Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Grenseflate molekylær-nivå strukturer av polymerer og Biomacromolecules avdekket via sum frekvens generasjon vibrasjonen spektroskopi

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59380
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

Summary

Å være omfattende utnyttet, sum frekvens generering (SFG) vibrasjonsmedisin spektroskopi kan bidra til å avdekke kjeden conformational orden og sekundære strukturelle endringer skjer på polymer og biomacromolecule grensesnitt.

Abstract

Som en andre-ordre ikke-lineær optisk spektroskopi, sum hyppigheten generasjon (SFG) vibrasjonen spektroskopi har vidt blitt anvendt inne etterforske forskjellige overflater og grenseflate. Denne ikke-invasiv optisk teknikk kan gi lokal molekylær-nivå informasjon med monolag eller submonolayer følsomhet. Vi her er å tilby eksperimentell metodikk på hvordan du selektivt oppdage begravet grensesnitt for både makromolekyler og biomacromolecules. Med dette i bakhodet, grenseflate sekundære strukturer av silke fibroin og vann strukturer rundt modellen kort-kjeden oligonukleotid tosidig er diskutert. Den førstnevnte viser en kjede-kjeden overlapping eller romlig fødsel effekt og sistnevnte viser en beskyttelse funksjon mot ca2 + ioner som følge av chiral ryggraden over bygningen av vann.

Introduction

Utvikling av sum frekvens generering (SFG) vibrasjonsmedisin spektroskopi kan dateres tilbake til arbeidet gjort av Shen et al. tretti år siden1,2. Det unike med grenseflate selektivitet og sub-monolag følsomhet gjør SFG vibrasjonen spektroskopi verdsatt av et stort antall forskere innen fysikk, kjemi, biologi og materialer vitenskap, etc3,4 ,5. For tiden er et bredt spekter av vitenskapelige spørsmål knyttet til overflater og grensesnitt blir undersøkt ved hjelp SFG, spesielt for komplekse grensesnitt med hensyn til polymerer og biomacromolecules, slik som kjeden strukturer og strukturelle avslapping på begravet polymer grensesnitt, proteinet sekundære strukturer, og grenseflate vann strukturer9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

For polymer overflater og grensesnitt, er tynn-film prøver generelt utarbeidet av Spin-belegg for å oppnå de ønskede overflater eller grensesnitt. Problemet oppstår på grunn av signalforstyrrelser fra de to grensesnittene i som-forberedt filmer, noe som fører til ulempe for å analysere de innsamlede SFG Spectra27,28,29. I de fleste tilfeller, vibrasjonsmedisin signalet bare fra ett enkelt grensesnitt, enten film/substrat eller film/det andre mediet, er ønskelig. Egentlig er løsningen på dette problemet ganske enkelt, nemlig å eksperimentelt maksimere lys feltene på ønskelig grensesnitt og minimere lys feltene på det andre grensesnittet. Derfor må Fresnel koeffisienter eller lokale felt koeffisienter beregnes via den tynne film modellen og bli validert med hensyn til de eksperimentelle resultatene3,9,10,11, 12,13,14,15,30.

Med ovennevnte bakgrunn i tankene, kan noen polymer og biologiske grensesnitt bli undersøkt for å forstå grunnleggende vitenskap fra molekylær nivå. I det følgende, tar tre grenseflate problemer som eksempler: undersøkelser Poly (2-hydroxyethyl akrylat) (PHEMA) overflate og begravet grensesnitt med substrat9, dannelse av silke FIBROIN (SF) sekundære strukturer på POLYSTYREN (PS) overflate og vann konstruksjoner rundt modellen kort-kjeden oligonukleotid duplex16,21, vil vi vise hvordan SFG vibrasjonen spektroskopi bidrar til å avdekke grenseflate molekylær-nivå strukturer i forbindelse med den underliggende vitenskapen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SFG eksperimentell

  1. Bruk en kommersiell picosecond SFG system (tabell av materialer), som gir en fundamental 1064 NM stråle med en pulsbredde på ~ 20 PS og en frekvens på 50 Hz, basert på en nd: YAG laser.
  2. Konverter den fundamentale 1064 NM strålen til en 532 nm stråle og en 355 NM stråle ved hjelp av andre og tredje harmoniske moduler. Direkte guide 532 nm strålen som en input lysstråle og generere andre innspill mid-infrarød (IR) strålen dekker frekvensområdet fra 1000 til 4000 cm-1 gjennom optiske parametrisk generasjon (OPG)/Optical parametrisk forsterkning (Opa)/ forskjellen frekvens generasjon (DFG) prosess.
  3. Angi hendelses vinklene for to inngangs bjelker som skal være 53 ° (IR) og 64 ° (synlige), henholdsvis i forhold til overflate normal.
  4. Å oppdage polymer grenseflate strukturer (enten film/substrat grensesnitt eller film/den andre medium grensesnitt), bruke SSP (s-polarisert sum-frekvens stråle, s-polarisert synlig stråle og p-polarisert infrarød stråle) og PPP polarisering kombinasjoner.
  5. Å oppdage grenseflate protein sekundære strukturer og vann strukturer rundt DNA, foruten SSP og PPP, bruk chiral spp og PSP polarisering kombinasjoner ble brukt.
  6. For å sikre at prøvene ikke ble skadet, kontrollere infrarød og synlig puls energier til å være ~ 70 og ~ 30 mJ, henholdsvis. En skjematisk fremstilling av SFG prosessen med det energi nivå diagrammet ble vist i figur 1. Figur 2 viser SFG-systemet i vårt rene rom.

2. Fresnel koeffisienter

  1. Bruk rett vinkel prismer som underlag for alle eksperimentene som diskuteres her. Det finnes to grensesnitt for en polymer film på den solide underlaget, dvs., polymer overflate i luft og polymer/substrat grensesnitt. Begge kan generere SFG signaler siden inversjon symmetri er brutt på begge grensesnittene. Derfor er en samlet SFG spektrum en forstyrret en. Imidlertid kan det lokale feltet koeffisienter eller Fresnel koeffisienter ved de to grensesnittene justeres ved å variere enten hendelsen vinkler eller filmtykkelse en om gangen eller samtidig31,32. Dette gir mulighet for oss å granske SFG vibrasjonsmedisin signalet fra bare ett grensesnitt. Her ble PHEMA film på CaF2 prisme tatt som et eksempel9.
  2. Som vist i Figur 3, ansette rett vinkel prisme geometri å oppdage SFG signalene generert fra bunnen PHEMA film. SFG utgangs intensitet i reflektert modus uttrykkes som
    Equation 11
    der Equation 2 betegner den effektive andre-Order ikke-lineær mottakelighet tensor.
    Equation 2består av tre deler, nemlig prisme/polymer-grensesnittet, polymer/bunn medium grensesnitt (bunn medium inkluderer gass, væske eller solid.) og nonresonant bakgrunn, som vist i følgende ligning.
    Equation 32
    Her bunnen medium kan være luft, vann eller noe annet. F representerer den tilsvarende Fresnel-koeffisienten som er ansvarlig for den lokale felt korrigeringen.
  3. Bruk en tynn film modell for å beregne Fresnel koeffisienter i dette tilfellet. Her presenteres bare korte beregnings prosedyrer.
    1. For prisme/polymer-grensesnittet, bruk
      Equation 43
      Equation 54
      Equation 65
      Betydningen av hver parameter som vises, vises nedenfor.
      1. ωjeg betegner stråle frekvensen.
      2. tp og ts betegner den samlede overførings koeffisienter og kan uttrykkes som
        Equation 76
        Equation 87
      3. tP12 og tS12 betegne den lineære overførings koeffisienter fra lysstrålen ved prisme/polymer-grensesnittet.
      4. rp23 og rS23 betegne den lineære refleksjon koeffisienter av lysstrålen på polymer/medium grensesnitt.
      5. α representerer fase forskjellen mellom en refleks stråle og den sekundære reflekterende strålen etter at den sprer seg over polymer tynne filmen og reflekterer tilbake, noe som kan uttrykkes som
        Equation 98
      6. λ representerer bølgelengden til lysstrålen og d er polymer filmtykkelse.
      7. Φ1 og Φ2 representerer hendelsen vinkler på prisme/polymer-grensesnitt og polymer/medium grensesnitt hhv.
      8. n1 og n2 representerer brytnings indeksene i henholdsvis prisme-og polymer filmen.
      9. n12 representerer brytnings indeksene av polymer grenseflate lag for prisme/polymer.
    2. For polymer/medium-grensesnitt, bruk
      Equation 109
      Equation 1110
      Equation 1211
      1. Δ representerer fase forskjellen i lys elektriske felt ved to grensesnitt.
      2. Fordi pulsen bredde for våre innspill bjelker er ~ 20 PS, feilen fra tidsforsinkelsen forbundet med dispersjon effekten kan bli neglisjert.
      3. Uttrykket av en slik fase forskjell for utgang SFG, input synlig og input infrarøde bjelker kan være separat skrevet som
        Equation 1312
        Equation 1413
        Equation 1514
         
  4. Fra ovenstående diskusjon, for prisme-polymer film-medium (1-2-3) system, uttrykker den totale Fresnel koeffisienter for prisme/polymer og polymer/medium grensesnitt som følgende ligninger, for SSP og PPP polarisering kombinasjoner . Selvfølgelig er begge grensesnittene anses azimuthally isotropic.
    1. For prisme/polymer-grensesnitt, uttrykk for den totale Fresnel koeffisienter for både SSP og PPP polarisering kombinasjoner presenteres som følger.
      1. For SSPer ligningen
        Equation 1615
      2. Og for PPP, ligningen er
        Equation 516
        Equation 517
        Equation 518
        Equation 519
         
      3. t10 og t01 betegne den lineære transmisjon koeffisienter på henholdsvis luft/prisme og prisme/luft grensesnitt.
    2. For polymer/medium-grensesnittet beskrives uttrykkene for de totale Fresnel koeffisienter for både SSP -og PPP -kombinasjoner som følger.
      1. For SSPer ligningen
        Equation 2120
      2. For PPPer formlene
        Equation 521
        Equation 522
        Equation 523
        Equation 524
           
         
  5. Etter beregning av Fresnel koeffisienter ved hjelp av den klemt modellen, plotte dem som en funksjon av filmtykkelse, som vist i Figur 4.
    Merk: i dette tilfellet finnes det en tykkelse område for innsamling av SFG signalet fra CaF2 PRISME/PHEMA grensesnitt med forsømmelig bidrag fra det andre grensesnittet, som er rundt 150 NM. Tilsvarende kan en passende tykkelse velges for påvisning av PHEMA/Bottom medium grensesnitt med forsømmelig bidrag fra CaF2 Prism/PHEMA grensesnitt.

3. Chiral SFG polarisering kombinasjon

  1. For normal achiral grensesnitt, vanligvis, bruk C∞ v symmetri i form av Ensemble gjennomsnitt33,34. Med drift av inversjon symmetri, den ikke-null andre-Order ikke-lineær mottakelighet tensor komponenter kan utledes, som er cxxz, cxzx, cZxx, cYYZ, cyzy, czyy og cZZZ (den eksisterende termer kan reduseres ytterligere hvis et isotropic grensesnitt antas, noe som betyr at x og y er de samme). Men for chiral grensesnittet, vil situasjonen være annerledes. Den chiral grensesnittet besitter C ∞ symmetri, bare rotasjon symmetri operasjonen er tillatt. I dette tilfellet, i tillegg til normal achiral vilkår, mer andre-ordre ikke-lineær mottakelighet vil være null, som kan betegnes som chiral termer, nemlig czyx, czxy og cyzx under vurdering av ikke-elektroniske Resonans. Derfor, ved hjelp av PSP, PPS og spp polarisering kombinasjoner, chiral SFG Spectra kan samles33,34.

4. prøveforberedelse

  1. Utarbeidelse av PHEMA film
    1. Løs opp PHEMA-pulver (se tabell over materialer) i vannfri etanol for å klargjøre løsningen med henholdsvis 2 vekt% og 4 vekt%.
    2. Før deponering av PHEMA filmer, suge CaF2 høyre vinkel prismer i toluen løsemiddel først og deretter vaske dem med etanol og ultrarent vann (18,2 MΩ · cm).
    3. Etterpå utsettes underlag (CaF2 høyre vinkel prismer) til oksygen plasma for å fjerne mulige organiske forurensninger av plasma renere (se tabell over materialer).
      1. Først slå på plasma renere og sette underlag i den.
      2. Slå deretter på vakuumpumpen for å vacuumize rengjøringsmiddelet. Input oksygenet i den.
      3. Endelig satt 4 minutter for rengjøring. Etter det, bevare den rene underlag for sekvensiell PHEMA film forberedelse.
      4. Deretter forberede PHEMA filmer på CaF2 prismer av en spin-elektrostatisk (se tabell over materialer). Juster filmtykkelsen etter løsnings konsentrasjonen og sentrifugehastigheten.
        1. Nakkens CaF2 prisme på sugende plate av Spin-elektrostatisk.
        2. Drop en dråpe av PHEMA løsningen forberedt før på ren underlag ved 1 500 RPM i 1 min (filmtykkelse 2 WT% for 100 NM og 4 WT% for 200 NM).
      5. Anneal alle de forberedte PHEMA-filmene i en vakuum ovn ved 80 ° c over natten.
  2. Utarbeidelse av silke fibroin (SF)
    Merk: protokollen som ble foreslått av Kaplan et al.35 ble vedtatt.
    1. Plasser 7,5 g silke kokonger B. Mori i det kokende natrium stedet (na2co3, 0,02 M) vandig oppløsning (3 L) i 30 min. Fjern fiber SF til en ren container.
    2. Vask den oppnådde fiber SF med deionisert vann for tre ganger under omrøring for å fjerne sericin molekyler og la bare SF molekyler i fiber prøven.
    3. Tørk fiber SF prøven i en vakuum ovn ved 60 ° c over natten.
    4. Etterpå oppløse den degummed fiber SF prøven i et litium-bromide (LiBr, 9,3 M) vandig løsning (1 g SF ble løst i ~ 4 mL av LiBr løsning.) og ruge det ved 60 ° c for 2 h under omrøring.
    5. Dialyze SF løsning mot deionisert vann (3 500 da dialyse poser) i 3 dager for å fjerne oppløst LiBr. Endre nye deionisert vann tre ganger hver dag. Til slutt lagrer du den behandlede SF-løsningen ved 4 ° c for senere SFG-eksperimenter.
  3. Utarbeidelse av Short-Chain oligonukleotid duplex
    1. Bestill single-strandet oligonukleotid prøve med sin 3 '-end modifisert av kolesterol-trietylenglykol glykol (Chol-TEG) (5 '-GCTTCCGAAGGTCGA-3 ') fra et kommersielt selskap (se tabell over materialer) samt komplementære ett. For hver enkelt tråd, oppløses 10 nmol i prøve pulveret i 0,5 ml ultrarent vann. Bland dem deretter sammen for å danne dupleks oligonukleotid løsningen (10 nmol/mL).
    2. Bland 2 mg 1, 2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) og 2 mg deuterert DPPC (d-DPPC) og oppløse dem i 1 mL kloroform for å forberede lipid-oppløsningen.
    3. Fremstilling av DPPC & d-DPPC monolag av en Langmuir − Blodgett (LB) trau
      1. Fest den høyre vinkel CaF2 prisme til en hjemmelaget prøve holderen med ett prisme ansikt vinkelrett dyppet i den vandige miljøet i lb trau.
      2. Etterpå injiserer blandet lipid løsning forberedt før på vannflaten til overflaten trykket nådde en viss verdi under 34 mN · m− 1.
      3. Etter overflaten trykket nivåer av, bruke to Teflon barrierer for å komprimere lipid monolag i forholdet 5 mm/min til et overflate Trykk på 34 mN · m− 1 ble nådd.
      4. Løft prisme med en lipid monolag ut av vannet med en hastighet på 1 mm/min vertikalt.
    4. Utarbeidelse av de andre lipid monolag
      1. For å lette monteringen av dupleks oligonukleotid og lipid molekyler via hydrofobe interaksjon (kolesterol og en lipid alkyl kjede), bland dupleks oligonukleotid løsning med lipid løsning i en molar ratio på 1:100 (oligonukleotid til lipid).
      2. Injiser den blandede lipid-og dupleks oligonukleotid løsningen på vannflaten i en hjemmelaget Teflon-beholder til et overflate Trykk på 34 mN · m− 1 ble nådd.
    5. Til slutt, sette lipid monolag på bunnen av prisme i kontakt med lipid monolag med innsatte duplex oligonukleotider på vannflaten for å danne den endelige prøven for SFG måling.
  4. Lorentz ligning
    1. Bruk Lorentz ligningen til å passe SFG Spectra å trekke vibrasjonen informasjon for en bestemt vibrasjonen modus.
      Equation 2625
      der Equation 27 representerer intensiteten av QTH Equation 28 vibrasjonen modus, representerer resonans frekvens, Equation 29 betegner halv bredde ved halv høyeste (HWHM) og Equation 30 representerer skanning frekvensen av hendelsen IR strålen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I Fresnel koeffisient del av protokoll seksjon, har vi vist at teoretisk sett er det mulig å selektivt oppdage bare ett enkelt grensesnitt på en gang. Her, eksperimentelt, bekreftet vi at denne metodikken er i utgangspunktet riktig, som vist i figur 5 og figur 6.

Figur 5 viser BEGRAVET grenseflate PHEMA struktur etter vann inntrenging med en ~ 150 NM PHEMA hydrogel film og figur 6 viser overflaten struktur i vann med en ~ 430 NM PHEMA hydrogel film. Panel A og B tilsvarer henholdsvis CH-og CO-områdene for begge tallene. Ved begravet grensesnittet, alle de observerte vibrasjonen toppene er skarpe og klare. Årsaken er at CaF2 underlaget er glatt og kan ikke GJENNOMSYRET av PHEMA molekyler, som fører til en skarp CaF2/PHEMA grensesnitt. Men på overflaten, fordi vannmolekyler kan samhandle med PHEMA og diffus i bulk, det PHEMA/Water grensesnittet ville være ikke så skarp som begravet en. Derfor er forskjellige Spectral profiler observert for disse to grensesnittene.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk visning av SFG prosessen (venstre panel) med energi overgangen diagram (høyre panel). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . SFG-systemet i laboratoriet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Skjematisk viser lyset forplantning banen i prisme for SFG eksperiment. Tallene 0, 1, 2 og 3 representerer luft, prisme, PHEMA og bunn medium (det nederste mediet kan luft, fast eller flytende.), henholdsvis. Gjengitt fra Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. makromolekyler 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref. 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Dette tallet er endret fra [9]. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Beregnet Fresnel koeffisienter som en funksjon av filmtykkelse for prisme geometri i vann for SSP og PPP polarisering kombinasjoner. Panelene a1 til C1 tilsvarer lm-området og panelene a2 til C2 tilsvarer co-serien. Gjengitt fra Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. makromolekyler 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref. 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Dette tallet er endret fra [9].

Figure 5
Figur 5 . SSP og PPP Spectra av CaF2/PHEMA Interface etter vanneksponering. A: CH og OH rekkevidde; B: CO rekkevidde. De sorte kurvene er de monterte resultatene ved hjelp av Lorentz ligning. The Spectra har blitt forskjøvet for klarhet. Gjengitt fra Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. makromolekyler 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref. 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Dette tallet er endret fra [9].

Figure 6
Figur 6 . SSP og PPP Spectra av PHEMA overflaten på CaF2 Prism. A: CH og OH rekkevidde; B: CO rekkevidde. Prøven ble satt i kontakt med vann. De sorte kurvene er de monterte resultatene ved hjelp av Lorentz ligning. The Spectra har blitt forskjøvet for klarhet. Gjengitt fra Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. makromolekyler 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref. 9). Copyright 2016 American Chemical Society. Dette tallet er endret fra [9].

Figure 7
Figur 7 . Normalisert chiral (PSP) SFG Spectra i amid i (panel A) og N-H (panel B) områder for PS/SF-løsning (90 mg/ml) grensesnitt før og etter tilsetning av metanol. Prikkene er eksperimentelle data, og de solide linjene er de monterte kurvene. Spectra har blitt forskjøvet for klarhet. Gjengitt fra Li, X.; Deng, G.; Jeg er en av dem. Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453 − 9459 (Ref. 16). Copyright 2018 American Chemical Society. Dette tallet er endret fra [16].

Figure 8
Figur 8 . Normalisert chiral (PSP) SFG Spectra i amid i (panel A) og N-H (panel B) områder for PS/SF løsning (1 mg/ml) grensesnitt før og etter tilsetning av metanol. Prikkene er eksperimentelle data, og de solide linjene er de monterte kurvene (blå). Spectra har blitt forskjøvet for klarhet. Gjengitt fra Li, X.; Deng, G.; Jeg er en av dem. Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453 − 9459 (Ref. 16). Copyright 2018 American Chemical Society. Dette tallet er endret fra [16].

Figure 9
Figur 9 . Achiral (SSP, A) og chiral (spp, B) SFG Spectra for dupleks oligonukleotid-forankret lipid Bilayer i kontakt med ca2 + solutions med ulike konsentrasjoner (fra 0,6 mm til 6 mm). Datapunktene var omtrent montert ved hjelp av Lorentz ligningen. Endringen av det integrerte området for vann vibrasjonen signaler som en funksjon av ca2 + konsentrasjon ble presentert (SSP, C; spp, D). Alle Spectra har blitt normalisert og offset for klarhet. Gjengitt fra Li, X.; Jeg er en av dem. Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 14774 − 14779 (Ref. 21). Copyright 2018 American Chemical Society. Dette tallet er endret fra [21].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å undersøke den strukturelle informasjon fra et molekylnivå, har SFG sine iboende fordeler (dvs. monolag eller sub-monolag følsomhet og grenseflate selektivitet), som kan brukes til å studere ulike grensesnitt, for eksempel fast/fast, solid/ væske, fast/gass, væske/gass, væske/væske-grensesnitt. Selv om utstyret vedlikehold og den optiske justeringen er fortsatt tidkrevende, er utbetalingen betydelig i at detaljert molekylær-nivå informasjon på overflater og grensesnitt kan fås.

Verifiserer Poly (2-hydroxyethyl akrylat) overflate og begravet grensesnitt i Solution: som vi viste ovenfor, lysfeltet koeffisienter kan justeres. Vi kan bekrefte dette eksperimentelt. Ved begravet grensesnitt med underlaget, fordi CaF2 substrat overflaten er glatt og kan ikke bli GJENNOMSYRET av PHEMA molekyler, er dette grensesnittet en skarp en. Men på overflaten med vann, kan vannmolekyler samhandle med PHEMA molekyler og diffus i bulk. Derfor er dette grensesnittet er uklart, og ikke så skarp som begravet en. Derfor vil forskjellige SFG Spectral profiler bli observert for disse to grensesnittene. Våre eksperimentelle SFG data gjorde bevise dette, noe som indikerer evnen til å selektivt undersøke begravet grensesnitt med underlaget eller overflaten i løsningen.

Interchain interaksjon eller fødsel effekt på dannelse av Silk Fibroin sekundær strukturer: en viktig faktor er den kritiske overlappende konsentrasjon (C *). For SF, C * er ~ 1,8 mg/mL. Eksperimentelt, for SF løsning av ~ 90 mg/mL (over C *), ingen chiral (PSP) SFG vibrasjonen signaler ble oppdaget ved SF Solution/PS-grensesnittet med mindre en inducing agent-metanol ble lagt til, som vist i figur 7. Men, for SF løsning av ~ 1 mg/mL (under C *), chiral (PSP) SFG vibrasjonen signaler kan bli direkte oppdaget uten å legge metanol, som vist i Figur 8, som indikerer at de bestilte sekundære strukturer har allerede blitt dannet ved SF grensesnitt for løsning/PS. Siden C * er en terskel konsentrasjon for kjeden kjeden overlapping, kjede-kjeden interaksjon eller romlig fødsel må tas som en regulerende faktor her for dannelsen av SF sekundære strukturer i grensesnittet.

Vann molekylære strukturer rundt Short-Chain Oligonukleotid duplex: for en kort-kjeden oligonukleotid duplex i vannet løsningen, CHIRAL vann SFG vibrasjonsmedisin signaler tilsvarer hydration laget av chiral ryggraden i mindre Groove . Achiral vann SFG vibrasjonsmedisin signaler meste tilsvarer vann laget rundt oligonukleotid duplex kjeden og bilayer (den chiral ryggraden i vann laget også bidrar)33. I en ca2 + konsentrasjon spenner fra 0,6 til 6 mm, som vist i figur 9, fant vi, var det ingen åpenbar endring for chiral vann vibrasjonsmedisin signaler i form av ca2 + konsentrasjon. Imidlertid ble achiral vann vibrasjonen signalene sterkt påvirket når ca2 + konsentrasjon ble endret. Dette indikerer at chiral ryggraden i vann laget tett binding til oligonukleotid dupleks kan beskytte oligonukleotid fra ca2 + ioner, i normal biologisk tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av statens nøkkel utviklings program for grunnleggende forskning i Kina (2017YFA0700500) og National Natural Science Foundation i Kina (21574020). Den grunnleggende Research Funds for Central universiteter, et prosjekt finansiert av priority Academic program utvikling av Jiangsu Higher Education institusjoner (PAPD) og National demonstrasjon Center for Experimental Biomedical engineering Utdanning (Southeast University) ble også verdsatt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, Y. R. Optical Second Harmonic Generation at Interfaces. Annual Review of Physical Chemistry. 40, 327-350 (1989).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337, 519-525 (1989).
  3. Lu, X., et al. Studying Polymer Surfaces and Interfaces with Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (1), 466-489 (2017).
  4. Chen, X., Clarke, M. L., Wang, J., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Molecular Conformation and Orientation of Biological Molecules at Interfaces. International Journal of Modern Physics B. 19 (4), 691-713 (2005).
  5. Eisenthal, K. B. Liquid Interfaces Probed by Second-Harmonic and Sum-Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 96 (4), 1343-1360 (1996).
  6. Richmond, G. L. Molcular Bonding and Interactions at Aqueous Surfaces as Probed by Vibrational Sum Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 102 (8), 2693-2724 (2002).
  7. Wang, H., Gan, W., Lu, R., Rao, Y., Wu, B. Quantitative spectral and orientational analysis in surface sum frequency generation vibrational spectroscopy(SFG-VS). International Reviews in Physical Chemistry. 24 (2), 191-256 (2007).
  8. Shultz, M. J., Schnitzer, C., Simonelli, D., Baldelli, S. Sum frequency generation spectroscopy of the aqueous interface: Ionic and soluble molecular solutions. International Reviews in Physical Chemistry. 19 (1), 123-153 (2010).
  9. Li, X., et al. Detecting Surface Hydration of Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) in Solution in situ. Macromolecules. 49, 3116-3125 (2016).
  10. Li, X., Lu, X. Evolution of Irreversibly Absorbed Layer Promotes Dewetting of Polystyrene Film on Sapphire. Macromolecules. 51, 6653-6660 (2018).
  11. Lu, X., Spanninga, S. A., Kristalyn, C. B., Chen, Z. Surface Orientation of Phenyl Groups in Poly(sodium 4-styrenesulfonate) and in Poly(sodium 4-styrenesulfonate): Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Mixture Examined by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. 26 (17), 14231-14235 (2010).
  12. Lu, X., Clarke, M. L., Li, D., Wang, X., Chen, Z. A Sum Frequency Generation Vibrational Study of the Interference Effect in Poly(n-butyl methacrylate) Thin Films Sandwiched between Silica and Water. Journal of Physical Chemistry C. 115, 13759-13767 (2011).
  13. Lu, X., et al. Directly Probing Molecular Ordering at the Buried Polymer/Metal Interface 2: Using P-Polarized Input Beams. Macromolecules. 45, 6087-6094 (2012).
  14. Lu, X., Myers, J. N., Chen, Z. Molecular Ordering of Phenyl Groups at the Buried Polystyrene/Metal Interface. Langmuir. 30, 9418-9422 (2014).
  15. Li, B., Lu, X., Ma, Y., Han, X., Chen, Z. Method to Probe Glass Transition Temperatures of Polymer Thin Films. ACS Macro Letters. 4, 548-551 (2015).
  16. Li, X., Deng, G., Ma, L., Lu, X. Interchain Overlap Affects Formation of Silk Fibroin Secondary Structure on Hydrophobic Polystyrene Surface Detected via Achiral/Chiral Sum Frequency Generation. Langmuir. 34, 9453-9459 (2018).
  17. Kai, S., Li, X., Li, B., Han, X., Lu, X. Calcium-dependent hydrolysis of supported planar lipids was triggered by honey bee venom phospholipase A2 with the right orientation at the interface. Physical Chemistry Chemical Physics. 20, 63-67 (2018).
  18. Wang, J., Buck, S., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Protein Adsorption. Journal of Physical Chemistry B. 106, 11666-11672 (2002).
  19. Wang, J., et al. Detection of Amide I Signals of Interfacial Proteins in Situ Using SFG. Journal of American Chemical Society. 125, 9914-9915 (2003).
  20. Nguyen, K. T., et al. Probing the Spontaneous Membrane Insertion of a Tall-Anchored Membrane Protein by Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 132, 15112-15115 (2010).
  21. Li, X., Ma, L., Lu, X. Calcium Ions Affect Water Molecular Structures Surrounding an Oligonucleotide Duplex as Revealed by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  22. Sartenaer, Y., et al. Sum-frequency generation spectroscopy of DNA monolayers. Biosensors & Bioelectronics. 22, 2179-2183 (2007).
  23. Asanuma, H., Noguchi, H., Uosaki, K., Yu, H. Metal Cation-induced Deformation of DNA Self-Assembled Monolayers on Silicon: Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 130, 8016-8022 (2008).
  24. Howell, C., Schmidt, R., Kurz, V., Koelsch, P. Sum-frequency-generation spectroscopy of DNA films in air and aqueous environments. Biointerphases. 3 (3), FC47 (2008).
  25. Walter, S. R., Geiger, F. M. DNA on Stage: Showcasing Oligonucleotides at Surfaces and Interfaces with Second Harmonic and Vibrational Sum Frequency Generation. Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 9-15 (2010).
  26. Li, Z., Weeraman, C., Azam, M. S., Osman, E., Gibbs-Davis, J. The thermal reorganization of DNA immobilized at the silica/buffer interface: a vibrational sum frequency generation investigation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 12452-12457 (2015).
  27. Lambert, A. G., Neivandt, D. J., Briggs, A. M., Usadi, E. W., Davies, P. B. Interference Effects in Sum Frequency Spectra from Monolayers on Composite Dielectric/Metal Substrates. Journal of Physical Chemistry B. 106, 5461-5469 (2002).
  28. Tong, Y., et al. Interference effects in the sum frequency generation spectra of thin organic films. I. Theoretical modeling and simulation. Journal of Chemical Physics. 133, 034704 (2010).
  29. McGall, S. J., Davies, P. B., Neivandt, D. J. Interference Effects in Sum Frequency Vibrational Spectra of Thin Polymer Films: An Experimental and Modeling Investigation. Journal of Physical Chemistry B. 108, 16030-16039 (2004).
  30. Li, B., et al. Interfacial Fresnel Coefficients and Molecular Structures of Model Cell Membranes: From a Lipid Monolayer to a Lipid Bilayer. Journal of Physical Chemistry C. 118, 28631-28639 (2014).
  31. Zhou, J., Anim-Danso, E., Zhang, Y., Zhou, Y., Dhinojwala, A. Interfacial Water at Polyurethane-Sapphire Interface. Langmuir. 31 (45), 12401-12407 (2015).
  32. Gautam, K. S., et al. Molecular Structure of Polystyrene at Air/Polymer and Solid/Polymer Interfaces. Physical Review Letters. 85 (18), 3854-3857 (2000).
  33. Yan, E. Y., Fu, L., Wang, Z., Liu, W. Biological Macromolecules at Interfaces Probed by Chiral Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Chemical Reviews. 114, 8471-8498 (2014).
  34. Belkin, M. A., Kulakov, T. A., Ernst, K. H., Yan, L., Shen, Y. R. Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy on Chiral Liquids: A Novel Technique to Probe Molecular Chirality. Physical Review Letters. 85, 4474 (2000).
  35. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6, 1612-1631 (2011).

Tags

Biokjemi analytisk diagnostiske og terapeutiske teknikker og utstyr undersøkende teknikker fenomener og prosesser fysiske fenomener kjemi og materialer kjemi og materialer (generelt) uorganisk organisk og fysisk Kjemi fysikk Atomic og Molekylærfysikk optikk SFG Fresnel koeffisienter grenseflate molekylær-nivå strukturer polymerer biomacromolecules chiral struktur romlig fødsel
Grenseflate molekylær-nivå strukturer av polymerer og Biomacromolecules avdekket via sum frekvens generasjon vibrasjonen spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial… More

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter