Summary
Hier presenteren we een protocol voor het meten van KDM1A doel betrokkenheid in een humane of dierlijke cel, weefsel of bloedmonsters behandeld met KDM1A remmers. Het protocol maakt gebruik van chemoprobe-tagging van het vrije KDM1A-enzym en de directe kwantificering van de doel bezetting met behulp van op chemoprobe gebaseerde immunoassays en kan worden gebruikt in preklinisch onderzoek en klinische studies.
Abstract
De beoordeling van de beoogde betrokkenheid, gedefinieerd als de interactie van een medicijn met het eiwit waarvoor het is ontworpen, is een basisvoorwaarde voor de interpretatie van de biologische activiteit van een samengestelde drug ontwikkeling of in basis onderzoeksprojecten. In Epigenetics wordt de doel betrokkenheid meestal beoordeeld door de analyse van proxy markers in plaats van het meten van de vereniging van de verbinding met het doel. Downstream biologische uitlezingen die zijn geanalyseerd omvatten de Histon Mark modulatie of genexpressie veranderingen. KDM1A is een lysine demethylase dat methylgroepen verwijdert uit mono-en dimethylated H3K4, een modificatie in verband met het uitzwijgen van genexpressie. Modulatie van de proxy markers is afhankelijk van het celtype en de functie van de genetische make-up van de onderzochte cellen, die interpretatie en Cross-case vergelijking vrij moeilijk kan maken. Om deze problemen te omzeilen, wordt een veelzijdig protocol gepresenteerd om de dosis effecten en de dynamiek van de directe KDM1A doel betrokkenheid te beoordelen. De beschreven test maakt gebruik van een KDM1A chemoprobe voor het vangen en kwantificeren van ongeremd enzym, kan breed worden toegepast op cellen of weefselmonsters zonder de noodzaak van genetische modificatie, heeft een uitstekend detectie venster en kan zowel voor fundamenteel onderzoek worden gebruikt en analyse van klinische monsters.
Introduction
Lysine specifieke demethylase 1 (KDM1A)1 is een demethylase betrokken bij de controle van gentranscriptie. Dit eiwit is ontstaan als een kandidaat farmacologisch doel2 in oncologie; waaronder acute myeloïde leukemie3 (AML), Myelodysplasie syndroom (MDS)4, myelofibrose (MF)5,6, kleincellige longkanker (SCLC)7; in sikkelcelziekte (SCD)8,9, en in het centrale zenuwstelsel ziekten met inbegrip van de ziekte van Alzheimer (AD), multiple sclerose (MS); en in agressie10.
De meeste van de KDM1A remmende verbindingen in de klinische ontwikkeling zijn cyclopropylamine derivaten en remmen het eiwit door covalente binding aan zijn flavine adenine dinucleotide (FAD) cofactor11. Remming van KDM1A induceert genexpressie veranderingen, maar deze veranderingen variëren enorm over weefsels, celtypen of ziektegevallen. Remming van KDM1A verandert ook Histon-markeringen12, maar deze veranderingen worden meestal lokaal geproduceerd op een specifieke site in het genoom, en zijn opnieuw, zeer weefsel-en celspecifiek.
Het protocol is ontwikkeld om direct KDM1A doel betrokkenheid bij biologische monsters te meten en is geoptimaliseerd voor gebruik met cycloopropylamine-remmers. De test is gebaseerd op ELISA-technologie en analyseert, parallel, totaal en vrij (d.w.z. ongebonden door remmer) KDM1A in een native proteïne-extract van een biologisch monster in een vaste fase test. Als eerste stap wordt het biologisch monster gelyseerd in aanwezigheid van de biotinyleerd KDM1A selectieve chemoprobe og-88113,14, afgeleid van de selectieve KDM1A remmer ORY-1001 (iadademstat), een krachtige remmer van KDM1A in klinisch ontwikkeling voor de behandeling van oncologische ziekte. De chemoprobe heeft een IC50 voor KDM1A van 120 nm en bevat een Fad binding gedeelte gekoppeld aan een biotinyleerd polyethyleenglycol (PEG)-staart. De chemoprobe bindt uitsluitend aan de vrije KDM1A, maar niet aan de KDM1A van de remmer in het monster. Na de binding van chemoprobe worden de KDM1A met complexen in het monster gevangen op microtiterplaten met streptavidine gecoat oppervlak om vrije KDM1A te bepalen, of op platen bekleed met een monoklonaal anti-KDM1A Capture antilichaam om de totale KDM1A te bepalen. Na het wassen worden beide platen geïnfiltreerd met een anti-KDM1A detectie-antilichaam, opnieuw gewassen, en geïnfiltreerd met een secundaire HRP-geconjugeerde ezel anti-Rabbit IgG antilichaam voor detectie met behulp van een luminescente substraat en kwantificering door het meten van relatieve verlichtingseenheden (RLU) in een luminometer (Figuur 1).
Figuur 1. Schema van ELISA-enzym gekoppeld chemoprobe-immunoabsorberende test voor KDM1A target engagement: A) bepaling van het totaal KDM1A met behulp van sandwich-Elisa en B) bepaling van vrije KDM1A met behulp van CHEMOPROBE Elisa. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
In beide ELISA-platen wordt een standaard curve opgenomen om de lineariteit van elke test te controleren. De bepaling van KDM1A doel betrokkenheid in elk monster wordt vervolgens berekend als een relatieve waarde voor de voor dosis of het behandelde monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bloedmonsters werden verkregen van het Instituto de Recheréda van de onderzoekers Sant Pau biobank volgens de Spaanse wetgeving (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) en de goedkeuring van de lokale ethische comités. Studies met dierlijk weefsel werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (Richtlijn 86/609/EEG van de Europese Gemeenschappen) die is ingesteld door het ethisch comité voor dierproeven op de PRAAL-PCB.
1. bereiding van biologische monsters voor de bepaling.
Let op: dit protocol heeft betrekking op de manipulatie van biologische monsters die kunnen worden onderworpen aan de standaard ziekteverwekkers op het werk van veiligheid en gezondheid (OSHA), door bloed overgedragen pathogenen (29 CFR 1910,1030), Richtlijn 2000/54/EG van het EuropeesParlement en de Raad van 18 september 2000 of gelijkwaardige verordeningen. Bovendien kunnen de biologische monsters sporen bevatten van biologisch actieve chemische verbindingen voor onderzoek en kan het protocol verdere manipulatie van dergelijke verbindingen inhouden. Bekijk het veiligheidsinformatieblad (SDS) van de verbindingen die vóór de inleiding van het experiment zijn gebruikt en observeer strikt alle toepasselijke veiligheidsmaatregelen die in het onderzoekscentrum zijn vastgesteld, waaronder het gebruik van adequate persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). Draag goede beschermende kleding en gebruik de juiste afscherming tijdens de loop van het experiment. Gooi residuen weg in de geschikte afvalcontainers (biologisch/cytotoxisch afval).
Opmerking: dit protocol begint met cellen of monsters van proefpersonen die met een KDM1A-remmer zijn behandeld en hun onbehandelde of met het voertuig/placebo behandelde besturingselementen3.
- Cellen die in vitro zijn behandeld met een voertuig of KDM1A remmer
- Voor de cellen die worden geteeld in suspensie, als 10 mL culturen, breng de suspensies in schone 15 mL conische buizen en ga verder naar 1.1.3.
- Voor de aanhandige cellen (gekweekt in kolven van 75 cm2 ), verwijder het medium uit de kolf en was het kort met 4 ml PBS. Ontkoppel de cellen van hun vaten met 1,5 mL 0,5% trypsine-EDTA gedurende 2-5 min (trypsinisatie omstandigheden kunnen variëren, volg de aanbevelingen van de provider voor de cellijn), Voeg 4 mL PBS toe en breng de cellen over in schone 15 mL conische buizen.
- Steek de buisjes in een bench top centrifuge en verzamel de cellen door centrifugeren gedurende 5 min bij 400 x g bij 4 °c. Verwijder het supernatant, regeer de pellet in 1 mL PBS die wordt afgeleverd met een micro pipet en breng de suspensie over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Steek de monsters in een microtube centrifuge en centrifugeer ze gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 °c. Verwijder de PBS door aspiratie met een micro pipet en houd de pellets op het ijs en ga verder naar stap 2; of Vries de pellets op droogijs en bewaar ze bij-80 °C tot stap 3.
- Monsters van proefpersonen of dieren die behandeld zijn met een voertuig/placebo of KDM1A remmer
- Weefsels: snijd het weefsel in kleine, ≈ 1 cm3 stukken met behulp van een scalpel. Vries de weefsels in vloeistof N2 in een Dewar container en bewaar ze bij-80 °C tot stap 3.
- Polymorfe bloed mononucleaire cellen (PBMCs): Verdun 10 mL vers bloed (proces maximaal 2 uur na bloed terugtrekking) verzameld in K2-EDTA-buisjes met 2 volumes PBS in een conische buis van 50 ml. Isoleer de PBMCs uit het bloed met behulp van commercieel verkregen PBMC scheidings buizen volgens de instructies van de fabrikant. Houd pellets op het ijs en ga verder naar stap 3,2; of Vries de pellets op droogijs en bewaar ze bij-80 °C tot stap 3.
Opmerking: een natte celpellet van 20 tot 50 μL bevat ≈ 1 x 107 cellen, afhankelijk van de celgrootte. Een natte PBMC pellet verkregen uit 10 mL gezond menselijk bloed heeft een volume van ≈ 20 μL en bevat ≈ 1 x 107 PBMCs. weefsels of celpellets kunnen maximaal 6 maanden bij-80 ºC worden bewaard.
2. voorbereiding van de oplossing
- Bereid 2 μm og-881-werkoplossing voor: Neem een hoeveelheid van 10 μL eenmalig gebruik van de 20 mm biotinyleerd probe og-881 stockoplossing uit de koelkast van 4 °c en laat deze gedurende 10 minuten op kamertemperatuur (RT). bereid de werkoplossing van 2 μM door seriële verdunning van de og-881 Stock solut ion in PBS, met behulp van een micropipet met filter tips en het verwisselen van de punt tussen de verschillende verdunnings stappen.
- Bereid 10x proteaseremmer: Los 1 tablet op in 1 mL PBS in een micro centrifugebuis.
- Bereid het gewenste volume 1x Celllysisbuffer voor met 25 nM OG-881 chemoprobe. Meng voor elke mL 100 μL commercieel verkregen 10x Cellysisbuffer, 150 μL van 10x proteaseremmer, 12,5 μL van 2 μM OG-881 en 737,5 μL type 1 dubbel gedistilleerd water.
- Bereid desgewenst het gewenste volume van 1x Celllysisbuffer, maar met 25 nM ORY-1001 in plaats van OG-881 zoals in stap 2,3. Minder krachtige remmers kunnen worden gebruikt, maar kunnen hogere concentraties vereisen, voor gebruik in de positieve controle met 100% remming (zie stap 3,5).
Opmerking: Neem passende maatregelen om onbedoelde besmetting van oplossingen of monsters met de OG-881 of KDM1A remmers stockoplossingen te voorkomen. Om het gewenste volume van 1x Celllysisbuffer met 25 nM OG-881 te berekenen, wordt ervan uitgegaan dat 400 μL vereist is per 40 mg verpulverd weefsel, of 200 μL per natte pellet van 107 cellen.
3. inheemse EiwitExtractie
- Uit weefsels:
- Pulverize en homogeniseren een ≈ 1 cm3 kubus van bevroren weefsel met een mortier en een stamper gekoeld op droogijs. Aliquot de monsters in injectieflacons voor eenmalig gebruik met ≈ 40 mg weefsel poeder, Vermijd ontdooien te allen tijde. Ga verder met stap 3.1.2. voor onmiddellijke verwerking of opslag bij-80 °C.
- Respendeer 40 mg poeder weefsel in 400 μL van 1x Celllysisbuffer met 25 nM OG-881, Vortex voor 10 sec. en forceer het monster ten minste vijf keer via een 18-gauge botte spuit naald totdat Lysis van het weefsel wordt bereikt en een troebel licht geel tot oranje suspensie is Verkregen. Vermijd bellenvorming.
- Ga verder naar stap 3,3
- Van celpellets (PBMCs en cellijnen):
- Respendeer een pellet van ≈ 1 x 107 cellen in 200 μL 1x celllysisbuffer met 25 nm OG-881. Vortex de monsters kort en houd ze gedurende 5 minuten op het ijs.
- Soniceren de monsters in een sonicator met 3 pulsen van 20 s elk op 45 kHz; plaats ze op ijs voor 20 s tussen pulsen.
Opmerking: zodra de biologische monsters zijn geresuspendeerd in de 1x cel lysis buffer, houd ze op het ijs tijdens de rest van het proces.
- Houd de monsters nog 5 minuten op ijs, Vortex kort en centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 14 000 x g in een voorgekoelde centrifuge bij 4 °C.
- Gebruik een micro Pipet van 1 ml, breng de supernatanten over in verse 1,5 ml micro centrifugebuizen en laat ze op het ijs tijdens 2 uur. Ga door naar stap 4.
- Desgewenst kan een positieve controle voor het simuleren van 100% doel betrokkenheid als volgt worden voorbereid:
- Respendeer de celpellet of poedervormige weefsels van een voertuig of onbehandeld (predose) monster in het vereiste volume van 1x Celllysisbuffer met 25 nM ORY-1001 en proces zoals beschreven in stap 3,1 tot 3,3.
- Breng de supernatanten van de positieve controle in verse 1,5 ml micro centrifugebuizen en laat ze op ijs voor 1 h. ORY-1001 opzettelijk remmen KDM1A en blok chemoprobe binding.
- Voeg 5 μL 2 μM OG-881-werkoplossing toe aan de positieve controle supernatant (volume voor positieve controle gegenereerd uit een weefselmonster van 40 mg) of 2,5 μL van 2 μM OG-881-werkoplossing (volume voor positieve controle gegenereerd uit een 107-celmonster) om dezelfde OG-881 concentratie als de andere monsters en laat op ijs tijdens 2 h. Ga door naar stap 4.
4. kwantificering van inheems eiwit met behulp van Bradford assay
- Verdun de commercieel geproduceerde Bradford Protein assay reagens 5 keer met H2O type 1 dubbel gedistilleerd water. Bereken het volume van het reagens dat nodig is voor de totale hoeveelheid monsters en normen (1 mL per monster of standaard + 5 mL overtollig volume).
- Bereid voor de standaard curve van de boviene serum albumine (BSA) één micro centrifugebuis met 1 mL verdunde Bradford-Eiwitassay oplossing (blanco) en zeven microcentrifugebuisjes met 995 μL van de verdunde Bradford Protein assay-oplossing. Voeg 5 μL van elk van de BSA-normen (concentratie variërend van 125 tot 2.000 μg/mL) toe aan elk van de 7 micro centrifugebuizen en meng ze door de buizen voorzichtig meerdere malen te inverteren. Inincuberen gedurende 5 minuten bij RT.
- Breng de verdunde normen over naar cuvettes en lees de OD van de blanco-en boviene serum albumine-standaardmonsters in een spectrofotometer bij 280 nm.
- Bereid voor de biologische monsters één micro centrifugebuis met 1 mL verdunde Bradford-Eiwitassay oplossing (blanco) en zoveel microcentrifugebuisjes met 999 μL van het verdunde Bradford Protein assay-reagens als monsters die moeten worden gekwantificeerd. Voeg met behulp van een automatische P2-micropipet 1 μL inheems proteïne-extract in stap 3 toe aan elke micro centrifugebuis en meng door de buizen voorzichtig meerdere malen te inverteren. Inincuberen de monsters 5 min bij RT.
- Breng de volumes over naar cuvettes en lees de OD van de monsters in een spectrofotometer bij 280 nm.
- Ga bij voorkeur onmiddellijk naar stap 5. U ook de oorspronkelijke eiwitextracten opslaan bij-80 °C tot stap 5. Vermijd ontdooien cycli.
5. lichtgevende Elisa's voor totale en vrije KDM1A bepaling
Opmerking: Houd de labtemperatuur constant bij 23-24 °C (RT).
- Coating van microtiterplaten met Capture KDM1A antilichaam of streptavidine
- Totaal KDM1A ELISA: bereid voor elke plaat 10 mL KDM1A Capture-antilichaam voor op een eindconcentratie van 2 μg/mL in PBS. Breng 100 μL over in elke put van de plaat.
- Gratis KDM1A ELISA: bereid voor elke plaat 10 mL streptavidine in op 10 μg/mL in PBS. Breng 100 μL over in elke put van de plaat.
- Top-Seal de totale en vrije KDM1A ELISA platen met zelfklevende folie en inbroed de platen 's nachts bij 4 °C in de koelkast.
- Wassen en blokkeren van de platen
- Neem de platen uit de koelkast en laat ze voor gebruik ongeveer 45 min op de RT laten equilibraten.
- Bereid 1.000 mL wasbuffer (0,1% tween in PBS) en 50 mL blokkerende buffer (1% BSA in PBS) per plaat.
- Was de platen 3 keer met de wasbuffer. In deze en volgende stappen, tikt u op de plaat op papieren handdoeken na elke wasstap om de rest oplossing te verwijderen.
- Voeg 200 μL blokkeerbuffer per put toe aan beide platen, sluit beide platen aan met een Kleef film en inbroed 2 uur bij RT.
- Biologische monstervoorbereiding
- Verdun de oorspronkelijke eiwitextracten die aan het einde van stap 3 zijn verkregen naar de juiste concentratie met PBS. De aanbevolen concentratie zal variëren in functie van het niveau van KDM1A expressie in het biologische monster. Voorbeelden van geschikte bereiken zijn (1) Celpellets: 0,5-10 μg per put. (2) PBMCs: 5-30 μg per put. (3) verpulverd weefsel (hersenen, longen, huid): 20-100 μg per put. Houd de monsters op het ijs tijdens de bereiding. Voer indien mogelijk technische drievand-sample analyses uit.
- Bereid een standaard curve voor met Human rKDM1A:
- Om de KDM1A standaardwerk oplossing voor te bereiden, Pipet de juiste hoeveelheid rKDM1A voor een uiteindelijke concentratie van 25 PG/μL, voeg 75 μL van 2 μM OG-881 toe en vul met 1 x PBS tot een totaal volume van 6 mL in een 15 mL Falcon buis. Houd de KDM1A standaardwerk oplossing op ijs gedurende 1 uur en meng de oplossing zachtjes door de 15 mL Falcon Tube meerdere malen om de 20 minuten te inverteren.
- Bereid de KDM1A standaard verdunnings serie in 1,5 ml micro centrifugebuizen volgens tabel 1 (standaard preparaat), in volume genoeg voor de drievoud analyse van 2 96 well microtiterplaten.
| STANDAARD SERIE | KDM1A standaardwerk oplossing (μL) | |
| (PG KDM1A/well) | PBS (μL) | |
| 2500 voor C-* | 800 | - |
| 2500 | 800 | - |
| 1750 | 560 | 240 |
| 1250 | 400 | 400 |
| 750 | 240 | 560 |
| 250 | 80 | 720 |
| 25 | 8 | 792 |
| 0 | 0 | 800 |
| Opmerking: | ||
| (1) het volume dat voor elke verdunning is bereid, is voldoende om in drievat 2 platen van assay te worden uitgevoerd. | ||
| (2) het aanbevolen bereik ligt tussen 2,5 en 5.000 PG/well | ||
| * Voor de negatieve controle C-, zonder KDM1A detectie antilichaam | ||
Tabel 1: standaard preparaat. Pipetteer de aangegeven volumes van KDM1A standaardwerk oplossing en PBS in acht correct gelabelde 1,5 mL micro centrifugebuizen om de standaard serie KDM1A eiwitten voor te bereiden.
Tabel 2: diep goed plaat ontwerp. Normen (blauw) en monsters (geel) uit stap 5.4.2. werden in de gereflecteerde posities van de diepe put gepipetteerd om het laden in de ELISA-platen te vergemakkelijken volgens de richting van de blauwe (standaard) en gele (samples) pijlen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Tabel 3: Elisa-plaat ontwerp. De test plaat bevat de standaard curve met afnemende hoeveelheden recombinant KDM1A target (in blauw); de biologische monsters (en) in geel; en bijbehorende negatieve controles (bevatten de monsters, maar niet het primaire detectie-antilichaam) in wit, om te worden geladen op de ELISA-platen van de diepe goed plaat. De blanco (0 in standaard curve) bevat alle opname-en detectie reagentia, maar geen monster. Klik hier om dit bestand te downloaden.
- Elisa
- (Vervolg van stap 5.2.4) Gooi na 2 uur incubatie de blokkerende buffer weg en was de platen met de wasbuffer.
- Breng de juiste verdunde monsters (inheemse eiwitextracten en standaard curve van stap 5,3.) over naar een gekoeld 96 diep goed opslag blok na de plaat verdeling weergegeven in tabel 2 (Deep well plate Design).
- Houd dit blok op ijs tot pipetteren 100 μL monster/goed in de totale en vrije ELISA platen na de plaat verdeling weergegeven in tabel 3 (Elisa plaat ontwerp).
- Inincuberen voor 1 uur bij RT, gooi de monsters weg en was de platen 5 keer met de wasbuffer.
- Bereid 20 mL konijn anti-KDM1A Detection antilichaam op 0,125 μg/mL in blokkerende buffer, voeg 100 μL per putje toe in elke plaat van de test, behalve in putjes die overeenkomen met de negatieve controles C-. Sluit de plaat met de bovenste afdichting en inbroed 1 uur bij RT.
- Gooi de oplossing voor detectie van antilichamen weg en was de platen 6 keer met de wasbuffer.
- Bereid 25 mL secundaire geit anti-konijnen antilichaam HRP in op een verdunning 1:5000 in blokkerende buffer, voeg 100 μL per put toe aan de microtiterplaten; en incuberen 1 uur bij RT.
-
Chemiluminescentie detectie
- 30 minuten voor het einde van stap 5.4.7. en onder zachte lichtomstandigheden, meng gelijke delen van Luminol-Enhancer en peroxide oplossing (10,5 mL: 10,5 mL, voor 2 platen) in een amberkleurige fles en laat het op RT.
Opmerking: Houd de Luminol-werkoplossing in een amberkleurige fles en Vermijd langdurige blootstelling aan intens licht. Kortdurende blootstelling aan typische laboratorium verlichting zal de werkoplossing niet schaden. - Ten minste 20 minuten voordat u de luminescentie meet, schakelt u de microplaat Reader in op 25 °c en stelt u uitlezingen in op 1.000 MS integratie tijd en 150 MS afstel tijd. Parameter instellingen kunnen optimalisatie in functie van het instrument vereisen.
- Na 1 uur incubatie bij stap 5.4.7., gooi de secundaire antilichaam oplossing weg en was de platen 6 keer met de wasbuffer.
- Pipetteer 100 μL per put van de Luminol-werkoplossing (chemiluminescentie substraat), bereid in stap 5.5.1. Pipetteer heel langzaam en Vermijd Bubble-vorming. Gebruik een timer om de tijd te bepalen tussen de toevoeging van de oplossing en de luminescentie meting van de platen en houd deze tijd constant om een goede inter assay reproduceerbaarheid te bereiken.
- Top-Seal de platen en centrifugeer tot 500 x g bij RT voor 45 s in een plaat centrifuge om eventuele resterende bubbels te elimineren. Incuberen de platen gedurende 1 minuut op een plaat Shaker bij 100 rpm.
- Plaats de plaat in de lezer en laat deze 3 minuten staan om de temperatuur te stabiliseren bij 25 °C (zonder zelfklevende folie). Begin altijd met de gratis ELISA-plaat.
- Lees de relatieve luminescentie eenheden (RLU) van elke ELISA-plaat test (vrije en totale KDM1A).
- Opslaan en kopiëren van de onbewerkte RLU-waarden uit de onbewerkte gegevens Excel-bestanden voor verdere analyse van de resultaten.
- 30 minuten voor het einde van stap 5.4.7. en onder zachte lichtomstandigheden, meng gelijke delen van Luminol-Enhancer en peroxide oplossing (10,5 mL: 10,5 mL, voor 2 platen) in een amberkleurige fles en laat het op RT.
6. berekening van de beoogde betrokkenheid
- Bereken in een spreadsheet software de RLU-vrije en RLU-totaalwaarden van de monsters SX en referentiemonsters Ref (onbehandeld, voertuig of pre-dosis monster) uit hun technische replicaatonbewerkte gegevens zoals hieronder beschreven:
- Voer de afzonderlijke RAW RLUi-totaal en RAW RLUi-vrije gegevens in van lege cellen, standaard curve, negatieve controles C-en biologische monsters (SX en REF) in het analyse gegevensblad (bijvoorbeeld Excel). Geef ook de bedragen (in PG) van KDM1A op uit de standaard curve in het gegevensblad.
- Bereken het ruwe gemiddelde RLU, standaarddeviaties σrlu, en variatiecoëfficiënt CVrlu uit de individuele RAW Total en RAW Free rlui gegevens voor elke technische replicaatdata.
- De eliminatie van uitschieters toepassen (voorbeeld voor triplicaten): voor elk afzonderlijk RAW rlu Total en RAW rlu Free Data Point rlui van een Technical drievoud Datapoint, passen Grubbs-criteria toe wanneer het CV voor de drievoud > 0,15, en enkele verdachte RAW rlu-waarde afwijzen Wanneer
,
waarbij Z = 1,148 voor n = 3 en 90% betrouwbaarheidsinterval (CI). - Als uitschieter eliminatie werd toegepast, herberekent de onbewerkte gemiddelde rlu, standaarddeviatie σrlu en CVrlu van de niet-geweigerde (nr) RAW rlui Total en RAW rlui vrije waarden voor elke Data Point.
- De achtergrondcorrectie toepassen: Bereken de gemiddelde RLU-vrije en RLU-totaalwaarden voor elk standaardmonster en elk monster SX en referentiemonster ref als:
- De gegevens als volgt grafisch weergeven:
- Plot de RLUvrije en Rlutotaal waarden (Y-as) ten opzichte van hun monster-identificatie (X-as) in een staafdiagram.
- Plot ook de RLU-waarden (Y-as) van de standaarden in een spreidingsdiagram ten opzichte van hun hoeveelheid PG van rKDM1A-eiwit (X-as) voor vrije en totale metingen, evenals de corresponderende lineale trendlijnen en bereken de r2 (het kwadraat van de lineaire correlatiecoëfficiënt).
- Bereken de beoogde betrokkenheid (TE); d.w.z. het percentage van KDM1A gebonden door de KDM1A-remmer in elk monster SX ten opzichte van een referentiemonster Ref (onbehandeld, voertuig of pre-dosis monster) als volgt:
- Bereken de ratio R van de gemiddelde RLU vrije tot de totale waarden voor de SX-en REF-monsters als:
- Bereken vervolgens de beoogde betrokkenheid (TE) van het monster SX als:
Facultatief: (1) indien N biologische replicaatexperimenten werden uitgevoerd, elk met n technische replicaten; Bereken eerst de TESX voor de technische replicaatsets. Bereken vervolgens de gemiddelde TE, SD en de CV-waarden voor de biologische replicaset.
- Bereken de ratio R van de gemiddelde RLU vrije tot de totale waarden voor de SX-en REF-monsters als:
- Herzien of aan de criteria voor acceptatie van de test wordt voldaan: Controleer of (1) de test achtergrond aanvaardbaar is en de gemiddelde blanco < 0,05 x 107 rlu; (2) de automatische luminescentie van het monster ontbreekt en de RLUs van de negatieve controles C-lager is dan de ondergrens van de kwantificering (LLOQ = gemiddelde blank + 10x SD); (3) de rKDM1A-standaard curve is lineair en R2 ≥ 0,98; (4) de biologische monsters hebben RLU-waarden die in het dynamische en lineaire bereik van de assay vallen, d.w.z. tussen LLOQ en 2.500 pg/well.
Opmerking: stappen 6,1. tot 6,4. kan gemakkelijk worden geautomatiseerd in een calculus gegevensblad. - Exporteer de TE gegevens naar een open source of commercieel verkregen statistiek software naar keuze voor de grafische weergave van de TE-waarden en aanvullende statistische evaluaties.
,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lineariteit van de totale en vrije KDM1A bepaling.
Een standaard serie werd opgesteld zoals beschreven in stap 5.3.2, met gebruikmaking van 0 tot 2500 PG van het humane recombinant KDM1A enzym van de volledige lengte. De RLU-waarden van Total en Free rKDM1A werden beoordeeld om de lineariteit te controleren (Figuur 2a en 2b). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde van 3 experimenten met 3 technische replicaten (n) ± SD. De RLU-waarden van Total en Free KDM1A gedetecteerd in humaan PBMCs uit het bloed van 3 onafhankelijke vrijwilligers worden op de standaard curve in figuur 2c en 2Dgezet. Bloedmonsters werden verkregen van het Instituto de Recheréda van de onderzoekers Sant Pau biobank volgens de Spaanse wetgeving (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) en de goedkeuring van de lokale ethische comités.
Figuur 2. Bepaling van de totale en vrije rKDM1A in PBMCs van gezonde vrijwilligers. Rlu-waarden van totaal rKDM1A beoordeeld door Elisa (A) en van vrije rKDM1A beoordeeld door chemoprobe Capture Elisa (B). Gegevens werden verkregen uit 3 replicaatexperimenten, elk geanalyseerd in drievand (N = 3; n = 3). RLU-waarden van totaal KDM1A beoordeeld door ELISA (C) en van vrije KDM1A (D) voor de PBMCs van 3 onafhankelijke onbehandelde vrijwilligers (rode, blauwe en groene vierkantjes) die worden afgezet op een standaard curve. De gegevens werden verkregen uit één experiment geanalyseerd in drievat (N = 1; n = 3). De aangegeven waarden zijn de gemiddelden ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Analyse van KDM1A doel betrokkenheid in cellen
AML-cellen zijn gecultiveerde na aanbevelingen van de provider. Cellen werden behandeld met voertuig of ORY-1001 bij verschillende concentraties (0,25; 0,5; 1; 5 en 25 nM) (Figuur 3). De inheemse eiwitextracten werden verkregen in aanwezigheid van 25 nM OG-881 chemoprobe. 0,5 μg totaal eiwit werd gebruikt om de beoogde betrokkenheids analyse uit te voeren, zoals eerder beschreven. Totaal en gratis KDM1A werden bepaald en het percentage van de beoogde betrokkenheid van ORY-1001 tot KDM1A werd berekend ten opzichte van het voertuig zoals beschreven.
Figuur 3. Dosis-respons van KDM1A doel betrokkenheid in een menselijke AML-cellijn. Cellen werden behandeld met voertuig of ORY-1001 in verschillende concentraties (0,25; 0,5; 1; 5 en 25 nm) en gebruikt voor de bepaling van de beoogde betrokkenheid zoals beschreven. Gegevens werden verkregen uit 3 replicaatexperimenten, elk geanalyseerd in drievand (N = 3, n = 3). De aangegeven waarden zijn de gemiddelden ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Analyse van in vivo KDM1A target engagement
Het doel van dit experiment was om de doel betrokkenheid van ORY-1001 in verschillende rat weefsels te karakteriseren, in functie van het dosisniveau. Om dit doel te bereiken, werden 15 Sprague-Dawley ratten (200-250 g) ondergebracht in een cytostatische beveiligingsruimte om mogelijke verontreiniging door de geteste stof te voorkomen. Een maximum van 3 ratten/kooi werden willekeurig toegewezen aan 5 studiegroepen. De 5 verschillende studiegroepen ontvingen respectievelijk het voertuig; 1 3 10 of 30 μg/kg ORY-1001 door orale toediening gedurende 4 opeenvolgende dagen. Samengestelde stamoplossingen werden dagelijks bereid. Voor elke toediening werden de dieren gewogen om het vereiste volume aan te passen. Alle dieren werden ondergebracht bij constante kamertemperatuur (20-24 ºC) en relatieve vochtigheid (45-65%) onder een licht-donker cyclus van 12 uur (brandt op 6:00 AM). Eten en water waren beschikbaar ad libitum. Bloedmonsters werden verzameld 2 h na laatste toediening in K2EDTA buizen en PBMCs werden geïsoleerd volgens de eerder beschreven procedure in stap 1.2.2. en bewaard bij-80 °C tot de oorspronkelijke EiwitExtractie. Long monsters werden ook verzameld 2 h na de laatste Drug Administration, onmiddellijk bevroren in vloeibare stikstof, en opgeslagen bij-80 °C. Studies werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (Richtlijn 86/609/EEG van de Europese Gemeenschappen), die is ingesteld door het ethisch comité voor dierproeven op de PRAAL-PCB.
Na verpulening werden de oorspronkelijke eiwitextracten uit de longen verkregen zoals beschreven en gekwantificeerd. 5 μg totaal eiwit uit gepoolde PBMCs of 7,5 μg totaal eiwit uit de longen van 3 dieren werden per dosisgroep gebruikt om de KDM1A target engagement assay uit te voeren.
De dosis-respons van KDM1A doel betrokkenheid bij PBMCs en bij Long behandeling van ratten met ORY-1001 door middel van een mond sonde, berekend ten opzichte van de voertuig groep, wordt weergegeven in Fig. 4a en 4b. Zoals in figuur 4ckan worden waargenomen, is de ex vivo incubatie met 25 nm ORY-1001 van Long proteïne-extracten van de behandelde dieren van het voertuig nog volledig, maar neemt niet verder toe in monsters van ratten behandeld voor 4 dagen met 30 μg/kg ORY-1001 , bevestigende KDM1A werd in vivo al volledig geremd.
Figuur 4. In vivo en ex vivo native KDM1A target engagement. Dosis-respons van KDM1A doel betrokkenheid in PBMCs (A) en Long monsters (B) van ratten behandeld met ORY-1001 gedurende 4 opeenvolgende dagen (p. o). De gegevens zijn afkomstig van gepoolde extracten van het huis van PBMCs van 3 dieren per cohort, geanalyseerd in tweevoud (N = 1, n = 2) of uit de longen van 3 individuele dieren per cohort, geanalyseerd in triplicaat (N = 3, n = 3). C. vergelijking van TE in gepoolde Long eiwitextracten van ratten behandeld met voertuig (links) of 30 μg/kg ORY-1001; na 1 uur inincubatie van de extracten zonder (grijze staven) of met 25 nM ORY-1001 (blauwe staven) (N = 3, n = 3). Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol is ontwikkeld om KDM1A doel betrokkenheid direct te meten met behulp van een roman KDM1A chemoprobe Capture based ELISA. De methode is gevalideerd op gekweekte menselijke cellijnen en ex vivo monsters van mens, rat en muis en baviaan (inclusief PBMCs, longen, hersenen, huid, tumoren), maar kan gemakkelijk worden toegepast op andere soorten waarin het KDM1A antilichaam doelwit epitopen en katalytische centrum worden bewaard. Aangezien OG-881 een op activiteiten gebaseerde chemoprobe is, is de monster kwaliteit belangrijk en moet de juiste manipulatie en instandhouding van monsters worden nagestreefd, vooral tijdens de eerste stappen van het Protocol, om ervoor te zorgen dat de KDM1A activiteit behouden wordt.
Het huidige experimentele protocol is geoptimaliseerd voor het analyseren van KDM1A doel betrokkenheid door covalente FAD-targetingremmers. Het kan ook worden gebruikt met omkeerbare remmers die de toegang tot de FAD cofactor van KDM1A blokkeren. Krachtige omkeerbare remmers met lange verblijfs tijden kunnen gebruik maken van het ongewijzigde protocol.
De OG-881 chemoprobe is mogelijk niet geschikt voor lage potentie omkeerbare remmers met hoge tarieven. De specifieke chemoprobe die in dit manuscript wordt gebruikt, is geen celpenetrant en daarom worden analyses ex vivo uitgevoerd op gelyseerd-monsters.
De methode kan worden uitgevoerd op instrumenten die algemeen beschikbaar zijn in onderzoeks-en analytische laboratoria; het vereist geen genetische modificaties in cellen worden geïntroduceerd, en het kan gemakkelijk worden toegepast op verschillende soorten steekproeven. Een ander voordeel is dat het kan worden gebruikt op monsters die zijn afgeleid van verschillende soorten die vaak worden gebruikt in het preklinisch bewijs van concept studies en in toxicologie modellen en dat het met succes is vertaald om klinische monsters te analyseren.
Andere methoden zijn gebruikt voor de analyse van KDM1A target engagement. Veel van deze methoden gebruiken proxy markeringen zoals wijzigingen van de H3K4me2 Histon Mark, met behulp van alphalisa15; of inductie van uitdrukkings markers met behulp van qRT-PCR of FACS Analysis16. Echter, in de cellen of weefsels, de Histon markeringen worden bestuurd door meerdere factoren, en assays dat maatregelen wijzigingen in de Histon merk niet altijd zorgen voor een goed dynamisch bereik voor analyse. KDM1A remming kan induceren krachtige veranderingen in gen en eiwit expressie, maar de respons neigt tot zeer heterogene en zeer celcontext afhankelijke, die kan compliceren analyses van de dosisrespons3,7.
Directe beoordeling van de bezetting van het doelwit is daarom de beste optie om de doel betrokkenheid te meten. Eén test die hiervoor is voorgesteld, is de cellulaire thermische verschuiving test (CETSA), gebaseerd op de verhoging van de thermische stabiliteit van doel eiwitten na binding van remmers. Deze methode kan in principe worden toegepast op ongewijzigde cellen en verschillende weefsel typen en is onlangs gebruikt om de cellulaire activiteit van KDM1A remmers in gecultiveerde cellen te beoordelen17. Echter, deze technologie is zelden gebruikt voor in vivo farmacodynamische studies18 en tot het beste van onze kennis, het gebruik ervan is niet gemeld in klinische proeven.
Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een volledig gevalideerde chemoprobe-methode die is gebruikt om KDM1A doel betrokkenheid in cellen en weefselmonsters te bepalen. De methode is met succes vertaald om monsters van menselijke proefpersonen behandeld met een KDM1A-remmer19 te analyseren en zal van groot gebruik zijn om PK/PD-reacties in klinische onderzoeken te modelleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur Tamara Maes is uitvoerend bestuurder en aandeelhouder, en de auteurs Cristina Mascaró en Raquel Ruiz Rodriguez zijn werknemers van Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. ontwikkelt KDM1A remmers en bezit octrooien voor verbindingen en methoden die worden gebruikt in dit artikel.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, en deels ondersteund door het CIIP-20152001 en RETOS Collaboration Program RTC-2015-3332-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0,05% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 X Protease Inhibitor Tablets | Roche | #11836153001 | |
| 96 deep well storage block | VWR | #734-1679 | |
| 96 well ELISA plates | Nunc | #436110 | |
| Adhesive black Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Adhesive transparent Film | VWR | #60941-062 | |
| Biotinylated KDM1A probe OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | # 3117057001 | |
| Bovine Serum Albumin Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Bradford Protein Assay | BioRad | #500-0001 | |
| Cell lysis buffer 10X | Cell Signaling | #9803 | |
| Centrifuge for 96- well plates | Hettich | Rotina 420R | |
| Flask | Thermo Scientific | #156499 | |
| Full length, enzymatically active human Recombinant LSD1 / KDM1A | Active Motif | #31426 | |
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer and Peroxide Solution (Chemiluminescent Substrate) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Micro Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Microplate reader Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mouse monoclonal capture antibody Anti-KDM1A (N-terminal epitope) | Abcam | #ab53269 | |
| Needle G18 gauge blunt | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| PBMC separation tubes 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| PBMC separation tubes 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Plate shaker | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Rabbit monoclonal detection antibody Anti-KDM1A (C-terminal epitope) | Cell Signaling | #672184BF-100 | |
| Secondary antibody Peroxidase-conjugated Donkey Anti-rabbit IgG | Thermo Scientific | #31458 | |
| Spectrophotometer cuvette 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spectrophotometer for cuvette | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptavidin | Promega | #Z704A | |
| Syringe | BD | #303172 | |
| Type 1 ultrapure water | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | USC200T |
References
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
- Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
- Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601 (2015).
- Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54 (2018).
- Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
- Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
- Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
- Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905 (2015).
- Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
- Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
- Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. Gonz#225;lez, E. C., Maes, T., Crusat, C. M., Mu#241;oz, A. O. , WO2017158136 (2016).
- Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
- Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
- Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
- Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
- Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000 (2017).
- Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192 (2017).
