C.; Guo, n.; D.; Lu, X. Macromolecole 2016, 49, 3116-3125 (rif 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Questa cifra è stata modificata a partire da [9]. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Calcolati i coefficienti di Fresnel in funzione dello spessore della pellicola per la geometria del prisma in acqua per le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp. I pannelli da A1 a C1 corrispondono alla gamma CH e i pannelli da A2 a C2 corrispondono alla gamma CO. Riprodotto da Li, X.; Li, B.; X.; Li, C.; Guo, n.; D.; Lu, X. Macromolecole 2016, 49, 3116-3125 (rif 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Questa cifra è stata modificata a partire da [9].

Figure 5
Figura 5 . ssp e ppp specper dell'interfaccia CaF2/ PHEMA dopo l'esposizione all'acqua. A: Gamma CH e OH; B: gamma CO. Le curve nere sono i risultati montati utilizzando l'equazione di Lorentz. Gli spettri sono stati sfalsati per chiarezza. Riprodotto da Li, X.; Li, B.; X.; Li, C.; Guo, n.; D.; Lu, X. Macromolecole 2016, 49, 3116-3125 (rif 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Questa cifra è stata modificata a partire da [9].

Figure 6
Figura 6 . ssp e ppp spettri della superficie PHEMA su cafe2 prisma. A: Gamma CH e OH; B: gamma CO. Il campione è stato messo a contatto con l'acqua. Le curve nere sono i risultati montati utilizzando l'equazione di Lorentz. Gli spettri sono stati sfalsati per chiarezza. Riprodotto da Li, X.; Li, B.; X.; Li, C.; Guo, n.; D.; Lu, X. Macromolecole 2016, 49, 3116-3125 (rif 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Questa cifra è stata modificata a partire da [9].

Figure 7
Figura 7 . Spettri SFG normalizzati (psp) negli intervalli amide I (Pannello A) e N-H (Pannello B) per l'interfaccia della soluzione PS/SF (90 mg/mL) prima e dopo l'aggiunta di metanolo. I punti sono dati sperimentali e le linee solide sono le curve aderenti. Gli spettri sono stati sfalsati per chiarezza. Riprodotto da Li, X.; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453-9459 (ref 16). Copyright 2018 American Chemical Society. Questa cifra è stata modificata a partire da [16].

Figure 8
Figura 8 . Spettri SFG normalizzati (psp) negli intervalli amide I (Pannello A) e N-H (Pannello B) per l'interfaccia della soluzione PS/SF (1 mg/mL) prima e dopo l'aggiunta del metanolo. I punti sono dati sperimentali e le linee continue sono le curve adattate (blu). Gli spettri sono stati sfalsati per chiarezza. Riprodotto da Li, X.; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453-9459 (ref 16). Copyright 2018 American Chemical Society. Questa cifra è stata modificata a partire da [16].

Figure 9
Figura 9 . Achiral (ssp, A) e chirale (ssp, B) spettrali SFG per il bistrato lipidico con ancoraggio di oligonucleotidi duplex a contatto con le soluzioni Ca2 o con concentrazioni diverse (da 0,6 mM a 6 mM). I punti dati sono stati approssimativamente adattati utilizzando l'equazione di Lorentz. È stato presentato il cambiamento dell'area integrata per i segnali vibrazionali dell'acqua in funzione della concentrazione di Ca 2o(ssp, C; spp, D). Tutti gli spettri sono stati normalizzati e compensati per chiarezza. Riprodotto da Li, X.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 14774-14779 (ref 21). Copyright 2018 American Chemical Society. Questa cifra è stata modificata a partire da [21].

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Discussion

Per studiare le informazioni strutturali a livello molecolare, SFG ha i suoi vantaggi intrinseci (ad esempio, sensibilità monostrato o sub-monostrato e selettività interfacciale), che possono essere applicati per studiare varie interfacce, come il solido/solido, solido/ interfacce liquide, solide/gas, liquide/gas, liquide/liquide. Anche se la manutenzione dell'apparecchiatura e l'allineamento ottico richiedono ancora molto tempo, il payoff è significativo in quanto è possibile ottenere le informazioni dettagliate a livello molecolare sulle superfici e sulle interfacce.

Sondaggio Poly(2-hydroxyethyl methacritlate) Superficie e sepolto interfaccia in soluzione: Come abbiamo dimostrato sopra, i coefficienti del campo di luce possono essere regolati. Possiamo confermarlo sperimentalmente. Nell'interfaccia sepolta con il substrato, poiché la superficie del substrato CaF2 è liscia e non può essere penetrata dalle molecole PHEMA, questa interfaccia è nitida. Tuttavia, in superficie con acqua, le molecole d'acqua possono interagire con le molecole PHEMA e diffondersi alla massa. Quindi questa interfaccia è sfocata, e non così affilata come quella sepolta. Pertanto, diversi profili spettrali SFG verrebbero osservati per queste due interfacce. I nostri dati sperimentali SFG hanno dimostrato questo, indicando la capacità di sondare selettivamente l'interfaccia sepolta con il substrato o la superficie in soluzione.

L'interazione tra catene o l'effetto Confinement sulla formazione delle strutture secondarie della fibrosidi seta : Un fattore chiave è la concentrazione di sovrapposizione critica (C. Per SF, il linguaggio Cè è di 1,8 mg/mL. Dal momento sperimentale, per la soluzione SF di 90 mg/mL (sopra c'è), non sono stati rilevati segnali vibrazionali SFG chirali (psp) nell'interfaccia soluzione/PS SF, a meno che non sia stato aggiunto un agente-metanolo che induce, come illustrato nella Figura 7. Ma, per la soluzione SF di 1 mg/mL (sotto C, chirale (psp) i segnali vibrazionali SFG possono essere rilevati direttamente senza aggiungere metanolo, come mostrato nella Figura 8, che indica che le strutture secondarie ordinate sono già state formate presso la SF l'interfaccia soluzione/PS. Dal momento che il C' è una concentrazione soglia per la sovrapposizione catena-catena, l'interazione catena-catena o il confinamento spaziale deve essere preso come un fattore di regolazione qui per la formazione di strutture secondarie SF all'interfaccia.

Strutture molecolari dell'acqua che circondano la catena corta Oligonucleotide Duplex: Per un duplex oligonucleotide a catena corta nella soluzione dell'acqua, i segnali vibrazionali SFG dell'acqua chirale corrispondono allo strato di idratazione della colonna vertebrale chirale nella scanalatura minore . I segnali vibrazionali SFG dell'acqua achirale corrispondono per lo più allo strato d'acqua che circonda la catena oligonucleotide duplex e al biostrato (la colonna vertebrale chirale dello strato d'acqua contribuisce)33. In una concentrazione di Ca2 o più da 0,6 a 6 mM, come mostrato nella Figura 9, abbiamo scoperto, non c'è stato alcun cambiamento evidente per i segnali vibrazionali dell'acqua chirale in termini di concentrazione di Ca2. Tuttavia, i segnali vibrazionali dell'acqua achirale sono stati fortemente colpiti quando è stata modificata la concentrazione di Ca2. Ciò indica che la colonna vertebrale chirale dello strato d'acqua strettamente legandosi all'oligonucleotide duplex può proteggere l'oligonucleotide dagli ioni di Ca2o, nella normale condizione biologica.

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Disclosures

Non abbiamo niente da rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dal Programma di sviluppo chiave dello Stato per la ricerca di base della Cina (2017YFA0700500) e dalla National Natural Science Foundation of China (21574020). I Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali, un progetto finanziato dal Programma Accademico Prioritario Sviluppo degli Istituti di Istruzione Superiore jiangsu (PAPD) e dal Centro di Dimostrazione Nazionale per l'Ingegneria Biomedica Sperimentale Anche l'istruzione (Southeast University) è stata molto apprezzata.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

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References

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Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial… More

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

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