Summary
Drogen inriktning till centrala nervsystemet tumörer är en stor utmaning. Här beskriver vi ett protokoll för att producera en in vitro-härma av blod-hjärn tumör-barriären med murin eller mänskliga celler och diskutera deras relevans för förutsägbarheten i centrala nervsystemet tumör inriktning Invivo.
Abstract
Mycket selektiv av naturen, på blod - hjärnbarriären (BBB) är viktigt för hjärnan homeostas i fysiologiska förhållanden. Dock i samband med hjärntumörer sköldar BBB molekylär selektivitet även de neoplastiska cellerna genom att blockera leverans av perifert administrerade kemoterapi. Utvecklingen av nya läkemedel (inklusive nanopartiklar) inriktning maligna hjärntumörer idealiskt kräver användning av prekliniska djurmodeller att studera läkemedlets transcytos och antitumöreffekt effekt. För att uppfylla principen 3R (förfina, minska och ersätta) för att minska antalet försöksdjur i experimentellt ställa in och utföra high-throughput screening av ett stort bibliotek av antitumöreffekt agenter, vi utvecklat en reproducerbar in vitro-människa och murina härma av blod-hjärn tumör-barriären (BBTB) med tre lager cellkulturer av endotelceller, astrocyter och patientderiverade glioblastoma sfärer. För högre skalbarhet och reproducerbarhet, har kommersiella cellinjer eller förevigade celler använts i skräddarsydda villkor för att tillåta bildandet av en barriär som liknar riktiga BBB. Här beskriver vi ett protokoll för att få en BBTB härma genom odling endotelceller i kontakt med astrocyter vid viss cell tätheter på skären. Denna BBTB härma kan användas, exempelvis för kvantifiering och confocal avbildning av nanopartiklar passagen genom de endothelial och astrocytic hinder, förutom utvärdering av tumör cell inriktningen inom samma analysen. Vi visar dessutom att de erhållna uppgifterna kan användas för att förutsäga beteendet hos nanopartiklar i prekliniska djurmodeller. I ett bredare perspektiv, in vitro-modellen skulle kunna anpassas till andra neurodegenerativa sjukdomar för bestämning av passagen av nya terapeutiska molekyler via BBB eller kompletteras med hjärnan organoids direkt utvärdera effekten av läkemedel.
Introduction
Neurovaskulära enheten består av nervceller, astrocyter och BBB, bildas av intrikata kopplingar mellan pericyter, astrocyter, endotelceller och associerade basalmembranet bildar hjärnan mikrocirkulation1. Denna snäva cell-vägg bildas av kontinuerlig, nonfenestrated fartyg fint reglerar rörelsen av joner och molekyler (inklusive hormoner, näringsämnen eller droger), men också av cirkulerande celler1. Den särskilt låga transcytos via BBB av hög molekylvikt molekyler, såsom terapeutiska antikroppar, drog konjugat eller nanocompounds, begränsar dramatiskt framstegen inom läkemedelsutveckling för neurologiska sjukdomar, inklusive maligna gliom2. Verkligen, oralt eller intravenöst levererade Kemoterapier nå hjärnparenkymet ofta vid otillräckligt låga koncentrationer att inducera en antitumöreffekt effekt eller helt enkelt inte att korsa BBTB för att nå de neoplastiska celler3. Flera prekliniska och kliniska studier behandlat inte frågan om BBTB penetration men har försökt att störa BBTB övergående, till exempel genom att använda fokuserat ultraljud4,5, eller för att kringgå det genom direkt i situ leverans av narkotika6. Ingen av dessa tekniker var dock kunna motverka den oundvikliga tumör expansionen eller återfall. Därför, när du utvecklar roman antiglioma terapier, diffusion genom BBTB anses vara en av de kritiska aspekterna för framgångsrik leverans av den terapeutiska medel7.
Mycket komplex Pågrund av cell interaktioner inom BBTB tycks in vivo-studier på försöksdjur vara det självklara valet när man studerar passage av molekyler från blodet till hjärnan. Hög skala Invivo metoder är dock relativt komplexa att upprätta och, därför, inte tillåter hög genomströmning screening av molekyler i rimlig tid till en rimlig kostnad. Ännu viktigare, har djurförsök att följa de 3R etiska riktlinjer definieras i) förfina, ii) minska, och, av relevans för den aktuella kontexten, iii) ersätta av alternativa protokoll (t.ex. in vitro/in silico-metoder). Därför att återskapa BBTB in vitro-visas som en intressant och attraktiv möjlighet, men det utgör också en komplex uppgift som utmanas av olika begränsningar. Många försöker återskapa detta komplexa fack med odlade primära celler eller cellinjer från hund, svin, murina, och även mänskliga ursprung har publicerats (som granskas av Rahman et al.8 och Helms et al.9). Dessa modeller inkluderar tredimensionella mikroflödessystem system10, BBB-på-ett-chip11,12, och mängder av varianter som baseras på klassisk samtidig kulturerna i infogar system. Nuvarande mikroflödessystem och chip system är dock antingen inte lämpar sig för snabb, hög genomströmning drog-validering studier13,14 eller är för närvarande inte kompatibelt med studier av drogen leverans till hjärntumörer. Dessutom visade översynen 155 publicerade modeller använder primära celler, inducerbara pluripotenta stamceller (iPSC) eller kommersiella cellinjer alla tillsammans odlade på skär en trend för interstudy diskrepans i sina mätningar eller slutsatser8. Denna brist på interlaboratory reproducerbarhet kunde korreleras med i) nonnormalized kultur förhållanden, till exempel med valfri beläggning med basalmembranet matrix proteiner i cellen kultur fartyget, ii) ett ökat antal subkultur och användning av serum-innehållande media, båda större förare av genetiska och fenotypiska ändringar av cell linjer15eller iii) svårigheten att reproducibly återskapa den rätt jämvikten mellan astroglial och endotel komponenterna i en maträtt. Även om användningen av förevigade celler eller kommersiella cell linjer för att upprätta en in vitro-BBB-modell saknar några av de egenskaper jämfört med liknande modeller som bara använder primära celler, i den beskrivna metoden visar vi att rätt kombination av celler uppvisar en mycket jämförbara prestanda till publicerade studier i andra modeller referens16,17. Så småningom, motiverade avsaknaden av en robust och reproducerbara modell för att studera passage av terapeutiska föreningar målgrupp hjärntumors genom BBTB oss att utveckla de metoder som beskrivs här.
Eftersom målet var att använda modellen för att förutsäga Invivo leverans av nanopartiklar i prekliniska djurmodeller, validerade vi först den BBTB modellen genom att utnyttja skär som innehåller murina endotelceller i kontakt med murin astrocyter. Utöver detta har optimerad vi också modellen för att använda vissa mänskliga cellinjer. När stabiliserad, överförs cellen hindren till kulturer med patientderiverade glioblastoma sfärer eller kommersiella glioma cell linjer. Därefter kan transcytos av nanopartiklar och tumör cell inriktning visualiseras genom konfokalmikroskopi och kvantifieras genom att samla prover över tid. Allt kunde resultat som erhållits med de BBTB härmar tillförlitligt förutsäga beteendet hos nanopartiklarna i vivo, stödja användningen av BBTB härma föregående prekliniska validering.
Protocol
I djurförsök har godkänts av kommittén för djur experiment i de distrikt i södra Finland (ESAVI/6285/04.10.07/2014).
1. fastställande av de BBTB härmar
Obs: Cellodlingsmedium och kosttillskott beskrivs i tabell material.
- Beredning av astrocyter
Obs: Följande volymer är lämpliga för en 10 cm petriskål eller en T75 cell kultur kolv.- Under sterila cell kultur huva, noggrant tvätta odlade astrocyterna med 5 mL steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Försiktigt kasta PBS med hjälp av en vakuumpump och tillsätt 2 mL av cell dissociation reagens för 5 min (vid 37 °C, se Tabell för material) att lossa cellerna. Kontrollera cellen avskildheten under mikroskopet. Överskrid inte 5 min inkubering att begränsa belastningen på cellerna.
- Tillsätt 10 mL steril komplett astrocyten cellodlingsmedium (ABM +) till fartyget att hämma aktiviteten av cell dissociation reagens. Använd en steril serologiska Pipettera överföra fristående cellerna från fartyget till en steril 15 mL tub. Centrifugera cellsuspensionen i 3 min på 250 rcf (acceleration: 9 rcf/s, retardation: 5 rcf/s) vid rumstemperatur (RT).
- Under tiden förbereder skären (se Tabell för material): Använd steril pincett, placera skären med hjärnan sida upp (figur 1A) på locket till en steril 6-well platta (figur 1B). Kontrollera i förväg att plattan kan placeras upp och ner på skären utan att röra eller flytta mellanläggen under processen.
Obs: Korrekt placering av skären tillåter entrapment av astrocyten suspensionen däremellan membranet och botten av brunnen. - När centrifugeras, noggrant avlägsna supernatanten från cellsuspensionen; återsuspendera pelleten astrocyten i 1 mL av ABM + av försiktigt omblandning pelleten på tuben's wall upp till 5 x. Undvik överdriven pipettering av cellerna för att begränsa belastningen på cellerna. Räkna cellerna och justera cell uppskov densiteten till 1,5 x 105 celler i 400 µL ABM / infoga.
- Placera cellsuspensionen i mitten av hjärnan-sidan av insatsen's membran (figur 1B) och, mycket noggrant, Sprid den med kapillär kraft med en steril Pipettera spets. Undvik direktkontakt som membranet är särskilt ömtåliga.
- Med hjärnan sidan av skären fortfarande upp, placera 6-väl plattan tillbaka på skären. Detta säkerställer att cellsuspensionen är instängd mellan membranet och den faktiska botten av brunnen (figur 1 c). Undvik luftbubblor i cellsuspension, eftersom det kommer att förhindra homogen spridning av astrocyterna på membranet.
- Placera plattan och skär, med hjärnan sida upp, i inkubatorn (vid 37 °C med 5% CO2) att tillåta celladhesion för minst 2 h (murina förevigade astrocyter) och upp till 6 h (människans primära astrocyter).
Obs: Skären underhålls uppochner, är visualisering av celladhesion inte möjligt under ett Mikroskop. Det rekommenderas därför att utsäde ett separat regelbunden cell kultur fartyg och kontrollera celladhesion i kärlet över tid. Försiktig manipulation av membranet är ett måste eftersom resultaten kommer att vara opålitliga när membran är skadade. - I slutet av inkubationstiden, kontrollera frånvaro av cell suspension läckor utanför området sådd och kassera skären om de är läckande. Återgå 6-väl plattan till sin ordinarie position, med skär som nu kommer att ha den blod sidan uppåt (figur 1A). Tillsätt 2,6 mL ABM + till varje brunn. Häll 2,5 mL komplett astrocyten medium i varje insats och placera plattan i inkubatorn (vid 37 °C med 5% CO2).
- Beredning av endotelceller
Obs: För murina hjärnan mikrovaskulära endotelceller (bEND3), måste cellerna nå 100% sammanflödet för att säkerställa maximal cell-cell kontakter utlöser den optimala åtsittande föreningspunkt proteinuttryck på dagen för experimentet. Detta gäller inte för mänskliga navel ven endotelceller (HuAR2T) som förekomsten av astrocyter krävs för ett åtsittande föreningspunkt proteinuttryck för dessa celler.- Fortsätt som tidigare beskrivits för astrocyterna (steg 1.1.1 och 1.1.2.). När centrifugeras, noggrant avlägsna supernatanten; återsuspendera pelleten endotelceller i 1 mL odlingsmedium för komplett endotelceller (EBM +) av långsamt pipettering cellsuspension på tuben's vägg upp till 5 x. Undvik överdriven pipettering av cellerna för att begränsa belastningen på cellerna. Räkna cellerna och justera cell uppskov densiteten till 2 x 105 celler i 2,5 mL/infoga av endothelial cellodlingsmedium saknar serum (EBM-) och vaskulär endotelial tillväxtfaktor-A (VEGF-A).
- Ta ut plåten som innehåller skären, noggrant kassera mediet från blod sida och ersätta det med 2,5 mL av suspensionen endotelceller. Tillbaka plattan till inkubatorn (vid 37 °C med 5% CO2) och lämna den över natten för endotelceller att följa membranet.
- Nästa dag, förbereda en steril 6-well platta genom att överföra 3 mL av förvärmd serumfritt astrocyten medium (ABM-) till varje brunn. Genom att hantera skären med steril pincett, noggrant kassera det endothelial komplett mediet från blod sida, placera insatsen i nya plattan som innehåller ABM- och tillsätt 2,5 mL EBM-.
Obs: Användningen av EBM - är kritisk för etableringen av endotel barriären (Vänligen se diskussionsavsnittet). - Lämna skären i inkubatorn (vid 37 °C med 5% CO2) med minimal fysisk störning och temperaturvariationer för 5 dagar, vilket gör att produktionen av endothelial basalmembranet, astrocyt kontakter med endotelceller, och så småningom BBTB härma bildandet. Ersätta mediet på dagen för överföringen på gliom cellkulturer (se avsnitt 1.4).
- Mätning av BBTB härma permeabilitet (tillval)
- Passiv diffusion av den små molekylvikt fluorescerande färg natrium-fluorescein (Na-Fl) med tiden från blodet till hjärnan sida av skären kan beräkningen av permeabilitet värdena enligt följande formel:
Här dFvälär fluorescens värdet mäts i brunnen vid en viss tidpunkt minus cellvärdet odlingsmedium autofluorescens, dT är tid i sekunder, A är ytan av barriären i kvadratcentimeter och dFInfoga mäts värdet fluorescens i Infoga vid samma tidpunkt minus medium autofluorescens värde). - Samla 100 µL av medium från både blod och hjärna sidorna av den BBTB härma och överföra dem till en separat flatbottnad, svart 96 brunnar plåt för efterföljande fluorescens mätningar. Använda vanligt media som tomrummet för att korrigera autofluorescens.
- Förbereda 2,5 mL per brunn Na-fl (50 µM) i EBM-. Prewarm Na-Fl lösningen till 37 ° C. Ersätta media från blod sida av skären med media som innehåller Na-Fl. starta en timer så snart mediet byts ut.
- Samla omsorgsfullt 100 µL av media från både blod och hjärna sida av skären på 5, 30, 60 och 120 min. överför varje prov till separata brunnar i den svarta plattan med 96 brunnar.
- Därför Ersätt insamlade media från skären att upprätthålla volymbalansen mellan båda sidor. Placera skär tillbaka i inkubatorn mellan varje provsamling minimera temperaturvariationer.
- Kvantifiera fluorescensen från de insamlade proverna, med en Plattläsare med filtret på 480/560 nm (excitation och utsläpp, respektive).
Obs: Fluorescens från hjärnan sida är nästan omöjlig att upptäcka de 5 min tidpunkt. Höga värden jämfört med tomrummet tyder på en läcka av / skador till infoga's membran eller barriären; Därför utesluta dessa från ytterligare analyser. Förväntade Na-Fl permeabilitet värden för BBTB bör i den 10-5 till 10-6 cm/s utbud (tabell 1).
- Passiv diffusion av den små molekylvikt fluorescerande färg natrium-fluorescein (Na-Fl) med tiden från blodet till hjärnan sida av skären kan beräkningen av permeabilitet värdena enligt följande formel:
- Beredning av glioma celler
Obs: Även om patientderiverade glioblastoma kulor används här, kan följande protokoll lätt anpassas för vidhäftande, kommersiellt tillgängliga glioblastoma celler såsom U - 87 MG.- Alternativt för immunofluorescens imaging, placera upp till fyra runda sterila Borsilikat coverslips (ø 0,9 cm) per brunn i en 6-well platta innehållande 2 mL av poly-D-lysin (0,01%). Odla i rumstemperatur i 30 min.
- Under tiden noggrant överföra sfärernas tumör från cell kultur fartyget till en 15 mL sterilt rör med hjälp av en steril serologiska Pipettera. Centrifugera sfärernas tumör för 3 min på 250 rcf.
- Kassera supernatanten, försiktigt Återsuspendera kulorna i 1 mL av bFGF/EGF-free (GBM) glioma cell medelstora och räkna cellerna. Justera cell densiteten ca 104 klot/ml (105 celler/mL) hos GBM-.
- Kassera den poly-D-lysin från brunnarna och skölj dem 3 x med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Utsäde plattan med 3 mL/väl av tumör sfäroid upphängning och skären med den BBB härma på tumör cellsuspension.
- Inkubera över natten (vid 37 °C med 5% CO2) till att jämvikt mellan blodet och hjärnan tumören sidor av analysen. Nästa dag, ersätta media i blod sida med EBM-kompletteras med de molekyler/droger/nanopartiklarna av intresse. Prover samlas in över tid för direkt kvantifiering som beskrivs i föregående avsnitt. Celler är fasta vid en exakt tidpunkt för fluorescens imaging (se avsnitt 2.1 och 2.2).
2. högupplöst Confocal avbildning av BBTB
Obs: 4% paraformaldehyd (PFA, pH 7,4, 6 mL per BBTB replikat) är alltid beredda färska i PBS. Håll det på is.
Varning: PFA är cancerframkallande. Använda nitrilhandskar att hantera PFA och förbereda lösningen under kemiska spiskåpa.
-
BBTB endothelial uttrycket av åtsittande föreningspunkt proteiner
- Skölj båda sidor av membranet med iskall PBS (3 x 5 min, 2,5 mL/Infoga, 3 mL/väl). Kassera PBS och tillsätt 3 mL och 2,5 mL iskallt 4% PFA i brunnen och i skäret, respektive. Inkubera på is för 10 min. Kassera PFA (beroende på institutionen som's farliga kemiska förfogande) och skölj 3 x med PBS på RT (2,5 mL/Infoga, 3 mL per brunn).
Obs: När fasta kan prover lagras i PBS (2,5 mL/Infoga, 3 mL per brunn) vid 4 °C i en vecka. - Använda en bomullspinne för att torka den hjärna sidan av Infoga och ta bort astrocyterna. Med en vass skalpell skär försiktigt membranet i fyra lika bitar genom att göra två vinkelräta snitt, bildar ett kors. Därefter sätter skalpell vid den punkt där membranet fästs infoga väggen och rotera insatsen med den andra handen för att befria de fyra proverna. Använda fin pincett, noga att överföra varje prov till en 24-well platta innehållande 200 µL av PBS per brunn, med blodet upp i varje brunn.
- Blockera membran med 10% fetalt bovint serum i PBS (för 30 min på RT, 200 µL per brunn). Bereda 1° antikropp lösning för immunfärgning av trånga korsningen proteiner (figur 1 d) (zonula occludens-1, claudin-5; se Tabell för material) i 200 µL blockerande lösning per brunn. Alternativt, verifieras endotelceller identitet genom att lägga till en antikropp som höjs mot trombocyter endotelceller vidhäftning molekylen (PECAM1 eller CD31; hänvisas till Tabell för material) till varje åtsittande föreningspunkt antikropp lösning. Kassera den blockerande lösningen och inkubera med de primära antikropparna' O/N vid 4 °C.
- Nästa dag, kasta de primära antikropparna och skölj dem med 200 µL av PBS (3 x 5 min på RT). Inkubera dem med lämpliga artspecifika fluorophore-konjugerad sekundära antikroppar (1: 500 utspädning, 200 µL per brunn, utspädd i blockerande lösning; hänvisas till Tabell för material) för 2 h på RT.
- Kassera de sekundära antikropparna, skölj med 200 µL PBS (3 x 5 min på RT). Ta bort PBS och counterstain cellkärnorna med hjälp av en 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) lösning med en slutlig koncentration på 1 µg/mL i rent destillerat H2O (dH2O; 200 µL per brunn, hänvisas till tabell för material ). Inkubera i 7 min på RT. ta bort DAPI och tvätta membranen 3 x med dH2O (200 µL per brunn).
- Placera en droppe av monteringsmedium (se Tabell för material) på ett glas objektglas. Använd fina pincett, noggrant ta membranet ur brunnen och att hålla orienteringen, ta bort överskottet av dH2O och placera den på släpp av monteringsmedium. Lägg till en annan droppe monteringsmedium ovanpå membranet och noggrant täcka den med en cover borosilikatglas. Se till att det inte finns några anhållna luftbubblor. Lagra proverna vid 4 °C och bort från ljuset tills konfokalmikroskopi observationer.
Obs: Astrocyten färgning kan utföras genom att placera bitar av membranen i 24-väl plattan med den hjärna sidan uppåt och med användning av valda astrocyten-specifika antikroppar (t ex riktat mot glial fibrillary syra proteinet [Fredsgenomförande]) (figur 1E ).
- Skölj båda sidor av membranet med iskall PBS (3 x 5 min, 2,5 mL/Infoga, 3 mL/väl). Kassera PBS och tillsätt 3 mL och 2,5 mL iskallt 4% PFA i brunnen och i skäret, respektive. Inkubera på is för 10 min. Kassera PFA (beroende på institutionen som's farliga kemiska förfogande) och skölj 3 x med PBS på RT (2,5 mL/Infoga, 3 mL per brunn).
-
BBTB fluorescens färgning för att upptäcka nanopartiklar transcytos
- Utföra live-cell Lysosomen märkning (t.ex. med hjälp av fluorescerande sonder [se Tabell för material]). Späd den Lysosomen fluorescerande färgämnen med en arbetande koncentration på 50 nM i förvärmd EBM - (2,5 mL/infoga) eller 75 mm i förvärmd ABM - (3 mL per brunn) för Lysosomen märkning av endotelceller och astrocyter, respektive. Inkubera cellerna för 45 min (vid 37 °C med 5% CO2); skölj sedan, 3 x med iskall PBS (2,5 mL/Infoga, 3 mL per brunn).
- Kassera PBS och tillsätt 3 mL och 2,5 mL iskallt 4% PFA att brunnen och skäret, respektive. Inkubera dem på is för 10 min. Kassera PFA och skölj cellerna 3 x med PBS (på RT, 2,5 mL/Infoga, 3 mL per brunn).
Obs: När fasta, kan proverna lagras i PBS (2,5 mL/Infoga, 3 mL per brunn) vid 4 ° C i en vecka. - Ta bort PBS och counterstain cellkärnorna med en DAPI lösning med en slutlig koncentration på 1 µg/mL i dH2O (1 mL/Infoga, 1 mL per brunn). Inkubera dem i 7 min på RT. ta bort DAPI och tvätta membranen 3 x med dH2O (2,5 mL/Infoga, 3 mL per brunn).
- Noggrant skära membranet, ta bort överskottet av dH2O och placera den på en droppe monteringsmedium (se Tabell för material) på ett glas objektglas. Lägga till en annan droppe monteringsmedium på andra sidan av membranet och noggrant täcka den med en cover borosilikatglas. Undvika anhållna luftbubblor. Lagra proverna vid 4 °C och hålla dem skyddas från ljus tills konfokalmikroskopi imaging.
-
Fluorescens färgning av tumörceller
- Använda fin pincett, noga att överföra den runda coverslips innehållande sfärernas tumör på en 24-väl tallrik fylld med iskall PBS. Fortsätt med live-cell Lysosomen märkning använder fluorescerande Lysosomen sonder på 75 nM i förvärmd GBM - (200 µL per brunn). Inkubera proverna för 45 min; skölj dem sedan, 3 x med iskall PBS (200 µL per brunn).
- Kassera PBS och tillsätt 200 µL av iskall PFA per brunn. Inkubera på is för 10 min. Kassera PFA och skölj proverna 3 x med PBS (på RT).
Obs: När fasta, proverna kan lagras i PBS (200 µL) vid 4 ° C i en vecka. - Ta bort PBS och counterstain cellkärnorna med en DAPI lösning med en slutlig koncentration på 1 µg/mL i dH2O (200 µL per brunn). Inkubera dem i 7 min på RT. ta bort DAPI och tvätta coverslips 3 x med dH2O (200 µL per brunn).
- Med fin pincett, ta ut täckglaset, ta bort överskottet av dH2O och placera den på en droppe monteringsmedium (se Tabell för material) på ett glas objektglas. Undvika fångade några luftbubblor. Lagra proverna vid 4 °C och hålla dem skyddas från ljus tills konfokalmikroskopi observationer.
3. in Vivo jämförande studie
- In situ inspelning av natrium-fluorescein diffusion genom BBB
- Förbereda 150 µL av en 50 nM Na-Fl lösning i en fysiologisk lösning. Förvara lösningen vid 37 °C vid intravenös leverans.
- Söva en mus med en intraperitoneal injektion av en Ketamin/xylazin cocktail (300 µL av 100 mg/kg Ketamin och 10 mg/kg xylazin i PBS). När djup anestesi är etablerad, placera djuret på en värmedyna till upprätthålla dess kroppstemperatur.
Obs: Tio veckor gamla kvinnliga Naval Medical Research Institute (NMRI) naken immunsupprimerade möss har använts för att erhålla de uppgifter som presenteras i figur 2. Detta protokoll är dock anpassad till både immunkompetenta och immunsupprimerade möss. Anestesi/analgesi metoden är på vetenskapsmannen'gottfinnande. Inandning anestesi såsom isofluran rekommenderas dock inte eftersom det avsevärt ökar BBB permeabilitet18. - Placera musen på en stereotaxic ram (se Tabell av material) och utföra ett längsgående snitt i hårbotten med fina sax, följt av mild dilacerations i bindväv, med fin pincett, som avslöjar skallen. Med cirkulära rörelser med en fin microdrill, ta bort en ø 0,3 mm cirkulär bit av skallen från vänster eller höger parietala ben. Fortsätt med försiktighet under borrningen och samtidigt avlägsna skalle pussla för att undvika skada på underliggande meningeal vävnad och blodkärl.
- Placera en droppe fysiologisk lösning på den exponerade vävnaden. Använda två par fina pincett, ta försiktigt bort meningeal vävnaden för att komma åt hjärncortexen. Hjärnvävnaden bör aldrig vara i direkt kontakt med luft.
Obs: Mindre blödningar från meningeal skada kan stoppas med hjälp av hematologiska svampar (se Tabell för material). - När den meningeal vävnaden tas bort och cortex är helt exponerad, snärja en droppe fysiologisk lösning mellan cortex och ett ø 0,5 mm Borsilikat täckglas. Säkra observationen området med en droppe cyanoakrylat lim (se Tabell för material) sprids runt täckglaset med en nål. Låt limmet torka i 1 min.
- Förbereda implanterbara katetern för svans ven injektion (figur 2A). Bryta en 25 G nålspetsen med Rochester-Ochsner pincetten och för in i en 10 cm lång PE20 polyuretan slang (se Tabell för material) (figur 2A).
- Infoga katetern i laterala svans ven av musen, med bulldog klämmor för katetern manipulation och införande (se Tabell för material) (figur 2B). Säkra insatta nålen med en droppe cyanoakrylat lim. Låt limmet torka i 20 s innan du tar bort bulldog klämman. Noggrant Anslut den andra änden av katetern till en 25 G nål ansluten till en spruta innehållande Na-Fl lösningen (figur 2B).
- Obs: Inte klämma svansen med bulldog klämman; Det används endast för exakt katetern hantering. Ordentlig katetrar kan bekräftas genom blod reflux i transparent slangen.
- Placera djuret under stereomikroskopet (se Tabell för material). Med hjälp av lågaktivt autofluorescens i den gröna kanalen (480 nm), fokusera på en region som innehåller relativt stora blodkärl (de visas mörkare på grund av hemoglobin absorptionen av ljus på denna våglängd) och mindre kapillärer (figur 2 c). Starta time-lapse förvärvet kort innan du injicerar den fluorescerande färgämnen för att få en mätning av bakgrunden fluorescensen.
Obs: Alternativt time-lapse inspelningen kan ersättas av ögonblicksbild bilder från T0 och från andra förutbestämda tidpunkter. - Injicera lösningen i en långsam och kontinuerlig takt, eller alternativt använda en automatiserade infusionssystem. Na-Fl fluorescensen upptäcks i blodet bör förbli stabila (halveringstid i blodet: 286 min), vilket möjliggör en inspelning av BBB diffusion genom fönstret kraniala flera minuter. När förvärvet är klar, försiktigt bort katetern och avliva djuret av cervikal Dislokation.
- In vivo bestämning av BBB permeabilitet
Obs: Värden erhålls från någon bildbehandling programvara, såsom ImageJ, möjliggör mätning av signal fluorescensintensiteten inuti en anpassad region av intresse (ROI).- Använd verktyget annotering, rita en rektangel-formade ROI utanför ett blodkärl, i hjärnvävnaden, på runt 5 µm avstånd från alla synliga blodkärl fylld med Na-Fl. Obs måtten på ROI och uppmätta fluorescensintensiteten på T0 i att ROI, som används som tomt för vävnaden's autofluorescens. Utan undantränger ROI, snabbspola framåt i en postinjection tid punkt (t.ex. till den allra sista inspelade bildrutan när hela lösningen har injicerats till djur) och notera de exakta tid och fluorescens mätvärdena inom ROI (figur 2 c).
- Flytta ROI på ett synliga blodkärl (figur 2 c) och notera T0 autofluorescens värdet från blodet. Utan undantränger ROI, snabbspola framåt till den samma tidpunkten som definieras i steg 3.2.1. och notera värdet fluorescens mätt inom ROI (figur 2 c).
- Använd följande formel (anpassad från avsnitt 1.3) att fastställa BBB permeabilitet:
- Här dFhjärnan är fluorescens intensitetsvärdet minus T0 tomt värde i hjärnan, dT är tidpunkten för förvärvet i sekunder, A är ungefärliga fartyget yta, som området ROI i kvadratcentimeter och dF blod är fluorescens intensitetsvärdet minus T0 tomt värde i blod.
Obs: Beräknade permeabilitet värden för BBB bör vara i intervallet 10-6 cm/s (tabell 1).
- Vävnad som behandling för detektion av fluorescerande nanopartiklar i murina hjärnan
- Implantatet patientderiverade glioblastoma sfärer (5 x 104 celler i 5 µL sterilt PBS) hos sövda 6-vecka-gammal kvinnlig NMRI naken möss i corpus callosum. Leta upp hjärnregionen på följande stereotaxic koordinater, start från Bregma: anteroposterior + 0,5 mm, vänster till höger + 2,5 mm, dorsoventral + 3 mm. Låt hjärnan tumören att växa för 2 veckor.
- Injicera nanopartiklar intravenöst (100 µg i 100 µL av steril fysiologisk lösning) och tillåta dem att cirkulera för 8 h. injicera kontroll möss intravenöst med 100 µL av steril fysiologisk lösning.
- Euthanize möss av cervikal Dislokation och samla hjärnor snabbt för snapin-frysning i isopentan underhålls på torris (1 min vid-50 °C). Lagra hjärnor vid-80 °C tills vävnad behandling.
- Skär koronalt hjärnan sektioner med en cryomicrotome. Leta upp intrakraniell implantation av ärret det bildas på cortex och skär 9 µm tjocka delar från det området på de lämpliga objektglas (se Tabell för material).
- Fördjupa hjärnan avsnitten som är orörlig på bilder i iskall PBS (2 x 5 min) och, sedan fixa dem i iskallt 4% PFA (för 5 min). Tvätta bilderna i PBS (3 x 5 min på RT). Placera glasen horisontellt och Pipettera det blockerande lösning innehållande 10% fetalt bovint serumet i PBS på vävnad sektioner som täcker hela ytan (för 1 h på RT, 500 µL/bild). Förbereda CD31 antikroppen (se Tabell för material) i 250 µL blockerande lösning/bild. Ersätta den blockerande lösningen med antikroppen och inkubera över natten vid 4 °C i en fuktig kammare.
- Nästa dag, doppa glasen i PBS (3 x 5 min på RT) och inkubera dem med den motsvarande fluorophore-konjugerad sekundär antikroppen (1: 500 i 250 µL av PBS för 2 h på RT). Skölj 3 x i PBS (på RT) och counterstain cellkärnorna med en DAPI lösning med en slutlig koncentration på 1 µg/mL i dH2O (250 µL/bild). Inkubera proverna för 7 min på RT. ta bort DAPI lösningen och tvätta bilderna 3 x med dH2O.
- Lägg till en droppe monteringsmedium på varje vävnad avsnitt (se Tabell av material) och säkra av prov med ett täckglas. Undvika fångade luftbubblor. Lagra proverna vid 4 °C och hålla dem skyddas från ljus tills konfokalmikroskopi observationer.
Representative Results
Confocal avbildning av den murina BBTB härma visar uttryck och cellulär lokalisering av åtsittande föreningspunkt proteiner zonula occludens-1 (ZO-1) och claudin-5 i bEND3. Kontakter mellan endotelceller och astrocyter inducerad tydligt omlokalisering av ZO-1 och claudin-5 till cell-endotelceller kontakter jämfört med de bEND3 monokulturer (figur 1 d). Med hjälp av immunofluorescens färgning för att visualisera de Fredsgenomförande-uttryckande astrocyterna på hjärnan-sidan av membranet, är det möjligt att observera och studera de astrocytic processer och slutet-fötter att kontakta endotelceller genom membranet (figur 1E ). Astrocyten-endotelceller kontakterna är kända för att främja och stabilisera åtstramning av den cellulära barriären och är associerade med lägre permeabilitet värden av BBB19. I enlighet med det, vi observerat en betydande minskning genomträngligheten av mus BBTB härma för Na-Fl från 27,63 (± 3,45) x 10-6 cm/s vid monokulturer till 6,74 (± 3.01) x 10-6 cm/s när co odlade med den hypoxi-inducerbara faktor knock-out (HIFko) astrocyter (tabell 1). Den förevigade HuAR2T bildar högpermeabel cellulära hinder (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, tabell 1). Liknar murina modellen, vi mätte betydligt lägre permeabilitet av BBTB till Na-Fl, nämligen (± 14,32) 47,4 x 10-6 cm/s, när de HuAR2T cellerna var samtidig odlade med människans primära astrocyterna (tabell 1).
I såväl mänskliga som murina BBTB härmar inducerade förekomsten av sfärernas patientderiverade glioblastoma en liten ökning i permeabilitet värden jämfört med de endothelial cellen-astrocyten samtidig kulturerna ensam (tabell 1). Detta fenomen kan iakttas med flera men inte alla av de tålmodiga gliom sfär modeller. Detta kan bero på den VEGF-A som utsöndras av några av dessa patientderiverade celler.
För att jämföra permeabilitet värdena för de in vitro-BBTB härmar med Invivo BBB, avbildade vi realtid diffusionen av Na-Fl genom ett kraniala fönster som implanteras i nakna möss. Använder ett fluorescens-stereomikroskop, spelades Na-Fl diffusion från blodkärl kapillärerna som härrör från huvudsakliga pial blodkärlen före, under och efter systemisk injektion av sonden (figur 2 c). Mätningar av differentiell fluorescens värdena från cirkulerande blod och hjärna kortikala parenkymet över tiden tillät oss att beräkna ungefärlig permeabilitet värden för naken musen's BBB för Na-Fl (5.57 ± 2,19 x 10-6 cm/s, Tabell 1).
För att illustrera hur denna BBTB härma kan användas för visualisering av passagen av föreningar från blod sida till hjärnan sida, jämförde vi transcytos ø 110 nm (NP110) och ø 350 nm (NP350) nanopartiklar inriktning patientderiverade glioblastoma sfärer. Resultat erhållna in vitro jämfördes sedan med de Invivo transcytos. I exemplet presenteras nanopartiklar var bestrukna med tumör-targeting peptiden CooP20 och laddad med den fluorescerande färgämnen (FITC) att underlätta visualiseringen. Vi märkt cellerna använder lysosomala färgämnet och counterstained med DAPI 24 h efter tillägg av de FITC nanopartiklarna på blod-sidan av BBTB härma och förvärvade confocal micrographs på olika nivåer (t.ex. blod sidan, membranet, hjärnan sidan, och patientens glioblastoma kulorna) (figur 3A). NP110-associerade fluorescerande signalen colocalized med lysosomerna i endotelceller, astrocyter och tumörceller. Dessutom NP110s var upptäckta däremellan den endothelial celler och astrocyter, passerar genom membranet porerna i skäret (figur 3A).
Passage av NP110s kvantifierades genom att mäta fluorescensen från prover som tagits från både blod och hjärna sida. Dessa permeabilitet värden jämfördes med dem som fastställts för nanopartiklarna av ø 350 nm (NP350). Resultaten visar att endast NP110 skulle kunna passera de BBTB härmar (figur 3B). NP350 förblev på blod-sidan av den BBTB härma, vilket resulterade i lägre permeabilitet värden för dessa nanopartiklar.
För att belysa betydelsen av de BBTB härmar jämfört med i vivo modeller, injicerades naken möss intravenöst med NP110 eller NP350 nanopartiklar belagda med tumör-targeting peptiden CooP och konjugerat med röd fluorescerande färgämne (TRITC) för detektion. Vävnader som samlats in vid flera tidpunkter avslöjade att efter 8 h, BBB-permeable nanopartiklar har extravasering i hjärnparenkymet, medan de nonpermeable de som bott i cirkulationen rensades främst från den systemiska cirkulationen Invivo. Därför vi samlade in hjärnor och kvantifieras antalet nanopartiklar per kvadrera millimetern 8 h postinjection. I enlighet med den in vitro-fynd, NP110, men inte NP350, framgångsrikt extravasering i hjärnparenkymet (figur 3 c). Hög förstoring avbildning av nanopartiklar platsen i hjärnan visade att NP110 var homogent fördelade i hjärnparenkymet utanför blod kapillärerna och framgångsrikt homed på implanterade glioblastoma celler (figur 3D). Trots uppvisar samma tumören inriktning biexponentiellt (CooP), NP350 kunde extravasate in i hjärnparenkymet och upptäcktes endast inom den luminala sidan av hjärnan blodkärl (figur 3E), liknar de uppnådda resultaten in vitro-.
Figur 1: Beskrivning av modellen, blod-hjärn tumör-barriär (BBTB). (A) Schematisk bild av platser av olika celltyper. (B) Illustration av Infoga placeringen på 6-well plate omslaget och sådd teknik för astrocyterna på hjärnan sida av insatsen's membran. (C) Illustration av 6-well plate placeringen möjliggör astrocyten vidhäftningen. (D) immunofluorescens micrographs av åtsittande föreningspunkt proteiner zonula occludens-1 (ZO-1, övre raden, röda) och claudin-5 (nedre raden, grön). Proteinuttryck jämfört med murin hjärnan mikrovaskulära endotelceller (bEND3) odlade på blod sida av BBTB ensam som en monokultur (vänster kolumn) eller med murin förevigade HIFko astrocyter (högra kolumnen). Cellkärnan är counterstained med DAPI (blå). (E) immunofluorescens mikrograf visar glial fibrillary sura proteinet (Fredsgenomförande, röd) i HIFko astrocyter odlade på hjärnan sidan av BBTB. Hög förstoring bilden visar astrocyten processer och slutet-fötter (pilar) att kontakta endotelceller genom membranet porer (höger panel). HIFko astrocyterna identitet har verifierats med immunofluorescens färgning av simian virus 40 stora T antigenet (SV40 stora T, grön) används för immortalization av cellerna. Endotelceller uttrycker Fredsgenomförande varken SV40 stora T och därför delvis kan observeras genom den genomskinliga, motsatta sidan av membranet som endast DAPI-färgade celler (streckade linjer). Cellkärnan är counterstained med DAPI (blå). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Intravital levande bestämning av musen BBB permeabilitet. (A) beredning av implanterbara kaudala ven katetern. (1) verktyg och utrustning är följande: (en) en PE20 polyeten rör (b) två 25 G nålar (c), Rochester-Ochsner pincett, och (d), en liten bulldog klämman. (2) en 25 G nål avlägsnas genom flera torsions med hjälp av pincetten och (3) noga insatt i röret. (4), den andra sidan av röret är ansluten till en annan 25 G nål. (B) vägledning för katetern implantation och positionering för att ingjuta natrium-fluorescein lösningen genom svansen av en mus. Inringade området anger området där en droppe cyanoakrylat lim är placerad för att säkra katetern. Bulldog klämman används för att hantera katetern och tas bort när katetern är säkrad. (C) representativa avbildning och kvantifiering metod att bestämma natrium-fluorescein permeabilitet värdena. Före den natrium-fluorescein infusionen (vänster kolumn) mäts autofluorescens/tomma inom en region av intresse (ROI) placeras på hjärnan (övre panelen, vit rektangel) och blodkärl områden (nedre panelen, röd rektangel). Under natrium-fluorescein infusionen (högra kolumnen) mäts fluorescensintensiteten i båda ROIs, möjliggör beräkning av BBB permeabilitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Prediktion av den intracerebral transcytos av nanopartiklar via BBB Invivo med hjälp av in vitro-BBTB-modellen. (A) grafisk representation av BBTB analysen med representativa confocal bilder tagna på de angivna olika nivåerna av murina BBTB modellen. Nanopartiklar av 110 nm i diameter (NP110) och konjugerad till FITC (grön) lades till blodet sida av BBTB celler har märkts med den lysosomala sonden (LT-99, röd). (1), Endothelial celler, (2), Endothelial transcytos av nanopartiklarna genom porerna i membranet (vit streckad linje), (3) astrocyter, och (4) patientens glioblastoma kulorna på bilden är identifierade och motsvarande confocal micrographs (höger). Lysosomala inkapsling av nanopartiklarna (pilar) föreslår aktiva transcytos genom de endothelial och astrocyten lager av BBTB. (B) kvantifiering av angivna nanopartiklar permeabilitet genom den in vitro-BBTB (n = 6). (C) kvantifiering indikerade nanopartiklar densitet i hjärnvävnaden avsnitt, 8 h efter den kaudala ven infusionen av naken möss (n = 3). (D) Confocal micrographs visar fördelningen av ø 110 nm nanopartiklar (NP110, röd) i murina hjärnan vävnadssnitt märkt med en CD31 antimus-antikropp (grön). På pilen belyser de nanopartiklar transcytos (till vänster). Nanopartiklar ackumuleras runt hjärnans tumörceller (tumör, högra panelen) på grund av CooP-targeting peptiden presenterade på deras yta. Inga betydande homing observeras i hjärnvävnad (hjärnan). (E) Confocal micrographs visar fördelningen av ø 350 nm nanopartiklar (NP350, röd) i murina hjärnan vävnadssnitt märkt med en CD31 antimus-antikropp (grön). Pilspetsar pekar på den NP350s som behölls i blodkärl lumen och inte kunde passera BBB, förmodligen på grund av deras större diameter jämfört med de NP110s. cellkärnorna är counterstained med DAPI (blå). P < 0,01. P-värdena beräknades med en tvåsidiga, icke-parametriska Mann-Whitney U test. Felstaplar representera standardavvikelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| murina BBTB härma | bEND3 | bEND3 + HIFko som | bEND3 + GB | bEND3 + HIFko som + GB | In vivo |
| Permeabilitet (10-6 cm/s) | 27,63 | 6,74 | 26,8 | 10,83 | 5,57 |
| SD (10-6 cm/s) | 3,45 | 3.01 | 7,99 | 2,65 | 2.19 |
| mänskliga BBTB härma | HuAR2T | HuAR2T + hIAs | HuAR2T + GB | HuAR2T + hIAs + GB | |
| Permeabilitet (10-6 cm/s) | 104.92 | 47,4 | 89.08 | 48.24 | |
| SD (10-6 cm/s) | 27,1 | 14,32 | 10,21 | 13.07 |
Tabell 1: värderingar av natrium-fluorescein (Na-Fl) permeabilitet (i centimeter per sekund) bestäms in vitro- i de angivna co kultur system och in vivo i NMRI naken möss. Data från ett representativt experiment (n = 3 möss).
Discussion
Ökningen av begreppet interindividuella tumör variabilitet föryngrad forskning om personlig cancer medicin21. Denna variation är också ett signum för centrala nervsystemet tumörer. På grund av oförutsägbarhet av tumören, svar på kemoterapi läggs till den skyddande effekten av BBB för drogen leverans och alldeles utgör stora utmaningar i patientvården22. För att utveckla effektivare terapier, är det ofta nödvändigt att skärmen stora bibliotek med nya molekyler. Utvärdera antitumöreffekt effekt och förmåga av nya terapeutiska leder att nå webbplatsen tumören, är det bästa alternativet den preklinisk studien om patientderiverade cellerna implanteras i vivo i murina patienten avatarer. På grund av praktiska (finansiella, tid, mänskliga och anläggning resurser) och etiska skäl (3R-principen när du använder försöksdjur), är utvecklingen av sådan storskalig Invivo undersökning plattform ofta inte möjligt, och därför de cellbaserade analyserna förbli en modell av val23. Rektor resonerar för att välja etablerade cellinjer och undvika primära celler är att underlätta reproducerbarhet och minska användningen av försöksdjur, som är den huvudsakliga källan för isolering och inrättandet av primära murina kulturer. De metoder som presenterar här, kunde fast uppfyller 3R, effektivt kassera nanopartiklar från en ytterligare prekliniska undersökningar på kriteriet av deras oförmåga att korsa modellen BBTB. Som ett proof-of-principle beskriver vi här resultat som erhållits under utveckling och validering av BBTB. Vi har kunnat bekräfta in vitro-fynd in vivo exempelvis vid mätning av en 376 Da natrium-fluorescein passiv diffusion.
Protokollet beskrivs i detta dokument beskrivs utarbetandet av endothelial celler cocultured med astrocyterna bildar en blod-hjärn tumör-barriär-liknande gränssnitt i en in vitro-setup. När en fysisk kontakt mellan dessa två celltyper är etablerad, uppvisar endotelceller lagret likheter med BBB (t.ex. en cell surface uttryck av åtsittande föreningspunkt proteiner och relativt låg permeabilitet). Intressant, tycktes den murina BBTB härma ge särskilt liknande Na-Fl permeabilitet värden som erhålls med Invivo musen BBB permeabilitet mätningar24. Därför länkas prestandan hos de BBTB härmar direkt till valet av de celler som används för att bilda barriären. De bEND3 endothelial cellerna härstammar från hjärnan och är kända för att vara framgångsrik i att bilda hinder när cocultured med astrocyter25. Vi har dock använt den förevigade HIFko astrocyter26 för att generera den BBTB härma. På grund av deras bristande hypoxi-inducerbara faktor, dessa astrocyter inte producerar VEGF-A, som är sinnebilden för den BBTB härma stabilisering beskrivs här. Astrocyterna har identifierats som modulatorer av BBB permeabilitet, till exempel genom frisättning av VEGF-A svar på neuroinflammation27. Aktivering av vaskulär endotelial tillväxtfaktor receptorer (VEGFRs) är en viktig regulator av endothelial/vaskulär permeabilitet både vitro28 och Invivo29. Därför aktivera VEGF-A tillskott i mediet den VEGFR2 på endotelceller, vilket inducerar fosforyleringen av adherens junction proteiner som VE-cadherin30. Förlusten av cell-endotelceller kontakter genererar mycket genomsläpplig blodkärl. På samma sätt orsaka både stark mitogena boende och okänd sammansättning av fostrets bovint serum används i cell kultur analyserna stora problem i barriär stabilisering och haltbestämning reproducerbarhet.
Mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) används ibland för att bilda BBB i vitro31. dock de avsevärt skiljer sig från hjärnan mikrovaskulära endotelceller, som cellen hCMEC/D3 linje32, när det gäller genuttryck och barriär-bilda boenden. Dock relativt högre permeabilitet värden som erhålls med HuAR2T celler odlas enbart jämfört med bEND3 minskade kraftigt med coculturing dem med mänskliga primära astrocyter. Även endotelceller krävs att bilda cellulära väggen, är det tydligt att astrocyterna har en lika viktig roll att spela för BBTB bildning och stabilisering.
När patientderiverade gliom sfärer lades till denna ekvation, redovisas mus BBTB härma några av funktionerna i murina xenograft, såsom narkotika diffusion genom den hjärnan vaskulatur och tumör cell inriktning. De BBTB härmar diskuteras här lyckades, exempelvis spegling i vivo beteendet när vi flera nanopartiklar med olika diametrar. För att illustrera parallellismen mellan in vitro- och in vivo modeller, vi använde de tidigare beskrivna mesoporous silikat nanopartiklar33 med cell-penetrerande egenskaper34 konjugerat till tumör-targeting peptiden CooP på deras surface20. CooP-targeting peptid hem till invasiv tumörceller genom den specifika bindningen till den mammary-derived tillväxt-hämmaren (MDGI). Flera cancerformer, inklusive gliom, överuttryck av MDGI jämfört med normal vävnad35, vilket gör CooP en mycket effektiv tumör-targeting biexponentiellt kan öka leveransen av en nyttolast20. De nanopartiklar används här har visats tidigare diffunderar in hjärnparenkymet (27547955), och när functionalized med Taxol, dessa nano-cargos har lyckats minska glioma tillväxt i prekliniska modeller36. Tillägg av polyetylenglykol (PEG) rester på ytan av nanopartiklarna underhålls också deras statisk laddning till positiva värden (runt + 4 mV), vilket gav bättre interaktion med de neurovaskulära enhet37 och även öka deras stabilitet i omlopp. I presenterade uppgifter, var 3 kDa av PEG konjugerat till NP110s, medan NP350s var belagda med 10 kDa av PEG. Dock resulterat ökade molekylvikt PEG också i en betydande ökning av nanopartiklar diameter, därav deras fysiska kapacitet att passera BBB. Därför, vi kollade om de fysiska dimensionerna av partiklarna hindras deras passage genom BBTB och huruvida dessa observationer kan avspeglas i vivo.
I enlighet med de tidigare publicerade synpunkter, vi konstaterade att NP110s extravasering genom både BBTB in vitro- och BBB möss med intrakraniell tumörer, medan NP350s behålls på luminala sida av den BBTB härma och i blodkärlen i den möss. Dessa liknande resultat tyder starkt på att den BBTB modellen förutspådde Invivo förmågan av nanopartiklar att passera BBB och når hjärnan.
Relevansen av cellulära modeller av BBB diskuteras ofta, även för den centrala leveransen av nanopartiklar38. Vi visar här att primära astrocyter och endotelceller, båda anses vara de mest relevanta in vitro-verktyg, kan ersättas av förevigade eller kommersiellt tillgängliga celler, att säkerställa större skalbarhet och reproducerbarhet. Nästa generation av de in vitro-BBB härmar skulle kunna utvecklas genom att införliva de mikroflödessystem enheter som låter vackert bildade neurovaskulära enheter som strukturellt liknar den faktiska BBB12,14. Sådana modeller är dock för närvarande olämpliga för high-throughput screening av molekyler som levereras till gliom, på grund av tekniska begränsningar i uppföljningen av leverans14. Det är verkligen svårt att fånga fysiologiska komplexiteten i BBB i en skål och möjliga bristen på vissa receptorer/proteiner, kända för att uttryckas med BBB, skulle kunna äventyra tolkningen av resultaten. Ett annat argument som rör den stora variabiliteten i genuttryck mellan in vivo och in vitro-villkor, samt från en cell linje till en annan, särskilt med tanke på endotelceller. Det kan emellertid också hävdas att neurovaskulära enheten inte är en enhetlig enhet inom den hjärna39. Vetenskaplig forskning i biologi har nått en human era där djurens välbefinnande, etiskt ansvar och kostnaden för att använda animaliskt liv anses alltid innan du utformar ett experiment. Därför, för att stödja utbyte av djur, ett ökande antal nyligen genomförda studier visar att medvetenheten om begränsningarna av modellerna och noggrant urval av de cellulära modellerna att upprätta barriären – med betoning på astrocyterna — garanterar en match mellan resultat som erhålls i en skål och i djur modeller40. Med den metod som beskrivs här, får vi ett steg närmare till att minska antalet försöksdjur som används vid screening av BBB transcytos för potentiella therapeutics.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av bidrag från de finska Cancer organisationer, Jane & Aatos Erkkos stiftelse, och Sigrid Juselius stiftelsen (till P.L. och V.L.J.), den schweiziska National Science Foundation (Advanced Postdoc.Mobility bevilja nr: P300PB_164732, s. K.), Orion forskningsstiftelsen (S.K.), Stiftelsen Maud Kuistilas Memorial (till S.K.) och Finlands Akademi (TERVA 2017, bevilja nr: 314 498). Biomedicum Imaging enheten (Helsingfors) är erkänt för att tillhandahålla microscopyen imaging core facilitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and - medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 mm x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25 G needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |
References
- Daneman, R., Prat, A.
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).
- Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound. Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review. World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).
- Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. Translational gap in ongoing clinical trials for glioma. Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier. Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Bang, S., et al. A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes. Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Pirsko, V., et al. An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3. Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Cao, Y., et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD. Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Kinnari, P. J., et al. Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy. Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).
- Levin, V. A.
- Weathers, S. S., Gilbert, M. R. Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview. Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).
- O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).
- Yang, S., et al. Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier. PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).
- Argaw, A. T., et al. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).
- Miao, Z., et al. VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).
- Claesson-Welsh, L.
- Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system. Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Paatero, I., et al. Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes. Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).
- Prabhakar, N., et al. Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery. International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).
- Hyvonen, M., et al. Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).
- Feng, X., et al. Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy. Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).
- Nance, E. A., et al. A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue. Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).
- Berg, C. Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models. Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).
- Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).
- Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).
