Summary
Здесь мы описываем поколения и применение свода трансгенных Arabidopsis thaliana линии благоприятных индуцибельной, ткани конкретных выражение в трех основных меристем и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы, камбий.
Abstract
Индуцибельной, ткани конкретного выражения является важным и мощным инструментом для изучения пространственно временной динамики генетической возмущений. Сочетание гибкой и эффективной GreenGate, клонирование системы с проверенной и протестированные LhGR системы (здесь называют GR-LhG4) для индуцибельной выражения, мы породили ряд трансгенных линий Arabidopsis, которые могут управлять выражение эффекторных Кассета в диапазоне типов конкретных клеток в трех главных растений меристем. С этой целью мы выбрали ранее разработанной GR-LhG4 система, основанная на химерных транскрипционный фактор и родственных поп тип промоутер, обеспечить жесткий контроль над широкий спектр выражение уровня. Кроме того чтобы визуализировать выражение домена, где активен синтетических транскрипционный фактор, флуоресцентные корреспонденту ER-локализованных mTurquoise2 под контролем промотора pOp4 или pOp6 кодируется в линии драйвер. Здесь мы описывают шаги, необходимые для создания драйверов или эффекторных линии и продемонстрировать как конкретное выражение типа клеток может быть индуцированных и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы и камбий Arabidopsis. С помощью нескольких или всех драйверов линии, специфическое действие контекста выражения одного или нескольких факторов (эффекторы) под контролем промотора синтетической поп можно оценить быстро, например F1 растений Креста между одной эффекторных и несколько линии драйвер. Этот подход подтверждается внематочная выражением VND7, НАК транскрипционный фактор способны индуцировать внематочная средних клеток стенки осаждения автономным образом клетки.
Introduction
Одним из основных ограничений в биологии в постгеномную эру является расшифровать конкретную роль контекста данного фактора или генетических возмущений. Учредительного генетических возмущений, таких, как потеря функции и выгоды функция подходы часто только позволяют концевой анализ пожизненный адаптационных процессов, запутывание различие между первичными и вторичными эффектами. Кроме того конкретные функции контекста может быть масках или разбавленный воздействием крупных масштабах в отдаленных тканях или на других этапах развития. Кроме того в крайних случаях, летальность может препятствовать любой механистической проницательность. Идеально чтобы обойти эти проблемы, можно проанализировать эффект острого генетических возмущений в конкретном контексте такие конкретные ячейки типа в духе времени решена. Для достижения этой цели требуется1генетических средства для индуцибельной, выражение определенного типа клеток. Для обеспечения ресурсов для быстрой оценки динамики пространственно-временных ответа на заданный эффекторных, мы объединили легкость клонирования, представленной GreenGate системе2 с доказанной эффективностью системы GR-LhG43, 45,,6. Мы породили набор линий, выражая химерных транскрипционный фактор, который LhG4 сливается с лигандом связывающий домен крысы корковых рецептор (GR)7 под контролем хорошо изученных ячейки типа конкретных промоутеров8. В отдыхая условий, транскрипционный фактор остается вне ядра, как GR домена связана цитозольной HSP90. С добавлением синтетических лигандом дексаметазона (Dex) индуцированной ядерных транслокации и LhG4 будет посредничать транскрипции выражение кассет под контролем промотора родственных синтетической поп типа , таких как репортер mTurquoise2 включены в линии драйвер для визуализации выражение домена после индукции. Таким образом водитель линии технически также содержат эффекторных кассеты. Пересечение набора драйверов линии с линией, перевозящих эффекторных кассету с, например, ген интереса под контролем промотора же поп типа таким образом позволяет быстрой оценки острой или долгосрочных последствий эффекторных выражения в широком диапазоне типов клеток.
Здесь мы предоставляем протокол описания процедур, необходимых для создания линии водителя и эффекторных и продемонстрировать как конкретное выражение типа клеток может быть индуцированных и стрелять апикальной Меристемы, корень апикальной Меристемы и камбий из Арабидопсис. Чтобы проиллюстрировать доблесть и специфичность данного подхода, мы используем известные транскрипционный фактор VND7, который способен вождения утолщений стены клетки ксилемы как средних ectopically9. Лечение F1 от помесь pSCR10,11 драйвер линией и линией эффекторных pOp6:VND7 приводит к образованию внематочная клетки ксилемы как в оболочке крахмала, что стволовые клетки Arabidopsis .
Для облегчения поколения больших сборок ДНК, необходимые для построения драйвера и эффекторных выражение плазмид, мы использовали быстро и эффективно GreenGate, клонирование метод2. Клонирование GreenGate основаны на тип II S энзимов ограничения такие как эко31I или его isoschizomer Bsa2. Эти ферменты отрезать вниз по течению от их асимметричной признание сайтов производства свесы с различной базовый состав. Включив эко31I /Bsaя ограничения сайтов в олигонуклеотиды и выделения конкретных навеса последовательностей ДНК элементы, Модульная клонирования достигается, содействие поколения больших сборок. В рамках GreenGate ДНК модули делятся на категории, A-F на основе последовательности навеса, которые служат адаптеры и собраны в этом порядке. Таким образом грунты, предназначенные для того чтобы усилить ваш желаемый продукт должен соответствовать выбранный модуль2 (рис. 1A). Если есть внутренней эко31I /Bsaя сайта и последовательность не совместим с модулями записи и назначения GreenGate, вы можете продолжить без mutagenizing, но с более низкой эффективности. Кроме того, для удаления эко31I использовать сайт Направленный мутагенез /Bsaя места ограничения, стараясь не изменять аминокислот в продуктах ген.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Векторы и модули можно получить из некоммерческих репозитория, Addgene (https://www.addgene.org).
1. клонирование, используя GreenGate
- Праймеры дизайн с использованием свесы, перечисленные в таблице 1, заменив модуль адаптера конкретного типа последовательности «NNNN» перечислены ниже: вперед: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + определенной последовательности 3´, обратный: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + задний ход дополнение 3´ определенной последовательности. Добавьте подчеркнутые базы для обеспечения поддержания рамка чтения.
Свесы модуль:
Примечание: В рамках GreenGate по умолчанию, шесть модулей, A-F, комплектуются позвоночника вектора трансформации растений в одно выражение плазмиду (рис. 1 c). Как правило модуль будет питать промоутер последовательностей, B-модуль N-терминальный тег или «думмичный» последовательность6, C-модуль CD, тег D-модуль C-терминала или манекен, E-модуль Терминатор и F-модуль сопротивления кассету для отбора трансгенной растения. Адаптер для соединения с другими подразделениями креплению доступны для использования вместо F модуль2. - Амплификации PCR
- Усилить последовательность интереса с дизайном праймеры полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно стандартных протоколов.
- Отдельный продукт PCR на геле агарозы. Акцизный и столбец очищают правильный фрагмент с помощью коммерческих комплект (см. Таблицу материалы) в соответствии с инструкциями производителя.
- Создание модуля записи
- Отдельно дайджест модуль вектора и ПЦР фрагмента (шаг 1.2.) (Рис. 1 A, B) с ОЭС31I/BsaI, с использованием 100-500 нг ДНК (вектор или фрагмент), 3 мкл 10 x буфер пищеварение и 5-10 U эко31I в трубку и доводят объем до 30 мкл с ddH2O.
- Смесь осторожно, закупорить вверх и вниз и спин вниз кратко на 1000 x g. Инкубируйте при 37 ° C на блоке тепла для 15 мин (или после времени рекомендации приобрели энзима ограничения).
- После переваривания, столбец очистить каждый образец, используя коммерческие комплекта (см. Таблицу материалы) и количественную оценку полученных ДНК путем определения оптической плотности на 260 Нм (260OD) с помощью спектрофотометра.
- Микс 30 – 100 нг усваивается закупорить вверх и вниз несколько раз вставить и 10-50 нг переваривается вектор и инкубировать с 1 мкл T4 лигаза (5 U/мкл и 3 мкл 10 x буфер лигирование T4 в общем объеме 30 мкл при комнатной температуре за 1 ч (после рекомендации Лигаза поставщика T4) (см. Таблицу материалы).
Примечание: Вычислить желаемого молярное соотношение вектор вход модуля: назначения (например, 3:1) для перевязки в зависимости от концентрации и длина пластин модуля записи. - Для повышения эффективности преобразования тепла инактивирует лигаза T4 по инкубации реакции при 65 ° C для 20 мин.
- Используйте продукт перешнуровки чтобы преобразовать сведущее Escherichia coli клетки согласно стандартным лаборатории протоколы и распространение бактерий на плитах агара дополнена ампициллин (100 мкг/мл)
- Инкубируйте пластину с бактериями при 37 ° C для ночлега.
- Экран для колоний с нужной записи модулем колонии PCR используя праймеры 86A1 (5 ' GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3′) и 86A2 (5 ' GTTTTCCCAGTCACGACG-3′) и стандартные условия PCR.
Примечание: Эта комбинация грунтовка действителен для всех модулей записи как праймеры привязку к магистрали вектора входа. - Выберите один колоний для изоляции плазмиды. Использовать 2 мл фунтов культур в жидкой среде дополнена ампициллин (100 мкг/мл) и инкубировать на ночь в шейкере 37 ° C.
- Изолировать плазмиды от ночи культур в жидкой среде с комплектом мини-Prep или желаемого извлечения протокола (см. Таблицу материалы).
- Чтобы идентифицировать плазмид с правильной вставки, выполните анализ энзима ограничения, например, выбрав двух ферментов, которые сократить уникально в вашем вставки путем смешивания 200 ng плазмида, 2 мкл 10 x буфер пищеварение, U 5-10 выбранных энзимов ограничения и ddH2 O 20 мкл.
- Последовательность отдельных плазмид, используя праймеры 86A1 и 86A2 (см. шаг 1.3.9.).
- Создание модуля назначения:
Примечание: Для назначения плазмида используют в желаемый пункт назначения модуль pGGZ001, pGGZ002 или pGGZ0032 (рис. 1 c).- В трубке добавить и смешайте 50 – 150 нг назначения пустой вектор (pGGZ003, например), 50-300 нг каждого заполнены модуль входа, 2 мкл 10 x буфер buffer пищеварение, 1.5 мкл 10 мм АТФ, 1 мкл T4 лигаза (30 U/мкл), 5-10 мкл U эко31I и dH2O суммарный объем 20 мкл.
Примечание: Вычислите желаемого молярное соотношение вектор вход модуля: назначения (например, 3:1) для перевязки в зависимости от концентрации и длина пластин модуля записи. - Смешать и выполнять GreenGate реакции2 с помощью ПЦР Термоциклер, чередуя 30 раз 37 ° C за 5 мин и 16 ° C в течение 2 мин, затем одиночных шагов 5 минут при 50 ° C и 5 мин при температуре 80 ° C.
- Для повышения эффективности, 1 мкл T4 лигаза (30 U/мкл) и 1,5 мкл 10 мм СПС реакции и инкубировать 1 час при комнатной температуре, затем тепло инактивации ДНК лигаза T4 в 65 ° C для 20 мин.
- Используйте реакции перешнуровки преобразовать сведущее Escherichia coli и распространять бактерии на плиты агара, дополняется соответствующей выборочной агент спектиномицин (50 мкг/мл).
- Инкубируйте преобразованные E. coli на табличке при 37 ° C для ночлега.
- Чтобы подтвердить преобразование, повторно испещрять каждого из выбранных одного колоний на спектиномицин (50 мкг/мл) и ампициллин (100 мкг/мл) содержащие пластины, соответственно. Используйте только колоний, которые растут на спектиномицин, но не на ампициллин пластины.
- Инкубировать E. coli колоний на ночь при 37 ° C.
- Выберите один колоний для плазмида изоляции. Использовать 2 мл фунтов культур в жидкой среде дополнена спектиномицин (50 мкг/мл) и инкубировать на ночь в шейкере 37 ° C.
- Изолировать соответствующий плазмид с набором мини-Prep (см. Таблицу материалы).
- Проверьте энзима ограничения анализа (см. 1.3.12.) и последовательность отдельных положительных конструкций с помощью грунтовки 88 c 3 (5 ' ACCTCTCGGGCTTCTGG-3′), 88 c 4 (5 ' CCTTTTTACGGTTCCTG-3′). Если вставка нельзя полностью виртуализированных с этими грунты, дизайн внутреннего Праймеры для виртуализации.
Примечание: Для выявления клонов с правильным количеством поп повторения последовательностей (см. обсуждение), грунты pOp6 (pOp6_F, 5 ' TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3′; и _R pOp6, 5 ' CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3′) которые связывают в короткие Фланкируя последовательности может использоваться для амплификации PCR и последующих электрофорез различать по размеру.
- В трубке добавить и смешайте 50 – 150 нг назначения пустой вектор (pGGZ003, например), 50-300 нг каждого заполнены модуль входа, 2 мкл 10 x буфер buffer пищеварение, 1.5 мкл 10 мм АТФ, 1 мкл T4 лигаза (30 U/мкл), 5-10 мкл U эко31I и dH2O суммарный объем 20 мкл.
- Создание промежуточных суперблока
- Чтобы объединить два независимых набора модулей записи, необходимые для генерации GR-LhG4 драйвер линии с интегрированной репортер эффекторных кассету, первый построить два промежуточных плазмид, под названием supermodules2, перед монтажом окончательное выражение плазмида в pGGZ001 или pGGZ003.
- Убедитесь в том добавить в конце первого суперблока и адаптер H-A в начале второго суперблока, (те служить соединения между двумя конструкции) как описано2F-H адаптер.
Примечание: Только pGGN000 промежуточный модуль осуществляет сопротивления кассеты. Чтобы создать выражение плазмида, выполняют GreenGate реакция с вектором назначения и промежуточных supermodules pGGN000 и pGGM000. Кроме того смесь назначения вектор, pGGN000 промежуточные суперблока и оставшиеся одиночных модулей для выполнения реакции GreenGate2. Последний способ менее эффективен, чем первый, но может быть быстрее. - Для создания pGGM000/pGGN000 суперблока, смешайте 1.5 мкл (100-300 нг/мкл) каждого из модулей записи с 1 мкл (30 нг/мкл) пустой промежуточных вектор (pGGM000 или pGGN000), 2 мкл 10 x буфер пищеварение, 1.5 мкл 10 мм АТФ, 1 мкл T4 лигаза (30 U/мкл) и 5-10 U эко31I в общем объеме 20 мкл.
Примечание: Вычислить желаемого молярное соотношение вектор вход модуля: назначения (например, 3:1) для перевязки в зависимости от концентрации и длина пластин модуля записи - Смешать и выполнять GreenGate реакции как шаг 1.4.2
- Для повышения эффективности, 1 мкл лигаза T4 и 1,5 мкл АТФ (10 мм) и инкубировать 1 час при комнатной температуре, а затем тепло инактивации при 65 ° C для 20 мин.
- Использование 10 мкл реакции перешнуровки преобразовать сведущее Escherichia coli и полоска на тарелках, содержащих канамицин (50 мкг/мл).
- Выполнять ночь инкубации преобразованные E. coli на табличке на 37 ° C.
- Повторно испещрять каждый из выбранного одного колоний на канамицин (50 мкг/мл) и ампициллин (100 мкг/мл) содержит пластины, соответственно.
- Выполнять на ночь инкубации E. coli колоний на табличке на 37 ° C.
- Выберите один колоний, которые растут только на канамицин, но не на ампициллин для плазмида изоляции. Использовать 2 мл фунтов культур в жидкой среде дополнена канамицин (50 мкг/мл) и инкубировать на ночь в шейкере 37 ° C.
- Выделить соответствующие плазмид, используя мини-готовит комплект (см. Таблицу материалы).
- Проверьте плазмид энзима ограничения анализа (см. 1.3.12). и подтвердите путем sequencing используя праймеры 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) и 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) отжиг к магистрали pGGM000/pGGN000. Если вставка нельзя полностью виртуализированных с этими грунты, дизайн внутреннего Праймеры для виртуализации.
Примечание: Если клонирование в pGGM000 или pGGN000 векторы неудачн, одним из возможных решений заключается в дайджест pGGM000 или pGGN000 с эко31I, на геле и очищают от геля pGGM000 или pGGN000 фрагмент позвоночника (примерно 2000 года bp) без Кассета ccdB (примерно 1400 bp). Затем обычно приступить к реакции перешнуровки.
- Трансформировать штамма pSOUP+ A. tumefaciens (например ASE), как происхождение pSa репликации (ori а. tum.) в векторы назначения требуют присутствия вспомогательный плазмида pSOUP12. Полоса бактерий на ФУНТ пластин, содержащие Хлорамфеникол (34 мкг/мл), канамицин (50 мкг/мл), спектиномицин (50 мкг/мл) и тетрациклинов (12,5 мкг/мл). Инкубируйте преобразованные A. tumefaciens на плите в инкубаторе 28 ° C для двух-трех дней.
2. поколение Arabidopsis трансгенных растений
- Преобразования Arabidopsis thaliana.
Примечание: Преобразование A. thaliana растений согласно Zhang et al., 200613. - Выбор трансгенных линий.
- Чтобы выбрать трансформированных растений, используйте Выбор схему, используемую на ГАБИ-Kat14 для сопротивления сульфадиазин15.
- Чтобы выбрать стабильной линии с возможной интеграции одного события, выберите те поколения T2, которые показывают соотношение 3:1 сегрегации в маркер сопротивления. Распространить эти линии T3 поколения и выберите гомозиготных для сопротивления ген растения. Кроме того выполните Южной блот анализ или стандартные количественные реального времени PCR (SA-ПЦР)16 выбрать один вставки строки.
3. индукция транс активации в линии Arabidopsis драйвер
- Корень
- Чтобы проверить репортер выражение в линии A. thaliana драйвер, порожденных через шаги 1 и 2, стерилизовать семена, как описано ниже.
- Добавить 0,5-1,0 мл 70% этанол + 0.01% неионные моющее средство для примерно 100 семян (20 мг) в 1,5 мл реакции и инвертировать трубки несколько раз. Спин вниз на 1000 x g 15 s и аспирата супернатант.
- Добавить 0,5-1,0 мл абсолютного этанола. Инвертировать трубке несколько раз, спина вниз для 1000 x g 15 s и удалить супернатант.
- Добавить 0,5-1,0 мл абсолютного этанола и инвертировать трубки t несколько раз, затем уменьшается на 1000 x g 15 s и удалить супернатант.
- Разрешить семена высохнуть внутри вытяжки. Если семена собираетесь расслаиваются в трубах, перейдите к шагу 3.1.1.6.
- Добавить 0,5-1,0 мл стерильной воды и инвертировать трубку несколько раз. Спин вниз на 1000 x g 15 s и удалить супернатант.
- Добавить 0,5-1,0 мл стерильной воды и инвертировать трубке несколько раз. Спин вниз на 1000 x g 15 s и удалить супернатант.
- Добавить 0,5-1,0 мл стерильной воды.
- Подготовка рН половину сила фотосинтетическую и Скуг среднего, 5.8 и добавить 0.9% завод агар и 1% сахарозы. После автоклавирования добавить дексаметазона (Dex), растворенного в ДМСО, до конечной концентрации 10-30 мкм для индукционных плит и равное количество ДМСО для контроля пластин, соответственно.
- Положите семена для корня изображений на тарелках и стратифицировать их за 48 ч в темноту и холод (4 ° C).
- Поместите пластины в вертикальном положении в инкубаторе завод (длинный день (16/8 h), 22 ° C, влажность 65%) и вырастить их в течение пяти дней.
- Через пять дней после прорастания (ГПДР), изображение саженцев, используя Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
- Чтобы проверить репортер выражение в линии A. thaliana драйвер, порожденных через шаги 1 и 2, стерилизовать семена, как описано ниже.
- Стебель
- Стерилизуйте семена, как описано в 2.1.1. и положил семена на ½ MS, агар растений 0,9% и 1% сахарозы пластин. Стратифицировать за 48 ч в темноту и холод (4 ° C).
- Шесть-семь дней после прорастания, передачи рассады в почву, каждый завод в одном горшке (длинный день (16/8 h), 22 ° C, влажность 65%).
- Вызвать транс активации в стебли, полив с Dex или макет решение, или путем погружения растений в Dex или макет решения, соответственно.
- Для полива, используйте 25 мкм Dex раствор в воде, приготовленный из запас 25 мм, которую Dex растворяется в этиловом спирте. Воды каждые 2-3 дня до желаемого времени индукции.
- Для погружения, подготовьте стакан емкостью 1 Л, 750 мл воды, содержащие silwet L-77 0,02% с 25 мкм Dex или эквивалентное количество ДМСО Dex и макет лечения, соответственно. Окуните одного растения для 30 s в индукции или в макет решения. Повторяйте каждые 2-3 дня до желаемого времени визуализации.
Примечание: После погружения, растения следует сохранить в высокой влажности на один час.
- Стрелять апикальной Меристемы (SAM)
- Стерилизуйте семена, как описано в 2.1.1. Подготовить пластины с ½ MS, агар растений 0,9% и 1% сахарозы среднего и положить семена на тарелках. Храните пластины на два дня в темноту и холод для стратификации.
- Поместите пластины в вертикальном положении в инкубаторе растений. Шесть-семь дней после прорастания, передачи рассады в почву, каждое растение в одном горшке (длинный день (16/8 h), 22 ° C, влажность 65%).
- Когда стебель длиной около 1 см (25-30 Даг), спрей соцветие Сэм с 10-50 мкм Dex в Ч.20, носить маску. Для индукции и изображений на более поздних стадиях развития побудить Самс более стеблей или боковых побегов.
Примечание: МСОС может также быть индуцированных paintbrushing Dex решения для предотвращения распыления капельки. Используете маску, когда Dex применяется путем распыления. - 24-48 ч после индукции, вскрыть МСОС и приступить к томографии (см. 4.3).
Примечание: Только ООН искусственных растений использовались для распространения для снижения вероятности сайленсинга генов. Растения в T2/T3 были использованы для обработки изображений.
4. imaging репортер выражения в линии драйвер арабидопсиса .
- Корень
- Передача саженцев от пластины в 10 мкг/мл пропидий йодидом (PI) решение и противодействию линяют на 5 мин.
- Поместите корни в изображений камеры микроскопа (1-ну тканевые культуры камеры на Стекло покровное II, см. Таблицу материалы) и образ их с помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с 63 x цель погружения воды (см. Таблицу материалы).
- Чтобы визуализировать PI флуоресценции, используйте возбуждения волны 488 нм и собирать выбросов между 590 и 660 нм. Для mTurquoise2 флуоресценции использовать 458 Нм возбуждения и собирать выбросов между 460 и 615 Нм.
- Стебель
- Выполняют горизонтальные рука вырезать части растений стебли с лезвием бритвы, иссечения сегмент из примерно 3 см. исправить стебель с пальцем на противоположной стороне нужного раздела, чтобы вырезать. Последовательно выполнить несколько тонких пропилов, но обратите внимание, что следует сравнивать только разделы с аналогичной должности в стволе.
- После каждого разреза погрузите razorblade в чашке Петри, содержащие водопроводной воды и сбора стволовых разделы. На данный момент запятнать разделы или непосредственно монтировать на скольжениях микроскопа.
- Для окрашивания, подготовить 1 мл 250 мкг/мл раствора PI воды в небольших Петри (см. Таблицу материалы). Погружать в разделах 5 мин и промойте их в воде. Перевести их на скольжениях микроскопа с тонкой щипцами или тонкой кистью. Позаботьтесь, чтобы не сжать образцы с coverslip.
- Изображения образцов с помощью конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с 25 x погружения воды погружение объектива (см. Таблицу материалы). Использование 561 Нм лазерного света для возбуждения флуоресценции PI и собирать с 570 до 620 Нм. Использование 405 нм на возбуждение эффектора Флюорофор mTurquoise2, кодируемых водитель линии конструкции и собирать выбросов от 425 до 475 Нм.
- Стрелять апикальной Меристемы
- Разрезать стебель 2 см ниже кончика стрелять с щипцами. Удерживая шток в одной руке и использование тонкой щипцы для удаления бутонов и большие Примордия. Чтобы удалить молодых Примордия, исправьте SAM в вертикальном положении в чашку Петри, содержащие 3% агарозном. Используйте бинокль и щипцы для удаления молодых Примордия недалеко от SAM. В качестве альтернативы используйте канюли инъекции (см. Таблицу материалы), чтобы отрезать эти Примордия.
- Пятно расчлененных Сэм в 250 мкг/мл PI раствор на 5-10 минут выполнять пятнать либо непосредственно закупорить несколько капель пятнать решения сверху подготовленный Сэм или передать образец трубки, наполненные окрашивание раствора. Держите SAM полностью погружен в процессе окрашивания.
- Место окрашенных Сэм в небольшой Петри (см. Таблицу материалы) с 3% агарозном среднего и Сэм накрыть ddH2O.
- Изображение расчлененный Самс, используя конфокальный лазерный сканирующий микроскоп оснащен 25 x погружения воды погружение объектива (см. Таблицу материалы).
- Использование 561 Нм лазерного света для возбуждения флуоресценции PI и собирать с 570 до 620 Нм. Использование 405 нм для возбуждения mTurquoise2 Флюорофор и собирать выбросов от 425 до 475 Нм.
Запись стеки изображений, охватывающих 50 мкм в z направлении с шагом размером 0,5 мкм.
Примечание: Сэм изображений как описано здесь требуется вертикально Конфокальная лазерная сканирование микроскоп и объектив (здесь, воды, окуная объектив) с рабочим расстоянием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поколение водителя и эффекторных линий через GreenGate клонирования
GreenGate, клонирование системы основана на GoldenGate клонирования и использования эндонуклеазы ограничения типа IIS Bsaя или его isoschizomer эко31I. Как фермента производит свесы далеких от асимметричной признание сайта, базовый состав свесы может быть свободно выбран, которая является основой образуют модульности системы. Сначала каждый ПЦР созданный элемент, например, промоутер последовательности, компакт-диски или терминатор, вставляется в вектор места для записи с совпадающими свесов производится путем ограничения дайджест для создания модуля. После subcloning, количество соответствующих модулей, обычно шесть, используются для реакции перешнуровки GreenGate результате в Ассамблее конструкции в векторе назначения двоичного завод.
Для драйверов линий модули, содержащие последовательностей ДНК тканей конкретной промоутера (pTS), фактор транскрипции GR-LHG4, промоутер pOp6 и mTurquoise2 репортер сливается с пептидной сигнал N-терминала и удержания сигнал C-терминал ER были склеенный, включая терминаторы и различные модули адаптер и модуль для трансгенных выбора, как описано ранее в 2,8 (рис. 2). Эффектор линии были построены с pOp6 промоутер и эффекторных кассету, например состоящий из гена интереса и Терминатор, а также модуль кодирования сопротивления ген для отбора трансгенных растений (рис. 2).
Индукция драйверов линий и визуализация репортер флуоресцирования
Индукции с Dex приводит к выражение конкретных mTurquoise2 типа клеток в корневом эндодермы (pSCR>> SP-mTurquoise2-HDEL, рис. 3A), флоэма прекурсоров и камбием (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, Рисунок 3B) и стволовые клетки апикальной Меристемы стрелять (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, рис. 3 c).
Транс активация VND7 в крахмал оболочка клетки камбия
Как тестовый случай для транс активации мы созданы, эффекторные линии кодировку средних клеток стенки мастер транскрипционный фактор VND7 сливается с VP16 активации домена, который был показан побудить стены формирования средней ячейке автономно когда misexpressed 8,9,19,20.
Соответственно, после 5 дней одного лечения с 15 мкм для индуцированного Dex или ДМСО или макет растения стволовых разделы были подготовлены для визуализации внематочная lignification в оболочке крахмала. Пропидий йодидом показывает сильное сродство стволовых Стачивание тканей. Оболочка клетки крахмала в индуцированной образцы Dex, но не в макет показал сильный сигнал для канала PI и некоторые клетки показывают типичный сетчатые утолщение стены клетки в клетках ксилемы (рис. 4).
Рисунок 1. GreenGate, клонирование принцип. A) эндонуклеазами ограничения типа IIS, как Bsaя /эко31I, признать не палиндром последовательности (красный) и вырезать асимметрично в определенного расстояния независимо от последовательности (синий). Эко31I признает «GGTCTC», порезы от второй нуклеотидов, вниз по течению признание сайта и создает четыре базовых 5' навеса. B GreenGate клонирования системы на основе модульной системы с шестью различными запись векторов pGGA000-pGGF000. Эти векторы содержат ампициллин сопротивления кассеты (AmpR) и ccdB кассету в окружении конкретные адаптеры для каждой записи вектор (например pGGA000 вход вектора) и «GGTCTC» эко31I признание сайтов. Эко31I переваривания pGGA000 выпускает ccdB и создает pGGA000-конкретных свесы четырех нуклеотидов (синий). Insert1 усиливается, грунты, укрывательство «GGTCTC» и pGGA000 конкретные адаптеры и после переваривания лигируют в pGGA000. Аналогичная процедура используется с другими модулями. C окончательный реакции GreenGate сочетает в себе эко31I пищеварение назначения вектор pGGZ001 и шесть вступления векторов pGGA000-pGGF000 и одновременное лигирование всех модулей в вектор назначения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Обзор системы Dex индуцибельной LhGR/поп с водителем и эффекторных линиями. В линии драйвер, ткани конкретных промоутеров (pTS) контролировать выражение синтетических транскрипционного фактора LhG4, который translationally сливается с лигандом связывающий домен крыса глюкокортикоидных рецепторов (GR) и тем самым предотвращает, в отсутствие Dex, ядерные транслокации. Линии эффекторных затаивает transcriptional кассеты, движимый элемент поп и Тата коробку с минимальным 35S промоутера. Пересекли с линией драйверов и по индукции Dex, GR-LhG4 связывает элементы поп тип кассеты репортер и тем в модуле эффектор, вызывая транскрипции mTurquoise2 и эффекторные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Индуцированная драйвер линии в корень, стебель и Сэм. A) линия Dex индуцированной водитель pSCR >>SP-mTurquoise2-HDEL (проросшие в 50 мкм Dex) в корень и макет лечения. Пугало промоутер (pSCR) опосредует выражение в эндодермы, коры/эндодермы первоначальный (ЦЕИ) и покоя центр (КК). Клетки борьбы с пятнами с пропидий йодидом (PI). Масштаб баров = 20 мкм. B) линия Dex индуцированной водитель pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (смоченной в растворе Dex 50 мкм и визуализирована после 3 дней) в в стебель и макет лечения. SMXL5 промоутер (pSMXL5) является посредником выражение в стволовых клеток камбия домен и флоэмы прекурсоров. Клетки борьбы с пятнами с пропидий йодидом (PI). Масштаб баров = 100 µm. C) линия Dex индуцированной водитель pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 мкм, 48 ч) в SAM. CLAVATA3 промоутер (CLV3p) опосредует выражение в области стволовых клеток. На снимках в нижней XZ и YZ сечения, Dex индуцированной и макет относились, соответственно. Клетки борьбы с пятнами с пропидий йодидом (PI). Масштаб баров = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Эктопическая lignification в оболочке крахмала ствола. A) внематочная lignification это видели через пять дней после индукции Dex линии водитель pSCR >> VND7-VP16 в стволе. Пугало промоутер (pSCR) является посредником выражение в клетках оболочка крахмала в стволе. Изображение слева показывает слияния канала PI и яркие области, справа, что изображение показывает только канала PI. B) макет элемента управления показывает сигнал не в клетках оболочка крахмала. Клетки борьбы с пятнами с пропидий йодидом (PI). Масштаб баров = 100 µm. Пи флуоресценции ложь цветные зеленым при хлоропласта auto флуоресценции Красного во всех изображениях. Белые стрелки указывают на крахмал оболочка клетки. Изображение слева показывает слияния канала PI и яркие области, справа, что изображение показывает только канала PI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Модуль | 5' свес | обычно используется для | 3' свес |
| A | ACCT | Промоутер | AACA |
| B | AACA | N-терминальный тег | GGCT |
| C | GGCT | Кодирующая последовательность | TCAG |
| D | TCAG | C-терминала тег | CTGC |
| E | CTGC | Терминатор | ОТЕЛЬ ACTA |
| F | ОТЕЛЬ ACTA | Кассета сопротивления | GTAT |
Таблица 1: Навесы для конструкции праймера
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь, мы описывают шаги, необходимые для создания и применения универсальный и всеобъемлющий инструментарий для индуцибельной, ячейки типа конкретных транс-активации. Пересечения линий, перевозящих эффекторных кассеты под контролем промотора поп с линии драйвер позволяет изучать последствия неправильного выражения в поколения F1, включение быстрой оценки генетических возмущений в широком диапазоне типов клеток. Кроме того эффекторные конструкции может использоваться для преобразования драйверов линии, или путем адаптации клонирования стратегии, водитель и эффекторных конструкции также могут быть объединены на одном T-ДНК. Приложения для этой системы варьируются от пространственно и височно контролируемых исследований неправильное выражение предметно НОК Даун или гена редактирования и тип ячейки конкретные дополнения.
Ни один из описанных здесь процедур следует представляют собой вызов лаборатории, оборудованные для общего молекулярные методы биологии. LhG4 выражение системы были тщательно протестированы и гарантирует, что не Дырявый и настраиваемый выражение, которое может управляться высокий уровни8, хотя мы предупреждаем, что динамический диапазон концентрации индуктор должен определяться эмпирически для каждого водителя и эффекторных линия комбинация сочетаются модульные GreenGate клонирования это проверенная система предлагает быстрый и простой способ индуцибельной выражение в любой тип клеток, для которого доступен конкретной промоутера. Мы заметили, что рекомбинации, что события могут происходить во время усиления плазмиды, которые содержат повторяющиеся последовательности промоутер поп типа . Это часто приводит к имея меньше повторов OP последовательности, которые могут быть оценены методом ПЦР. Окончательной конструкции всегда должны быть подтверждены последовательности в Escherichia coli и Agrobacterium tumefaciens. Однако иногда рекомбинации события были обнаружены только в E. coli.
Ограничения применения этой техники является таким образом время для создания трансгенных растений. Это имеет решающее значение для проверки гена глушителей, начиная с поколения T2 и только поддерживать стабильные линии. Чтобы свести к минимуму вероятность глушителей, мы советуем, собирая семена только формы-индуцированной растения.
Метод, описанный здесь является бесплатным для других транс активации систем21,22, как она обеспечивает всеобъемлющий ресурс и сочетает в себе специфику ткани с индуцибельной выражение. Возможного будущего развития данного метода является включение более промоутеров определенного типа клеток для дисков GR-LhG4, например в тканях вне основной меристем. Что касается эффекторы захватывающие возможности расширения является адаптация высокоэффективных гена, инструменты для ячейки конкретного типа стук выходы23редактирования.
Линии драйвер, описанных в Schürholz et al. 20188 доступны от НКБА (http://arabidopsis.info/), ДНК конструкции описаны в Лабропулос et al., 2013-2 и Schürholz et al., 20188 доступны с Addgene (https://www.addgene.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Работа в нашей лаборатории поддерживается Немецкий исследовательский фонд (DFG) гранты WO 1660/6-1 (с.в.) и GR 2104/4-1 (т.г.) и SFB1101 (для т.г. и J.U.L) и Европейский исследовательский совет консолидатором предоставить т.г. (PLANTSTEMS 647148) С.в. поддерживается через братство Эмми Нётер DFG через Грант WO 1660/2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
