Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Interfacial molekylär nivå strukturer av polymerer och Biomacromolecules avslöjade via sum Frequency generation vibrational spektroskopi

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59380
Automatic Translation
1, 1, 1
1State Key Laboratory of Bioelectronics, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University

Summary

Att vara omfattande utnyttjas, kan sum Frequency generation (SFG) vibrations spektroskopi bidra till att avslöja kedje kon Formations ordning och sekundära strukturella förändringar sker vid polymer och biomacromolecule gränssnitt.

Abstract

Som en Second-order ickelinjär Optisk spektroskopi, har sum Frequency generation (SFG) vibrations spektroskopi i stor utsträckning använts för att undersöka olika ytor och gränssnitt. Denna icke-invasiva optiska teknik kan ge lokal molekylär nivå information med enskiktslager eller submonolayer känslighet. Vi ger här en experimentell metodik för att selektivt detektera det begravda gränssnittet för både makromolekyler och biomacromolecules. Med detta i åtanke, gränsskikts sekundära strukturer av silke så fibroin och vatten strukturer runt modellen kort kedjans oligonukleotide duplex diskuteras. Den förstnämnda visar en kedje-kedja överlappning eller rumslig instängdhet effekt och den senare visar en skyddsfunktion mot ca2 + joner som härrör från kirala ryggraden överbyggnad av vatten.

Introduction

Utveckling av sum Frequency generation (SFG) vibrations spektroskopi kan dateras tillbaka till det arbete som gjorts av Shen et al. trettio år sedan1,2. Det unika med gränsskikts selektivitet och sub-monolayer känslighet gör SFG vibrations spektroskopi uppskattas av ett stort antal forskare inom områdena fysik, kemi, biologi och materialvetenskap, etc3,4 ,5. För närvarande utreds ett brett spektrum av vetenskapliga frågor med anknytning till ytor och gränssnitt med hjälp av SFG, särskilt för komplexa gränssnitt med avseende på polymerer och biomacromolecules, såsom kedje strukturer och strukturell avslappning vid begravda polymer gränssnitt, proteinet sekundära strukturer, och den gränsskikts vatten strukturer9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

För polymerytor och gränssnitt, är tunnfilms prov i allmänhet utarbetats av spinn-beläggning för att få önskad ytor eller gränssnitt. Problemet uppstår tack vare signalstörningen från tvåna har kontakt av som-förberett filmar, som blytak till besvär för analysering av de samlade SFG-spektra27,28,29. I de flesta fall är Vibrationssignalen endast från ett enda gränssnitt, antingen film/substrat eller film/det andra mediet, önskvärt. Egentligen är lösningen på detta problem ganska lätt, nämligen att experimentellt maximera ljus fälten på det önskvärda gränssnittet och minimera ljus fälten på det andra gränssnittet. Därför måste de Fresnel-koefficienterna eller de lokala fältkoefficienterna beräknas via den tunna film modellen och valideras med avseende på de experimentella resultaten3,9,10,11, 12,13,14,15,30.

Med ovanstående bakgrund i åtanke, kan vissa polymer och biologiska gränssnitt undersökas för att förstå grundläggande vetenskap från molekylär nivå. I följande, med tre gränsskikts frågor som exempel: sondering poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (phema) yta och begravda gränssnitt med substrat9, bildandet av Silk så fibroin (SF) sekundära strukturer på polystyren (PS) yta och vatten strukturer omgivande modell kort kedja oligonukleotide duplex16,21, kommer vi att visa hur SFG vibrations spektroskopi hjälper till att avslöja gränsskikts molekylär nivå strukturer i samband med den underliggande vetenskapen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SFG experimentell

  1. Använd en kommersiell pikosekund SFG system (tabell över material), som ger en grundläggande 1064 nm balk med en pulsbredd på ~ 20 PS och en frekvens av 50 Hz, baserat på en nd: YAG-laser.
  2. Omvandla den grundläggande 1064 nm-strålen till en 532 nm-stråle och en 355 nm-stråle genom att använda andra och tredje harmoniska moduler. Direkt vägleda 532 nm strålen som en ingång ljusstråle och generera andra indata mitten av infraröd (IR) stråle som täcker frekvensområdet från 1000 till 4000 cm-1 genom optisk parametriska generationen (OPG)/optisk parametriska AMPLIFIERING (OPA)/ process för generering av differensfrekvenser (DFG).
  3. Ställ in incidentvinklar på två ingångs balkar till 53 ° (IR) och 64 ° (synlig), respektive, jämfört med ytan normal.
  4. För att upptäcka polymeren gränsskikts strukturer (antingen film/substrat gränssnitt eller film/det andra mediet gränssnitt), Använd SSP (s-polariserad sum-frekvens balk, s-polariserad synlig stråle och p-polariserad infraröd stråle) och PPP polarisering kombinationer.
  5. För att detektera gränsskikts protein sekundära strukturer och vatten strukturer kring DNA, Förutom SSP och PPP, Använd kirala SPP och PSP polariserings kombinationer användes.
  6. För att säkerställa att proverna inte var skadade, kontrollera den infraröda och synliga pulsen energier vara ~ 70 och ~ 30 mJ, respektive. En schematisk del av SFG-processen med energinivå diagrammet visades i figur 1. Figur 2 visar SFG-systemet i vårt renrum.

2. Fresnel koefficienter

  1. Använd rätvinkliga prismor som substrat för alla de experiment som diskuteras här. Det finns två gränssnitt för en polymerfilm på det fasta underlaget, dvs polymer yta i luft och polymer/substrat gränssnitt. Båda kan generera SFG signaler eftersom inversion symmetri bryts vid båda gränssnitten. Därför är ett samlat SFG spektrum en stört en. De lokala fältkoefficienterna eller Fresnel-koefficienterna vid de två gränssnitten kan dock justeras genom att antingen variera incidentvinkeln eller filmtjockleken en i taget eller samtidigt31,32. Detta ger möjlighet för oss att söka SFG Vibrationssignalen från endast ett gränssnitt. Här togs PHEMA film på CaF2 Prisma som ett exempel9.
  2. Som visas i figur 3, anställa den rätvinkliga Prisma geometri för att upptäcka SFG signaler som genereras från botten phema filmen. SFG-utmatningsintensiteten i det reflekterade läget uttrycks som
    Equation 11
    där Equation 2 betecknar den effektiva andra ordningens ickelinjära mottaglighet tensor.
    Equation 2består av tre delar, nämligen, Prism/polymer gränssnitt, polymer/botten medium Interface (botten medium inkluderar gas, flytande eller fast.) och nonresonant bakgrund, som visas i följande ekvation.
    Equation 32
    Här kan botten mediet vara luft, vatten eller något annat. F representerar den motsvarande Fresnel-koefficienten som ansvarar för den lokala fält korrigeringen.
  3. Tillämpa en tunnfilms modell för att beräkna Fresnel koefficienterna i detta fall. Här framläggas endast kort beräknings tillvägagångssätt.
    1. För Prisma/polymergränssnittet, Använd
      Equation 43
      Equation 54
      Equation 65
      Innebörden av varje parameter som visas presenteras nedan.
      1. ωi betecknar strål frekvensen.
      2. tp och ts betecknar de sammanlagda överföringskoefficienterna och kan uttryckas
        Equation 76
        Equation 87
      3. tP12 och tS12 betecknar ljusstrålens linjära överföringskoefficienter vid gränssnittet Prism/polymer.
      4. rP23 och rS23 betecknar ljusstrålens linjära reflektions koefficienter vid polymer/medium-gränssnittet.
      5. α representerar fasskillnaden mellan en reflekterande balk och dess sekundära reflekterande balk efter det sprider sig över polymeren tunn film och sedan reflekterar tillbaka, vilket kan uttryckas som
        Equation 98
      6. λ representerar ljusstrålens våglängd och d är polymerfilmens tjocklek.
      7. Φ1 och φ2 representerar de infallande vinklarna vid prismat/polymergränssnittet och polymeret/medel gränssnittet respektive.
      8. n1 och n2 representerar brytningsindex för Prisma respektive polymerfilm.
      9. n12 representerar brytningsindex av polymeren gränsskikts skikt för Prism/polymer.
    2. För polymer/medium Interface, Använd
      Equation 109
      Equation 1110
      Equation 1211
      1. Δ föreställer arrangera gradvis skillnaden av det ljust elektriskt sätter in på två har kontakt.
      2. Eftersom pulsbredden för våra ingångs strålar är ~ 20 PS, kan felet från tidsfördröjningen i samband med spridningseffekten försummas.
      3. Uttrycket av en sådan fas skillnad för utdata SFG, den synliga ingången och de infraröda strålar kan skrivas separat som
        Equation 1312
        Equation 1413
        Equation 1514
         
  4. Från ovanstående diskussion, för Prism-polymer film-medium (1-2-3) system, uttrycka den totala Fresnel koefficienter för Prism/polymer och polymer/medium gränssnitt som följande ekvationer, för SSP och PPP polarisering kombinationer . Naturligtvis är båda gränssnitten anses azimuthally isotrop.
    1. För gränssnittet Prism/polymer presenteras uttrycken för de totala Fresnel-koefficienterna för både SSP -och PPP -polariseringskombinationer enligt följande.
      1. För SSPär ekvationen
        Equation 1615
      2. Och för PPPär ekvationen
        Equation 516
        Equation 517
        Equation 518
        Equation 519
         
      3. t10 och t01 betecknar de linjära överföringskoefficienterna vid gränssnitten luft/Prisma respektive Prisma/luft.
    2. För polymer/medium-gränssnittet beskrivs uttrycken för de totala Fresnel-koefficienterna för både SSP -och PPP -polariseringskombinationerna enligt följande.
      1. För SSPär ekvationen
        Equation 2120
      2. För PPPär ekvationerna
        Equation 521
        Equation 522
        Equation 523
        Equation 524
           
         
  5. Efter beräkning av Fresnel koefficienterna med hjälp av den inklämta modellen, rita dem som en funktion av filmtjockleken, som visas i figur 4.
    Obs: i detta fall finns det en tjocklek intervall för att samla in SFG signalen från CaF2 Prism/phema gränssnitt med försumbar bidrag från det andra gränssnittet, vilket är cirka 150 Nm. På samma sätt kan en lämplig tjocklek väljas för detektion av phema/bottom medium gränssnitt med försumbar bidrag från CaF2 Prism/phema gränssnitt.

3. CHIRAL SFG polarisering kombination

  1. För det normala plasma Interface, vanligen, använda C∞ v symmetri i termer av Ensemble genomsnitt33,34. Med drift av inversion symmetri, den annat än noll Second-order ickelinjär mottaglighet tensor komponenter kan härledas, som ärc xxz, cxzx, czxx, cYYZ, cyzy, cZYY och cZZZ (den befintliga villkor kan minskas ytterligare om ett isotropiskt gränssnitt antas, vilket innebär att x och y är desamma). Men för det kirala gränssnittet, kommer situationen att vara annorlunda. Det kirala gränssnittet besitter C ∞ symmetrin, endast rotation symmetri operationen är tillåten. I detta fall, förutom den normala plasma termer, mer Second-order ickelinjära mottaglighet kommer att vara nonzero, som kan betecknas som kirala termer, nämligen, cZYX, czxy och cYZX under övervägande av icke-elektroniska Resonans. Därför, genom att använda PSP, PPS och SPP polarisering kombinationer, kan kirala SFG Spectra samlas33,34.

4. provberedning

  1. Beredning av PHEMA film
    1. Lös upp PHEMA-pulvret (se tabell över material) i vattenfri etanol för att bereda lösningen med 2 WT% respektive 4 WT%.
    2. Innan deposition av phema filmer, blöt CaF2 rätvinkliga prismor i toluen lösningsmedel först och sedan tvätta dem med etanol och ultrarent vatten (18,2 MΩ · cm).
    3. Efteråt, exponera substrat (CaF2 rätvinkliga prismor) till syre plasma för att avlägsna eventuella organiska föroreningar genom plasma renare (se tabell över material).
      1. Först slå på plasma renare och sätta substrat i den.
      2. Slå sedan på vakuumpumpen för att vacuumize renare. Mata in syret i den.
      3. Ställ slutligen 4 minuter för rengöring. Efter det, bevara de rena substrat för den sekventiella PHEMA film beredning.
      4. Förbered sedan PHEMA filmerna på CaF2 prismor av en spin-coater (se tabell över material). Justera filmtjockleken med lösnings koncentrationen och rotationshastigheten.
        1. Immobilize CaF2 prisma på sugande skiva av spin-coater.
        2. Släpp en droppe av PHEMA lösning beredd innan på den rena substrat vid 1 500 rpm för 1 min (film tjocklek 2 WT% för 100 nm och 4 WT% för 200 nm).
      5. Anneal alla beredda PHEMA filmer i en vakuumugn vid 80 ° c över natten.
  2. Beredning av silkes så fibroin (SF)
    Anmärkning: det protokoll som föreslogs av Kaplan et al.35 antogs.
    1. Placera 7,5 g siden Kobra av B. Mori i kokande natriumkarbonat (na2Co3, 0,02 M) vattenlösning (3 L) för 30 min. ta bort fibrösa SF till en ren behållare.
    2. Tvätta den erhållna fibrösa SF med avjoniserat vatten under tre gånger under omrörning för att avlägsna sericin molekyler och lämna endast SF molekyler i fibrös provet.
    3. Torka den fibrösa SF provet i en vakuumugn vid 60 ° c över natten.
    4. Efteråt, lös den Degummed fibrösa SF provet i en litium-bromid (LiBr, 9,3 M) vattenlösning (1 g av SF löstes i ~ 4 mL av LiBr lösning.) och inkubera den vid 60 ° c i 2 timmar under omrörning.
    5. Dialyze SF lösning mot avjoniserat vatten (3 500 Da dialys påsar) för 3 dagar att ta bort upplöst LiBr. Byt nytt avjoniserat vatten tre gånger varje dag. Förvara slutligen den bearbetade SF-lösningen vid 4 ° c för senare SFG-experiment.
  3. Beredning av kort kedjans oligonukleotid duplex
    1. Beställ det enkelsträngade oligonukleotidprovet med dess 3 '-ände modifierat av kolesterol-trietylenglykol (Chol-TEG) (5 '-GCTTCCGAAGGTCGA-3 ') från ett kommersiellt företag (se tabell över material) samt komplementär. Lös 10 nmol av prov pulvret i 0,5 ml ultrarent vatten för varje enskild sträng. Blanda sedan ihop dem för att bilda den duplex-oligonukleotidlösningen (10 nmol/mL).
    2. Blanda 2 mg 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DPPC) och 2 mg deutserdade DPPC (d-DPPC) och lös upp dem i 1 mL kloroform för att bereda lipidlösningen.
    3. Beredning av dppc & d-dppc enskiktslager av en Langmuir − Blodgett (lb) tråg
      1. Fäst den rätvinkliga CaF2 Prisma till en hemlagad provhållare med en prisma ansikte vinkelrätt doppas i vattenmiljön i lb tråg.
      2. Injicera sedan den blandade lipidlösningen som förberetts före på vattenytan tills yttrycket nådde ett visst värde under 34 mN · m− 1.
      3. Efter yttryck nivåer av, använda två Teflon hinder för att komprimera lipidmonolayer vid ett förhållande av 5 mm/min tills ett yttryck på 34 mN · m− 1 nåddes.
      4. Lyft prismat med en lipidmonolayer ur vattnet med en hastighet av 1 mm/min vertikalt.
    4. Beredning av den andra lipidmonolayer
      1. För att underlätta monteringen av den duplex-oligonukleotiden och lipidmolekylerna via hydrofob interaktion (kolesterol och en lipidalkylkedja), blanda den duplex-oligonukleotidlösningen med lipidlösningen i ett molar förhållande på 1:100 (oligonukleotid till lipider).
      2. Injicera den blandade lipid-och duplex-oligonukleotidlösningen på vattenytan i en hemlagad teflonbehållare tills ett yttryck på 34 mN · m− 1 uppnåddes.
    5. Slutligen, Lägg lipidmonolayer på botten av prismat i kontakt med lipidmonolayer med införda duplex oligonukleotides på vattenytan för att bilda det slutliga provet för SFG mätningen.
  4. Lorentz ekvation
    1. Använd Lorentzekvationen för att passa SFG-spektrat för att extrahera vibrations informationen för ett specifikt vibrationsläget.
      Equation 2625
      där Equation 27 representerar intensiteten i qth vibrationella läge, Equation 28 representerar resonansfrekvens, Equation 29 betecknar halva bredden vid halva maximum (hwhm) och Equation 30 representerar skannings frekvensen av incidenten IR beam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I Fresnel koefficienten del av protokoll avsnitt, har vi visat att, teoretiskt, är det möjligt att selektivt upptäcka endast ett enda gränssnitt på en gång. Här, experimentellt, bekräftade vi att denna metod är i grunden korrekt, som visas i figur 5 och figur 6.

Figur 5 visar den begravda gränsskikts phema struktur efter vatteninträngning med en ~ 150 Nm phema hydrogel film och figur 6 visar ytan struktur i vatten med en ~ 430 nm phema hydrogel film. Panelerna A och B motsvarar CH-och CO-intervallen respektive för båda siffrorna. Vid det begravda gränssnittet är alla observerade vibrationella toppar skarpa och tydliga. Anledningen är att CaF2 -underlaget är smidigt och inte kan tränas av phema-molekyler, vilket leder till ett skarpt CAF2/phema-gränssnitt. Men på ytan, eftersom vattenmolekyler kan interagera med PHEMA och diffus i bulk, PHEMA/vatten gränssnittet skulle vara inte lika skarp som den begravda. Därför observeras olika spektrala profiler för dessa två gränssnitt.

Figure 1
Figur 1 . Schematisk show av SFG-processen (vänster panel) med energi övergångs diagrammet (höger panel). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . SFG-systemet i labbet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Schematiska visar ljus spridnings banan i Prism för SFG experiment. Siffrorna 0, 1, 2 och 3 representerar luften, prisma, PHEMA och botten medium (det undre mediet kan vara luft, fast eller flytande.), respektive. Återges från Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref 9). Copyright 2016 amerikanska kemiska sällskapet. Denna siffra har modifierats från [9]. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Beräknade Fresnel koefficienter som en funktion av filmtjockleken för Prisma geometri i vatten för SSP och PPP polarisering kombinationer. Panelerna a1 till C1 motsvarar CH-området och panelerna a2 till C2 motsvarar Co-sortimentet. Återges från Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref 9). Copyright 2016 amerikanska kemiska sällskapet. Denna siffra har modifierats från [9].

Figure 5
Figur 5 . SSP -och PPP -spektra av CaF2/phema-gränssnittet efter vatten exponering. A: CH och OH spänner; B: CO-sortimentet. De svarta kurvorna är de monterade resultaten genom att använda Lorentz ekvation. Spektra har kompenserats för tydlighetens skull. Återges från Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref 9). Copyright 2016 amerikanska kemiska sällskapet. Denna siffra har modifierats från [9].

Figure 6
Figur 6 . SSP och PPP spektra av Phema ytan på CaF2 prisma. A: CH och OH spänner; B: CO-sortimentet. Provet placerades i kontakt med vatten. De svarta kurvorna är de monterade resultaten genom att använda Lorentz ekvation. Spektra har kompenserats för tydlighetens skull. Återges från Li, X.; Li, B.; Zhang, X.; Li, C.; Guo, Z.; Zhou, D.; Lu, X. Macromolecules 2016, 49, 3116 − 3125 (Ref 9). Copyright 2016 amerikanska kemiska sällskapet. Denna siffra har modifierats från [9].

Figure 7
Figur 7 . Normaliserade kirala (PSP) SFG Spectra i Amid i (panel A) och N-H (panel B) intervall för PS/SF lösning (90 mg/ml) gränssnitt före och efter tillsats av metanol. Prickarna är experimentella data och de heldragna linjerna är de monterade kurvorna. Spektra har kompenserats för tydlighetens skull. Återges från Li, X.; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453 − 9459 (Ref 16). Copyright 2018 amerikanska kemiska sällskapet. Denna siffra har modifierats från [16].

Figure 8
Figur 8 . Normaliserade kirala (PSP) SFG Spectra i Amid i (panel A) och N-H (panel B) intervall för PS/SF lösning (1 mg/ml) gränssnitt före och efter tillsats av metanol. Prickarna är experimentella data och de heldragna linjerna är de monterade kurvorna (blå). Spektra har kompenserats för tydlighetens skull. Återges från Li, X.; Deng, G.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 9453 − 9459 (Ref 16). Copyright 2018 amerikanska kemiska sällskapet. Denna siffra har modifierats från [16].

Figure 9
Figur 9 . Achiral (SSP, A) och kirala (SPP, B) SFG Spectra för den duplex oligonukleotide-förankrade lipidbilayer i kontakt med ca2 + lösningar med olika koncentrationer (från 0,6 mm till 6 mm). Datapunkterna utrustades ungefär med hjälp av Lorentzekvationen. Förändringen av det integrerade området för vatten vibrationella signaler som en funktion av ca2 + koncentrationen presenterades (SSP, C; SPP, D). Alla spektra har normaliserats och kompenserats för tydlighetens skull. Återges från Li, X.; Ma, L.; Lu, X.; Langmuir 2018, 34, 14774 − 14779 (Ref 21). Copyright 2018 amerikanska kemiska sällskapet. Denna siffra har modifierats från [21].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att undersöka den strukturella informationen från en molekylär nivå har SFG sina inneboende fördelar (dvs., enskiktslager eller sub-enskiktslager känslighet och gränsskikts selektivitet), som kan tillämpas för att studera olika gränssnitt, såsom solid/solid, solid/ vätska, fast/gas, vätska/gas, flytande/flytande gränssnitt. Även om utrustningen underhåll och den optiska anpassningen är fortfarande tidskrävande, är payoff betydande i att den detaljerade molekylnivå information på ytor och gränssnitt kan erhållas.

Probing poly (2-hydroxyethyl methacrylate) yta och begravda gränssnitt i lösning: som vi visade ovan kan ljusfältskoefficienterna justeras. Vi kan bekräfta detta experimentellt. Vid det begravda gränssnittet med underlaget, eftersom CaF2 substrat ytan är slät och kan inte trängt in av phema molekyler, detta gränssnitt är en skarp en. Men på ytan med vatten, vattenmolekyler kan interagera med PHEMA molekyler och diffus i bulk. Därav detta gränssnitt är suddiga, och inte lika skarp som den begravda. Därför skulle olika SFG spektrala profiler observeras för dessa två gränssnitt. Våra experimentella SFG data visade detta, vilket indikerar förmågan att selektivt sond det begravda gränssnittet med underlaget eller ytan i lösning.

Interchain interaktion eller instängdhet effekt på bildandet av Silk fibroin sekundära strukturer: en nyckelfaktor är den kritiska överlappande koncentrationen (C *). För SF, C * är ~ 1,8 mg/mL. Experimentellt, för SF lösning av ~ 90 mg/mL (ovan C *), ingen kirala (PSP) SFG vibrationella signaler upptäcktes på SF lösning/PS-gränssnittet om inte en inducerande agent-metanol lades, som visas i figur 7. Men, för SF lösning av ~ 1 mg/mL (nedan C *), kirala (PSP) SFG vibrationella signaler kan upptäckas direkt utan att lägga metanol, som visas i figur 8, vilket tyder på att de beställda sekundära strukturer har redan bildats vid SF lösning/PS-gränssnitt. Eftersom C * är en tröskelkoncentration för kedje kedjan överlappning, kedjan-kedjan interaktion eller rumslig inneslutning måste tas som en reglerande faktor här för bildandet av SF sekundära strukturer i gränssnittet.

Vattenmolekyl ära strukturer som omger kort kedjans oligonukleotid duplex: för en kortkedjiga oligonukleotid duplex i vatten lösningen, kirala vatten SFG vibrationella signaler motsvarar vätskeskiktet i kirala ryggraden i mindre spåret . Achiral vatten SFG vibrationella signaler motsvarar mestadels vattenskiktet kring oligonukleotid duplex kedjan och lipidens (kirala ryggraden i vattenskiktet bidrar också)33. I en ca2 + koncentrationsintervall från 0,6 till 6 mm, som visas i figur 9, Vi hittade, det fanns ingen uppenbar förändring för kirala vatten vibrationella signaler i form av ca2 + koncentration. Men de plasmavatten vibrationella signalerna påverkades starkt när ca2 + koncentrationen ändrades. Detta indikerar att den kirala ryggraden i vattenskiktet nära bindning till oligonukleotidduplex kan skydda oligonukleotiden från ca2 + joner, i det normala biologiska tillståndet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av staten Key Development program för grundläggande forskning i Kina (2017YFA0700500) och National Natural Science Foundation i Kina (21574020). De grundläggande forskningsfonderna för de centrala universiteten, ett projekt finansierat av den prioriterade akademiska program utvecklingen i Jiangsu högre utbildningsanstalter (PAPD) och det nationella demonstrations centret för experimentell medicinsk teknik Education (Southeast University) var också mycket uppskattat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shen, Y. R. Optical Second Harmonic Generation at Interfaces. Annual Review of Physical Chemistry. 40, 327-350 (1989).
  2. Shen, Y. R. Surface properties probed by second-harmonic and sum-frequency generation. Nature. 337, 519-525 (1989).
  3. Lu, X., et al. Studying Polymer Surfaces and Interfaces with Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Analytical Chemistry. 89 (1), 466-489 (2017).
  4. Chen, X., Clarke, M. L., Wang, J., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Molecular Conformation and Orientation of Biological Molecules at Interfaces. International Journal of Modern Physics B. 19 (4), 691-713 (2005).
  5. Eisenthal, K. B. Liquid Interfaces Probed by Second-Harmonic and Sum-Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 96 (4), 1343-1360 (1996).
  6. Richmond, G. L. Molcular Bonding and Interactions at Aqueous Surfaces as Probed by Vibrational Sum Frequency Spectroscopy. Chemical Reviews. 102 (8), 2693-2724 (2002).
  7. Wang, H., Gan, W., Lu, R., Rao, Y., Wu, B. Quantitative spectral and orientational analysis in surface sum frequency generation vibrational spectroscopy(SFG-VS). International Reviews in Physical Chemistry. 24 (2), 191-256 (2007).
  8. Shultz, M. J., Schnitzer, C., Simonelli, D., Baldelli, S. Sum frequency generation spectroscopy of the aqueous interface: Ionic and soluble molecular solutions. International Reviews in Physical Chemistry. 19 (1), 123-153 (2010).
  9. Li, X., et al. Detecting Surface Hydration of Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) in Solution in situ. Macromolecules. 49, 3116-3125 (2016).
  10. Li, X., Lu, X. Evolution of Irreversibly Absorbed Layer Promotes Dewetting of Polystyrene Film on Sapphire. Macromolecules. 51, 6653-6660 (2018).
  11. Lu, X., Spanninga, S. A., Kristalyn, C. B., Chen, Z. Surface Orientation of Phenyl Groups in Poly(sodium 4-styrenesulfonate) and in Poly(sodium 4-styrenesulfonate): Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) Mixture Examined by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. 26 (17), 14231-14235 (2010).
  12. Lu, X., Clarke, M. L., Li, D., Wang, X., Chen, Z. A Sum Frequency Generation Vibrational Study of the Interference Effect in Poly(n-butyl methacrylate) Thin Films Sandwiched between Silica and Water. Journal of Physical Chemistry C. 115, 13759-13767 (2011).
  13. Lu, X., et al. Directly Probing Molecular Ordering at the Buried Polymer/Metal Interface 2: Using P-Polarized Input Beams. Macromolecules. 45, 6087-6094 (2012).
  14. Lu, X., Myers, J. N., Chen, Z. Molecular Ordering of Phenyl Groups at the Buried Polystyrene/Metal Interface. Langmuir. 30, 9418-9422 (2014).
  15. Li, B., Lu, X., Ma, Y., Han, X., Chen, Z. Method to Probe Glass Transition Temperatures of Polymer Thin Films. ACS Macro Letters. 4, 548-551 (2015).
  16. Li, X., Deng, G., Ma, L., Lu, X. Interchain Overlap Affects Formation of Silk Fibroin Secondary Structure on Hydrophobic Polystyrene Surface Detected via Achiral/Chiral Sum Frequency Generation. Langmuir. 34, 9453-9459 (2018).
  17. Kai, S., Li, X., Li, B., Han, X., Lu, X. Calcium-dependent hydrolysis of supported planar lipids was triggered by honey bee venom phospholipase A2 with the right orientation at the interface. Physical Chemistry Chemical Physics. 20, 63-67 (2018).
  18. Wang, J., Buck, S., Chen, Z. Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy Studies on Protein Adsorption. Journal of Physical Chemistry B. 106, 11666-11672 (2002).
  19. Wang, J., et al. Detection of Amide I Signals of Interfacial Proteins in Situ Using SFG. Journal of American Chemical Society. 125, 9914-9915 (2003).
  20. Nguyen, K. T., et al. Probing the Spontaneous Membrane Insertion of a Tall-Anchored Membrane Protein by Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 132, 15112-15115 (2010).
  21. Li, X., Ma, L., Lu, X. Calcium Ions Affect Water Molecular Structures Surrounding an Oligonucleotide Duplex as Revealed by Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. Langmuir. , (2018).
  22. Sartenaer, Y., et al. Sum-frequency generation spectroscopy of DNA monolayers. Biosensors & Bioelectronics. 22, 2179-2183 (2007).
  23. Asanuma, H., Noguchi, H., Uosaki, K., Yu, H. Metal Cation-induced Deformation of DNA Self-Assembled Monolayers on Silicon: Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Journal of American Chemistry Society. 130, 8016-8022 (2008).
  24. Howell, C., Schmidt, R., Kurz, V., Koelsch, P. Sum-frequency-generation spectroscopy of DNA films in air and aqueous environments. Biointerphases. 3 (3), FC47 (2008).
  25. Walter, S. R., Geiger, F. M. DNA on Stage: Showcasing Oligonucleotides at Surfaces and Interfaces with Second Harmonic and Vibrational Sum Frequency Generation. Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 9-15 (2010).
  26. Li, Z., Weeraman, C., Azam, M. S., Osman, E., Gibbs-Davis, J. The thermal reorganization of DNA immobilized at the silica/buffer interface: a vibrational sum frequency generation investigation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17, 12452-12457 (2015).
  27. Lambert, A. G., Neivandt, D. J., Briggs, A. M., Usadi, E. W., Davies, P. B. Interference Effects in Sum Frequency Spectra from Monolayers on Composite Dielectric/Metal Substrates. Journal of Physical Chemistry B. 106, 5461-5469 (2002).
  28. Tong, Y., et al. Interference effects in the sum frequency generation spectra of thin organic films. I. Theoretical modeling and simulation. Journal of Chemical Physics. 133, 034704 (2010).
  29. McGall, S. J., Davies, P. B., Neivandt, D. J. Interference Effects in Sum Frequency Vibrational Spectra of Thin Polymer Films: An Experimental and Modeling Investigation. Journal of Physical Chemistry B. 108, 16030-16039 (2004).
  30. Li, B., et al. Interfacial Fresnel Coefficients and Molecular Structures of Model Cell Membranes: From a Lipid Monolayer to a Lipid Bilayer. Journal of Physical Chemistry C. 118, 28631-28639 (2014).
  31. Zhou, J., Anim-Danso, E., Zhang, Y., Zhou, Y., Dhinojwala, A. Interfacial Water at Polyurethane-Sapphire Interface. Langmuir. 31 (45), 12401-12407 (2015).
  32. Gautam, K. S., et al. Molecular Structure of Polystyrene at Air/Polymer and Solid/Polymer Interfaces. Physical Review Letters. 85 (18), 3854-3857 (2000).
  33. Yan, E. Y., Fu, L., Wang, Z., Liu, W. Biological Macromolecules at Interfaces Probed by Chiral Vibrational Sum Frequency Generation Spectroscopy. Chemical Reviews. 114, 8471-8498 (2014).
  34. Belkin, M. A., Kulakov, T. A., Ernst, K. H., Yan, L., Shen, Y. R. Sum-Frequency Vibrational Spectroscopy on Chiral Liquids: A Novel Technique to Probe Molecular Chirality. Physical Review Letters. 85, 4474 (2000).
  35. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nature Protocols. 6, 1612-1631 (2011).

Tags

Biokemi analytiska diagnostiska och terapeutiska tekniker och utrustning utredningsteknik fenomen och processer fysikaliska fenomen kemi och material kemi och material (allmänt) oorganiska organiska och fysikaliska Kemi fysik Atom-och molekylfysik optik SFG Fresnel-koefficienter gränsskikts molekylär nivå strukturer polymerer biomacromolecules kirala struktur rumslig inneslutning
Interfacial molekylär nivå strukturer av polymerer och Biomacromolecules avslöjade via sum Frequency generation vibrational spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial… More

Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter