Summary
Stoffet målretting til sentralnervesystemet svulster er en stor utfordring. Her beskriver vi en protokoll for å produsere en i vitro etterligne av blod-hjerne svulst-barrieren bruke murine og/eller menneskelige celler og diskutere deres relevans for forutsigbarheten av sentralnervesystemet svulst målretting i vivo.
Abstract
Svært selektive av natur, blod - hjerne barrieren (BBB) er avgjørende for hjernen homeostase i fysiologiske forhold. Men i sammenheng med hjernesvulster beskytter molekylær selektivitet av BBB også neoplastic cellene ved å blokkere levering av perifert administrert chemotherapies. Utviklingen av romanen narkotika (inkludert nanopartikler) målretting ondartede hjernesvulster ideelt krever bruk av prekliniske dyremodeller stoffets transcytosis og antitumor effekt. For å overholde 3R prinsippet (avgrense, redusere og erstatte) for å redusere antall forsøksdyr i eksperimentelle oppsett og utføre høy gjennomstrømming screening av et stort bibliotek med antitumor midler, vi utviklet et reproduserbar i vitro menneske og murine etterligne av blod-hjerne svulst-barrieren (BBTB) bruker tre-lagdelt kulturer av endotelceller, astrocyttene og pasient-avledede glioblastom kuler. Høyere skalerbarhet og reproduserbarhet, har kommersielle linjer eller udødeliggjort celler blitt brukt i skreddersydd forhold at dannelsen av en barriere som ligner faktiske BBB. Her beskriver vi en protokoll for å få en BBTB etterligne av dyrking endotelceller i kontakt med astrocyttene på bestemt celle tettheter på innlegg. Denne BBTB etterligne kan for eksempel brukes for kvantifisering og AC confocal avbildning av hydrogenion passasjen gjennom endothelial og astrocytic barrierer, i tillegg til evalueringen av svulst celle målretting innenfor samme analysen. Videre viser vi at innhentet data kan brukes til å forutsi oppførselen til nanopartikler i preklinisk dyremodeller. I et bredere perspektiv, denne i vitro modellen kan tilpasses til andre nevrodegenerative sykdommer for fastsettelse av passering av nye terapeutiske molekyler gjennom BBB og/eller suppleres med hjernen organoids direkte evaluere effekten av narkotika.
Introduction
Nevrovaskulære enheten er sammensatt av neurons, astrocyttene og BBB, dannet av intrikate tilkoblinger mellom pericytes, astrocyttene, endotelceller og tilknyttede kjelleren membranen danner hjernen microvasculature1. Denne stramt mobilnettet veggen dannet av kontinuerlig, nonfenestrated fartøy fint regulerer bevegelsen av ioner og molekyler (inkludert hormoner, næringsstoffer eller narkotika), men også av sirkulerende celler1. De spesielt lave transcytosis gjennom BBB av høy-molekylvekt molekyler, som terapeutiske antistoffer, narkotika conjugates eller nanocompounds, begrenser dramatisk fremskritt i stoffet funnet for nevrologiske sykdommer, inkludert ondartet gliomas2. Faktisk, muntlig eller intravenøst levert chemotherapies nå hjernen parenchyma ofte på mangelfullt Lavinnblanding å indusere en antitumor effekt eller bare ikke krysse BBTB for å nå de neoplastic celler3. Flere prekliniske og kliniske studier har ikke behandlet spørsmålet om BBTB penetrasjon men har forsøkt å avbryte BBTB transiently, for eksempel ved å bruke fokusert ultrasounds4,5, eller omgå det ved direkte i situ levering av narkotika6. Men var ingen av disse teknikkene kunne motvirke uunngåelig svulst utvidelse eller tilbakefall. Derfor, når utvikle romanen antiglioma terapi, spredning gjennom BBTB anses som en av de viktige aspektene for vellykket levering av terapeutiske agenter7.
På grunn av svært komplekse natur celle interaksjoner i BBTB synes i vivo studier i forsøksdyr å være det opplagte valget når studere passering av molekyler fra blod til hjernen. Men høy-skala i vivo metoder er relativt komplisert å etablere og, derfor tillater ikke høy gjennomstrømming screening av molekyler i rimelig tid til en rimelig pris. Enda viktigere, må dyreforsøk følge 3R etiske retningslinjen definert som i) Forny ii) redusere og, av relevans til gjeldende kontekst, iii) erstatter av alternative protokoller (f.eks i vitro/i sili metoder). Derfor gjenskape BBTB i vitro vises som en interessant og attraktiv mulighet, men også utgjør en komplisert oppgave utfordret av ulike begrensninger. Mange forsøk på å gjenskape dette komplekse seksjon med kulturperler primære celler eller linjer fra hjørnetann, svin, murine, og selv menneskelige opprinnelse har blitt publisert (som vurderes av Rahman et al.8 og Helms et al.9). Disse modellene inkluderer tredimensjonale microfluidic systemer10, BBB-on-a-chip11,12, og mengder av varianter basert på den klassiske co kulturene i setter systemer. Likevel, gjeldende microfluidic og chip-systemer er ikke egnet for rask, høy gjennomstrømming narkotika-validering studier13,14 eller er ikke kompatibelt med studier av narkotika-leveranser til hjernesvulster. I tillegg gjennomgang av 155 publiserte modeller med primær celler, induserbart pluripotent stamceller (iPSC) eller kommersielle cellelinjer alle co kultivert på innlegg viste en trend for interstudy avvik i sitt mål og/eller konklusjoner8. Denne mangelen på interlaboratory reproduserbarhet kan være korrelert med i) nonnormalized kultur forhold, for eksempel med valgfri belegget med kjelleren membran matrix proteiner i celle kultur fartøyet, ii) et økt antall subkultur og bruk av serum inneholder medier, både viktige drivere av genetiske og fenotypiske endringer av cellen linjer15eller iii) er vanskelig å gjenskape reproduserbar høyre likevekt mellom astroglial og endothelial komponenter i en rett. Selv om bruken av udødeliggjort celler eller kommersielle cellen linjer for å opprette en i vitro BBB modell mangler noen av egenskapene i forhold til lignende modeller som bare bruker primære celler, i metoden beskrevet vi vise at den rette kombinasjonen av celler utstillinger en svært sammenlignbare resultater til publiserte studier i andre modeller av referanse16,17. Til slutt, motivert mangel på en robust og reproduserbar modell å studere passering av terapeutiske forbindelser målretting hjernesvulster gjennom BBTB oss å utvikle metodene som er beskrevet her.
Siden målet var å bruke modellen til å forutsi i vivo levering av nanopartikler i preklinisk dyremodeller, bekreftet vi først BBTB modellen ved å benytte setter inneholder murine endotelceller i kontakt med murine astrocyttene. I tillegg til dette optimalisert vi også modellen til å bruke bestemte humane cellelinjer. Når stabilisert, overføres celle barrierer til kulturer med pasient-avledede glioblastom kuler eller kommersielle glioma linjer. Transcytosis av nanopartikler og svulst celle målretting kan deretter visualisert ved AC confocal mikroskopi og kvantifisert ved å samle eksempler over tid. Viktigst, kan resultatene med BBTB etterlikner sikkert forutsi oppførselen til nanopartikler i vivo, støtter bruk av BBTB etterligne forutgående prekliniske valideringen.
Protocol
Det dyreforsøkene ble godkjent av komiteen for dyr eksperimenter av distriktet av sørlige Finland (ESAVI/6285/04.10.07/2014).
1. etablering av BBTB etterlikner
Merk: Celle kultur medium og kosttilskudd er beskrevet i tabellen av materialer.
- Utarbeidelse av astrocyttene
Merk: Følgende volumer er egnet for en 10 cm Petriskål eller en MT75 celle kultur kolbe.- Under sterilt celle kultur hette, nøye vask de kultiverte astrocyttene med 5 mL steril fosfat-bufret saltoppløsning (PBS). Forsiktig kaste PBS bruk av en vakuumpumpe og legge 2 mL celle dissosiasjon reagensen i 5 min (på 37 °C, se Tabellen for materiale) koble cellene. Merk cellen brøkdel under mikroskopet. Ikke overstige 5 min med inkubering å begrense belastningen på cellene.
- Legge til 10 mL steril komplett astrocytter celle kultur medium (ABM +) fartøy å hemmer aktiviteten til celle dissosiasjon reagensen. Bruk en steril serologisk Pipetter overføre frittstående cellene fra fartøyet til en steril 15 mL tube. Sentrifuge celle suspensjon i 3 minutter på 250 rcf (akselerasjon: 9 rcf/s, retardasjon: 5 rcf/s) ved romtemperatur (RT).
- I mellomtiden forbereder som setter inn (se Tabell for materiale): bruker sterilt tang, plassere skivene med hjernen side opp (figur 1A) på lokket på en steril 6-vel plate (figur 1B). Kontroller på forhånd at platen kan plasseres opp-ned på skivene uten å berøre eller flytte skivene under prosessen.
Merk: Riktig plassering av skivene lar entrapment av astrocytter suspensjon mellom membranen og bunnen av brønnen. - Når sentrifugeres, nøye forkaste nedbryting fra cellen suspensjon; resuspend astrocytter pellet i 1 mL av ABM + av forsiktig resuspending pellet på røret's vegg opptil 5 x. Unngå overdreven pipettering cellene å begrense belastningen på cellene. Telle celler og justere celle suspensjon tettheten til 1,5 x 105 celler i 400 µL av ABM / setter inn.
- Plasser celle suspensjon i midten på hjernen-side av sette's membran (figur 1B) og veldig nøye, spre den ved hjelp av kapillær kraft med et sterilt Pipetter tips. Unngå direkte kontakt som membranen er spesielt sårbare.
- Med hjernen side av skivene fortsatt opp, sted 6-vel platen tilbake på skivene. Dette sikrer at cellen suspensjon er fanget mellom membranen og faktiske bunnen av brønnen (figur 1 c). Unngå luftbobler i cellen suspensjon, som vil forhindre homogen spredning av astrocyttene på membranen.
- Plasser platen og setter inn, med siden hjernen, i inkubator (på 37 °C med 5% CO2) å tillate celle vedheft minimum 2 h (murine udødeliggjort astrocyttene) og 6 h (menneskelige primære astrocyttene).
Merk: Som skivene beholdes opp ned, er visualisering av celle vedheft ikke mulig under et mikroskop. Det er derfor anbefalt å frø en separat vanlig celle kultur fartøy og kontroll celle vedheft i fartøyet over tid. Forsiktig manipulasjon av membranen er et must som resultatene vil være upålitelig når membraner er skadet. - På slutten av inkubasjon tiden, kontroller at celle suspensjon lekkasjer utenfor seeding området, og Forkast som setter inn hvis de er lekk. Tilbakestille 6-vel platen til normal posisjon, med innlegg som vil nå ha blod siden opp (figur 1A). Legge til 2.6 mL ABM + i hver brønn. Hell 2,5 mL av komplett astrocytter medium i hvert sett inn og Plasser platen i inkubator (på 37 °C med 5% CO2).
- Utarbeidelse av endotelceller
Merk: For murine hjernen mikrovaskulær endotelceller (bEND3), må cellene nå 100% samløpet for å sikre maksimal celle-celle kontakter utløser optimal tett krysset protein uttrykk på dagen for eksperimentet. Dette gjelder ikke for menneskelig umbilical blodåre endotelceller (HuAR2T) tilstedeværelsen av astrocyttene er nødvendig for en tett krysset protein uttrykk for disse cellene.- Fortsette som tidligere beskrevet for astrocyttene (trinn 1.1.1 og 1.1.2.). Når sentrifugeres, nøye forkaste nedbryting; resuspend endothelial celle pellet i 1 mL av komplett endothelial celle kultur medium (EBM +) av sakte pipettering celle suspensjon på røret's vegg opptil 5 x. Unngå overdreven pipettering cellene å begrense belastningen på cellene. Telle celler og justere celle suspensjon tetthet 2 x 105 celler i 2,5 mL/insert endothelial celle kultur medium uten serum (EBM-) og vaskulær endotelial vekstfaktor-en (VEGF-A).
- Ta ut platen inneholder skivene, nøye forkaste mediet siden blod og erstatte den med 2,5 mL av endothelial celle suspensjon. Returnere platen til inkubator (på 37 °C med 5% CO2) og la den over natten for endotelceller overholder membranen.
- Neste dag, forberede en steril 6-vel-plate ved å overføre 3 mL prewarmed serum-free astrocytter medium (ABM-) i hver brønn. Ved å håndtere skivene med sterilt tang, nøye forkaste endothelial komplett mediet siden blod, plasser innsatsen i den nye platen inneholder ABM- og legge 2,5 mL EBM-.
Merk: Bruken av EBM - er avgjørende for etableringen av endothelial barrieren (se drøftingen). - La skivene i inkubator (på 37 °C med 5% CO2) med minimal fysiske forstyrrelser og temperaturvariasjoner for 5 dager, slik at produksjonen av endothelial kjelleren membranen, astrocytter kontakter med endotelceller, og til slutt BBTB etterligne dannelsen. Erstatt medium ved overføringen på glioma cellekulturer (se delen 1.4).
- Måling av BBTB etterligne permeabilitet (valgfritt)
- Passiv spredning av små molekyl vekt fluorescerende fargestoff natrium-fluorescein (Na-Fl) over tid fra blod til hjernen siden av skivene kan beregning av permeabilitet verdiene i henhold til følgende formel:
Her, dFgodter fluorescens verdien målt i brønnen på et bestemt tidspunkt minus autofluorescence celleverdien kultur medium, dT er tiden i sekunder, er overflaten av barrieren i kvadrat centimeter, og dFSett måles fluorescens verdien i innsatsen på samme tidspunkt minus middels autofluorescence verdien). - Samle 100 µL av mediet fra både blod og hjernen sidene av BBTB etterligne og overføre hver av dem til en separat flat bunn, svart 96-brønns plate for påfølgende fluorescens målinger. Bruk vanlig media samt blank for å rette autofluorescence.
- Forberede 2,5 mL per brønn av Na-Fl (50 µM) i EBM. Prewarm Na-Fl løsning på 37 ° C. Erstatt media fra blod siden av skivene med mediet som inneholder Na-Fl. starter en tidtaker som mediet er erstattet.
- Samle nøye 100 µL av media fra både blod og hjernen siden av skivene på 5, 30, 60, og 120 min. overføre hver prøve å skille brønner av svart 96-brønns plate.
- Følgelig erstatte samlet media fra skivene å opprettholde volum balansen mellom begge sider. Plass skivene tilbake i inkubator mellom hvert eksemplar innsamling av kollekt å minimere temperaturvariasjoner.
- Kvantifisere fluorescens fra de innsamlede eksemplene, likner en plate med filteret på 480/560 nm (eksitasjon og utslipp, henholdsvis).
Merk: Fluorescens fra siden hjernen er nesten umulig å oppdage på 5 min tidspunktet. Høye verdier i forhold til tomt indikere en lekkasje av / skade å sette's membran eller barriere; Derfor Utelukk disse fra videre analyser. Forventet Na-Fl permeabilitet verdier for BBTB bør være i de 10-5 10-6 cm/s utvalg (tabell 1).
- Passiv spredning av små molekyl vekt fluorescerende fargestoff natrium-fluorescein (Na-Fl) over tid fra blod til hjernen siden av skivene kan beregning av permeabilitet verdiene i henhold til følgende formel:
- Utarbeidelse av glioma celler
Merk: Selv om pasient-avledede glioblastom kuler er brukt her, kan følgende protokollen lett tilpasses for tilhenger, kommersielt tilgjengelig glioblastom celler som U - 87 MG.- Eventuelt for immunofluorescence avbildning, plassere opptil fire runde sterilt borosilicate coverslips (ø 0.9 cm) per brønn i en 6-vel plate som inneholder 2 mL poly-D-lysine (0,01%). Inkuber ved romtemperatur for 30 min.
- I mellomtiden overføre nøye svulst kulene fra celle kultur fartøyet til en 15 mL steril rør med en bakteriefri serologisk pipetter. Sentrifuge svulst kulene i 3 minutter på 250 rcf.
- Forkast nedbryting, forsiktig resuspend kulene i 1 mL av bFGF EGF-fri (GBM) glioma celle mellomlang og telle celler. Justere celle tettheten til ca 104 kuler/mL (105 celler/mL) i GBM.
- Forkaste poly-D-lysine fra brønnene og skyll 3 x med sterilt PBS. Frø platen med 3 mL/vel av svulst spheroid suspensjon og overføre bilag med BBB forhåndsvisningen på svulst celle suspensjon.
- Ruge over natten (på 37 °C med 5% CO2) å tillate likevekt mellom blod og hjernen svulst sider av analysen. På den neste dagen, erstatte media i blod siden med EBM-med molekyler/legemidler/nanopartikler rundt. Eksempler er samlet over tid for direkte kvantifisering som beskrevet i forrige avsnitt. Celler er løst på en nøyaktig tidspunkt for fluorescens bildebehandling (se delene 2.1 og 2.2).
2. høy oppløsning AC Confocal avbildning av BBTB
Merk: 4% paraformaldehyde (PFA, pH 7.4, 6 mL per BBTB replikere) er alltid forberedt friskt i PBS. Hold det på is.
Forsiktig: PFA er kreftfremkallende. Bruk nitrilhansker håndtere PFA og forberede løsningen under kjemiske avtrekksvifte.
-
BBTB endothelial uttrykk for tett krysset proteiner
- Skyll begge sider av membranen med iskald PBS (3 x for 5 min, 2,5 mL/setter inn, 3 mL/vel). Forkaste PBS og legge til 3 mL 2,5 mL av iskalde 4% PFA i brønnen og innsatsen, henholdsvis. Ruge på is 10 min. Forkast PFA (ifølge institusjonen's farlige kjemiske disposisjon) og skyll 3 x med PBS på RT (2.5 mL/insert, 3 mL/vel).
Merk: En gang bestemt, kan prøver lagres i PBS (2.5 mL/insert, 3 mL/vel) på 4 °C i en uke. - Bruk en bomullspinne tørke siden hjernen av sette og fjerne astrocyttene. Bruker en skarp skalpell, nøye skåret membranen i fire like plugger ved å lage to vinkelrett kutt, danner et kors. Neste, sett skalpell på punktet der membranen er knyttet til sett inn veggen og rotere innsatsen med den andre hånden å frigjøre fire prøvene. Bruke fine pinsett, nøye overføre hvert utvalg til en 24-vel plate inneholder 200 µL PBS/godt, med blod side opp i hver brønn.
- Blokkere membraner med 10% fosterets bovin serum i PBS (for 30 min på RT, 200 µL/vel). Forberede 1° antistoff løsningen immunostaining av tett krysset proteiner (figur 1 d) (zonula occludens-1, claudin-5, se Tabellen for materiale) i 200 µL av blokkering løsning/godt. Eventuelt er endothelial celle identiteten bekreftet ved å legge et antistoff hevet mot Platederivert endothelial celle vedheft molekyl (PECAM1 eller CD31, se Tabell of Materials) til hver tett krysset antistoff løsning. Forkaste blokkerer løsningen og ruge med primære antistoffer' O/N på 4 °C.
- På den neste dagen, forkaste primære antistoffer og skyll med 200 µL av PBS (3 x i 5 min på RT). Inkuber dem med riktig artsspesifikke fluorophore-konjugerte sekundære antistoffer (1:500 fortynning, 200 µL/Vel, fortynnet i blokkering løsning, kan du se Tabellen for materiale) 2 h på RT.
- Forkaste sekundære antistoffer, skyll med 200 µL av PBS (3 x i 5 min på RT). Fjerne PBS og counterstain celle kjerner ved hjelp av en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning på en siste konsentrasjon av 1 µg/mL i ren destillert H2O (dH2O, 200 µL/bra; se tabell for materiale ). Inkuber i 7 min på rett fjerne DAPI og vaske membraner 3 x med dH2O (200 µL/vel).
- Plasser en dråpe montering medium (se Tabell for materiale) på en barometer microscope skyve. Bruke fine pinsett, forsiktig ta membranen av brønnen og holde retningen, fjerne overflødig dH2O og plassere den på slipp av montering medium. Legg en dråpe montering medium over membranen og nøye dekke det med en cover Borosilikatglass. Kontroller at det er ingen fanget luftbobler. Lagre prøvene 4 °C og fra lys til AC confocal mikroskopi observasjoner.
Merk: Astrocytter flekker kan utføres ved å plassere bitene av membraner i 24-vel plate med hjernen side opp, og med bruk av valgte astrocytter-spesifikke antistoffer (f.eks rettet mot glial fibrillary syre proteinet [GFAP]) (figur 1E ).
- Skyll begge sider av membranen med iskald PBS (3 x for 5 min, 2,5 mL/setter inn, 3 mL/vel). Forkaste PBS og legge til 3 mL 2,5 mL av iskalde 4% PFA i brønnen og innsatsen, henholdsvis. Ruge på is 10 min. Forkast PFA (ifølge institusjonen's farlige kjemiske disposisjon) og skyll 3 x med PBS på RT (2.5 mL/insert, 3 mL/vel).
-
BBTB fluorescens flekker for å oppdage hydrogenion transcytosis
- Utføre live-celle lysosome merking (f.eks bruke fluorescerende sonder [se Tabellen for materiale]). Fortynn lysosome fluorescerende fargestoff i en arbeider konsentrasjon av 50 nM i prewarmed EBM (2.5 mL/insert) eller 75 mM prewarmed ABM-(3 mL/vel) for lysosome merking av endotelceller og astrocyttene, henholdsvis. Inkuber celler for 45 min (på 37 °C med 5% CO2); Skyll 3 x med iskald PBS (2.5 mL/insert, 3 mL/vel).
- Forkaste PBS og legge til 3 mL 2,5 mL av iskalde 4% PFA brønnen og innsatsen, henholdsvis. Inkuber dem på is 10 min. Forkast PFA og skyll cellene 3 x med PBS (på RT, 2,5 mL/insert, 3 mL/vel).
Merk: En gang bestemt, kan prøvene lagres i PBS (2.5 mL/insert, 3 mL/vel) på 4 ° C i en uke. - Fjern PBS og counterstain celle kjerner ved å bruke en DAPI løsning i en siste konsentrasjon av 1 µg/mL i dH2O (1 mL/insert, 1 mL/godt). Inkuber dem i 7 min på rett fjerne DAPI og vaske membraner 3 x med dH2O (2.5 mL/insert, 3 mL/vel).
- Nøye klippe membranen, fjerne overflødig dH2O og plassere den på en dråpe av montering medium (se Tabell for materiale) på en barometer microscope skyve. Legg en dråpe montering medium på den andre siden av membranen og nøye dekke det med en cover Borosilikatglass. Unngå fanget luftbobler. Lagre prøver på 4 °C og holde dem protected fra lys til AC confocal mikroskopi bildebehandling.
-
Fluorescens farging av kreftceller
- Bruke fine pinsett, nøye overføre den runde coverslips som inneholder den svulst kuler til en 24-vel plate fylt med iskald PBS. Fortsette med live-celle lysosome merking bruke fluorescerende lysosome sonder på 75 nM i prewarmed GBM (200 µL/vel). Inkuber prøvene for 45 min; deretter skyll 3 x med iskald PBS (200 µL/vel).
- Forkaste PBS og legge 200 µL av iskalde PFA per brønn. Ruge på is 10 min. Forkast PFA og skyll prøvene 3 x med PBS (på RT).
Merk: En gang bestemt, prøvene er lagret i PBS (200 µL) på 4 ° C i en uke. - Fjerne PBS og counterstain celle kjerner ved å bruke en DAPI løsning i en siste konsentrasjon av 1 µg/mL i dH2O (200 µL/vel). Inkuber dem i 7 min på rett fjerne DAPI, og vask coverslips 3 x med dH2O (200 µL/vel).
- Bruke fine pinsett, ta ut dekkglassvæske, fjerne overflødig dH2O og plassere den på en dråpe av montering medium (se Tabell for materiale) på en barometer microscope skyve. Unngå entrapping noen luftbobler. Lagre prøver på 4 °C og holde dem protected fra lys til AC confocal mikroskopi observasjoner.
3. i Vivo komparativ studie
- In situ opptak av natrium-fluorescein spredning gjennom BBB
- Forberede 150 µL av en 50 nM Na-Fl løsning i en fysiologisk løsning. Hold i løsning på 37 °C ved intravenøs levering.
- Bedøve en mus med en intraperitoneal injeksjon av en ketamin/xylazine cocktail (300 µL av 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazine i PBS). Når dyp anestesi er opprettet, kan du plassere dyret på en varmeputen å opprettholde sin kroppstemperatur.
Merk: Ti-uke-gamle kvinnelige Naval Medical Research Institute (NMRI) naken immunsupprimerte mus har blitt brukt til å hente dataene som vises i figur 2. Men er denne protokollen tilpasset både immunkompetente og immunsupprimerte mus. Metoden anestesi/analgesi er forskeren's skjønn. Innånding anestesi som isoflurane anbefales imidlertid ikke signifikant øker BBB permeabilitet18. - Plasser musen på en stereotaxic ramme (se Tabell for materiale) og utføre en langsgående snitt av hodebunnen med fine saks, etterfulgt av mild dilacerations i bindevev, bruke fine pinsetter, for å avsløre skallen. Bruke sirkulære bevegelser med en fin microdrill, fjerne en ø 0.3 mm rund bit av skallen fra venstre eller høyre parietal benet. Fortsette med varsomhet under boring og under fjerning skallen stykket for å unngå å skade den underliggende meningeal vev og blod fartøy.
- Plass en dråpe fysiologiske løsning på utsatte vev. Bruker to par fine tang, forsiktig fjerne meningeal vevet til hjerne cortex. Hjernevev bør aldri være i direkte kontakt med luft.
Merk: Mindre hemorrhages fra meningeal skade kan stoppes ved hjelp av hematologic svamper (se Tabell for materiale). - Når meningeal vevet er fjernet og cortex er fullt eksponert, lure en dråpe fysiologiske løsning mellom cortex og en ø 0,5 mm borosilicate dekkglassvæske. Sikre observasjonen området med en dråpe cyanoacrylate lim (se Tabell for materiale) spredt rundt i dekkglassvæske med en nål. La limet tørr for 1 min.
- Forberede den implanterbare kateter hale blodåre injeksjon (figur 2A). Bryte spissen av en 25 G nål ved hjelp av Rochester-Ochsner pinsett og sett den i en 10 cm lang PE20 polyuretan tube (se Tabell for materiale) (figur 2A).
- Kateter inn lateral hale åre musen, bruker bulldog klemmer for kateter manipulasjon og innsetting (se Tabell for materiale) (figur 2B). Sikre satt inn nålen med en dråpe cyanoacrylate lim. La limet tørr for 20 før fjerne bulldog klemmen. Nøye koble den andre enden av kateter til en 25 G nål koblet til en sprøyte som inneholder Na-Fl løsningen (figur 2B).
- Merk: Ikke klemme halen med bulldog klemme; det brukes bare for presis kateter håndtering. Riktig kateter innsetting kan bekreftes av blood-reflux i gjennomsiktig slangen.
- Plassere dyret under stereomicroscope (se Tabell for materiale). Ved hjelp av den lave autofluorescence i den grønne kanalen (480 nm), fokusere på et område som inneholder relativt store blodkar (de vises mørkere på grunn av hemoglobin absorpsjon av lys på denne bølgelengde) og mindre blodkar (figur 2C). Starte time-lapse oppkjøpet kort før injisere fluorescerende fargestoff for å få en måling av bakgrunnen fluorescens.
Merk: Alternativt, tid-lapse innspillingen kan erstattes av øyeblikksbilde bilder fra T0 og fra andre angitt tidspunkt. - Injisere løsningen på en langsom og kontinuerlig tempo, eller alternativt bruke en automatisert infusjonssystemet. Na-Fl fluorescens oppdaget i blodet bør forbli stabil (halveringstid i blod: 286 min), som tillater et opptak av BBB spredningen gjennom vinduet skallen i flere minutter. Når oppkjøpet er fullført, nøye fjerne kateter og euthanize dyret av cervical forvridning.
- In vivo fastsettelse av BBB permeabilitet
Merk: Verdiene hentes fra bildebehandling programvare, for eksempel ImageJ, slik at måling av fluorescens signal intensiteten i et egendefinert område av interesse (ROI).- Bruke merknadsverktøy, tegne en rektangel formet avkastning utenfor en blodåre i hjernevevet, på rundt 5 µm avstand fra alle synlige blodkar fylt med Na-Fl. dimensjonene på Avkastningen og målt fluorescens intensiteten ved T0 i at Avkastningen, som brukes som tom for vevet's autofluorescence. Uten displacing Avkastningen, spole en postinjection tid punkt (f.eks til den siste registrerte rammen når hele løsningen har blitt injisert til dyret) og merke de nøyaktige tid og fluorescens verdiene målt innenfor Avkastningen (figur 2C).
- Flytt Avkastningen på en synlig blod fartøy (figur 2C) og noter T0 autofluorescence verdien fra blodet. Uten displacing Avkastningen, spole fremover til samme tidspunkt som definert i trinn 3.2.1. og Merk fluorescens verdien målt innenfor Avkastningen (figur 2C).
- Bruk følgende formel (tilpasset fra delen 1.3) til å fastslå BBB permeabilitet:
- Her, dFhjernen er fluorescens intensitetsverdien minus T0 tomme verdien i hjernen, dT er tidspunktet oppkjøpet sekunder, er omtrentlige fartøyet areal, tatt som Avkastningen området i kvadrat centimeter, og dF blod er fluorescens intensitetsverdien minus T0 tomme verdien i blodet.
Merk: Forventet permeabilitet verdier for BBB bør være i 10-6 cm/s rekkevidde (tabell 1).
- Vev behandling for påvisning av fluorescerende nanopartikler i murine hjernen
- Implantatet pasient-avledede glioblastom kuler (5 x 10-4 celler i 5 µL av sterile PBS) i bedøvet 6 uke gamle kvinnelige NMRI naken mus i corpus callosum. Finne denne hjernen regionen på følgende stereotaxic koordinater, fra Bregma: anteroposterior + 0,5 mm, venstre til høyre + 2,5, dorsoventral + 3 mm. tillate hjernesvulst å vokse i 2 uker.
- Injisere nanopartikler intravenøst (100 µg i 100 µL av sterile fysiologiske løsning) og tillate dem å sirkulere for 8 h. injisere kontroll mus intravenøst med 100 µL av sterile fysiologiske løsning.
- Euthanize musene av cervical forvridning og samle hjernen raskt for snapin-frysing i isopentane på tørris (1 min på-50 °C). Lagre hjernen på-80 °C til vev behandling.
- Kuttet koronale hjernen seksjoner med en cryomicrotome. Finn intrakranielt implantering av arret den dannet på cortex, og kutte 9 µm tykke inndelinger fra området på de aktuelle objektglass (se Tabell for materiale).
- Fordype hjernen delene som er blokkert på lysbildene i iskalde PBS (2 x 5 min) og deretter løse dem i iskalde 4% PFA (for 5 min). Vaske lysbildene i PBS (3 x i 5 min på RT). Plasser lysbildene horisontalt og Pipetter blokkerer løsning som inneholder 10% fosterets bovin serum i PBS på vev seksjoner som dekker hele overflaten (for 1 h på RT, 500 µL/lysbildet). Forberede CD31 antistoffer (se Tabell for materiale) i 250 µL av blokkering løsning/lysbilde. Erstatte blokkerer løsningen med antistoffer og ruge over natten på 4 °C i en fuktet kammer.
- Neste dag, fordype lysbildene i PBS (3 x i 5 min på RT) og Inkuber dem med tilsvarende fluorophore-konjugerte sekundære antistoffer (1:500 i 250 µL av PBS 2 h på RT). Skyll 3 x i PBS (på RT) og counterstain celle kjerner ved å bruke en DAPI løsning i en siste konsentrasjon av 1 µg/mL i dH2O (250 µL/lysbilde). Inkuber prøvene i 7 min på rett fjerne DAPI løsningen og vaske lysbildene 3 x med dH2O.
- Legg en dråpe montering medium på avsnittene vev (se Tabell for materiale) og sikre prøvene med en dekkglassvæske. Unngå entrapping luftbobler. Lagre prøver på 4 °C og holde dem protected fra lys til AC confocal mikroskopi observasjoner.
Representative Results
AC confocal avbildning av murine BBTB forhåndsvisningen viser uttrykk og mobilnettet lokalisering av tett krysset proteiner zonula occludens-1 (ZO-1) og claudin-5 i bEND3. Kontakter mellom endotelceller og astrocyttene indusert tydelig flytting av ZO-1 og claudin-5 endothelial celle-celle kontaktene sammenlignet bEND3 monokulturer (figur 1 d). Bruke immunofluorescence flekker for å visualisere GFAP-uttrykke astrocyttene på hjernen-siden av membranen, er det mulig å observere og studere astrocytic prosesser og slutten-fot å kontakte endotelceller gjennom membran (figur 1E ). Astrocytter-endothelial celle kontaktene er kjent for å fremme og stabilisere innstramming av mobilnettet barrieren og er assosiert med lavere permeabilitet verdier av BBB19. I samsvar med det, observerte vi en betydelig reduksjon i permeabilitet av musen BBTB forhåndsvisningen for Na-Fl fra 27.63 (± 3,45) x 10-6 cm/s ved monokulturer til 6.74 (± 3.01) x 10-6 cm/s når co kultivert med hypoksi-induserbart faktor fortrenging astrocyttene og (HIFko) (tabell 1). Den udødeliggjort HuAR2T utgjør svært permeable mobilnettet barrierer (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, tabell 1). Ligner murine modellen, vi målt betydelig lavere permeabilitet av BBTB å Na-Fl, nemlig 47,4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, da HuAR2T cellene var co kulturperler med de menneskelige primære astrocyttene (tabell 1).
I både murine og menneskelig BBTB etterlikner indusert tilstedeværelse av pasient-avledede glioblastom kulene en svak økning i permeabilitet verdiene sammenlignet med endotelial celle-astrocytter co kulturer alene (tabell 1). Dette fenomenet er observert med flere, men ikke alle av det pasienten glioma sphere modeller. Dette kan skyldes VEGF-A som utskilles av noen av disse pasient-avledet celler.
Hvis du vil sammenligne permeabilitet verdiene for de i vitro BBTB imiterer med i vivo BBB, fotografert vi sanntid spredningen av Na-Fl gjennom et skallen vindu implantert i naken mus. Bruker en fluorescens stereomicroscope, ble Na-Fl diffusjon fra blodkaret kapillærene avledet fra viktigste pial blodkar registrert før, under og etter systemisk injeksjon av sonden (figur 2C). Målinger av differensial fluorescens verdiene fra sirkulerende blod og hjernen kortikale parenchyma over tid tillot oss å beregne omtrentlig permeabilitet verdiene av naken musen's BBB for Na-Fl (5.57 ± 2.19 x 10-6 cm/s, Tabell 1).
For å illustrere hvordan denne BBTB etterligne kan brukes for visualisering av tidens forbindelser fra til siden blod til hjernen side, sammenlignet vi transcytosis ø 110 nm (NP110) og ø 350 nm (NP350) nanopartikler målretting pasient-avledede glioblastom kuler. Resultatene i vitro ble sammenlignet med den i vivo transcytosis. I eksemplet presentert nanopartikler var overflaten-belagt med svulst målretting peptid CooP20 og lastet med fluorescerende fargestoff (FITC) å forenkle visualisering. Vi merket cellene med lysosomale fargestoff og counterstained med DAPI 24 h etter tillegg av FITC nanopartikler på blod-siden av BBTB etterligner og kjøpt AC confocal micrographs på ulike nivåer (f.eks blod siden membranen, siden hjernen og pasienten glioblastom kuler) (figur 3A). NP110-assosiert fluorescerende signalet colocalized med lysosomer i endotelceller, astrocyttene og kreftceller. I tillegg NP110s ble oppdaget i mellom endotelceller og astrocyttene, passerer gjennom membranen porene av sette (figur 3A).
Passering av NP110s ble kvantifisert ved å måle fluorescens fra prøver fra både blod og hjernen side. Disse permeabilitet verdiene ble sammenliknet med dem bestemt for nanopartikler av ø 350 nm (NP350). Resultatene viser at bare NP110 kunne krysse BBTB etterlikner (figur 3B). NP350 forble på blod-siden av den BBTB etterligne, som resulterte i lavere permeabilitet verdier for disse nanopartikler.
For å fremheve relevansen av BBTB etterlikner sammenlignet i vivo modellene, ble naken musene intravenøst injisert med NP110 eller NP350 nanopartikler belagt med svulst målretting peptid CooP og konjugert med rød fluorescerende farge (TRITC) for påvisning. Vev samlet på flere tidspunkt avdekket at etter 8 h, BBB-permeable nanopartikler har extravasated i hjernen parenchyma, mens den nonpermeable de som bodde i sirkulasjon hovedsakelig ble tømt fra systemisk sirkulasjonen i vivo. Derfor vi samlet hjernen og kvantifisert antall nanopartikler per kvadrat millimeter 8 h postinjection. I samsvar med den i vitro funn, NP110, men ikke NP350, ble extravasated i hjernen parenchyma (Figur 3 c). Høy forstørrelse bildebehandling av hydrogenion plassering i hjernen viste at NP110 var homogent distribuert i hjernen parenchyma utenfor blod blodkar og vellykket homed til implantert glioblastom cellene (figur 3D). Til tross for viser samme svulsten målretting moiety (CooP), NP350 ikke extravasate i hjernen parenchyma og fant bare innenfor den luminal siden av hjerne blodkar (figur 3E), ligner på resultatene i vitro.
Figur 1: beskrivelse av blod-hjerne svulst barriere (BBTB) modell. (A) skjematisk fremstilling av plasseringen av forskjellige celletyper. (B) illustrasjon av sett inn plassering på 6-vel plate dekselet og seeding teknikken for astrocyttene på hjernen side av sette's membran. (C) illustrasjon av 6-vel plate plasseringen slik at astrocytter vedheft. (D) Immunofluorescence micrographs av tett krysset proteiner zonula occludens-1 (ZO-1, øvre rad, rød) og claudin-5 (nederste rad, grønn). Protein uttrykk sammenlignes murine hjernen mikrovaskulær endotelceller (bEND3) kultivert på blod side av BBTB alene som en monokultur (venstre kolonne) eller med murine udødeliggjort HIFko astrocyttene (høyre kolonne). Cellen kjerner er counterstained med DAPI (blå). (E) Immunofluorescence mikroskop-bilde viser glial fibrillary Sure protein (GFAP, rød) i HIFko astrocyttene kultivert på hjernen side av BBTB. Høy forstørrelse bildet viser astrocytter prosesser og slutten-fot (piler) kontakter endotelceller gjennom membranen porene (høyre panel). Identiteten til HIFko astrocyttene ble bekreftet av immunofluorescence farging av simian virus 40 store T antigen (SV40 store T, grønn) brukes for immortalization i cellene. Endotelceller uttrykke GFAP verken SV40 store T, og derfor kan være delvis observert gjennom gjennomsiktig, motsatt side av membranen som bare DAPI-farget celler (stiplet linje). Cellen kjerner er counterstained med DAPI (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Intravital live fastsettelse av musen BBB permeabilitet. (A) utarbeidelse av implanterbare caudal blodåre kateter. (1) verktøy og utstyr er følgende: (en) en PE20 polyetylen rør (b) to 25 G nåler (c) Rochester-Ochsner tang, og (d) en liten bulldog klemme. (2) en 25 G nålen fjernes ved flere torsions ved hjelp av tang og (3) nøye inn i røret. (4) den andre siden av røret er koblet til en annen 25 G pinnen. (B) veiledning for kateter implantation og posisjonering å sette mot natrium-fluorescein løsningen gjennom halen åre mus. Innringet området angir området der en dråpe cyanoacrylate lim er plassert for å sikre kateter. Bulldog klemmen brukes til å håndtere kateter, fjernet når kateter er sikret. (C) representant bildebehandling og kvantifisering metode å avgjøre natrium-fluorescein permeabilitet verdiene. Før natrium-fluorescein infusjon (venstre kolonne) målt den autofluorescence/tomt innenfor et område av interesse (ROI) plassert på hjernen (toppanelet, hvitt rektangel) og blodkar områder (bunnen panel, røde rektanglet). Under natrium-fluorescein infusjon (høyre kolonne) måles fluorescens intensiteten i begge ROIs, slik at beregningen av BBB permeabilitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: prediksjon av de intracerebral transcytosis av nanopartikler gjennom BBB i vivo bruker i vitro BBTB modellen. (A) grafisk representasjon av BBTB analysen med representant AC confocal bilder på de angitte ulike nivåene av murine BBTB modellen. Nanopartikler på 110 nm i diameter (NP110) og konjugert til FITC (grønn) ble lagt til blodet side BBTB cellene var merket med lysosomale sonden (LT-99, rød). (1) Endothelial celler, (2) Endothelial transcytosis av nanopartikler gjennom porene i membranen (hvit stiplet linje), astrocyttene og (3), og (4) pasienten glioblastom kuler identifiseres på grafikken og tilsvarende AC confocal micrographs (til høyre). Lysosomale innkapsling av nanopartikler (piler) antyder aktive transcytosis gjennom endothelial og astrocytter lagene i BBTB. (B) kvantifisering av angitte hydrogenion permeabilitet gjennom BBTB i vitro (n = 6). (C) kvantifisering av angitte hydrogenion tetthet i hjernevevet seksjoner, 8 timer etter caudal blodåre-infusjon av naken mus (n = 3). (D) AC Confocal micrographs viser fordelingen av ø 110 nm nanopartikler (NP110, rød) i murine hjernen vev deler merket med et anti-musen CD31 antistoff (grønn). Pilen høydepunkter hydrogenion transcytosis (venstre panel). Nanopartikler samlet rundt kreftceller hjernen (svulst, høyre panel) på grunn av CooP målretting peptid presentert på overflaten deres. Ingen betydelige homing er observert i hjernevevet (hjernen). (E) AC Confocal micrographs viser fordelingen av ø 350 nm nanopartikler (NP350, rød) i murine hjernen vev seksjoner merket med et anti-musen CD31 antistoff (grønn). Pilspisser peker til NP350s som ble beholdt i blodkar lumen og klarte ikke å krysse BBB, sannsynligvis på grunn av deres større diameter i forhold til NP110s.-cellen kjerner er counterstained med DAPI (blå). P < 0,01. P-verdier ble beregnet ved hjelp av en tosidig, parametriske Mann-Whitney U test. Feilfeltene representerer standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| murine BBTB etterligne | bEND3 | bEND3 + HIFko som | bEND3 + GB | bEND3 + HIFko som + GB | In vivo |
| Permeabilitet (10-6 cm/s) | 27.63 | 6.74 | 26.8 | 10.83 | 5.57 |
| SD (10-6 cm/s) | 3,45 | 3.01 | 7,99 | 2,65 | 2.19 |
| menneskelige BBTB etterligne | HuAR2T | HuAR2T + hIAs | HuAR2T + GB | HuAR2T + hIAs + GB | |
| Permeabilitet (10-6 cm/s) | 104.92 | 47,4 | 89.08 | 48.24 | |
| SD (10-6 cm/s) | 27,1 | 14.32 | 10.21 | 13.07 |
Tabell 1: verdier av natrium-fluorescein (Na-Fl) permeabilitet (i cm per sekund) i vitro i angitte co kultur systemer og in vivo i NMRI naken mus. Data fra en representant eksperiment (n = 3 mus).
Discussion
Fremveksten av interpatient svulst variasjon konseptet fornyet forskning på personlig kreft medisin21. Denne variasjonen er også et kjennetegn på sentralnervesystemet neoplasms. På grunn av uforutsigbarhet svulsten, reaksjon på kjemoterapi legger til beskyttende effekten av BBB for narkotika-leveranser, og helt utgjør store utfordringer i pasientomsorg22. For å utvikle mer effektive terapi, er det ofte nødvendig å skjermen store biblioteker av nye molekyler. For å evaluere antitumor effekt og evne til de nye terapeutiske kundeemnene på svulst nettstedet, er det beste alternativet prekliniske studiet på pasient-avledede celler implantert i vivo i murine pasienten avatarer. Praktisk (finans, tid, menneskelige og anlegget ressurser) og etiske grunner (3Rs prinsippet ved forsøksdyr), er utviklingen av slik storskala i vivo screening plattform ofte ikke mulig, og derfor cellebasert analyser være en modell av valg23. Den viktigste grunnen for valg etablert linjer og unngå primære celler er å lette reproduserbarhet og redusere bruken av forsøksdyr, som er den viktigste kilden for isolasjon og etablering av primære murine kulturer. Metodene presenterer her, kan fast i samsvar med 3Rs, effektivt forkaste nanopartikler fra en videre prekliniske undersøkelser på criterium av deres manglende evne til å krysse modellen BBTB. Som et bevis-av-prinsipp beskriver vi her resultatene innhentet under utvikling og validering av BBTB. Vi klarte å bekrefte i vitro funn i vivo, for eksempel ved måling passiv spredningen av en 376 Da natrium-fluorescein.
Protokollen beskrevet i dette dokumentet beskriver utarbeidelse av endotelceller cocultured med astrocyttene å danne en blod-hjerne svulst barriere som grensesnitt i en i vitro oppsett. Når en fysisk kontakt mellom disse to celletyper er opprettet, viser endothelial celle laget likheter med BBB (f.eks en celle overflaten uttrykk tett krysset proteiner og relativt lav permeabilitet). Interessant, syntes murine BBTB forhåndsvisningen å gi spesielt lignende Na-Fl permeabilitet verdiene til dem med i vivo musen BBB permeabilitet målinger24. Derfor vil ytelsen til BBTB etterlikner være direkte knyttet til valg av cellene som brukes til å danne barrieren. BEND3 endotelceller kommer fra hjernen og er kjent for å være vellykket i forming barrierer når cocultured med astrocyttene25. Men har vi brukt udødeliggjort HIFko astrocyttene26 for å generere BBTB forhåndsvisningen. På grunn av deres mangel på hypoksi-induserbart faktor, produserer ikke disse astrocyttene VEGF-A, som er typisk i BBTB etterligne stabilisering beskrevet her. Astrocyttene har blitt identifisert som modulatorer av BBB permeabilitet, for eksempel gjennom utgivelsen av VEGF-A svar på neuroinflammation27. Aktivering av vaskulær endotelial vekstfaktor reseptorer (VEGFRs) er en viktig regulator av endothelial/vaskulær permeabilitet både i vitro28 og i vivo29. Derfor aktivere VEGF-A kosttilskudd i medium VEGFR2 på endotelceller, som induserer fosforylering adherens junction proteiner som VE-cadherin30. Tap av endothelial celle-celle kontakter genererer svært permeable blodkar. På samme måte føre både sterke mitogenic eiendom og ukjent sammensetningen av de fosterets bovin sera brukes i celle kultur analyser til store problemer i barriere stabilisering og analysen reproduserbarhet.
Menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) brukes til BBB i vitro31; men de avviker seg betydelig fra hjernen mikrovaskulær endotelceller, som hCMEC/D3 cellen linje32, genuttrykk og barriere-forming egenskaper. Men relativt høyere permeabilitet verdier hentet med HuAR2T celler dyrket alene sammenlignet med bEND3 ble sterkt redusert ved coculturing dem med menneskelige primære astrocyttene. Selv endotelceller må danne mobilnettet veggen, er det klart at astrocyttene har en like viktig rolle å spille for BBTB dannelse og stabilisering.
Når pasient-avledede glioma kuler ble lagt til denne ligningen, recapitulated musen BBTB etterligne noen av funksjonene i murine xenografts, som narkotika spredningen gjennom hjerne blodkar og svulst celle målretting. BBTB etterlikner diskutert her var for eksempel vellykket i speilet i vivo virkemåten når vi vist flere nanopartikler med forskjellige diametere. For å illustrere parallellisme mellom i vitro og in vivo modeller, vi brukte tidligere beskrevet mesoporous silikat nanopartikler33 med celle-gjennomtrengende egenskaper34 konjugert til tumor målretting peptid CooP på deres surface20. De CooP målretting peptid boliger til invasiv tumorceller gjennom bestemte bindingen til den mammary-avledet vekst inhibitor (MDGI). Flere typer kreft, inkludert gliomas, er overexpressing MDGI sammenlignet med det normalt vev35, noe som gjør CooP en svært effektiv svulst målretting moiety kan øke levering av en nyttelast20. Nanopartikler her har vist tidligere å spre inn i hjernen parenchyma (27547955), og når functionalized med Taxol, disse nano-cargos har vært vellykket i å redusere glioma vekst i preklinisk modeller36. Tillegg av polyetylenglykol (PEG) rester på overflaten av nanopartikler også beholdt sine statiske kostnader til positive verdier (rundt + 4 mV), som tillater bedre samspill med nevrovaskulære enheten37 og også øke deres stabilitet i sirkulasjon. I presenteres dataene, var 3 kDa av PEG konjugert til NP110s, mens NP350s ble belagt med 10 kDa av PINNEN. Men resultert økt-molekylvekt PEG også i en betydelig økning i hydrogenion diameter, derav deres fysiske evner å krysse BBB. Derfor sjekket vi om de fysiske dimensjonene til partikler hindret deres passasje gjennom BBTB og om disse observasjonene kan speiles i vivo.
I samsvar med de tidligere publiserte observasjonene, observerte vi at NP110s extravasated gjennom både BBTB i vitro og BBB mus bærer intrakranielt svulster, mens NP350s beholdes på luminal side av BBTB etterligne og i blodkar av den mus. Disse lignende resultater sterkeste at BBTB modellen spådde i vivo evne til nanopartikler krysse BBB og kommer i hjernen.
Relevansen av mobilnettet modeller av BBB er ofte diskutert, selv for sentrale levering av nanopartikler38. Vi viser her at primære astrocyttene og endotelceller, begge ansett som de mest relevante i vitro verktøyene, kan erstattes av udødelighet og/eller kommersielt tilgjengelig celler, som sikrer bedre skalerbarhet og reproduserbarhet. Neste generasjon i vitro BBB imiterer kunne utvikles ved å innlemme microfluidic enheter, slik at vakkert formet nevrovaskulære enheter som strukturelt ligner den faktiske BBB12,14. Men er slike modeller for tiden uegnet for høy gjennomstrømming screening av molekyler levert til gliomas, på grunn av tekniske begrensninger i oppfølgingen levering14. Det er faktisk vanskelig å fange fysiologiske kompleksiteten i BBB i en parabol, og mulig mangel på noen reseptorer/proteiner, kjent for å være uttrykt av BBB, kunne kompromittere tolkning av resultatene. Et annet argument gjelder stor variasjon i genuttrykk mellom i vivo og in vitro forhold, samt fra én celle linje til en annen, spesielt vurderer endotelceller. Men kan det også hevdes at nevrovaskulære enheten ikke er en ensartet enhet i hjernen39. Vitenskapelig forskning i biologi har nådd en human æra der dyr velferd, etiske ansvaret og kostnaden ved å bruke dyr liv er alltid vurdert før utforme et eksperiment. Derfor, for å støtte utskifting av dyr, et økende antall nyere studier viser at bevisstheten om begrensningene for modellene og forsiktig utvalg av mobilnettet modeller å etablere barrieren, med vekt på astrocyttene-garanterer en kampen mellom resultater oppnådd i en rett og i dyr modeller40. Med metodikk beskrevet her, får vi et skritt nærmere å redusere antall forsøksdyr som brukes for screening av BBB transcytosis for potensielle therapeutics.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra den finske kreft organisasjoner, Jane & Wen Erkko Foundation, og Sigrid Juselius Foundation (til P.L. og V.L.J.), Swiss National Science Foundation (avanserte Postdoc.Mobility gir ingen: P300PB_164732, til S. K.), Orion Research Foundation (til S.K.), Maud Kuistila Memorial Foundation (til S.K.) og for Finlands akademi (TERVA 2017, gir ingen: 314 498). Biomedicum Imaging enheten (Helsinki) er anerkjent for å gi mikroskopi imaging kjernen anlegget.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and - medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 mm x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25 G needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |
References
- Daneman, R., Prat, A.
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).
- Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound. Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review. World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).
- Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. Translational gap in ongoing clinical trials for glioma. Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier. Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Bang, S., et al. A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes. Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Pirsko, V., et al. An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3. Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Cao, Y., et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD. Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Kinnari, P. J., et al. Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy. Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).
- Levin, V. A.
- Weathers, S. S., Gilbert, M. R. Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview. Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).
- O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).
- Yang, S., et al. Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier. PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).
- Argaw, A. T., et al. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).
- Miao, Z., et al. VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).
- Claesson-Welsh, L.
- Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system. Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Paatero, I., et al. Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes. Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).
- Prabhakar, N., et al. Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery. International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).
- Hyvonen, M., et al. Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).
- Feng, X., et al. Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy. Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).
- Nance, E. A., et al. A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue. Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).
- Berg, C. Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models. Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).
- Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).
- Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).
