Summary
Drug targeting aan tumoren van het centrale zenuwstelsel is een grote uitdaging. Hier beschrijven we een protocol om te produceren van een in vitro nabootsen van de bloed-hersen tumor-barrière lymfkliertest en/of menselijke cellen gebruiken en bespreken het belang ervan voor de voorspelbaarheid van het centrale zenuwstelsel tumor targeting in vivo.
Abstract
Zeer selectief door de natuur, de bloed - hersenbarrière (BBB) is essentieel voor de hersenen homeostase in fysiologische omstandigheden. Echter, in het kader van hersentumoren, de moleculaire selectiviteit van BBB ook beschermt de neoplastische cellen door het blokkeren van de levering van ook door de overheid gereguleerde chemokuren. De ontwikkeling van nieuwe medicijnen (waaronder nanodeeltjes) gericht op kwaadaardige hersentumoren ideaal vereist het gebruik van preklinische diermodellen om te bestuderen van de drug transcytosis en antitumorale werkzaamheid. Om te voldoen aan het 3R-principe (verfijnen, verminderen en vervangen) te verminderen van het aantal proefdieren in experimentele opzet en uitvoeren van de high-throughput screening van een grote bibliotheek van antitumorale agenten, ontwikkelden we een reproduceerbare in vitro mens en lymfkliertest nabootsen van de tumor bloed-hersen-barrière (BBTB) met behulp van drie lagen culturen van endotheliale cellen, astrocyten en patiënt afkomstige glioblastoma sferen. Voor een hogere schaalbaarheid en reproduceerbaarheid, commerciële cellijnen of vereeuwigd cellen zijn gebruikt in op maat gemaakte voorwaarden om de vorming van een barrière die lijkt op de werkelijke BBB. Hier beschrijven we een protocol voor het nabootsen van een BBTB door het kweken van endotheliale cellen in contact met de astrocyten bij specifieke cel dichtheden op inzetstukken. Deze BBTB nagebootst kan worden gebruikt, bijvoorbeeld voor de kwantificering en confocal beeldvorming van de nanoparticle-passage door de barrières endotheel en astrocytic, naast de evaluatie van de tumor cel gericht op binnen de dezelfde bepaling. Bovendien laten we zien dat de verkregen gegevens kunnen worden gebruikt om te voorspellen van het gedrag van nanodeeltjes in preklinische diermodellen. In een breder perspectief, dit in vitro model kan worden aangepast aan andere neurodegeneratieve ziekten voor de bepaling van de passage van nieuwe therapeutische moleculen door de BBB en/of worden aangevuld met hersenen organoids direct het evalueren van de werkzaamheid van drugs.
Introduction
De neurovasculaire eenheid bestaat uit neuronen, astrocyten en de BBB, gevormd door ingewikkelde verbindingen tussen pericytes, astrocyten, endotheliale cellen en de bijbehorende kelder membraan vorming van de hersenen microvasculature1. Deze strakke cellulaire muur gevormd door continue, nonfenestrated schepen fijn regelt de beweging van ionen en moleculen (met inbegrip van hormonen, voedingsstoffen, of drugs), maar ook van de circulerende cellen1. De met name lage transcytosis door middel van de BBB van hoog-moleculair-gewicht moleculen, zoals therapeutische antistoffen, drug geconjugeerde of nanocompounds, beperkt drastisch de vooruitgang in de drugontdekking voor neurologische ziekten, waaronder maligne gliomen2. Inderdaad, oraal of intraveneus geleverde chemokuren bereikt de hersenen parenchym vaak bij onvoldoende lage concentraties voor het opwekken van een antitumorale effect of zijn eenvoudigweg niet in staat om de BBTB te bereiken de neoplastische cellen3Kruis. Verschillende preklinische en klinische studies niet behandeld met de kwestie van de penetratie van de BBTB, maar hebben geprobeerd te verstoren de BBTB Transient, bijvoorbeeld met behulp van gerichte ultrasounds4,5, of te omzeilen het door de directe in situ levering van drugs6. Echter, geen van deze technieken waren kunnen neutraliseren de uitbreiding onvermijdelijk tumor of terugvallen. Dus, bij het ontwikkelen van nieuwe antiglioma therapieën, de verspreiding via de BBTB moet worden beschouwd als een van de essentiële aspecten voor de succesvolle levering van de therapeutische agenten7.
Vanwege de zeer complexe aard van de interacties van de cel binnen de BBTB, in vivo onderzoek bij proefdieren lijken te zijn van de hand liggende keuze bij de studie van de overgang van moleculen van bloed naar de hersenen. Hoge-schaal in vivo methoden zijn echter relatief complex om te stellen en, dus, laat niet de high-throughput screening van moleculen in een redelijke termijn tegen een redelijke prijs. Nog belangrijker, moet dierproeven volgen de 3R ethische richtsnoer gedefinieerd als i) verfijnen, ii) beperking en, van belang zijn voor de huidige context, iii) te vervangen door alternatieve protocollen (bijvoorbeeld in vitro/in silico methoden). Daarom herscheppen van de BBTB in vitro verschijnt als een interessante en aantrekkelijke mogelijkheid, maar het vormt ook een complexe taak uitgedaagd door verschillende beperkingen. Veel probeert te herscheppen van deze complexe compartiment met gekweekte primaire cellen of cellijnen van honden, varkens, lymfkliertest en zelfs menselijke oorsprong zijn gepubliceerd (zoals herzien door Rahman et al.8 en Helms et al.9). Deze modellen zijn voorzien van drie-dimensionale microfluidic systemen10, BBB-on-a-chip11,12, en menigten van varianten gebaseerd op de klassieke co culturen in voegt systemen. Huidige microfluidic en chip systemen zijn echter niet geschikt voor snelle, hoge-doorvoer drug-validatie studies13,14 of zijn momenteel niet compatibel met studies van de drug levering aan hersentumoren. Bovendien, de herziening van 155 gepubliceerde modellen met behulp van primaire cellen, afleidbare pluripotente stamcellen (iPSC) of commerciële cellijnen alle mede gekweekte op inzetstukken toonde een trend voor interstudy discrepantie in hun metingen en/of conclusies8. Dit gebrek aan interlaboratory reproduceerbaarheid kan worden gecorreleerd met i) nonnormalized kweekomstandigheden, bijvoorbeeld met de optionele coating met kelder matrix membraaneiwitten in de cel cultuur vaartuig, ii) een toenemend aantal subcultuur en gebruik van serum-bevattende media, beide grote bestuurders van genetische en fenotypische wijzigingen van de cel lijnen15, of iii) de moeilijkheid om de reproducibly opnieuw het juiste evenwicht tussen de astroglial en endotheel componenten in een schotel. Hoewel het gebruik van vereeuwigd cellen of commerciële cel lijnen om een in vitro model van de BBB ontbreken enkele van de eigenschappen in vergelijking met soortgelijke modellen die alleen gebruikmaken van primaire cellen, in de beschreven methode laten we zien dat de juiste combinatie van exposities cellen een zeer vergelijkbare prestaties aan publiceerde studies in andere modellen van referentie16,17. Uiteindelijk, het ontbreken van een robuuste en reproduceerbare model te bestuderen van de passage van therapeutische stoffen gericht op hersentumoren door middel van de BBTB gemotiveerd ons de hier beschreven methoden te ontwikkelen.
Aangezien het doel was om te gebruiken het model om te voorspellen de in vivo levering van nanodeeltjes in preklinische diermodellen, we eerst het BBTB-model met behulp van inzetstukken met lymfkliertest endotheliale cellen in contact met lymfkliertest astrocyten gevalideerd. Naast dit, wij ook het model voor het gebruik van bepaalde menselijke cellijnen geoptimaliseerd. Eenmaal gestabiliseerd, worden de cel barrières overgedragen aan culturen met patiënt afkomstige glioblastoma bollen of commerciële glioma cellijnen. Daarna kan de transcytosis van nanodeeltjes en het bereiken van de cel van de tumor worden gevisualiseerd door confocale microscopie en gekwantificeerd door het verzamelen van monsters na verloop van tijd. Bovenal kon resultaten verkregen met behulp van de Nabootsers van de BBTB betrouwbaar voorspellen het gedrag van de nanodeeltjes in vivo, ondersteuning van het gebruik van de BBTB nabootsen voorafgaand de preklinische validatie.
Protocol
De dierproeven zijn goedgekeurd door het Comité voor dier experimenten voor het District van Zuid Finland (ESAVI/6285/04.10.07/2014).
1. oprichting van de Nabootsers van de BBTB
Opmerking: Cel kweekmedium en supplementen zijn gedetailleerd in de tabel van materialen.
- Voorbereiding van astrocyten
Opmerking: De volgende volumes zijn geschikt voor een 10 cm petrischaal of een T75 maatkolf voor de cultuur van de cel.- Onder de motorkap van een steriele cel cultuur, grondig te wassen de gekweekte astrocyten met 5 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Zachtjes negeren de PBS met behulp van een vacuümpomp en voeg toe 2 mL van de cel dissociatie reagens voor 5 min (bij 37 °C, zie de Tabel van materialen) loskoppelen van de cellen. Controleer de mobiele-detachement onder de Microscoop. 5 min van incubatie te beperken de nadruk op de cellen niet overschrijden.
- Voeg 10 mL steriele volledige Astrocyt cel kweekmedium (ABM +) aan het vaartuig dat remt de activiteit van de cel dissociatie reagens. Gebruik een steriele serologische Pipetteer overbrengen van de vrijstaande cellen van het schip naar een steriele 15 mL-buis. Centrifugeer de celsuspensie voor 3 min op 250 rcf (versnelling: 9 rcf/s, vertraging: 5 rcf/s) bij kamertemperatuur (RT).
- Ondertussen bereiden de inserts (Zie de Tabel van materialen): plaats steriele pincet met de inzetstukken met de hersenen kant omhoog (figuur 1A) op het deksel van een steriele 6-well plaat (figuur 1B). Controleer vooraf of dat de plaat kan worden geplaatst ondersteboven op de inserts zonder aan te raken of te verplaatsen van de inserts tijdens het proces.
Opmerking: De juiste plaatsing van de tussenvoegsels kunt de beklemming van de Astrocyt schorsing tussen het membraan en de bodem van de put. - Zodra gecentrifugeerd, zorgvuldig Verwijder het supernatant van de celsuspensie; resuspendeer de Astrocyt pellet in 1 mL ABM + door voorzichtig resuspending de pellet op de buis'wall s maximaal 5 x. Vermijd buitensporige pipetteren van de cellen te beperken de nadruk op de cellen. Cellen tellen en aanpassen van de celdichtheid voor de schorsing aan 1.5 x 105 cellen in 400 µL van ABM +/ invoegen.
- Plaats de celsuspensie in het midden van de hersenen-kant van de insert's membraan (figuur 1B), en zeer zorgvuldig verspreid met behulp van capillaire werking met een steriele Pipetteer tip. Vermijd direct contact zoals het membraan bijzonder kwetsbaar is.
- Met de kant van de hersenen van de inserts nog steeds omhoog, de 6-well plaat terug op de inserts. Dit zorgt ervoor dat de celsuspensie tussen het membraan en de werkelijke bodem van de put (Figuur 1 c opgesloten ligt). Vermijd luchtbellen in de celsuspensie, zoals het zal de homogene verbreiding van de astrocyten op het membraan.
- Plaats de plaat en inzetstukken, met de kant van de hersenen, in de incubator (bij 37 °C met 5% CO2) dat de cel adhesie voor een minimum van 2 h (lymfkliertest vereeuwigd astrocyten) en maximaal 6 h (menselijke primaire astrocyten).
Opmerking: De inserts zijn ondersteboven gehandhaafd, is visualisatie van de cel adhesie niet mogelijk onder een microscoop. Het wordt daarom aanbevolen om zaad van een aparte regelmatige cel cultuur vaartuig en de controle van de cel adhesie in het vaartuig na verloop van tijd. Voorzichtig manipulatie van het membraan is een must als de resultaten onbetrouwbaar zullen wanneer membranen zijn beschadigd. - Aan het eind van de incubatietijd, Controleer de afwezigheid van cel schorsing lekken buiten het seeding gebied en negeren de inserts als ze lekkende. Het terugkeren van de 6-well plaat naar zijn normale positie, met inzetstukken die nu de bloed kant omhoog (figuur 1A hebt). Voeg 2,6 mL ABM + aan elk putje. Giet 2,5 mL van volledige Astrocyt medium in elke toevoeging en plaats van de plaat in de incubator (bij 37 °C met 5% CO2).
- Voorbereiding van endotheliale cellen
Opmerking: Voor de lymfkliertest microvasculaire endothelial hersencellen (bEND3), moeten de cellen bereiken 100% samenvloeiing om ervoor te zorgen maximale cel contacten triggering de optimale tight junction eiwit expressie op de dag van het experiment. Dit geldt niet voor de endotheliale cellen van menselijke navelstreng ader (HuAR2T), zoals de aanwezigheid van astrocyten vereist voor een strakke junction eiwit expressie voor deze cellen is.- Ga verder zoals eerder beschreven voor de astrocyten (stappen 1.1.1 en 1.1.2.). Zodra gecentrifugeerd, zorgvuldig Verwijder het supernatant; resuspendeer de pellet endothelial cel in 1 mL volledige endothelial cel kweekmedium (EBM +) door het langzaam pipetteren de celsuspensie op de buis'wall s maximaal 5 x. Vermijd buitensporige pipetteren van de cellen te beperken de nadruk op de cellen. Cellen tellen en aanpassen van de celdichtheid voor ophanging aan 2 x 105 cellen in 2.5 mL incert van endothelial cel kweekmedium verstoken van serum (EBM-) en vasculaire endotheliale groeifactor-een (VEGF-A).
- Neem uit de plaat met de inserts zorgvuldig verwijderen van het medium van de kant van het bloed en 2,5 mL van het endotheel celsuspensie te vervangen. De plaat terug te keren naar de incubator (bij 37 °C met 5% CO2) en laat het 's nachts aan de endotheliale cellen zich te houden aan het membraan.
- De volgende dag, bereiden een steriele 6-well plaat door de overdracht van 3 mL serumvrij Astrocyt voorverwarmde medium (ABM-) aan elk putje. Door behandeling de inzetstukken met steriel pincet, zorgvuldig negeren van het endotheel compleet medium van de kant van het bloed, plaatsen van het donormateriaal in de nieuwe plaat met ABM- en voeg 2,5 mL EBM-.
Opmerking: Het gebruik van EBM - is essentieel voor de oprichting van het endotheel blok (Raadpleeg de sectie discussie). - Laat de inserts in de incubator (bij 37 °C met 5% CO2) met minimum fysieke verstoring en temperatuurvariaties gedurende 5 dagen, waardoor de productie van het endotheel kelder membraan, Astrocyt contacten met endotheliale cellen, en uiteindelijk de BBTB nabootsen vorming. Het medium op de dag van de overdracht op glioma celculturen vervangen (zie punt 1.4).
- Meting van de BBTB nabootsen permeabiliteit (optioneel)
- Passieve diffusie van de kleine-moleculair-gewicht fluorescente kleurstof natrium-fluoresceïne (nb-Fl) na verloop van tijd uit het bloed naar de hersenen-kant van de tussenvoegsels kunt de berekening van de waarden van de permeabiliteit volgens de volgende formule:
Hier, dFgoedis de fluorescentie-waarde gemeten in het goed op een bepaald punt van tijd verminderd met de waarde van cel kweekmedium autofluorescence, dT is de tijd in seconden, A is het oppervlak van de barrière in vierkante centimeters, en dFInvoegen is de fluorescentie-waarde gemeten in het invoegen op de hetzelfde tijdstip verminderd met de waarde van de middellange autofluorescence). - Verzamelen van 100 µL van het medium uit het bloed en de zijkanten van de hersenen van de BBTB nabootsen en elk van hen overbrengen in een afzonderlijke platbodem, zwart 96-wells-plaat voor latere fluorescentie metingen. Gebruik de gewone media als de blanco te corrigeren van de autofluorescence.
- Bereiden van 2.5 mL per putje van de nb-Fl (50 µM) in EBM-. Prewarm van de nb-Fl-oplossing tot 37 ° C. De media van de kant van het bloed van de inserts vervangen door de media met Na-Fl. Start een timer zodra het medium wordt vervangen.
- Zorgvuldig verzamelen 100 µL van media uit het bloed en de kant van de hersenen van de inserts op 5, 30, 60 en 120 min. Transfer elk monster te scheiden van putjes van de zwarte 96-wells-plaat.
- Dienovereenkomstig, vervangen de verzamelde media van de inserts te handhaven de volumebalans tussen beide zijden. Plaats de inserts terug in de incubator tussen elke sample collectie te minimaliseren de temperatuurverschillen.
- Kwantificeren van de fluorescentie van de verzamelde monsters, een afleesapparaat met het filter ingesteld op 480/560 nm (excitatie en emissie, respectievelijk).
Opmerking: Fluorescentie van de kant van de hersenen is bijna niet aantoonbaar nu 5 min tijd. Hoge waarden ten opzichte van de blanco geven een lek van / schade aan de insert's membraan of de barrière; Daarom, uitsluiten van verdere analyses. Verwachte waarden van de permeabiliteit van de nb-Fl voor de BBTB moet in de 10-5 tot 10-6 cm/s bereik (tabel 1).
- Passieve diffusie van de kleine-moleculair-gewicht fluorescente kleurstof natrium-fluoresceïne (nb-Fl) na verloop van tijd uit het bloed naar de hersenen-kant van de tussenvoegsels kunt de berekening van de waarden van de permeabiliteit volgens de volgende formule:
- Voorbereiding van glioma cellen
Opmerking: Hoewel patiënt afkomstige glioblastoma bollen hier gebruikt worden, kan het volgende protocol worden gemakkelijk aan te passen voor aanhangend, verkrijgbare glioblastoma cellen zoals U - 87 MG.- Optioneel, voor immunofluorescentie imaging, plaatst u maximaal vier ronde steriele borosilicaat coverslips (ø 0.9 cm) per putje in een 6-well plaat met 2 mL poly-D-lysine (0.01%). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Ondertussen, zorgvuldig overbrengen in de sferen van de tumor uit de cel cultuur vaartuig een steriele tube van 15 mL, met behulp van een steriele serologische Pipetteer. Centrifugeer de tumor sferen voor 3 min op 250 rcf.
- Verwijder het supernatant, zachtjes resuspendeer de bollen in 1 mL bFGF/EGF-gratis (GBM) glioma cel middelgrote en cellen tellen. De celdichtheid tot ongeveer 104 bollen/mL (105 cellen/mL) in GBM - aanpassen.
- Negeren van de poly-D-lysine de putjes en spoel ze 3 x met steriel PBS. Zaad van de plaat met 3 mL/goed van de tumor sferoïde schorsing en breng de inzetstukken met de BBB mimic op de tumor celsuspensie.
- Na een nacht bebroeden (bij 37 °C met 5% CO2) om evenwicht tussen het bloed en de hersenen tumor zijden van de bepaling. Op de volgende dag, vervangen door de media in de bloed-kant EBM-aangevuld met de moleculen/drugs/nanodeeltjes van belang. Monsters worden genomen na verloop van tijd voor directe kwantificering, zoals beschreven in de vorige sectie. Cellen worden opgelost op een precies tijdstip voor fluorescentie beeldvorming (Zie de punten 2.1 en 2.2).
2. hoge-resolutie van de Confocal beeldvorming van de BBTB
Opmerking: 4% paraformaldehyde (PFA, pH 7.4, 6 mL per BBTB repliceren) is altijd bereid verse in PBS. Houd het op ijs.
Let op: PFA is kankerverwekkend. Nitril handschoenen gebruiken om te behandelen PFA en bereid de oplossing onder een chemische zuurkast.
-
BBTB endothelial expressie van strakke junction eiwitten
- Spoel van beide zijden van de membraan met ijskoude PBS (3 x voor 5 min, 2,5 mL/invoegt, 3 mL/goed). Negeren van de PBS en voeg 3 mL en 2,5 mL ijskoud 4% PFA in de put en in het invoegen, respectievelijk. Incubeer op ijs voor 10 min. negeren de PFA (volgens de instelling's gevaarlijke chemische verwijdering) en spoel 3 x met PBS op RT (2,5 mL/invoegen, 3 mL/putje).
Opmerking: Zodra vastgesteld, kunnen monsters worden opgeslagen in PBS (2,5 mL/invoegen, 3 mL/putje) bij 4 °C voor een week. - Gebruik een wattenstaafje veeg de kant van de hersenen van het invoegen en verwijderen van de astrocyten. Met behulp van een scherpe scalpel, zorgvuldig gesneden het membraan in vier gelijke stukken door twee loodrecht bezuinigingen, vorming van een kruis. Vervolgens plaatst u de scalpel op het punt waar het membraan is aangesloten op de muur invoegen en draaien de invoegen met de andere hand te bevrijden van de vier monsters. Met behulp van fijne pincet, zorgvuldig overbrengen in elk monster een 24-well plaat met 200 µL van PBS per putje, met de kant van de bloed omhoog in elk putje.
- Het blokkeren van de membranen met 10% foetale runderserum in PBS (voor 30 min op RT, 200 µL per putje). Bereid de oplossing van de antilichaam 1° voor de immunokleuring van de strakke junction eiwitten (Figuur 1 d) (zonula occludens-1, claudin-5; Gelieve te verwijzen naar de Tabel van materialen) in 200 µL van het blokkeren van de oplossing per putje. Optioneel, is endothelial cel identiteit geverifieerd door het toevoegen van een antilichaam tegen de bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul (PECAM1 of CD31; gelieve te verwijzen naar de Tabel of Materials) verhoogd tot elke tight junction antilichaam oplossing. Negeren van de blokkerende oplossing en incubeer met de primaire antilichamen' O/N bij 4 °C.
- Op de volgende dag, het negeren van de primaire antilichamen en spoel ze af met 200 µL van PBS (3 x voor 5 min op RT). Incubeer hen met passende soortspecifieke fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:500 verdunning, 200 µL per putje, verdund in blokkerende oplossing; gelieve te verwijzen naar de Tabel of Materials) voor 2 h op RT.
- Negeren van de secundaire antilichamen, spoelen met 200 µL van PBS (3 x voor 5 min op RT). Verwijder de PBS en counterstain van de celkernen met behulp van een 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oplossing bij een eindconcentratie van 1 µg/mL in zuiver gedestilleerd H2O (dH2O; 200 µL per putje; verwijzen wij u naar de tabel van materialen ). Incubeer gedurende 7 minuten verwijderd van de RT. de DAPI en wassen van de membranen 3 x met dH2O (200 µL per putje).
- Breng een druppel van het montage-medium (Zie de Tabel van materialen) op een microscoopglaasje van glas. Met behulp van fijne pincet, zorgvuldig het membraan uit de put halen en houden de afdrukstand, de overdaad aan dH2O verwijderen en plaats deze op de daling van het montage-medium. Voeg een andere druppel van montage medium op de top van het membraan en zorgvuldig bedek het met een cover borosilicaatglas. Ervoor zorgen dat er geen prikroller luchtbellen. Het bewaren van de monsters bij 4 °C en weg van licht tot confocale microscopie opmerkingen.
Opmerking: Astrocyt kleuring kan worden uitgevoerd door het plaatsen van de stukken van de membranen in de 24-well plaat met de hersenen zijde omhoog en met het gebruik van geselecteerde Astrocyt-specifieke antilichamen (bv, gericht tegen de gliale fibrillary zuur eiwit [GFAP]) (figuur 1E ).
- Spoel van beide zijden van de membraan met ijskoude PBS (3 x voor 5 min, 2,5 mL/invoegt, 3 mL/goed). Negeren van de PBS en voeg 3 mL en 2,5 mL ijskoud 4% PFA in de put en in het invoegen, respectievelijk. Incubeer op ijs voor 10 min. negeren de PFA (volgens de instelling's gevaarlijke chemische verwijdering) en spoel 3 x met PBS op RT (2,5 mL/invoegen, 3 mL/putje).
-
BBTB fluorescentie kleuring voor het detecteren van nanoparticle transcytosis
- Uitvoeren van live-cel lysosoom labelen (bijvoorbeeld met behulp van fluorescerende sondes [Zie de Tabel van materialen]). Verdun het lysosoom fluorescente kleurstof bij een concentratie van de werken van 50 nM in voorverwarmde EBM - (2,5 mL/insert) of van 75 mM in voorverwarmde ABM - (3 mL/putje) voor het lysosoom etikettering van endotheliale cellen en astrocyten, respectievelijk. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten (bij 37 °C met 5% CO2); Spoel vervolgens 3 x met ijskoude PBS (2,5 mL/invoegen, 3 mL/putje).
- Negeren van de PBS en voeg 3 mL en 2,5 mL ijskoud 4% PFA naar de waterput en het invoegen, respectievelijk. Incubeer hen op ijs voor 10 min. negeren de PFA en spoel de cellen 3 x met PBS (op RT, 2,5 mL/invoegen, 3 mL/putje).
Opmerking: Zodra vastgesteld, kunnen de monsters worden opgeslagen in PBS (2,5 mL/invoegen, 3 mL/putje) bij 4 ° C voor een week. - Verwijder de PBS en counterstain van de celkernen met behulp van een oplossing van de DAPI op een eindconcentratie van 1 µg/mL in dH2O (1 mL/invoegen, 1 mL/putje). Incubeer hen gedurende 7 minuten verwijderd van de RT. de DAPI en wassen van de membranen 3 x met dH2O (2,5 mL/invoegen, 3 mL/putje).
- Snijden van het membraan, verwijder voorzichtig de overdaad aan dH2O, en plaats deze op een daling van montage medium (Zie de Tabel van materialen) op een microscoopglaasje van glas. Voeg een andere druppel van montage medium aan de andere kant van het membraan en zorgvuldig bedek het met een cover borosilicaatglas. Prikroller luchtbellen voorkomen. Opslaan van de monsters bij 4 °C en houd ze beschermd tegen licht tot confocale microscopie imaging.
-
Fluorescentie kleuring van tumorcellen
- De ronde coverslips met de sferen van de tumor op een 24-well bord gevuld met ijskoude PBS met fijne pincet, zorgvuldig worden overdragen. Doorgaan met leven-cel lysosoom labelen met behulp van fluorescerende lysosoom sondes op 75 nM in voorverwarmde GBM - (200 µL per putje). Incubeer de monsters gedurende 45 minuten; spoel ze vervolgens af 3 x met ijskoude PBS (200 µL per putje).
- Negeren van de PBS en voeg 200 µL van ijskoude PFA per putje. Incubeer op ijs voor 10 min. negeren de PFA en spoel de monsters 3 x met PBS (bij RT).
Opmerking: Zodra vastgesteld, de monsters kunnen worden opgeslagen in PBS (200 µL) bij 4 ° C voor een week. - Verwijder de PBS en counterstain van de celkernen met behulp van een oplossing van de DAPI op een eindconcentratie van 1 µg/mL in dH2O (200 µL per putje). Incubeer hen gedurende 7 minuten verwijderd van de RT. de DAPI en wassen van de coverslips 3 x met dH2O (200 µL per putje).
- Met behulp van fijne pincet, nemen het dekglaasje aan, verwijderen van de overdaad aan dH2O en plaats deze op een daling van montage medium (Zie de Tabel van materialen) op een microscoopglaasje van glas. Vermijd entrapping luchtbellen. Opslaan van de monsters bij 4 °C en houd ze beschermd tegen licht tot confocale microscopie opmerkingen.
3. in Vivo vergelijkende studie
- In situ-opname van natrium-fluoresceïne verspreiding via de BBB
- Bereiden 150 µL van een 50 nM nb-Fl oplossing in een fysiologische oplossing. Bewaar deze oplossing bij 37 °C bij intraveneuze levering.
- Anesthetize een muis met een intraperitoneale injectie met een ketamine/xylazine cocktail (300 µL van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine in PBS). Zodra diepe verdoving wordt gevestigd, plaats het dier op een verwarming pad te handhaven van de lichaamstemperatuur.
Opmerking: Tien weken oude vrouwelijke Naval Medical Research Institute (NMRI) naakt immuungecompromitteerde muizen zijn gebruikt om het verkrijgen van de gegevens in Figuur 2. Dit protocol is echter aangepast aan zowel immunocompetent en immuungecompromitteerde muizen. De methode van narcose/analgesie is op de wetenschapper's discretie. Inademing verdoving zoals Isofluraan wordt echter niet aanbevolen, omdat het aanzienlijk de BBB permeabiliteit18 verhoogt. - Plaats de muis op een stereotaxic frame (Zie de Tabel van materialen) en het uitvoeren van een longitudinaal insnijding van de hoofdhuid met fijne schaar, gevolgd door zachte dilacerations van het bindweefsel, met behulp van fijne pincet, te onthullen van de schedel. Cirkelvormige bewegingen met een fijne microdrill, een ø 0.3 mm circulaire stukje van de schedel van het linker of rechter pariëtale bot verwijderen. Doorgaan met uiterste voorzichtigheid tijdens het boren en tijdens het verwijderen van het stuk van de schedel te voorkomen verwonden het onderliggende meningeal weefsel en de bloedvaten.
- Breng een druppel van fysiologische oplossing op de blootgestelde weefsel. Met behulp van twee paar fijne pincet, verwijder voorzichtig het meningeal weefsel voor toegang tot de cortex van de hersenen. Het hersenweefsel moet nooit in direct contact met lucht.
Opmerking: Kleine bloeduitstortingen van meningeal letsel kunnen worden gestopt met behulp van hematologic sponzen (Zie de Tabel van de materialen). - Zodra het meningeal weefsel wordt verwijderd en de cortex volledig is blootgesteld, vangen een daling van fysiologische oplossing tussen de cortex en een ø 0,5 mm borosilicaat dekglaasje aan. Veilig op het gebied van de observatie met een druppel Cyanoacrylaat lijm (Zie de Tabel van materialen) verspreid over het dekglaasje aan met een naald. Laat de lijm droog is voor 1 min.
- De implanteerbare katheter voorbereiden op de staart veneuze injectie (figuur 2A). Breken van de tip van een 25 G naald met behulp van Rochester-Ochsner pincet en breng de tip in een 10 cm lange PE20 polyurethaan buis (Zie de Tabel van materialen) (figuur 2A).
- De katheter in de ader van de laterale staart van de muis, met behulp van bulldog klemmen voor de manipulatie van de katheter en de invoegpositie invoegen (Zie de Tabel van materialen) (figuur 2B). Beveilig de ingevoegde naald met een druppel Cyanoacrylaat lijm. Laat de lijm drogen 20 s voordat u verwijdert de bulldog klem. Sluit het andere uiteinde van de katheter zorgvuldig naar een 25 G naald verbonden met een injectiespuit met de oplossing van de nb-Fl (figuur 2B).
- Opmerking: Niet klem de staart met de bulldog klem; het wordt alleen gebruikt voor nauwkeurige katheter hanteren. Juiste katheter inbrengen kan worden bevestigd door bloed terugvloeiing in de transparante buis.
- Plaats het dier onder de stereomicroscoop (Zie de Tabel van de materialen). Met behulp van de low-level autofluorescence in het groene kanaal (480 nm), zich richten op een gebied met relatief grote bloedvaten (ze donkerder als gevolg van de absorptie van het hemoglobine van licht op deze golflengte) en kleinere haarvaten (figuur 2C). Start de time-lapse overname kort vóór het injecteren van de fluorescente kleurstof om een meting van de fluorescentie van de achtergrond.
Opmerking: Als alternatief, de time-lapse opname kan worden vervangen door momentopname foto's van T0 en van alle andere vooraf ingestelde tijdstippen. - Injecteren van de oplossing in een tempo traag en continue, of als alternatief een geautomatiseerde Infusiesysteem gebruiken. De fluorescentie van de nb-Fl gedetecteerd in het bloed stabiel moet blijven (halfwaardetijd in bloed: 286 min), waarmee een opname van de BBB-diffusie door de craniale raam voor enkele minuten. Zodra de overname voltooid is, zorgvuldig verwijderen van de katheter en euthanaseren van het dier door cervicale dislocatie.
- In vivo bepaling van de BBB-permeabiliteit
Opmerking: Waarden worden verkregen beeld-verwerkende software, zoals ImageJ, waardoor de meting van de intensiteit van de fluorescentie signaal binnen een aangepaste regio van belang (ROI).- Met de aantekeningsfunctie, tekent u een rechthoek-vormige ROI buiten een bloedvat, in het hersenweefsel, op ongeveer 5 µm afstand van enige zichtbare bloedvaten gevuld met Na-Fl. Opmerking de afmetingen van de ROI en de intensiteit van de fluorescentie gemeten op T0 in dat ROI, die wordt gebruikt als leeg voor het weefsel's autofluorescence. Zonder de ROI, fast-forward een postinjection tijd wijs (bijvoorbeeld naar het allerlaatste opgenomen frame wanneer de hele oplossing heeft ingespoten aan het dier) en Let op de nauwkeurige tijd en fluorescentie waardes gemeten binnen de ROI (figuur 2C).
- Verplaatsen van de ROI op een zichtbare bloedvat (figuur 2C) en noteer de waarde van de autofluorescence T0 uit het bloed. Zonder de ROI, fast-forward naar de hetzelfde tijdstip als omschreven in stap 3.2.1. en noteer de waarde van de fluorescentie gemeten binnen de ROI (figuur 2C).
- Gebruik de volgende formule (aangepast van punt 1.3) om te bepalen van de BBB doorlaatbaarheid:
- Hier, dFhersenen is de fluorescentie intensiteitswaarde minus de T0 lege waarde in de hersenen, dT is het tijdstip van de overname in seconden, A is de oppervlakte bij benadering vaartuig, genomen als de ROI-gebied in vierkante centimeters, en dF bloed is de fluorescentie intensiteitswaarde minus de T0 lege waarde in het bloed.
Opmerking: Verwachte permeabiliteit waarden voor de BBB moeten in het 10-6 cm/s bereik (tabel 1).
- Weefsel verwerking voor de detectie van fluorescerende nanodeeltjes in de lymfkliertest hersenen
- Implantaat patiënt afkomstige glioblastoma bollen (5 x 10,4 cellen in 5 µL van steriele PBS) in narcose 6 weken oude vrouwelijke NMRI naakt muizen in het corpus callosum. Zoek deze regio van de hersenen op de volgende stereotaxic coördinaten, vanaf de Bregma: anteroposterior + 0,5 mm, links naar rechts 2,5 mm, dorsoventral + 3 mm. toestaan de hersentumor groeien voor 2 weken.
- Intraveneus injecteren van de nanodeeltjes (100 µg in 100 µL van steriele fysiologische oplossing) en laten circuleren voor 8 h. de muizen controle intraveneus injecteren met 100 µL van steriele fysiologische oplossing.
- De muizen door cervicale dislocatie euthanaseren en het verzamelen van de hersenen snel voor module-bevriezing in tolueen bijgehouden op droog ijs (1 min bij-50 °C). Bewaren de hersenen-80 °C tot verwerking van het weefsel.
- Gesneden coronale hersenen secties met een cryomicrotome. Zoek de intracraniële implantatie door het litteken het gevormd op de cortex en snijd 9 µm dik secties uit dat gebied in de juiste Microscoop dia's (Zie de Tabel van de materialen).
- Dompel de hersenen secties die zijn geïmmobiliseerd op de dia's in ijskoude PBS (2 x 5 min) en kunt u ze vervolgens in ijskoude 4% PFA (voor 5 min). Wassen van de dia's in PBS (3 x voor 5 min op RT). Plaats van de dia's horizontaal en Pipetteer de blokkerende oplossing met 10% foetale runderserum in PBS op het weefsel secties die betrekking hebben op het gehele oppervlak (voor 1 h op RT, 500 µL/dia). Voorbereiden van het antilichaam van CD31 (Zie de Tabel van materialen) in 250 µL van het blokkeren van oplossing/dia. De blokkerende oplossing vervangen door het antilichaam en na een nacht bebroeden bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
- De volgende dag, dompel onder dia's in PBS (3 x voor 5 min op RT) en hen met de bijbehorende fluorophore-geconjugeerde secundair antilichaam (1:500 in 250 µL van PBS voor 2 h op RT) uit te broeden. Spoel van 3 x in PBS (bij RT) en counterstain van de celkernen met behulp van een oplossing van de DAPI op een eindconcentratie van 1 µg/mL in dH2O (250 µL/dia). Incubeer de monsters gedurende 7 minuten verwijderd van de RT. de DAPI-oplossing en wassen van de dia's 3 x met dH2O.
- Voeg op elke weefselsectie, een druppel van montage medium (Zie de Tabel van materialen) en beveiligen van de monsters met een dekglaasje aan. Vermijd entrapping luchtbellen. Opslaan van de monsters bij 4 °C en houd ze beschermd tegen licht tot confocale microscopie opmerkingen.
Representative Results
Confocale beeldvorming van de lymfkliertest BBTB mimic toont de expressie en cellulaire lokalisatie van de strakke junction eiwitten zonula occludens-1 (ZO-1) en claudin-5 in bEND3. Contacten tussen de endotheliale cellen en de astrocyten geïnduceerde duidelijk de verplaatsing van de ZO-1 en claudin-5 tot en met de contacten van de endothelial cel ten opzichte van de bEND3 monoculturen (Figuur 1 d). Met immunofluorescentie vlekken om te visualiseren de astrocyten GFAP-uiten aan de hersenen-kant van het membraan, is het mogelijk om te observeren en bestuderen van de astrocytic processen en einde-voeten contact opnemen met de endotheliale cellen via het membraan (figuur 1E ). De Astrocyt-endothelial cel contacten te bevorderen en stabiliseren de aanscherping van de cellulaire barrière zijn bekend en zijn geassocieerd met lagere waarden van de permeabiliteit van de BBB-19. Overeenkomstig dat we een substantiële afname van de permeabiliteit van de muis BBTB nabootsen voor de nb-Fl van 27.63 (± 3.45) x 10-6 cm/s in het geval van monoculturen te 6.74 (± 3.01) x 10-6 cm/s waargenomen wanneer mede gekweekt met het hypoxie-afleidbare factor knock out (HIFko) astrocyten (tabel 1). De vereeuwigd HuAR2T vormen zeer doorlaatbare cellulaire belemmeringen (104.92 ± 27.1 x 10-6 cm/s, tabel 1). Gelijkaardig aan het lymfkliertest model, we gemeten aanzienlijk lager permeabiliteit van de BBTB naar nb-Fl, namelijk 47.4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, wanneer de HuAR2T cellen mede gekweekte met de menselijke primaire astrocyten (tabel 1 werden).
De aanwezigheid van de patiënt-afgeleide glioblastoma bollen geïnduceerde in zowel menselijke als lymfkliertest BBTB nabootsers, een lichte stijging van de waarden van de permeabiliteit in vergelijking met de endothelial cel-Astrocyt co culturen alleen (tabel 1). Dit verschijnsel is waargenomen met een aantal maar niet alle van de patiënt glioma bol modellen. Dit kan worden veroorzaakt door de VEGF-A dat wordt uitgescheiden door een aantal van deze patiënt-afgeleide cellen.
Om te vergelijken de waarden van de permeabiliteit van de in vitro BBTB nabootsers bij de in vivo BBB, beeld we de real-time verspreiding van de nb-Fl door een cranial raam geïmplanteerd in naakt muizen. Met behulp van een stereomicroscoop fluorescentie, werd nb-Fl diffusie van de haarvaten van de bloedvat die voortvloeien uit de belangrijkste pial bloedvaten opgenomen vóór, tijdens en na systemische injectie van de sonde (figuur 2C). Metingen van de differentiële fluorescentie waarden uit het circulerende bloed en hersenen corticale parenchym na verloop van tijd konden we voor het berekenen van de waarden bij benadering permeabiliteit van de naakt muis's BBB voor nb-Fl (5.57 ± 2.19 x 10-6 cm/s, Tabel 1).
Om te illustreren hoe deze BBTB nagebootst kan worden gebruikt voor visualisatie van de passage van stoffen uit aan de zijkant van het bloed naar de hersenen kant, vergeleken we de transcytosis van ø 110 nm (NP110) en ø 350 nm (NP350) nanodeeltjes targeting patiënt afkomstige glioblastoma sferen. Resultaten in vitro werden vervolgens vergeleken met de in vivo transcytosis. In het gepresenteerde voorbeeld nanodeeltjes waren beklede oppervlak met de tumor-targeting peptide CooP20 en geladen met de fluorescente kleurstof (FITC) ter vergemakkelijking van de visualisatie. We het label van de cellen met behulp van de lysosomale kleurstof en counterstained met DAPI 24 h na de toevoeging van de FITC-nanodeeltjes op de bloed-kant van de BBTB na te bootsen en verworven confocal microfoto op verschillende niveaus (bijvoorbeeld de bloed kant het membraan, de kant van de hersenen, en de patiënt glioblastoma sferen) (figuur 3A). Het NP110-geassocieerde fluorescent signaal colocalized met de lysosomen in de endotheliale cellen, astrocyten en tumorcellen. Daarnaast NP110s werden gevonden tussen de endotheliale cellen en de astrocyten, passeren de poriën van de membraan van de insert (figuur 3A).
Het verstrijken van de NP110s werd gekwantificeerd door het meten van de fluorescentie van monsters die van de kant van zowel het bloed en de hersenen. Deze permeabiliteit waarden werden vergeleken met die voor de nanodeeltjes van bepaald ø 350 nm (NP350). Uit de resultaten blijkt dat alleen NP110 was in staat om over te steken van de Nabootsers van de BBTB (figuur 3B). NP350 bleef aan de bloed-kant van de BBTB nabootsen, wat in lagere waarden van de permeabiliteit voor deze nanodeeltjes resulteerde.
Nadruk wordt gelegd op de relevantie van de Nabootsers van de BBTB ten opzichte van de in vivo modellen, werden naakt muizen intraveneus ingespoten met NP110 of NP350 nanodeeltjes bedekt met de tumor-targeting peptide CooP en geconjugeerd met rode fluorescerende kleurstof (TRITC) voor de detectie. Weefsels die op verschillende tijdstippen bleek dat na 8u, BBB-permeabele nanodeeltjes hebben extravasated in de hersenen parenchym, terwijl de nonpermeable degenen die in de omloop bleven voornamelijk van de systemische circulatie in vivo gewist zijn. Daarom we verzameld van de hersenen en het aantal nanodeeltjes per vierkante millimeter 8 h postinjection gekwantificeerd. Overeenkomstig de in vitro bevindingen, NP110, maar niet NP350, extravasated met succes in de hersenen parenchym (Figuur 3 c). High-vergroting beeldvorming van de locatie van de nanoparticle in de hersenen bleek dat NP110 was homogeen verspreid in de hersenen parenchym buiten de haarvaten bloed en succesvol homed op de geïmplanteerde glioblastoma cellen (figuur 3D). Ondanks het tentoonstellen van de dezelfde tumor gericht op groep (CooP), NP350 kon extravasate in de hersenen parenchym en was alleen gedetecteerd binnen de luminal kant van de hersenen bloedvaten (figuur 3E), vergelijkbaar met de resultaten van in vitro.
Figuur 1: beschrijving van het model van blood-brain tumor-barrière (BBTB). (A) Schematische weergave van de locaties van verschillende celtypes. (B) afbeelding van de plaatsing van de invoegen op de cover van de 6-well plaat en de seeding techniek voor de astrocyten aan de kant van de hersenen van de insert's membraan. (C) de illustratie van de plaatsing van de 6-well plaat waardoor de Astrocyt hechting. (D) immunofluorescentie microfoto van de strakke junction eiwitten zonula occludens-1 (ZO-1, bovenste rij, rood) en claudin-5 (onderste rij, groen). De eiwit expressie wordt vergeleken met de lymfkliertest microvasculaire endothelial hersencellen (bEND3) aan de kant van het bloed van de BBTB alleen gekweekt als een monocultuur (linker kolom) of met lymfkliertest vereeuwigd HIFko astrocyten (rechter kolom). Celkernen zijn counterstained met de DAPI (blauw). (E) immunofluorescentie opname de gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP, rood) in HIFko astrocyten gekweekt aan de zijkant van de hersenen van de BBTB tonen. De high-vergroting afbeelding toont Astrocyt processen en einde-voeten (pijlen) contact opnemen met de endotheliale cellen via het membraan poriën (rechtervenster). De identiteit van de astrocyten HIFko werd gecontroleerd door immunofluorescentie kleuring van de simian 40 grote T virusantigeen (SV40 grote T, groene) gebruikt voor de immortalization van de cellen. Endotheliale cellen express van het algemeen kaderakkoord voor vrede noch de grote T SV40 en daarom kunnen gedeeltelijk worden waargenomen door de transparante, tegenover kant van het membraan als alleen-DAPI gekleurde cellen (onderbroken lijnen). Celkernen zijn counterstained met de DAPI (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Intravital live bepaling van de muis BBB permeabiliteit. (A) voorbereiding van de implanteerbare caudal veneuze katheter. (1) hulpmiddelen en apparatuur zijn de volgende: (een) een PE20 polyethyleen buis (b) twee 25 G verder breinld zonder knop (c) Rochester-Ochsner Tang en (d) een kleine bulldog klem. (2) A 25 G naald wordt verwijderd door verschillende torsies zorgvuldig gebruik van de Tang en (3) ingevoegd in de buis. (4) de andere kant van de buis is verbonden met een ander 25 G naald. (B) richtlijnen voor de inplanting van de katheter en positionering te doordringen van de natrium-fluoresceïne-oplossing door de ader van de staart van een muis. Het omcirkelde gebied geeft het gebied waar een druppel Cyanoacrylaat lijm teneinde de katheter wordt geplaatst. De bulldog klem is gebruikt voor het verwerken van de katheter en verwijderd zodra de katheter is beveiligd. (C) vertegenwoordiger beeldvorming en kwantificering methode de natrium-fluoresceïne permeabiliteit waarden bepalen. Voorafgaand aan de natrium-fluoresceïne infusie (linker kolom), wordt de autofluorescence/blanco gemeten binnen een gebied van belang (ROI) geplaatst op de hersenen (bovenste paneel, witte rechthoek) en het bloedvat gebieden (onderste deelvenster rode rechthoek). Tijdens de infusie van de natrium-fluoresceïne (rechter kolom), wordt de intensiteit van de fluorescentie gemeten in beide ROIs, waardoor de berekening van de permeabiliteit van de BBB. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: voorspelling van de intracerebrale transcytosis van nanodeeltjes via BBB in vivo met behulp van de in vitro model voor BBTB. (A) grafische weergave van de bepaling van de BBTB met representatieve confocal beelden verkregen op de aangegeven verschillende niveaus van het lymfkliertest BBTB model. Nanodeeltjes van 110 nm in diameter (NP110) en geconjugeerd aan FITC (groen) zijn toegevoegd naar het bloed kant van de BBTB cellen zijn geëtiketteerd met de lysosomale sonde (LT-99, rood). (1) Endotheliale cellen, (2) Endotheliale transcytosis van de nanodeeltjes via de poriën van het membraan (witte gestippelde lijn), (3) de astrocyten, en (4) patiënt glioblastoma bollen worden geïdentificeerd op de afbeelding en overeenkomstige confocal microfoto (rechts). Lysosomale inkapseling van de nanodeeltjes (pijlen) suggereert actieve transcytosis door de lagen van het endotheel en Astrocyt van de BBTB. (B) kwantificering van de permeabiliteit van de aangegeven nanoparticle via de BBTB in vitro (n = 6). (C) kwantificering van de dichtheid van de aangegeven nanoparticle in het hersenweefsel afdelingen, 8 h na de infusie caudal ader van de muizen naakt (n = 3). Confocale microfoto (D) waarin de verdeling van de ø 110 nm nanodeeltjes (NP110, rood) in lymfkliertest hersenen weefselsecties is voorzien van een anti-muis CD31 antilichaam (groen). De pijl wijst op de nanoparticle transcytosis (linkerdeel). Nanodeeltjes opgebouwd rond de tumorcellen hersenen (tumor, rechter paneel) als gevolg van de CooP-targeting peptide gepresenteerd op hun oppervlak. Geen significante homing wordt waargenomen in het hersenweefsel (hersenen). (E) Confocal microfoto vertonen de verdeling van de ø 350 nm nanodeeltjes (NP350, rode) lymfkliertest hersenen weefselsecties aangeduid met een anti-muis CD31 antilichaam (groen). Pijlpunten punt aan de NP350s die werden bewaard in het bloedvat lumen en konden de BBB, waarschijnlijk als gevolg van hun grotere diameter ten opzichte van de celkernen NP110s. Kruis zijn counterstained met de DAPI (blauw). P < 0,01. P-waarden werden berekend aan de hand van een tweezijdige, niet-parametrische Mann-Whitney U test. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| lymfkliertest BBTB mimic | bEND3 | bEND3 + HIFko als | bEND3 + GB | bEND3 + HIFko als + GB | In vivo |
| Permeabiliteit (10-6 cm/s) | 27.63 | 6.74 | 26,8 | 10,83 | 5.57 |
| SD (10-6 cm/s) | 3.45 | 3.01 | 7,99 | 2.65 | 2.19 |
| menselijke BBTB mimic | HuAR2T | HuAR2T + hIAs | HuAR2T + GB | HuAR2T + hIAs + GB | |
| Permeabiliteit (10-6 cm/s) | 104.92 | 47.4 | 89.08 | 48.24 | |
| SD (10-6 cm/s) | 27.1 | 14.32 | 10.21 | 13.07 |
Tabel 1: waarden van de permeabiliteit van de natrium-fluoresceïne (nb-Fl) (in centimeters per seconde) bepaald in vitro in de aangegeven co cultuur systemen en in vivo in NMRI naakt muizen. Gegevens uit een representatieve experiment (n = 3 muizen).
Discussion
De opkomst van het concept van de variabiliteit interpatient tumor verjongd het onderzoek naar kanker van gepersonaliseerde geneeskunde21. Deze variabiliteit is ook een kenmerk van het centrale zenuwstelsel gezwellen. Als gevolg van de onvoorspelbaarheid van de tumor, reactie op chemotherapie wordt toegevoegd aan het beschermend effect van de BBB voor drug delivery, en over het geheel genomen vormt grote uitdagingen in patiëntenzorg22. Oog op de ontwikkeling van meer effectieve therapieën, is het vaak noodzakelijk naar scherm grote bibliotheken van nieuwe moleculen. De beste optie is om te beoordelen de antitumorale werkzaamheid en het vermogen van de nieuwe therapeutische leads te bereiken de plaats van de tumor, de preklinische studie op patiënt-afgeleide cellen ingeplant lymfkliertest patiënt avatars in vivo. Vanwege praktische (financieel, tijd, mens en faciliteit middelen) en ethische redenen (3V beginsel bij het gebruik van proefdieren), is de ontwikkeling van dergelijke een grootschalig in vivo onderzoek platform vaak niet mogelijk, en dus de cel-gebaseerd testen een model van keuze23blijven. De voornaamste reden voor het selecteren van gevestigde cellijnen en het vermijden van primaire cellen is het vergemakkelijken van de reproduceerbaarheid en vermindering van het gebruik van proefdieren, die de belangrijkste bron voor de isolatie en de totstandbrenging van primaire lymfkliertest culturen. De methoden presenteren hier, kon stevig op de naleving van de 3V, efficiënt negeren nanodeeltjes van een nader preklinisch onderzoek op het criterium van hun onvermogen om over te steken van het model BBTB. Als een bewijs-van-principe beschrijven we hier bevindingen verkregen tijdens de ontwikkeling en validering van de BBTB. We konden bevestigen in vitro bevindingen in vivo, bijvoorbeeld wanneer het meten van de passieve diffusie van een 376 Da natrium-fluoresceïne.
Het protocol beschreven in dit document wordt beschreven op de voorbereiding van endotheliale cellen cocultured met astrocyten vormen een bloed-brain tumor-barrière-achtige interface in een in vitro opstelling. Zodra een fysiek contact tussen deze twee celtypes wordt gevestigd, vertoont het endotheel cellaag gelijkenissen met de BBB (bijvoorbeeld een cel oppervlakte uitdrukking van strakke junction eiwitten en relatief lage permeabiliteit). Interessant is dat leek de lymfkliertest BBTB mimic te bieden met name gelijkaardige waarden van de permeabiliteit van de nb-Fl die verkregen met de in vivo muis BBB permeabiliteit metingen24. Daarom zal de prestaties van de Nabootsers van de BBTB rechtstreeks worden gekoppeld aan de keuze van de cellen die worden gebruikt om te vormen van de barrière. De endotheliale cellen van de bEND3 zijn afkomstig uit de hersenen en staan bekend om succesvol in de vorming van handelsbelemmeringen als cocultured met astrocyten25te zijn. Echter, we gebruiken de vereeuwigd HIFko astrocyten26 voor het genereren van de BBTB nabootsen. Wegens hun gebrek aan hypoxie-afleidbare factor, deze astrocyten niet produceren VEGF-A, die is het ultieme in de BBTB nabootsen van stabilisatie die hier worden beschreven. Astrocyten zijn geïdentificeerd als modulatoren van de BBB-permeabiliteit, bijvoorbeeld door de vrijlating van VEGF-A in reactie op de neuroinflammation27. Activering van de vasculaire endotheliale groeifactor receptoren (VEGFRs) is een belangrijke regulator van het endotheel/vasculaire permeabiliteit zowel in vitro28 en in vivo29. Daarom activeren VEGF-A supplementen in het medium de VEGFR2 op de endotheliale cellen, die de fosforylatie van adherens junction eiwitten zoals VE-cadherine30induceert. Het verlies van endothelial cel contacten genereert zeer doorlaatbare bloedvaten. Ook de sterke mitogene eigenschap zowel onbekende samenstelling van de foetale boviene sera gebruikt in de cel cultuur testen grote problemen veroorzaken in de barrière stabilisatie en assay reproduceerbaarheid.
Menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) worden soms gebruikt voor het vormen van BBB in vitro31; echter ze aanzienlijk afwijken van de hersenen microvasculaire endotheliale cellen, zoals de cel hCMEC/D3 lijn32, in termen van genexpressie en barrière-vormende eigenschappen. De relatief hogere permeabiliteit waarden, verkregen met de cellen van de HuAR2T alleen gegroeid ten opzichte van de bEND3 waren echter sterk verminderd door coculturing hen met menselijke primaire astrocyten. Hoewel de endotheliale cellen vormen van de cellulaire muur moeten, is het duidelijk dat de astrocyten hebben een even belangrijke rol spelen voor de vorming van de BBTB en stabilisatie.
Wanneer de patiënt afkomstige glioma bollen zijn toegevoegd aan deze vergelijking, de muis BBTB mimic gerecapituleerd enkele van de kenmerken van lymfkliertest xenografts, zoals de verspreiding van drugs via de hersenen-therapieën en het richten van de cel van de tumor. De Nabootsers van de BBTB hier besproken is gelukt, bijvoorbeeld in de spiegeling van het in vivo gedrag wanneer we gescreend verschillende nanodeeltjes met verschillende diameters. Om te illustreren het parallellisme tussen de in vitro en in vivo modellen, gebruikten we de hierboven beschreven mesoporous silicaat nanopartikels33 met cel-penetrating eigenschappen34 geconjugeerd met de tumor-targeting peptide CooP op hun surface20. De CooP-targeting peptide huizen aan invasieve tumorcellen via de specifieke binding aan de borstklier afkomstige groei remmer (MDGI). Verschillende vormen van kanker, met inbegrip van gliomen, zijn MDGI in vergelijking met de normale weefsel35, waardoor de CooP een zeer efficiënte tumor-targeting deel staat voor het verhogen van de levering van een nettolading20overexpressing. De nanodeeltjes die hier gebruikt is eerder gebleken om te verspreiden in de hersenen parenchym (27547955), en toen matiemaatschappij met Taxol, deze nano-cargos geweest zijn succesvol in het terugdringen van de groei van glioma in preklinische modellen36. De toevoeging van polyethyleenglycol (PEG) residuen op het oppervlak van de nanodeeltjes onderhouden ook hun statische lading naar positieve waarden (rond + 4 mV), waardoor betere interactie met de neurovasculaire eenheid37 en ook het verhogen van hun stabiliteit in omloop. In de gepresenteerde gegevens, was 3 kDa van PEG geconjugeerd met NP110s, terwijl NP350s met 10 kDa van PEG bedekt waren. Echter verhoogd-moleculair-gewicht PEG ook geleid tot een aanzienlijke toename van de nanoparticle diameter, vandaar hun fysieke vermogens te steken van de BBB. Dus, wij gecontroleerd of de fysieke afmetingen van de deeltjes voorkomen hun passage door de BBTB en of deze opmerkingen kunnen worden gespiegeld in vivo.
Overeenkomstig de eerder gepubliceerde opmerkingen, we kunnen constateren dat de NP110s via de BBTB in vitro en de BBB van muizen die intracraniële tumoren, terwijl NP350s op de luminal kant van de BBTB nabootsen en in de bloedvaten van achtergebleven extravasated de muizen. Deze vergelijkbare resultaten raden dat het BBTB-model het in vivo vermogen van nanodeeltjes voorspelde te steken van de BBB en de hersenen bereiken.
De relevantie van cellulaire modellen van de BBB wordt vaak besproken, zelfs voor de middenafleg van nanodeeltjes38. Laten we zien hier dat primaire astrocyten en endotheliale cellen, zowel beschouwd als de meest relevante hulpmiddelen voor in vitro kunnen worden vervangen door vereeuwigd en/of commercieel beschikbare cellen, zorgen voor grotere schaalbaarheid en reproduceerbaarheid. De volgende generatie van de in vitro BBB nabootsers kan worden ontwikkeld door de integratie van de microfluidic-apparaten, waardoor prachtig gevormde neurovasculaire eenheden die structureel lijken op de werkelijke BBB12,14. Deze modellen zijn echter momenteel ongeschikt voor de high-throughput screening van moleculen aan gliomen, als gevolg van technische beperkingen in de follow-up van de levering14geleverd. Het is inderdaad moeilijk te vangen de fysiologische complexiteit van de BBB in een schotel, en het mogelijke gebrek aan sommige receptoren/eiwitten, bekend moet worden uitgedrukt door de BBB, de interpretatie van de resultaten in gevaar kan brengen. Een ander argument betreft de grote variabiliteit in genexpressie tussen in vivo en in vitro voorwaarden alsook uit één cel naar de andere, vooral gezien endotheliale cellen. Er kan echter ook worden betoogd dat de neurovasculaire-eenheid geen uniforme entiteit binnen de hersenen39 is. Wetenschappelijk onderzoek in de biologie heeft bereikt een humane tijdperk waar het dierenwelzijn, ethische verantwoordelijkheid en de kosten van het gebruik van dierlijke leven worden altijd beschouwd voor het ontwerpen van een experiment. Daarom, ter ondersteuning van de vervanging van dieren, een toenemend aantal recente studies tonen aan dat het besef van de beperkingen van de modellen en de zorgvuldige keuze van de cellulaire modellen om de barrière — met de nadruk op de astrocyten — garandeert een wedstrijd tussen de resultaten verkregen in een schotel en in dierlijke modellen40. Met de hier beschreven methode, krijgen we een stap dichter bij het verminderen van het aantal proefdieren gebruikt voor screeningonderzoek voor BBB transcytosis voor potentiële therapeutics.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van de Finse kanker organisaties, Jane & ihmissusi Erkko Foundation, en Sigrid Juselius Foundation (aan P.L. en V.L.J.), de Zwitserse National Science Foundation (Advanced Postdoc.Mobility verlenen neen: P300PB_164732, naar de S. K.), de Orion Research Foundation (SK) de Maud Kuistila Memorial Foundation (SK) en de Academie van Finland (TERVA 2017, verlenen neen: 314 498). De Biomedicum Imaging eenheid (Helsinki) is erkend voor het verstrekken van de microscopie imaging core faciliteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| bEND3 | ATCC | CRL-2299 | Cultured in: DMEM (1g/L glucose) supplemented with 10% FBS, 5 mL L-glutamine and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HIFko immortalized mouse astrocytes | Isolated in Dr. Gabriele Bergers Lab | https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6 | Cultured in: BME-1 supplemented with 5% FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM sodium pyruvate, 3 g D-glucose and 5 mL penicillin/streptomycin |
| HuAR2T | Isolated in Dr. Dagmar Wirth Lab | https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184 | Cultured in: EBM-2 with SupplementMix |
| normal human primary astrocytes | Lonza | CC-2565 | Cultured in: ABM with SingleQuots |
| Material and reagents | |||
| 100 mm x17 mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| 10 mL serological pipet | ThermoFisher Scientific | 170361 | |
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339650 | |
| ABM Basal Medium, 500 mL | Lonza | CC-3187 | For primary human astrocytes. ABM+: contains all the additives from the supplement mix. ABM-:all the additives except for rhEGF and FBS |
| Accutase Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | |
| AGM SingleQuots Supplements and Growth Factors | Lonza | CC-4123 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | for both GBM + and - medium |
| Basal Medium Eagle | ThermoFisher Scientific | 21010046 | BME-1 |
| Corning Costar TC-Treated 6-Well Plates | Sigma-Aldrich | CLS3506 | |
| Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3452 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | dissolve in 50 mL of BME-1 and sterile filter before adding to the medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham | Gibco | 21331-020 | Specific to the culture of the patient-derived spheres isolated in our lab, may vary for other glioma cell lines |
| EBM-2 growth Medium SupplementMix | PromoCell | c-39216 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2) | PromoCell | c-22211 | EBM+: contains all the additives from the supplement mix. EBM-:all the additives except for VEGF-A and FBS |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | ThermoFisher Scientific | 10500056 | |
| Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma-Aldrich | Greiner 655090 | black polystyrene wells flat bottom (with micro-clear bottom) |
| Menzel-Gläser 0.9 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 10313573 | |
| PBS tablets | Medicago | 09-9400-100 | one tablet per liter of dH2O, then sterilize the solution by autoclaving |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | GMP100-15 | for GBM+ medium |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | 100-18B | for GBM+ medium |
| Immunofluorescence | |||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| 24 mm x 60 mm microscope slide cover glass | ORSAtec | 0224601-D | |
| AlexaFluor 488 and 594 secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | dilution: 1/500 | |
| Anti-Claudin-5 antibody | Abcam | ab15106 | dilution: 1/150 |
| Anti-GFAP antibody clone GF5 | Abcam | ab10062 | dilution: 1/150 |
| Anti-Mouse CD31 antibody Clone MEC 13.3 | BD Biosciences | 550274 | dilution 1/800 |
| Anti-SV40 T-antigen antibody | Abcam | ab16879 | dilution: 1/150 |
| Anti-Zonula Occludens-1 | Abcam | ab96587 | dilution: 1/200 |
| DAPI | TOCRIS | 5748 | |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| LysoTracker Red DND-99 | ThermoFisher Scientific | L7528 | |
| Animal procedures | |||
| 10 cm curved dissecting scissors | World Precision Instruments | 14394 | |
| BD Microlance 25 G needles | Becton Dickinson | 300600 | |
| Fine Forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 503283 | for tissue dissociation |
| Intramedic Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Ketaminol vet 50 mg/mL | Intervet | Vnr511485 | Ketamine |
| Mains Powered microdrill | World Precision Instruments | 503599 | |
| Menzel-Gläser 0.5 cm round borosilicate Cover Slips | Thermo Scientific | 11888372 | |
| Micro Bulldog clamp | World Precision Instruments | 14119 | |
| Physiological saline solution | Mustela | Sterile single dose vials 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Medical device class | |
| Rochester-Oschner forceps | World Precision Instruments | 501709 | |
| Rompun vet 20 mg/mL | Intervet | Vnr148999 | Xylazine |
| Stereotaxic adapter | World Precision Instruments | 502063 | |
| Sugi Sponge Points | Kettenbach | 31603 | |
| Equipment | |||
| Axio Zoom.V16 fluorescence stereo zoom microscope | Carl Zeiss | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| ORCA-Flash 4.0 digital sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Universal 320 tabletop centrifuge | Hettich | Cat. No. 1401 | |
| ZEISS LSM 880 with Airyscan confocal microscope | Carl Zeiss |
References
- Daneman, R., Prat, A.
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
- Wang, Z., Sun, H., Yakisich, J. S. Overcoming the blood-brain barrier for chemotherapy: limitations, challenges and rising problems. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 14 (8), 1085-1093 (2014).
- Alkins, R. D., Brodersen, P. M., Sodhi, R. N., Hynynen, K. Enhancing drug delivery for boron neutron capture therapy of brain tumors with focused ultrasound. Neuro Oncology. 15 (9), 1225-1235 (2013).
- Alli, S., et al. Brainstem blood brain barrier disruption using focused ultrasound: A demonstration of feasibility and enhanced doxorubicin delivery. Journal of Controlled Release. 281, 29-41 (2018).
- Ashby, L. S., Smith, K. A., Stea, B. Gliadel wafer implantation combined with standard radiotherapy and concurrent followed by adjuvant temozolomide for treatment of newly diagnosed high-grade glioma: a systematic literature review. World Journal of Surgical Oncology. 14 (1), 225 (2016).
- Guishard, A. F., Yakisich, J. S., Azad, N., Iyer, A. K. V. Translational gap in ongoing clinical trials for glioma. Journal of Clinical Neurosciences. 47, 28-42 (2018).
- Rahman, N. A., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: A systematic review. Brain Research. 1642, 532-545 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier. Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Bang, S., et al. A Low Permeability Microfluidic Blood-Brain Barrier Platform with Direct Contact between Perfusable Vascular Network and Astrocytes. Scientific Reports. 7 (1), 8083 (2017).
- Wilhelm, I., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier for the study of drug delivery to the brain. Molecular Pharmacology. 11 (7), 1949-1963 (2014).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Pirsko, V., et al. An Effect of Culture Media on Epithelial Differentiation Markers in Breast Cancer Cell Lines MCF7, MDA-MB-436 and SkBr3. Medicina (Kaunas). 54 (2), (2018).
- Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
- Canfield, S. G., et al. An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).
- Cao, Y., et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha is involved in isoflurane-induced blood-brain barrier disruption in aged rats model of POCD. Behavioural Brain Research. 339, 39-46 (2018).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Kinnari, P. J., et al. Tumour homing peptide-functionalized porous silicon nanovectors for cancer therapy. Biomaterials. 34 (36), 9134-9141 (2013).
- Levin, V. A.
- Weathers, S. S., Gilbert, M. R. Toward Personalized Targeted Therapeutics: An Overview. Neurotherapeutics. 14 (2), 256-264 (2017).
- O'Duibhir, E., Carragher, N. O., Pollard, S. M. Accelerating glioblastoma drug discovery: Convergence of patient-derived models, genome editing and phenotypic screening. Molecular and Cellular Neuroscience. 80, 198-207 (2017).
- Kaya, M., Ahishali, B. Assessment of permeability in barrier type of endothelium in brain using tracers: Evans blue, sodium fluorescein, and horseradish peroxidase. Methods in Molecular Biology. 763, 369-382 (2011).
- Yang, S., et al. Identification of two immortalized cell lines, ECV304 and bEnd3, for in vitro permeability studies of blood-brain barrier. PLoS One. 12 (10), e0187017 (2017).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4 (2), 133-146 (2003).
- Argaw, A. T., et al. Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2454-2468 (2012).
- Miao, Z., et al. VEGF increases paracellular permeability in brain endothelial cells via upregulation of EphA2. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (5), 964-972 (2014).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).
- Claesson-Welsh, L.
- Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system. Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Paatero, I., et al. Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes. Scientific Reports. 7 (1), 8423 (2017).
- Prabhakar, N., et al. Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery. International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).
- Hyvonen, M., et al. Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).
- Feng, X., et al. Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy. Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).
- Nance, E. A., et al. A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue. Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119 (2012).
- Berg, C. Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models. Tissue Barriers. 4 (1), e1143545 (2016).
- Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models. Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12 (2018).
- Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).
