Summary
Drug målretning til centralnervesystemet tumorer er en stor udfordring. Her beskriver vi en protokol for at producere en in vitro-efterligner af blod-hjerne tumor-barrieren ved hjælp af murine og/eller menneskelige celler og diskutere deres relevans for forudsigelighed af centralnervesystemet tumor målretning in vivo.
Abstract
Yderst selektive natur, blod - hjerne barrieren (BBB) er afgørende for hjernen homøostase i fysiologiske forhold. Men i forbindelse med hjernetumorer, BBB molekylære selektivitet også skjolde de neoplastiske celler ved at blokere for leveringen af perifert administreret kemoterapier. Udvikling af nye stoffer (herunder nanopartikler) målretning maligne hjernetumorer ideelt kræver brug af prækliniske dyremodeller for at studere stoffet transcytosis og antitumor virkning. For at overholde princippet om 3R (forfine, begrænse og erstatte) for at reducere antallet af forsøgsdyr i eksperimentel opsætning og udføre high throughput screening af et stort bibliotek af antitumor agenter, udviklede vi en reproducerbar in vitro-menneskelige og murine efterligner af blod-hjerne tumor-barriere (BBTB) ved hjælp af tre-lags kulturer i endothelial celler, astrocytter, og patienten-afledte glioblastom kugler. For større skalerbarhed og reproducerbarhed, har kommercielle cellelinjer eller udødeliggjort celler været anvendt i skræddersyede betingelser for at tillade dannelsen af en barriere, der ligner de faktiske BBB. Her beskriver vi en protokol for at opnå en BBTB efterligner ved dyrkning af endothelceller kontakt med astrocytter ved specifikke celle tætheder på skær. Denne BBTB efterligner kan eksempelvis bruges til kvantificering og konfokal billeddannelse af nanopartikel passage gennem i endothelial og astrocytic barrierer, ud over evaluering af tumor celle målretning inden for den samme analyse. Vi viser desuden, at de opnåede data kan bruges til at forudsige funktionsmåden af nanopartikler i prækliniske dyremodeller. I et bredere perspektiv, denne in vitro model kunne tilpasses til andre neurodegenerative sygdomme til bestemmelse af passage af nye terapeutiske molekyler gennem BBB og/eller suppleres med hjernen organoids direkte evaluere effekten af narkotika.
Introduction
Den neurovaskulære enhed er sammensat af neuroner, astrocytter og BBB, dannet af indviklede forbindelser mellem pericytes, astrocytter, endotelceller, og den tilknyttede basalmembranen danner hjernen microvasculature1. Denne stramme cellulære væg dannet af kontinuerlig, nonfenestrated fartøjer fint regulerer bevægelse af ioner og molekyler (herunder hormoner, næringsstoffer eller stoffer), men også af cirkulerende celler1. Den specielt lave transcytosis gennem BBB af høj molekylvægt molekyler, som terapeutisk antistoffer, drug konjugater eller nanocompounds, begrænser dramatisk fremskridtene inden for drug discovery for neurologiske sygdomme, herunder maligne gliomer2. Faktisk, oralt eller intravenøst leveret kemoterapier nå hjernen parenkym ofte ved utilstrækkeligt lave koncentrationer til at fremkalde en antitumor effekt eller simpelthen ikke kan krydse BBTB for at nå de neoplastiske celler3. Flere prækliniske og kliniske undersøgelser ikke har behandlet spørgsmålet om BBTB penetration men har forsøgt at forstyrre BBTB forbigående, for eksempel ved hjælp af fokuseret ultralyd4,5, eller at omgå det ved direkte i situ levering af medicin6. Ingen af disse teknikker var imidlertid at modvirke den uundgåelige tumor udvidelse eller tilbagefald. Derfor, når de udvikler nye antiglioma behandlingsformer, diffusion gennem BBTB bør betragtes som en af de afgørende aspekter for den succesrige levering af terapeutiske agenter7.
På grund af den meget komplekse karakter af celle interaktioner inden for BBTB synes in vivo-undersøgelser i forsøgsdyr at være det oplagte valg, når man studerer passagen af molekyler fra blod til hjernen. High-skala in vivo metoder er dog relativt kompliceret at etablere og, derfor, ikke tillader high throughput screening af molekyler i en rimelig tid til en rimelig pris. Endnu vigtigere, har dyreforsøg at følge 3R etiske retningslinje defineres som i) Præciser, ii) reducere og af relevans for den aktuelle kontekst, iii) erstattes af alternative protokoller (f.eks. i vitro/i siliciummangan metoder). Derfor, genskabe den in vitro-BBTB vises som en interessant og attraktiv mulighed, men det udgør også en kompleks opgave udfordret af forskellige begrænsninger. Mange forsøg på at genskabe denne komplekse rum med kulturperler primærelementer eller cellelinjer fra hunde, svin, murine, og selv menneskets oprindelse er offentliggjort (som gennemgået af Rahman et al.8 og Helms et al.9). Disse modeller omfatter tre-dimensionelle mikrofluid systemer10, BBB-on-a-chip11,12, og skarer af varianter baseret på de klassiske Co kulturer i indsætter systemer. Aktuelle mikrofluid og chip systemer er dog enten ikke egnet til hurtig og høj overførselshastighed stof-validering undersøgelser13,14 eller er i øjeblikket uforenelig med undersøgelser af medicinafgivelse til hjernetumorer. Desuden gennemgang af 155 offentliggjort modeller bruger primærelementer, inducerbar pluripotente stamceller (iPSC) eller kommercielle cellelinjer alle Co kulturperler på skær viste en tendens til interstudy forskel i deres målinger og/eller konklusioner8. Denne mangel på sammenlignende reproducerbarhed kunne være korreleret med i) nonnormalized kultur betingelser, for eksempel med den valgfri belægning med basalmembranen matrix proteiner i celle kultur fartøjer, ii) et øget antal subkultur og skik af serum-holdige medier, både store førere af genetiske og fænotypiske ændringer af celle linier15, eller iii) svært at reproducerbar genskabe den rette balance mellem astroglial og endotel komponenter i et fad. Selv om brugen af udødeliggjort celler eller kommercielle celle linjer for at etablere en in vitro-BBB model mangler nogle af egenskaberne i forhold til lignende modeller, der kun bruger primærelementer, i den beskrevne metode viser vi, at den rette kombination af celler udstillinger en meget sammenlignelige resultater til offentliggjort undersøgelser i andre modeller af reference16,17. Til sidst, motiveret manglen på en robust og reproducerbare model at studere passage af terapeutiske forbindelser målretning hjernetumorer gennem BBTB os til at udvikle de metoder, der beskrives her.
Da målet var at bruge modellen til at forudsige in vivo levering af nanopartikler i prækliniske dyremodeller, valideres vi først BBTB modellen ved at udnytte skær murine endothelial celler i kontakt med murine astrocytter. Ud over dette optimeret vi også model for at bruge visse menneskelige cellelinjer. Når stabiliseret, er celle barrierer overført til kulturer med patienten-afledte glioblastom kugler eller kommercielle gliom cellelinjer. Transcytosis af nanopartikler og tumor celle målretning kan derefter visualiseres ved Konfokal mikroskopi og kvantificeres ved indsamling af prøver over tid. Vigtigere, kunne resultater, der opnås ved hjælp af BBTB efterligner pålideligt forudsige funktionsmåden af nanopartikler in vivo, støtter brugen af BBTB efterligne forudgående prækliniske valideringen.
Protocol
De dyreforsøg blev godkendt af Udvalget for dyr eksperimenter for District i det sydlige Finland (ESAVI/6285/04.10.07/2014).
1. etablering af BBTB efterligner
Bemærk: Cellekulturmedium og kosttilskud er nærmere beskrevet i tabel af materialer.
- Forberedelse af astrocytter
Bemærk: De følgende mængder er egnet til en 10 cm petriskål eller en T75 celle kultur kolbe.- Under en steril celle kultur hætte, omhyggeligt vaske de kulturperler astrocytter med 5 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Forsigtigt kassere PBS ved hjælp af en vakuumpumpe, og der tilsættes 2 mL af celle dissociation reagens i 5 min (ved 37 °C, se Tabel af materialer) til at frigøre cellerne. Kontrollere celle detachement under mikroskop. Overskrid ikke 5 min inkubation at begrænse stress på cellerne.
- Der tilsættes 10 mL af sterile komplet astrocyte cellekulturmedium (ABM +) til fartøj til at hæmme aktiviteten af celle dissociation reagens. Bruge en steril serologisk pipette til at overføre de fritliggende celler fra skibet til en steril 15 mL tube. Centrifugeres cellesuspension til 3 min. ved 250 genbrugsfibre (acceleration: 9 genbrugsfibre/s, deceleration: 5 genbrugsfibre/s) ved stuetemperatur (RT).
- I mellemtiden forbereder indsætter (Se Tabel af materialer): ved hjælp af steril pincet, placere skær med hjernen side op (figur 1A) på låget af en steril 6-godt plade (figur 1B). Kontrollere på forhånd, at pladen kan være placeret op og ned på indsætter uden at røre eller flytte indsætter i løbet af processen.
Bemærk: Den korrekte placering af indsætter tillader fastklemning af astrocyte suspension mellem membranen og i bunden af brønden. - Når centrifugeres, omhyggeligt supernatanten fra cellesuspension; astrocyte resuspenderes i 1 mL af ABM + af forsigtigt resuspending pellet på tube's væg op til 5 x. Undgå overdreven Pipettering af celler til at begrænse stress på cellerne. Tælle cellerne og justere celle suspendering massefylden til 1,5 x 105 celler i 400 µL af ABM / Indsæt.
- Placer cellesuspension midt i hjerne-side af Indsæt's membran (figur 1B) og meget forsigtigt sprede det via kapillar kraft med en steril pipette tip. Undgå direkte kontakt som membranen er særligt skrøbelige.
- Med hjernen side af indsætter stadig op, 6-godt pladen anbringes tilbage på skærene. Dette sikrer, at cellesuspension er fanget mellem membranen og selve bunden af brønd (figur 1 c). Undgå luftbobler i cellesuspension, da det vil forhindre homogen spredning af astrocytter på membranen.
- Placere plade og skær, med hjerne side op, i rugemaskinen (ved 37 °C med 5% CO2) at tillader celle vedhæftning for et minimum af 2 h (murine udødeliggjort astrocytter) og op til 6 h (menneskelige primære astrocytter).
Bemærk: Som indsætter vedligeholdes hovedet, er visualisering af celle vedhæftning ikke muligt under et mikroskop. Det anbefales derfor, at frø en separat regelmæssig celle kultur fartøj og styre celle vedhæftning i skibet over tid. Omhyggelig manipulation af membranen er et must, da resultaterne bliver upålidelige når membraner er beskadiget. - For enden af inkubationstiden verificere fravær af celle suspension lækager uden for området seeding og kassér indsætter, hvis de er utætte. Vende den 6-godt plade til sin regulære position, med skær, der nu vil have blod side op (figur 1A). 2.6 mL ABM + tilsættes til hvert hul. Hæld 2,5 mL af komplet astrocyte medium i hver Indsæt og pladen anbringes i inkubator (37 °C med 5% CO2).
- Forberedelse i endothelial celler
Bemærk: For murine hjernen mikrovaskulære endothelial celler (bEND3) skal celler være 100% sammenløbet for at sikre maksimal celle-celle kontakter udløser optimal tight junction protein udtryk på dagen af forsøget. Dette gælder ikke for de menneskelige umbilical vene endothelial celler (HuAR2T) som tilstedeværelsen af astrocytter er nødvendige for et tight junction-protein udtryk for disse celler.- Fortsæt som tidligere beskrevet for astrocytter (trin 1.1.1 og 1.1.2.). Når centrifugeres, omhyggeligt supernatanten; endotel celle resuspenderes i 1 mL af komplet endotel cellekulturmedium (EBM +) af langsomt pipettering cellesuspension på tube's væg op til 5 x. Undgå overdreven Pipettering af celler til at begrænse stress på cellerne. Tælle cellerne og justere celle suspendering massefylden til 2 x 105 celler i 2,5 mL/Indsæt i endothelial cellekulturmedium uden serum (EBM-) og vaskulær endotel vækstfaktor-en (VEGF-A).
- Tag pladen som indeholder indsætter, omhyggeligt kassere medium fra blod side, og erstatte det med 2,5 mL i endothelial cellesuspension. Returnere pladen til rugemaskine (ved 37 °C med 5% CO2) og lad det natten over for endotelceller at holde sig til membranen.
- Den næste dag, forberede en steril 6-godt pladen ved at overføre 3 mL af forvarmet serumfrit astrocyte medium (ABM-) til hver brønd. Ved håndtering af skær med steril pincet, omhyggeligt kassere i endothelial komplet medium fra blod side, placere indsatsen i den ny plade der indeholder ABM-, og tilsættes 2,5 mL af EBM-.
Bemærk: Brugen af EBM - er afgørende for etableringen af den endotel barriere (der henvises til afsnittet diskussion). - Forlade indsætter i inkubator (37 °C med 5% CO2) med minimal fysiske forstyrrelser og temperaturen variationer i 5 dage, så produktionen i endothelial basalmembranen, astrocyte kontakter med endotelceller, og til sidst, BBTB efterligne dannelse. Udskift mediet på dagen for overførslen på gliom cellekulturer (der henvises til afsnit 1.4).
- Måling af BBTB efterligne permeabilitet (valgfri)
- Passiv diffusion af små molekylvægt fluorescerende farvestof natrium-fluorescein (Na-Fl) over tid fra blod til hjerne side indsætter giver beregningen af permeabilitet værdier efter følgende formel:
Her, dFgodter fluorescens værdien målt i brønden på et bestemt tidspunkt minus næringssubstratet autofluorescence celleværdi, dT er tid i sekunder, er overfladen af barriere i kvadratcentimeter, og dFindsætte måles værdien fluorescens i indsatsen for de samme tidspunkt minus værdien medium autofluorescence). - Indsamle 100 µL af medium fra både blod og hjerne sider af BBTB efterligner og overføre hver af dem til en separat fladbundede, sort 96-brønd plade for efterfølgende fluorescens målinger. Bruge plain medierne som tomt til at korrigere autofluorescence.
- Forberede 2,5 mL pr. brønd af Na-Fl (50 µM) i EBM-. Prewarm Na-Fl løsning til 37 ° C. Erstatte medier fra blod siden af skærene med de medier, der indeholder Na-Fl. starter en timer som mediet er erstattet.
- Indsamle omhyggeligt 100 µL af medier fra både blod og hjerne side af skær på 5, 30, 60 og 120 min. overføre hver prøve at adskille pladens huller, sorte 96-brønd.
- Derfor erstatte de indsamlede medier fra skær at opretholde lydstyrkebalance mellem begge sider. Placer indsætter tilbage i inkubatoren mellem hver prøve samling at minimere temperaturen variationer.
- Kvantificere fluorescens fra de indsamlede prøver, ved hjælp af en Pladelæser med filteret på 480/560 nm (excitation og emission, henholdsvis).
Bemærk: Fluorescens fra hjernen side er næsten ikke målbart på 5 min gang punkt. Høje værdier i forhold til blindprøven angiver en lækage af / skade på Indsæt's membran eller barriere; derfor udelukke disse fra yderligere analyser. Forventet Na-Fl permeabilitet værdier for BBTB skal være i den 10-5 til 10-6 cm/s sortiment (tabel 1).
- Passiv diffusion af små molekylvægt fluorescerende farvestof natrium-fluorescein (Na-Fl) over tid fra blod til hjerne side indsætter giver beregningen af permeabilitet værdier efter følgende formel:
- Forberedelse af gliom celler
Bemærk: Selvom patienten-afledte glioblastom kugler bruges her, kan følgende protokol nemt tilpasses for vedhængende, kommercielt tilgængelige glioblastom celler som U - 87 MG.- Valgfrit, immunofluorescens imaging, Læg op til fire runde sterile borosilicate coverslips (ø 0.9 cm) pr. brønd i en 6-godt plade med 2 mL af poly-D-lysin (0,01%). Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
- I mellemtiden, omhyggeligt overføre tumor kugler fra celle kultur fartøj til en 15 mL sterilt rør ved hjælp af en steril serologisk pipette. Der centrifugeres tumor kugler til 3 min. ved 250 genbrugsfibre.
- Supernatanten, forsigtigt resuspend kugler i 1 mL bFGF/EGF-fri (GBM-) gliom celle medium og tælle cellerne. Justere celle tæthed til ca. 104 kugler/mL (105 celler/mL) i GBM-.
- Kassér poly-D-lysin fra brøndene og skyl dem 3 x med steril PBS. Seed plade med 3 mL/godt af tumor klumpformet suspension og overføre skær med BBB efterligner på tumor cellesuspension.
- Der inkuberes natten over (ved 37 °C med 5% CO2) at tillade ligevægt mellem blod og hjernen tumor sider af analysen. Den næste dag, skal du erstatte medier i blod side med EBM-suppleret med molekyler/narkotika/nanopartikler af interesse. Prøverne er indsamlet over tid for direkte kvantificering som beskrevet i forrige afsnit. Celler er fastsat for et præcist tidspunkt for fluorescens imaging (der henvises til afsnit 2.1 og 2.2).
2. høj opløsning Konfokal billeddannelse af BBTB
Bemærk: 4% PARAFORMALDEHYD (PFA, pH 7,4, 6 mL pr. BBTB replikat) er altid forberedt friske i PBS. Hold det på køl.
Forsigtighed: PFA er kræftfremkaldende. Bruge nitrilhandsker til at håndtere PFA og forberede løsningen under en kemisk stinkskab.
-
BBTB endotel udtryk for tight junction proteiner
- Skyl begge sider af membranen med iskold PBS (3 x 5 min, 2,5 ml/Indsæt, 3 mL/godt). Kassér PBS og tilsættes 3 mL og 2,5 mL iskold 4% PFA i brønden og Indsæt, henholdsvis. Der inkuberes i isbad i 10 min. kassere PFA (ifølge institution's farlige kemiske bortskaffelse) og skyl 3 x med PBS på RT (2,5 mL/Indsæt, 3 mL/hul).
Bemærk: Når fast, kan prøver opbevares i PBS (2,5 mL/Indsæt, 3 mL/hul) ved 4 °C for en uge. - Brug en vatpind til at aftørre hjernen side indsætte og fjerne astrocytter. Brug en skarp skalpel, omhyggeligt skåret membranen i fire lige store stykker ved at gøre to vinkelrette snit, danner et kors. Derefter indsætte skalpel på det punkt hvor membranen er fastgjort til Indsæt væg og rotere Indsæt med anden hånden til at befri de fire prøver. Bruger fine pincet, omhyggeligt overføre hver prøve til en 24-godt plade der indeholder 200 µL af PBS/godt, med blod side op i hver brønd.
- Blokere membraner med 10% føtal bovint serum i PBS (for 30 min på RT, 200 µL/brønd). Forberede 1° antistof løsning for immunfarvning af stram vejkryds proteiner (fig. 1 d) (zonula occludens-1, claudin-5, henvises til Tabel af materialer) i 200 µL blokerende løsning/godt. Valgfrit, er endotel celle identitet bekræftet ved at tilføje et antistof, der er rejst mod trombocyt endotel celle vedhæftning molekyle (PECAM1 eller CD31, der henvises til Tabel af materialer) til hver tight junction antistof løsning. Kassér den blokerende løsning og inkuberes med de primære antistoffer' O/N ved 4 °C.
- Den næste dag, kassere de primære antistoffer og skyl dem med 200 µL af PBS (3 x i 5 min på RT). Inkuber dem med passende artsspecifik fluorophore-konjugeret sekundære antistoffer (1: 500 fortynding, 200 µL/brønd, fortyndet i blokerende løsning, der henvises til Tabel af materialer) i 2 timer ved RT.
- Kassér de sekundære antistoffer, skylles med 200 µL af PBS (3 x i 5 min på RT). Fjerne PBS og counterstain af cellekerner ved hjælp af en 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning i en endelig koncentration på 1 μg/mL i ren destilleret H2O (dH2O; 200 µL/brønd; henvises til tabel af materialer ). Inkuber i 7 min. ved RT. Fjern DAPI og vaske membraner 3 x med dH2O (200 µL/brønd).
- Anbring en dråbe af montering medium (Se Tabel af materialer) på et glas objektglas. Bruger fine pincet, omhyggeligt tage membranen ud af brønden, og at holde retningen, fjerne overskydende af dH2O og placere den på dråbe af montering medium. Tilføje en anden dråbe montering medium oven på membranen og omhyggeligt dække det med et dække borsilikatglas. Sikre, at der er ingen fanget luftbobler. Opbevare prøver ved 4 °C og væk fra lys indtil konfokalmikroskopi observationer.
Bemærk: Astrocyte farvning kan udføres ved at placere brikkerne i membraner i 24-godt plade med hjernen opad, og med anvendelse af udvalgte astrocyte-specifikke antistoffer (f.eks. rettet mod den glial fibrillære syre protein [GFAP]) (figur 1E ).
- Skyl begge sider af membranen med iskold PBS (3 x 5 min, 2,5 ml/Indsæt, 3 mL/godt). Kassér PBS og tilsættes 3 mL og 2,5 mL iskold 4% PFA i brønden og Indsæt, henholdsvis. Der inkuberes i isbad i 10 min. kassere PFA (ifølge institution's farlige kemiske bortskaffelse) og skyl 3 x med PBS på RT (2,5 mL/Indsæt, 3 mL/hul).
-
BBTB fluorescens farvning for at opdage nanopartikel transcytosis
- Udføre live-celle lysosomet mærkning (f.eks. ved hjælp af fluorescerende sonder [Se Tabel af materialer]). Fortynd lysosomet fluorescerende farvestof i en arbejdsgruppe koncentration på 50 nM i forvarmet EBM - (2,5 mL/Indsæt) eller 75 mm i forvarmet ABM - (3 mL/hul) for lysosomet mærkning i endothelial celler og astrocytter, henholdsvis. Inkuber celler i 45 min (ved 37 °C med 5% CO2); Skyl 3 x med iskold PBS (2,5 mL/Indsæt, 3 mL/hul).
- Kassér PBS og tilsættes 3 mL og 2,5 mL iskold 4% PFA til brønden og Indsæt, henholdsvis. Inkuber dem i isbad i 10 min. kassere PFA og skyl celler 3 x med PBS (på RT, 2,5 mL/Indsæt, 3 mL/hul).
Bemærk: Når fast, kan prøver opbevares i PBS (2,5 mL/Indsæt, 3 mL/hul) ved 4 ° C i en uge. - Fjerne PBS og counterstain af cellekerner ved hjælp af en DAPI løsning i en endelig koncentration på 1 µg/mL i dH2O (1 mL/Indsæt, 1 mL/hul). Inkuber dem i 7 min. ved RT. Fjern DAPI og vaske membraner 3 x med dH2O (2,5 mL/Indsæt, 3 mL/hul).
- Omhyggeligt skæres membranen, fjerne overskydende af dH2O, og Placer den på en dråbe af montering medium (Se Tabel af materialer) på et glas objektglas. Tilføje en anden dråbe montering medium på anden siden af membranen og omhyggeligt dække det med et dække borsilikatglas. Undgå fanget luftbobler. Opbevare prøver ved 4 °C og holde dem beskyttet mod lys indtil konfokalmikroskopi billeddannelse.
-
Fluorescens farvning af tumorceller
- Bruger fine pincet, omhyggeligt overføre den runde coverslips indeholdende tumor kugler til en 24-godt tallerken fyldt med iskolde PBS. Fortsætte med live-celle lysosomet mærkning ved hjælp af fluorescerende lysosomet sonder på 75 nM i forvarmet GBM - (200 µL/brønd). Inkuber prøver for 45 min. Skyl dem 3 x med iskold PBS (200 µL/brønd).
- Kassér PBS og tilføje 200 µL af iskold PFA pr. brønd. Der inkuberes i isbad i 10 min. kassere PFA og skyl prøver 3 x med PBS (på RT).
Bemærk: Når fast, prøverne kan opbevares i PBS (200 µL) ved 4 ° C for en uge. - Fjerne PBS og counterstain af cellekerner ved hjælp af en DAPI løsning i en endelig koncentration på 1 µg/mL i dH2O (200 µL/brønd). Inkuber dem i 7 min. ved RT. Fjern DAPI og vaske coverslips 3 x med dH2O (200 µL/brønd).
- Bruger fine pincet, tage ud i coverslip, fjerne overskydende af dH2O og placere den på en dråbe af montering medium (Se Tabel af materialer) på et glas objektglas. Undgå narres eventuelle luftbobler. Opbevare prøver ved 4 °C og holde dem beskyttet mod lys indtil konfokalmikroskopi observationer.
3. in Vivo sammenlignende undersøgelse
- In situ optagelse af natrium-fluorescein diffusion gennem BBB
- Forberede 150 µL af en 50 nM Na-Fl løsning i en fysiologisk løsning. Holde løsningen ved 37 °C ved intravenøs levering.
- Bedøver en mus med en intraperitoneal injektion af en ketamin/xylazin cocktail (300 µL af 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin i PBS). Når dybe anæstesi er etableret, skal du placere dyret på en varmepude til at opretholde sin kropstemperatur.
Bemærk: Ti-uge-forhenværende kvindelig Naval Medical Research Institute (NMRI) nøgen immunkompromitterede mus har været brugt til at hente data præsenteret i figur 2. Denne protokol er dog tilpasset både immunkompetente og immunkompromitterede mus. Metoden anæstesi/analgesi er på videnskabsmand's skøn. Inhalation anæstesi som isofluran anbefales dog ikke, da det øger BBB permeabilitet18. - Placer musen på et stereotaxisk rammen (Se Tabel af materialer) og udføre en langsgående indsnit i hovedbunden med fine saks, efterfulgt af blid dilacerations af bindevæv, ved hjælp af fine pincet, for at afsløre kraniet. Ved hjælp af cirkulære bevægelser med et fint microdrill, fjerne en ø 0,3 mm cirkulære stykke af kraniet fra den venstre eller højre parietal knogle. Fortsætte med ekstrem forsigtighed under boring og samtidig fjerne kraniet stykke for at undgå at skade den underliggende meningeal væv og blodkar.
- Anbring en dråbe af fysiologiske løsning på de udsatte væv. Ved hjælp af to par af fine pincet, forsigtigt fjerne de meningeal væv for at få adgang til hjernens cortex. Hjernevæv bør aldrig være i direkte kontakt med luft.
Bemærk: Mindre hemorrhages fra meningeal skade kan stoppes ved hjælp af hæmatologiske svampe (henvises til Tabel af materialer). - Når de meningeal væv er fjernet og cortex er fuldt eksponeret, lokke en dråbe af fysiologiske løsning mellem cortex og en ø 0,5 mm borosilicate coverslip. Sikre bemærkning området med en dråbe Cyanocrylat lim (henvises til Tabel af materialer) spredt rundt i coverslip med en nål. Lad limen tørre i 1 minut.
- Forberede den implantable kateter til hale vene injektion (figur 2A). Bryde spidsen af en 25 G nålen ved hjælp af Rochester-Ochsner pincet og indsætte spidsen i 10 cm lange PE20 polyurethan rør (der henvises til Tabel af materialer) (figur 2A).
- Indsæt kateteret ind i laterale hale vene af musen, bruge bulldog klemmer til kateter manipulation og indsættelse (henvises til Tabel af materialer) (figur 2B). Sikre den indsatte nål med en dråbe Cyanocrylat lim. Lad limen tør for 20 s før du fjerner bulldog klemme. Omhyggeligt Tilslut anden enden af kateteret til en 25 G kanyle tilsluttet en sprøjte, der indeholder Na-Fl løsning (figur 2B).
- Bemærk: Ikke klemme halen med bulldog klemme; det bruges kun til præcise kateter håndtering. Ordentlig kateter indsættelse kan bekræftes af blod refluks i gennemsigtig slange.
- Placere dyret under stereomikroskopet (Se Tabel af materialer). Ved hjælp af den laveste-niveau-autofluorescence i den grønne kanal (480 nm), fokusere på et område, der indeholder relativt store blodkar (de vises mørkere på grund af hæmoglobin absorption af lys ved denne bølgelængde) og mindre kapillærer (figur 2 c). Start time-lapse erhvervelse kort før injektion af fluorescerende farvestof for at få en måling af baggrunden fluorescens.
Bemærk: Alternativt, time-lapse optagelsen kan erstattes af snapshot billeder fra T0 og fra enhver anden forudbestemt tidspunkt punkter. - Injicere løsning i en langsom og konstant tempo, eller alternativt bruge en automatiseret infusion system. Na-Fl fluorescens påvises i blodet bør forblive stabil (halveringstid i blodet: 286 min), som giver mulighed for en optagelse af BBB diffusion gennem vinduet kranie i flere minutter. Når købet er gennemført, forsigtigt fjerne kateteret og aflive dyret af cervikal dislokation.
- In vivo bestemmelse af BBB permeabilitet
Bemærk: Værdier er fremstillet af billedbehandling software, såsom ImageJ, tillader måling af fluorescens signal intensitet inde i en brugerdefineret region af interesse (ROI).- Ved hjælp af værktøjet anmærkning tegne et rektangel-formet ROI udenfor et blodkar i hjernevævet, på omkring 5 µm afstand fra nogen synlige blodkar fyldt med Na-Fl. Note dimensioner af ROI og målte fluorescens intensitet på T0 i denne ROI, som bruges som tom for væv's autofluorescence. Uden fortrænger ROI, spole frem gangen postinjection punkt (f.eks., at den allersidste indspillet ramme når hele løsningen har været injiceres at dyret) og Bemærk de præcise tid og fluorescens målte inden for ROI (figur 2 c).
- Flytte ROI på en synlige blodkar (figur 2 c) og Bemærk T0 autofluorescence værdi fra blodet. Uden fortrænger ROI, spole hurtigt frem til det samme tidspunkt, som defineret i trin 3.2.1. og Bemærk fluorescens værdi målt i ROI (figur 2 c).
- Brug følgende formel (tilpasset fra punkt 1.3) til at bestemme BBB permeabilitet:
- Her, dFhjernen er fluorescens intensitet værdi minus T0 tom værdi i hjernen, dT er punktet erhvervelse tid i sekunder, A er den omtrentlige fartøj areal, som området ROI i kvadratcentimeter, og dF blod er fluorescens intensitet værdi minus T0 tom værdi i blodet.
Bemærk: Forventet permeabilitet værdier for BBB skal være i området 10-6 cm/s (tabel 1).
- Væv forarbejdning til påvisning af fluorescerende nanopartikler i murine hjernen
- Implantat patient-afledte glioblastom kugler (5 x 104 celler i 5 µL sterilt PBS) i bedøvede 6 uger gamle NMRI nøgen hunmus i corpus callosum. Find dette område af hjernen på de følgende stereotaxisk koordinater, startende fra Bregma: anteroposterior + 0,5 mm, venstre mod højre + 2,5 mm, dorsoventral + 3 mm. tillade hjernetumor til at vokse i 2 uger.
- Injicere nanopartikler intravenøst (100 µg i 100 µL sterilt fysiologisk løsning) og tillade dem at cirkulere for 8 h. injicere kontrol mus intravenøst med 100 µL sterilt fysiologisk løsning.
- Aflive mus af cervikal dislokation og indsamle hjerner hurtigt for snap-frysning i isopentane vedligeholdes på tøris (1 min på-50 °C). Store hjerner ved-80 °C indtil væv behandling.
- Skær koronale hjernen sektioner med en cryomicrotome. Find det intrakranielle implantation af arret det dannet på cortex og skær 9 µm tykt sektioner fra dette område på de passende objektglas (Se Tabel af materialer).
- Fordyb afsnittene hjerne, der er immobiliseret på dias i iskold PBS (2 x til 5 min) og derefter rette dem i iskoldt 4% PFA (for 5 min). Vask dias i PBS (3 x i 5 min på RT). Objektglassene vandret og afpipetteres blokerende løsning indeholdende 10% føtal bovin serum i PBS på væv sektioner, der dækker hele overfladen (for 1 h i RT, 500 µL/dias). Forberede CD31 antistof (henvises til Tabel af materialer) i 250 µL blokerende løsning/dias. Erstatte den blokerende løsning med antistoffet og inkuberes natten over ved 4 °C i en fugtig kammer.
- Den næste dag, fordybe dias i PBS (3 x i 5 min på RT), og der inkuberes dem med den tilsvarende fluorophore-konjugeret sekundær antistof (1: 500 i 250 µL af PBS for 2 h i RT). Skyl 3 x i PBS (på RT) og counterstain af cellekerner ved hjælp af en DAPI løsning i en endelig koncentration på 1 µg/mL i dH2O (250 µL/dias). Inkuber prøver i 7 min. på RT. Fjern DAPI løsning og vaske dias 3 x med dH2O.
- På hvert væv afsnit, tilføje en dråbe af montering medium (henvises til Tabel af materialer) og sikre prøverne med en coverslip. Undgå narres luftbobler. Opbevare prøver ved 4 °C og holde dem beskyttet mod lys indtil konfokalmikroskopi observationer.
Representative Results
Konfokal billeddannelse af murine BBTB efterligner viser udtryk og cellulære lokalisering af stram vejkryds proteiner zonula occludens-1 (ZO-1) og claudin-5 i bEND3. Kontakter mellem i endothelial celler og astrocytter induceret klart flytning af ZO-1 og claudin-5 i endothelial celle-celle kontakter i forhold til bEND3 monokulturer (fig. 1 d). Med immunofluorescens farvning for at visualisere GFAP-udtrykker astrocytter på hjernen-side af membranen, er det muligt at observere og studere astrocytic processer og ende-fødder at kontakte i endothelial celler gennem membran (figur 1E ). Astrocyte-endotel celle kontakter er kendt for at fremme og stabilisere stramning af den cellulære barriere og er forbundet med lavere permeabilitet værdier for BBB19. Efter at vi observeret et betydeligt fald i permeabilitet af mus BBTB efterligner for Na-Fl fra 27.63 (± 3,45) x 10-6 cm/s i tilfælde af monokulturer til 6.74 (± 3.01) x 10-6 cm/s når Co kulturperler med hypoxi-inducerbar faktor knock ud (HIFko) astrocytter (tabel 1). Den udødeliggjort HuAR2T danner meget gennemtrængelig cellulære barrierer (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s, tabel 1). Svarende til den murine model, vi målte betydeligt lavere permeabilitet af BBTB til Na-Fl, nemlig 47.4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, når HuAR2T cellerne var Co kulturperler med de menneskelige primære astrocytter (tabel 1).
I både murine og menneskelige BBTB efterligner induceret tilstedeværelsen af patient-afledte glioblastom kugler en svag stigning i permeabilitet værdier i forhold til i endothelial celle-astrocyte Co kulturer alene (tabel 1). Dette fænomen er observeret med flere, men ikke alle af de tålmodige gliom sfære modeller. Dette kan skyldes den VEGF-A, der udskilles af nogle af disse patient-afledte celler.
For at sammenligne permeabilitet værdier af in vitro-BBTB efterligner med in vivo BBB, filmede vi real-time udbredelsen af Na-Fl gennem et kranie vindue implanteret i nøgen mus. Ved hjælp af et fluorescens stereomikroskop, blev Na-Fl diffusion fra blodkar kapillærer fra de vigtigste pial blodkar indspillet før, under og efter systemisk injektion af sonde (figur 2 c). Målinger af differential fluorescens værdier fra den cirkulerende blod og hjerne kortikale parenkym over tid tillod os at beregne de omtrentlige permeabilitet værdier af nøgen musen's BBB for Na-Fl (5,57 ± 2.19 x 10-6 cm/s, Tabel 1).
For at illustrere, hvordan denne BBTB efterligner kan anvendes til visualisering af passage af stoffer fra blodet side til hjernen side, sammenlignede vi transcytosis ø 110 nm (NP110) og ø 350 nm (NP350) nanopartikler målretning patient-afledte glioblastom kugler. Resultater opnået i vitro blev derefter sammenlignet med den in vivo transcytosis. I eksemplet præsenteres nanopartikler var overfladen belagt med tumor-targeting peptid CooP20 og fyldt med den fluorescerende farvestof (FITC) at lette visualisering. Vi mærket celler ved hjælp af den lysosomale farvestof og counterstained med DAPI 24 timer efter tilsætning af FITC nanopartikler i blod-side af BBTB efterligner og erhvervet Konfokal micrographs på forskellige niveauer (f.eks. blod side, membranen, hjernen side, og patienten glioblastom kugler) (figur 3A). Den NP110-associerede fluorescerende signal colocalized med lysosomer i endothelial celler, astrocytter og tumor celler. Derudover NP110s blev opdaget i-mellem i endothelial celler og astrocytter, passerer gennem membranen porerne i Indsæt (figur 3A).
Passage af NP110s var kvantificeres ved at måle fluorescens fra prøver, der opsamlet fra både blod og hjerne side. Disse permeabilitet værdier blev sammenlignet med dem bestemmes for nanopartikler af ø 350 nm (NP350). Resultaterne viser, at kun NP110 var i stand til at krydse BBTB efterligner (figur 3B). NP350 forblev på blod-siden af BBTB efterligner, hvilket resulterede i lavere permeabilitet værdier for disse nanopartikler.
For at understrege relevansen af BBTB efterligner i forhold til in vivo modeller, blev nøgen mus intravenøst injiceret med NP110 eller NP350 nanopartikler belagt med tumor-targeting peptid CooP og konjugeret med rødt fluorescerende farvestof (TRITC) til påvisning. Væv, der opsamlet på flere tidspunkter afslørede, at efter 8 h, BBB-gennemtrængelige nanopartikler har behovet i hjernen parenkym, mens den nonpermeable dem, der opholdt sig i omløb var hovedsagelig ryddet fra systemisk cirkulation in vivo. Derfor, vi har indsamlet hjerner og kvantificeret antallet af nanopartikler pr. kvadrat millimeter 8 h postinjection. I overensstemmelse med den in vitro-resultater, NP110, men ikke NP350, med held behovet i hjernen parenkym (figur 3 c). Høj forstørrelse billeddannelse af nanopartikel placering i hjernen viste at NP110 var ensartet fordelt i hjernen parenkym udenfor Blodkapillærer og med held homed implanterede glioblastom celler (figur 3D). Trods udstiller den samme tumor målretning gruppe (CooP), NP350 var ikke i stand til at extravasate i hjernen parenkym og blev kun påvist i den luminale side af hjernen blodkar (figur 3), svarende til de opnåede in vitro-. resultater
Figur 1: Beskrivelse af modellens blod-hjerne tumor barriere (BBTB). (A) skematisk gengivelse af placeringen af forskellige celletyper. (B) Illustration af Indsæt placeringen på dækslet til 6-godt plade og den såning teknik til astrocytter i hjernen side af Indsæt's membran. (C) Illustration af den 6-godt plade placering tillader astrocyte vedhæftning. (D) immunofluorescens micrographs af stram vejkryds proteiner zonula occludens-1 (ZO-1, øverste række, red) og claudin-5 (nederste række, grønne). Protein udtryk er i forhold til murine hjernen mikrovaskulære endotelceller (bEND3) kulturperler i blod side af BBTB alene som en monokultur (venstre kolonne) eller med murine udødeliggjort HIFko astrocytter (højre kolonne). Cellekerner er counterstained med DAPI (blå). (E) immunofluorescens Mikrograf viser den glial fibrillære sure protein (GFAP, red) i HIFko astrocytter kulturperler på hjernen side af BBTB. Høj forstørrelse billede viser astrocyte processer og ende-fødder (pile) at kontakte i endothelial celler gennem membranen porer (højre panel). HIFko astrocytter identitet blev bekræftet ved immunfluorescens farvning af den simian virus 40 store T antigen (SV40 store T, grøn) bruges til immortalization af celler. Endotelceller express hverken GFAP eller SV40 stort T, og derfor kan være delvist observeret gennem den gennemsigtige, modsatte side af membranen som kun DAPI-farvede celler (stiplet linje). Cellekerner er counterstained med DAPI (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Intravital live bestemmelse af musen BBB permeabilitet. (A) forberedelse af implantabelt caudale vene kateter. (1) værktøj og udstyr, er følgende: (et) en PE20 polyethylen rør (b) to 25 G nåle (c) Rochester-Ochsner pincet, og (d) en lille bulldog klemme. (2) en 25 G kanyle er fjernet af flere torsions ved hjælp af pincet og (3) omhyggeligt indsat i røret. (4) anden siden af røret er tilsluttet en anden 25 G kanyle. (B) vejledning til kateter implantation og placering til at indgyde natrium-fluorescein løsning gennem halen venen på en mus. Kredsede området angiver det område, hvor en dråbe Cyanocrylat lim er placeret til at sikre kateteret. Bulldog klemme bruges til at håndtere kateteret og fjernet når kateteret er sikret. (C) repræsentative imaging og kvantificering metode til at afgøre, natrium-fluorescein permeabilitet værdier. Før natrium-fluorescein infusion (venstre kolonne) måles autofluorescence/blank indenfor en region af interesse (ROI) placeret på hjernen (øverste panel, hvide rektangel) og blodkar områder (nederste panel, røde rektangel). Under natrium-fluorescein infusion (højre kolonne), er fluorescens-intensiteten målt i både ROIs, giver beregningen af BBB permeabilitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: forudsigelse af nanopartikler gennem BBB in vivo, in vitro-BBTB modellen intracerebralt transcytosis. (A) grafisk repræsentation af BBTB analysen med repræsentative Konfokal billeder fremstilles på de angivne forskellige niveauer af murine BBTB model. Nanopartikler af 110 nm i diameter (NP110) og konjugeret til FITC (grøn) blev føjet til blodet side af BBTB celler blev mærket med lysosomale sonden (LT-99, red). (1) Endothelial celler, (2) Endothelial transcytosis af nanopartikler gennem porerne i membran (hvide stiplede linje), (3) astrocytter, og (4) patient glioblastom kugler er identificeret på grafiske og tilsvarende Konfokal micrographs (til højre). Lysosomale indkapsling af nanopartikler (pile) foreslår aktive transcytosis gennem endotel og astrocyte lag af BBTB. (B) kvantificering af de angivne nanopartikel permeabilitet gennem in vitro-BBTB (n = 6). (C) kvantificering af den angivne nanopartikel tæthed i hjernevæv sektioner, 8 h efter caudale vene infusion af nøgen mus (n = 3). (D) Konfokal micrographs viser fordelingen af ø 110 nm nanopartikler (NP110, red) i murine hjernen væv sektioner mærket med en anti-mus CD31 antistof (grøn). Pilen fremhæver nanopartikel transcytosis (venstre panel). Nanopartikler akkumuleret omkring hjernen tumorceller (tumor, højre panel) på grund af den CooP-targeting peptid præsenteret på deres overflade. Ingen betydelig homing er observeret i hjernevæv (hjernen). (E) Konfokal micrographs viser fordelingen af ø 350 nm nanopartikler (NP350, red) i murine hjernen væv sektioner mærket med en anti-mus CD31 antistof (grøn). Pilespidser punkt til den NP350s, der blev bevaret i blodkar lumen og var ude af stand til at krydse BBB, sandsynligvis på grund af deres større diameter sammenlignet med NP110s. cellekerner er counterstained med DAPI (blå). P < 0,01. P-værdier blev beregnet ved hjælp af en to-sidet, ikke-parametrisk Mann-Whitney U test. Fejllinjer udgør standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| murine BBTB efterligner | bEND3 | bEND3 + HIFko som | bEND3 + GB | bEND3 + HIFko som + GB | In vivo |
| Permeabilitet (10-6 cm/s) | 27.63 | 6.74 | 26,8 | 10.83 | 5.57 |
| SD (10-6 cm/s) | 3,45 | 3.01 | 7,99 | 2,65 | 2.19 |
| menneskelige BBTB efterligner | HuAR2T | HuAR2T + hIAs | HuAR2T + GB | HuAR2T + hIAs + GB | |
| Permeabilitet (10-6 cm/s) | 104.92 | 47.4 | 89.08 | 48.24 | |
| SD (10-6 cm/s) | 27.1 | 14.32 | 10,21 | 13.07 |
Tabel 1: værdier af natrium-fluorescein (Na-Fl) permeabilitet (i centimeter i sekundet) bestemmes in vitro- i de angivne Co kultur systemer og in vivo i NMRI nøgen mus. Data fra en repræsentativ eksperiment (n = 3 mus).
Discussion
Anledning af begrebet interpatient tumor variabilitet forynget forskning på personlig cancer medicine21. Denne variation er også kendetegnende for centralnervesystemet neoplasmer. På grund af uforudsigeligheden af tumor, reaktion på kemoterapi tilføjer til den levende effekt af BBB for medicinafgivelse, og helt udgør store udfordringer i patientpleje22. For at udvikle mere effektive behandlinger, er det ofte nødvendigt at skærmen store biblioteker af nye molekyler. For at evaluere den antitumor effekt og evne af de nye terapeutiske fører til tumor site, er den bedste løsning den prækliniske undersøgelse på patient-afledte celler implanteret i vivo i murine patient avatarer. På grund af praktiske (finansielle, tid, menneskelige og facilitet ressourcer) og etiske grunde (3R-princippet ved hjælp af forsøgsdyr), er udvikling af sådan en omfattende in vivo screening platform ofte ikke muligt, og derfor de celle-baserede assays forblive en model af valget23. Hovedårsagen til at vælge etableret cellelinjer og undgå primærelementer er at fremme reproducerbarhed og reducere brugen af forsøgsdyr, som er den vigtigste kilde til isolering og etablering af primære murine kulturer. Metoderne præsentere her, kunne fast overholder 3R, effektivt kassere nanopartikler fra en yderligere prækliniske undersøgelser på criterium deres evne til at krydse model BBTB. Som en proof-of-principle beskriver vi her resultaterne under udvikling og validering af BBTB. Vi var i stand til at bekræfte in vitro-resultater in vivo for eksempel Hvornår måling af en 376 Da natrium-fluorescein passiv diffusion.
Den protokol, der er skitseret i dette dokument beskrives forberedelse i endothelial celler cocultured med astrocytter til at danne en blod-hjerne tumor-barriere-lignende interface i en in vitro-setup. Når der etableres en fysisk kontakt mellem disse to celletyper, udstiller i endothelial cellelag ligheder med BBB (f.eks. en celle overflade udtryk for tight junction proteiner og relativt lav permeabilitet). Interessant, syntes de murine BBTB efterligner at give især lignende Na-Fl permeabilitet værdier til dem, der opnås med in vivo musen BBB permeabilitet målinger24. Derfor vil udførelsen af BBTB efterligner direkte knyttet til valget af de celler, der bruges til at danne barrieren. BEND3 endothelial celler stammer fra hjernen og er kendt for at være vellykket i danner barrierer når cocultured med astrocytter25. Men vi har brugt den udødeliggjort HIFko astrocytter26 til at generere BBTB efterligner. På grund af deres manglende hypoxi-inducerbar faktor, disse astrocytter ikke producerer VEGF-A, hvilket er indbegrebet i BBTB efterligner stabilisering beskrevet her. Astrocytter er blevet identificeret som modulatorer af BBB permeabilitet, for eksempel via frigivelse af VEGF-et svar på neuroinflammation27. Aktivering af vaskulær endotel vækstfaktor receptorer (VEGFRs) er et centralt regulator af i endothelial/vaskulær permeabilitet både i vitro28 og in vivo29. Derfor, VEGF-vitamintilskud på mellemlang aktivere VEGFR2 på endotelceller, som inducerer fosforylering af adherens junction proteiner som VE-cadherin30. Tab i endothelial celle-celle kontakter genererer meget gennemtrængelig blodkar. På samme måde, både stærke mitogenic ejendom og ukendt sammensætning af føtal bovin sera anvendes i celle kultur assays forårsage store problemer i barriere stabilisering og assay reproducerbarhed.
Menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs) er undertiden bruges til at danne BBB i vitro31; men de væsentligt afviger fra hjernen mikrovaskulære endotelceller, som cellen hCMEC/D3 linje32, genekspression og barriere-dannende egenskaber. Dog relativt højere permeabilitet værdier opnået med de HuAR2T celler dyrkes alene i forhold til bEND3 blev stærkt reduceret ved coculturing dem med menneskelig primær astrocytter. Selv om i endothelial celler er forpligtet til at danne den cellulære væg, er det klart, at astrocytter har en lige så vigtig rolle at spille for BBTB dannelse og stabilisering.
Når patienten-afledte gliom kugler blev føjet til denne ligning, sammenfattet mus BBTB efterligner nogle af funktionerne i murine xenografts, såsom narkotika diffusion gennem hjernen Vaskulaturen og tumor celle målretning. BBTB efterligner drøftet her var for eksempel vellykket i mirroring in vivo adfærd når vi screenet flere nanopartikler med forskellige diametre. For at illustrere parallelitet mellem de in vitro- og in vivo modeller, vi brugte tidligere beskrevne mesoporøse silikat nanopartikler33 med celle-gennemtrængende egenskaber34 konjugeret til tumor-targeting peptid CooP på deres surface20. CooP-targeting peptid hjem til invasiv tumorceller gennem specifikke bindingen til Mamma-afledt vækst-hæmmer (MDGI). Flere kræftformer, herunder gliomer, overekspression MDGI i forhold til de normale væv35, hvilket gør CooP en meget effektiv målretning af tumor gruppe i stand til at øge levering af en nyttelast20. Nanopartikler anvendes her har tidligere vist sig at diffuse i hjernen parenkym (27547955), og når functionalized med Taxol, disse nano-ladninger har haft succes med at reducere gliom vækst i prækliniske modeller36. Tilsætning af polyethylenglycol (PEG) rester på overfladen af nanopartikler også fastholdt deres statisk ladning til positive værdier (omkring + 4 mV), giver bedre interaktion med neurovaskulære enhed37 og også øge deres stabilitet i omløb. I de præsenterede data, var 3 kDa af PIND konjugeret til NP110s, mens NP350s var belagt med 10 kDa af PIND. Imidlertid resulterede steg molekylvægt PIND også i en betydelig stigning i nanopartikel diameter, dermed deres fysiske evner at krydse BBB. Derfor, vi tjekket om de fysiske dimensioner af partiklerne forhindret deres passage gennem BBTB og hvorvidt disse bemærkninger kunne spejles in vivo.
I overensstemmelse med de tidligere offentliggjorte bemærkninger, vi observerede, at NP110s behovet gennem både in vitro-BBTB og BBB af mus forsynet med intrakraniel tumorer, mens NP350s beholdes om det luminale side af BBTB efterligner og i blodkarrene i den mus. Disse lignende resultater tyder stærkt på at BBTB modellen forudsagde nanopartikler til at krydse BBB og nå hjernen in vivo evne.
Relevansen af cellulære modeller af BBB er ofte diskuteret, selv for de centrale levering af nanopartikler38. Vi viser her at primære astrocytter og endotelceller, begge betragtes som de mest relevante in vitro-værktøjer, kan være erstattet af udødeliggjort og/eller kommercielt tilgængelige celler, sikre større skalerbarhed og reproducerbarhed. Den næste generation af in vitro-BBB efterligner kan udvikles ved at indarbejde mikrofluid enheder, så smukt udformet neurovaskulære enheder, der strukturelt ligner de faktiske BBB12,14. Disse modeller er dog i øjeblikket uegnet til high throughput screening af molekyler leveret til gliomer, på grund af tekniske begrænsninger i opfølgningen af levering14. Det er faktisk svært at fange den fysiologiske kompleksiteten af BBB i en skål, og en eventuel mangel nogle receptorer/proteiner, kendt for at være udtrykt ved BBB, kunne kompromittere fortolkningen af resultaterne. Et andet argument vedrører den store variation i genekspression mellem in vivo og in vitro-betingelser, samt fra én cellelinje til en anden, især i betragtning af endothelceller. Det kan imidlertid også hævdes, at den neurovaskulære enhed ikke er en ensartet enhed i hjernen39. Videnskabelig forskning i biologi har nået en human æra hvor den dyrevelfærd, etiske ansvar og omkostningerne ved at bruge animalsk liv er altid anset før du designer et eksperiment. Derfor, for at støtte udskiftning af dyr, et stigende antal af de seneste undersøgelser viser, at bevidstheden om begrænsninger af modeller og omhyggelig udvælgelse af de cellulære modeller til at etablere barrieren — med vægt på astrocytter — garanterer en match mellem resultaterne opnået i et fad og i dyre modeller40. Med den metode, der beskrives her, får vi et skridt tættere på at reducere antallet af forsøgsdyr, der anvendes til screening af BBB transcytosis for potentielle therapeutics.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af tilskud fra den finske kræft organisationer, Jane & Aatos Erkko Foundation, og Sigrid Juselius Foundation (til P.L. og V.L.J.), den schweiziske National Science Foundation (avanceret Postdoc.Mobility giver ingen: P300PB_164732 til S. K.), Orion Research Foundation (til S.K.), Maud Kuistila Memorial Foundation (til S.K.) og Finlands Akademi (TERVA 2017, give no: 314 498). Biomedicum Imaging enhed (Helsinki) er anerkendt for at levere mikroskopi imaging core facilitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and - medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 mm x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25 G needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |
References
- Daneman, R., Prat, A.
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).
- Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound. Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review. World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).
- Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. Translational gap in ongoing clinical trials for glioma. Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier. Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Bang, S., et al. A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes. Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Pirsko, V., et al. An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3. Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Cao, Y., et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD. Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Kinnari, P. J., et al. Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy. Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).
- Levin, V. A.
- Weathers, S. S., Gilbert, M. R. Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview. Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).
- O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).
- Yang, S., et al. Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier. PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).
- Argaw, A. T., et al. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).
- Miao, Z., et al. VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).
- Claesson-Welsh, L.
- Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system. Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Paatero, I., et al. Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes. Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).
- Prabhakar, N., et al. Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery. International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).
- Hyvonen, M., et al. Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).
- Feng, X., et al. Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy. Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).
- Nance, E. A., et al. A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue. Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).
- Berg, C. Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models. Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).
- Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).
- Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).
