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Genetics

Inductible, Expression spécifique au Type cellulaire chez Arabidopsis thaliana médiation par le biais de LhGR Trans-Activation

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59394
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1, 3, 3, 1, 2
1Department of Developmental Physiology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 2Department of Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 3Department of Stem Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg
* These authors contributed equally

Summary

Ici, nous décrivons la génération et l’application d’un ensemble de transgéniques Arabidopsis thaliana lignes habilitante expression inductible, tissu-spécifique dans les trois méristèmes principaux, le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium.

Abstract

Expression inductible, tissu-spécifique est un outil important et puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelle des perturbations génétiques. Combinant la GreenGate souple et efficace avec l’éprouvée et Benchmarké LhGR système (ici appelé GR-LhG4) pour l’expression inductible de clonage, nous avons généré un ensemble de lignées transgéniques de Arabidopsis qui permet de piloter l’expression d’un effecteur cassette dans un éventail de types de cellules spécifiques dans les méristèmes usine principale trois. À cette fin, nous avons choisi le système GR-LhG4 déjà élaborée, fondé sur un facteur de transcription chimérique et un promoteur apparenté de type pOp , assurer un contrôle serré sur un large éventail de niveaux d’expression. En outre, afin de visualiser le domaine d’expression où le facteur de transcription synthétique est actif, un journaliste fluorescent mTurquoise2 ER localisée sous le contrôle du promoteur pOp4 ou pOp6 est codé en lignes correspondant au pilote. Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour générer une ligne pilote ou effectrices et démontrer comment expression spécifiques du type cellulaire peut être induite et suivie dans le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium d’Arabidopsis. En utilisant le pilote plusieurs ou toutes les lignes, l’effet de contexte spécifique d’exprimer un ou plusieurs facteurs (effecteurs) sous contrôle du promoteur synthétique pOp peut être évaluées rapidement, par exemple chez les plantes F1 d’un croisement entre un effecteur et multiple lignes de pilote. Cette approche est illustrée par l’expression ectopique de VND7, un facteur de transcription du CNA capable d’induire la déposition ectopique cellule secondaire de la paroi de manière autonome de la cellule.

Introduction

Une limitation majeure en biologie dans l’ère postgénomique est à déchiffrer le rôle spécifique du contexte d’un facteur donné ou perturbation génétique. Constitutives perturbations génétiques comme les approches de perte de fonction et de gain de fonction permettent souvent seulement point final une analyse des processus d’adaptation permanente, dissimuler la distinction entre les effets primaires et secondaires. En outre, des fonctions spécifiques de contexte peuvent être masquées ou diluées par des effets à grande échelle en tissus éloignés ou pendant d’autres phases de développement. En outre, dans les cas extrêmes, la létalité peut empêcher toute idée mécanistique. Idéalement, pour contourner ces problèmes, on pourrait analyser l’effet d’une perturbation génétique aiguë dans un contexte spécifique tel qu’un type de cellule spécifique d’une manière résolue dans le temps. Pour ce faire, des outils génétiques pour inductible, expression spécifique au type de cellule sont requis1. Pour fournir une ressource pour l’évaluation rapide de la dynamique spatio-temporelle d’une réponse à un effecteur donné, nous avons combiné la facilité du clonage fournies par le système de GreenGate2 avec l’efficacité prouvée du système GR-LhG43, 4,5,6. Nous avons généré un ensemble de lignes exprimant le facteur de transcription chimérique LhG4 fondu pour le domaine de liaison du ligand du récepteur (GR) corticoïdes rat7 sous le contrôle du type de cellule bien caractérisés promoteurs spécifiques8. En conditions de repos, le facteur de transcription reste en dehors du noyau, comme le domaine des ressources génétiques est lié par la HSP90 cytosolique. Avec l’ajout de ligands synthétiques dexaméthasone, translocation nucléaire est induite et LhG4 vont médier transcription des cassettes d’expression sous contrôle d’un promoteur analogues synthétiques de type pOp , comme un journaliste mTurquoise2 inclus dans les lignes correspondant au pilote de visualiser le domaine d’expression après l’induction.  Ainsi, les lignes correspondant au pilote techniquement aussi contenant une cassette d’effecteur. La traversée d’un ensemble de lignes correspondant au pilote avec une ligne transportant une cassette d’effecteur avec, par exemple, un gène d’intérêt sous le contrôle du même promoteur pOp-type donc permet une évaluation rapide des conséquences aiguës ou à long terme d’expression de l’effecteur dans un large éventail de types de cellules.

Ici, nous fournissons un protocole décrivant les procédures nécessaires pour générer les lignes pilote et effectrices et démontrer comment expression spécifiques du type cellulaire peut être induite et suivie dans le méristème apical, le méristème apical racinaire et le cambium de Arabidopsis. Pour illustrer la prouesse et la spécificité de cette approche, nous utilisons le facteur de transcription bien connu VND7 qui est capable de piloter des épaississements de mur de cellules du xylème secondaire façon ectopique9. Traitement de F1 d’un croisement entre la ligne de pilote pSCR10,11 et l’effecteur pOp6:VND7 conduit à la formation des cellules du xylème ectopiques dans la gaine de l’amidon de l' Arabidopsis , les cellules souches.

Pour faciliter la génération de grands assemblages d’ADN requis pour construire des plasmides d’expression conducteur et effectrices, nous avons utilisé le GreenGate rapide et efficace méthode2le clonage. GreenGate clonage est basé sur les enzymes de restriction type II S tels Eco31I ou ses isochizomère BsaI2. Ces enzymes couper en aval de leurs sites de reconnaissance asymétrique produisant des surplombs avec des variables de composition en bases. En intégrant l' éco31I /Bsaj’ai des sites de restriction en oligonucléotides et affectation des séquences spécifiques de porte-à-faux à des éléments d’ADN, clonage modulaire est atteint, facilitant la génération de grandes assemblées. Dans le cadre de GreenGate, modules d’ADN relèvent de catégories Qu'a à F repose sur la séquence de surplomb qui servent de cartes et sont montés dans cet ordre. Les amorces conçues pour amplifier votre produit désiré devraient donc selon le module sélectionné2 (Figure 1 a). Si il y a un interne Eco31I /Bsaje site et la séquence n’est pas compatible avec les modules d’entrée et de la destination de GreenGate, vous pouvez procéder sans la mutagenèse, mais avec une efficacité moindre. Également utiliser mutagenèse pour supprimer Eco31I /Bsaj’ai des sites de restriction prenant soin de ne pas pour changer d’acides aminés dans les produits des gènes.

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Protocol

Vecteurs et modules peuvent être obtenus du référentiel à but non lucratif, Addgene (https://www.addgene.org).

1. clonage à l’aide de GreenGate

  1. Des amorces de conception en utilisant les surplombs énumérés au tableau 1, remplacer « NNNN » avec des séquences d’adaptateur spécifique au type de module ci-dessous : vers l’avant : 5´AACA GGTCTC NNNN (n) CA* + 3´ de séquence spécifique, inverser : 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + marche arrière complément de la séquence spécifique 3´. Ajouter les bases soulignés pour assurer l’entretien de la trame de lecture.
    Débords de module :
    NOTE : dans le cadre de GreenGate par défaut, 6 modules, A-F, sont assemblés avec un squelette de vecteur de transformation végétale dans le plasmide d’une expression (Figure 1). En général, le module A va abriter séquences promotrices, un B-module un N-terminal tag ou « factice » séquence6, un module C un CD, une balise D-module un C-terminal ou mannequin, un E-module un terminateur et un F-module une cassette de résistance pour la sélection de transgéniques plantes. Adaptateur pour attelage avec d’autres unités préassemblées peuvent être utilisées au lieu du module de F2.
  2. Amplification par PCR
    1. Amplifier la séquence d’intérêt avec les amorces par polymerase chain reaction (PCR), conformément aux protocoles standards.
    2. Séparer le produit PCR sur gel d’agarose. Accise et la colonne purifient le fragment correct à l’aide d’un film publicitaire nécessaire (voir la Table des matières) selon les instructions du fabricant.
  3. Création de module entrée
    1. Digérer séparément le vecteur de module et le fragment PCR (étape 1.2.) (Figure 1 A, B) avec Eco31I/Bsaj’ai à l’aide de 100 à 500 ng d’ADN (vectoriel ou Fragment), 3 µL 10 x tampon de digestion et 5-10 U Eco31I dans un tube et porter le volume à 30 µL avec FD2O.
    2. Mélanger doucement par pipetage de haut en bas et la centrifuger brièvement à 1 000 x g. Incuber à 37 ° C dans un bloc chauffant pendant 15 min (ou suite à la recommandation de temps de l’enzyme de restriction achetée).
    3. Après la digestion, colonne purifier chaque échantillon en utilisant une publicité nécessaire (voir la Table des matières) et de quantifier l’ADN obtenu par la détermination de la densité optique à 260 nm (OD260) à l’aide d’un spectrophotomètre.
    4. Mix le 30 – 100 ng digéré l’insert et le vecteur de 10 à 50 ng digéré en pipettant également monter et descendre plusieurs fois et incuber 1 µl T4 Ligase (5 U/µL et 3 µL 10 x tampon ligature T4 dans un volume total de 30 µL à température ambiante pendant 1 h (selon la recommandation le fournisseur de ligase T4) (voir la Table des matières).
      Remarque : Calculer le vecteur de module : destination désirée rapport molaire en entrée (p. ex. 3:1) pour la ligature selon la concentration et la durée des inserts module entrée.
    5. Pour augmenter l’efficacité de transformation, chaleur inactiver la ligase T4 en Incubant la réaction à 65 ° C pendant 20 min.
    6. Utilisation du produit de ligature pour transformer compétentes d' e. coli cellules selon les protocoles de laboratoire standard et la propagation des bactéries sur milieu gélosé additionnés d’ampicilline (100 µg/mL)
    7. Incuber la plaque avec les bactéries à 37 ° C pendant une nuit.
    8. Écran des colonies avec le module d’entrée souhaitée par PCR en utilisant les amorces 86A1 (5′-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3′) et les 86A2 (5′-GTTTTCCCAGTCACGACG-3′) et les conditions normalisées de PCR sur colonie.
      Remarque : Cette combinaison d’amorces est valable pour tous les modules d’entrée comme les amorces se lient à l’ossature de vecteur d’entrée.
    9. Sélectionnez des colonies individuelles pour l’isolement de plasmide. Utiliser 2 mL LB culture liquide additionnée d’ampicilline (100 µg/mL) et incuber pendant la nuit dans un shaker de 37 ° C.
    10. Les plasmides isolat de la culture liquide une nuit ou plus avec un Kit de mini-préparent ou l’extraction désirée protocole (voir Table des matières).
    11. Pour identifier les plasmides avec l’insert correct, effectuer une analyse de l’enzyme de restriction, par exemple en choisissant deux enzymes qui coupent uniquement dans votre insert en mélangeant 200 ng de plasmide, 2 µL 10 x tampon de digestion, 5-10 U de sélectionné enzymes de restriction et de ddH2 O à 20 µL.
    12. Séquencer les plasmides sélectionnés en utilisant les amorces 86A1 et 86A2 (voir l’étape 1.3.9).
  4. Création de module de destination :
    Remarque : Pour le plasmide de destination, utilisez la destination souhaitée module pGGZ001, pGGZ002 ou pGGZ0032 (Figure 1).
    1. Dans un tube à ajouter et mélanger 50 – 150 vector de destination vide ng (pGGZ003, par exemple), rempli de ng 50-300 de chaque module d’entrée, 2 µL 10 x tampon de digestion, 1,5 ml 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL), 5 à 10 µL de U Eco31I et dH2O pour un volume total de 20 µl.
      Remarque : Calculer le vecteur rapport molaire désirée de module : destination entrée (p. ex. 3:1) pour la ligature selon la concentration et la durée des inserts module entrée.
    2. Mélanger et effectuer la réaction de GreenGate2 à l’aide d’un thermocycleur PCR alternant 30 fois entre 37 ° C pendant 5 min et 16 ° C pendant 2 min, suivie par des mesures simples de 5 min à 50 ° C et 5 min à 80 ° C.
    3. Pour augmenter l’efficacité, ajouter 1 µL T4 Ligase (30 U/µL) et 1,5 µL ATP 10 mM à la réaction et incuber pendant 1 heure à température ambiante, suivie de chaleur-inactivation de T4 DNA Ligase à 65 ° C pendant 20 min.
    4. La réaction de ligature permet de transformer des compétentes d' Escherichia coli et propager les bactéries sur milieu gélosé additionné à la spectinomycine agent sélectif approprié (50 µg/mL).
    5. Incuber le transformé e. coli sur les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
    6. Pour confirmer la transformation, ré-ensemencer chacun des colonies unique sélectionnées sur la spectinomycine (50 µg/mL) et à l’ampicilline (100 µg/mL) contenant des plaques, respectivement. Utilisez seulement les colonies qui se développent sur la spectinomycine, mais pas sur les plaques d’ampicilline.
    7. Incuber les colonies d’e. coli pendant une nuit à 37 ° C.
    8. Sélectionnez des colonies individuelles pour l’isolement de plasmide. Utiliser 2 mL LB culture liquide additionnée de spectinomycine (50 µg/mL) et incuber pendant la nuit à un shaker de 37 ° C.
    9. Isoler les plasmides correspondants avec un Kit de préparation mini (voir Table des matières).
    10. Vérifier par analyse de restriction enzymatique (voir 1.3.12.) et la séquence sélectionnée des constructions positives à l’aide d’amorces 88 3 (5′-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3′), 88 4 (5′-CCTTTTTACGGTTCCTG-3′). Si l’insert ne peut pas être entièrement séquencé avec ces amorces, concevoir des amorces internes pour le séquençage.
      Remarque : Pour identifier les clones avec le nombre correct de pOp séquences répétées (voir Discussion), les amorces pOp6 (_FpOp6, 5′-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3′ ; et pOp6_R, 5′-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3′) qui se lient dans le Bref des séquences d’accompagnement peut être utilisé pour l’amplification par PCR et électrophorèse sur gel subséquent de discriminer selon la taille.
  5. Création de supermodule intermédiaire
    1. Pour combiner deux séries indépendantes de modules d’entrée, tel que requis pour générer les GR-LhG4 lignes correspondant au pilote avec cassette intégrée journaliste-effecteur, première génération deux plasmides intermédiaire, appelés supermodules2, avant d’assembler l’expression finale plasmide dans pGGZ001 ou pGGZ003.
    2. N’oubliez pas d’ajouter l’adaptateur F-H à la fin de la première supermodule et adaptateur H-A au début de la deuxième supermodule (ceux qui servent de connexions entre deux constructions) comme décrit2.
      Remarque : Seul le module intermédiaire pGGN000 porte de la cassette de résistance. Pour générer le plasmide d’expression, effectuer la réaction de GreenGate avec le vecteur de la destination et le supermodules intermédiaires pGGN000 et pGGM000. Vous pouvez également mélanger destination vecteur, pGGN000 supermodule intermédiaires et les autres modules simples à effectuer la réaction de GreenGate2. Cette dernière méthode est moins efficace que l’ancien mais peut être plus rapide.
    3. Pour créer un supermodule pGGM000/pGGN000, mélanger 1,5 µL (100-300 ng/µL) de chacun des modules entrée avec 1 µL (30 ng/µL) intermédiaire vecteur vide (pGGM000 ou pGGN000), 2 µL de tampon de digestion x 10, 1,5 µL ATP, 1 µL 10 mM T4 Ligase (30 U/µL) et 5-10 U Eco31I dans un volume total de 20 µL.
      Remarque : Calculer le vecteur de module : destination désirée rapport molaire en entrée (p. ex. 3:1) pour la ligature selon la concentration et la durée des inserts module entrée
    4. Mélanger et effectuer la réaction de GreenGate comme au point 1.4.2
    5. Pour augmenter l’efficacité, ajouter 1 µL T4 Ligase et 1,5 µL ATP (10 mM) et incuber pendant 1 heure à température ambiante, suivie inactivation par la chaleur à 65 ° C pendant 20 min.
    6. Utiliser 10 µL de la réaction de ligature pour transformer compétentes d' e. coli et l’ensemencer sur des plaques contenant la kanamycine (50 µg/mL).
    7. Effectuer une nuit d’incubation de la transformée d’e. coli sur les plaques à 37 ° C.
    8. Ré-ensemencer chacun des colonies unique sélectionnées sur la kanamycine (50 µg/mL) et à l’ampicilline (100 µg/mL) contenant des plaques, respectivement.
    9. Effectuer une nuit d’incubation des colonies Escherichia coli sur les plaques à 37 ° C.
    10. Sélectionnez des colonies individuelles qui poussent uniquement sur kanamycine mais pas sur ampicilline pour l’isolement de plasmide. Utiliser 2 mL LB culture liquide additionnée de kanamycine (50 µg/mL) et incuber pendant la nuit dans un shaker de 37 ° C.
    11. Isoler les plasmides correspondants en utilisant une préparation de mini kit (voir Table des matières).
    12. Vérifier les plasmides par analyse de restriction enzymatique (voir 1.3.12). et confirmez par séquençage à l’aide d’amorces 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) et 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) recuit à la colonne vertébrale pGGM000/pGGN000. Si l’insert ne peut pas être entièrement séquencé avec ces amorces, concevoir des amorces internes pour le séquençage.
      Remarque : Si le clonage dans le vecteur pGGM000 ou pGGN000 est infructueux, une solution possible est de digérer le pGGM000 ou le pGGN000 avec l' Eco31I, courir sur un gel et purifier du gel le fragment d’épine dorsale (environ 2000 bp) pGGM000 ou pGGN000 sans la BCDC cassette (environ 1400 bp). Puis procéder normalement à la réaction de ligature.
  6. Transformer une souche de pSOUP+ a. tumefaciens (ASE, par exemple), comme l’origine pSa de réplication (ori A. tum.) dans les vecteurs de destination requiert la présence du plasmide d’assistance pSOUP12. Ensemencer les bactéries sur des plaques LB contenant le chloramphénicol (34 µg/mL), kanamycine (50 µg/mL), spectinomycine (50 µg/mL) et la tétracycline (12,5 µg/mL). Incuber le transformé a. tumefaciens sur la plaque dans un incubateur à 28 ° C pendant deux à trois jours.

2. génération de plantes transgéniques d’Arabidopsis

  1. Transformation d’Arabidopsis thaliana.
    NOTE : Transformer les plantes Arabidopsis selon Zhang et al., 2006,13.
  2. Sélection de lignées transgéniques.
    1. Pour sélectionner les plantes transformées, utilisez le schéma de sélection utilisé à GABI-Kat14 pour la résistance à la sulfadiazine15.
    2. Pour sélectionner des lignes stables avec un événement possible intégration unique, choisissez ceux dans génération T2, qui montrent le ratio de 3:1 ségrégation dans le marqueur de résistance. Se propagent ces lignes pour production de T3 et sélectionner les plantes homozygotes pour le gène de résistance. Vous pouvez également effectuer une analyse du Southern Blot ou une norme quantitative en temps réel PCR (SA-qPCR)16 pour sélectionner des lignes d’insertion unique.

3. induction de trans-activation de lignes correspondant au pilote Arabidopsis

  1. Racine
    1. Pour tester les expression du rapporteur dans Arabidopsis conducteur lignes générées par les étapes 1 et 2, stériliser les graines comme décrit ci-dessous.
      1. Ajouter 0,5 à 1,0 mL de 70 % éthanol + 0,01 % de détergent non ionique pour environ 100 graines (20 mg) dans un tube de réaction de 1,5 ml et inverser le tube à quelques reprises. Tournez en bas à 1000 x g pendant 15 s et aspirer le surnageant.
      2. Ajouter 0,5 à 1,0 mL d’éthanol absolu. Inverser le tube plusieurs fois, tourner vers le bas pour 1 000 g pendant 15 s et jeter le surnageant.
      3. Ajouter 0,5 à 1,0 mL d’éthanol absolu et inverser le tube t plusieurs fois, puis tourner vers le bas à 1 000 x g pendant 15 s et jeter le surnageant.
      4. Laissez les graines à sécher à l’intérieur de la hotte. Si les graines vont être stratifiée en tubes, continuez au point 3.1.1.6.
      5. Ajouter 0,5 à 1,0 mL d’eau stérile et inverser le tube à quelques reprises. Tournez en bas à 1 000 x g pendant 15 s et jeter le surnageant.
      6. Ajouter 0,5 à 1,0 mL d’eau stérile et inverser le tube plusieurs fois. Tournez en bas à 1 000 x g pendant 15 s et jeter le surnageant.
      7. Ajouter 0,5 à 1,0 mL d’eau stérile.
    2. Préparer la force de Murashige et Skoog, pH du milieu 5,8 et ajouter 0,9 % usine agar et 1 % de sucrose. Après autoclavage ajouté dexaméthasone (Dex), dissous dans le DMSO, à une concentration finale de 10 à 30 µM à plaques induction et une quantité égale de DMSO plaques de contrôle, respectivement.
    3. Mettez les graines pour l’imagerie de la racine sur les plaques et les stratifier pendant 48 heures dans l’obscurité et le froid (4 ° C).
    4. Mettre les plaques en position verticale dans un incubateur de l’usine (longue journée (16/8 h), 22 ° C, humidité, 65 %) et les cultiver pendant cinq jours.
    5. Cinq jours après la germination (dag), image les semis à l’aide de laser confocal, microscopie à balayage.
  2. Tige
    1. Stériliser les graines comme décrit à la section 2.1.1. et mettre des graines sur MS ½, agar plante 0,9 % et 1 % plaques de saccharose. Stratifier pendant 48 heures dans l’obscurité et le froid (4 ° C).
    2. Six ou sept jours après la germination, transférer les plants dans le sol, chaque plante dans un pot unique (longue journée (16/8 h), 22 ° C, humidité, 65 %).
    3. Induire la trans-activation dans les tiges par arrosage avec Dex ou solution simulée, ou en plongeant les plantes dans Dex ou faux, respectivement.
    4. Pour l’arrosage, utilisez une solution de Dex 25 µM dans l’eau, préparé à partir d’un stock de 25 mM Dex dissous dans l’éthanol. Eau tous les 2-3 jours jusqu’au moment désiré de l’induction.
    5. Pour faire trempette, préparer un bécher de 1 L, 750 mL d’eau contenant 0,02 % silwet L-77 avec 25 µM de Dex ou quantité équivalente de DMSO pour Dex et traiter les simulacre, respectivement. Tremper les plantes isolées pendant 30 s dans l’induction ou dans la solution simulée. Répéter tous les 2-3 jours jusqu’au moment désiré de l’imagerie.
      Remarque : Après le trempage, les plantes devraient être maintenues dans une humidité élevée pendant une heure.
  3. Méristème Apical (SAM)
    1. Stériliser les graines comme décrit à la section 2.1.1. Préparer les assiettes avec ½ MS, agar de plante de 0,9 % et 1 % milieu de sucrose et mettre des graines sur les plaques. Stocker les plaques pendant deux jours dans l’obscurité et le froid pour la stratification.
    2. Mettre les plaques en position verticale dans un incubateur de l’usine. Six ou sept jours après la germination, transférer les semis au sol, chaque plante dans un pot unique (longue journée (16/8 h), 22 ° C, humidité, 65 %).
    3. Quand la tige est environ 1 cm de long (25-30 dag), vaporiser l’inflorescence SAM avec 10 à 50 µM Dex dans H20 portant un masque du visage. Pour l’induction et l’imagerie à un stade ultérieur du développement, induire SAMs des tiges plus longues ou de pousses latérales.
      NOTE : SAMs peuvent également être induite par le paintbrushing la solution de Dex pour empêcher des gouttelettes. Utilisez un masque lorsque Dex est appliqué par pulvérisation.
    4. 24-48 h après l’induction, disséquer les SAMs et passez à l’imagerie (voir point 4.3).
      NOTE : Seulement les plantes non induites ont été utilisés pour la multiplication pour réduire la probabilité de silençage génique. Plantes en T2/T3 ont été utilisés pour l’imagerie.

4. imagerie de l’expression du rapporteur dans Arabidopsis lignes correspondant au pilote.

  1. Racine
    1. Transfert des semis de plaque à une solution de (PI) de l’iodure de propidium µg/mL 10 et dans leur tache pendant 5 min.
    2. Placer les racines dans un microscope imaging chambre (chambre de culture de tissus 1 cupule sur la lamelle couvre-objet II, voir Table des matières) et de l’image à l’aide d’un confocal laser scanning microscope avec un 63 x objectif à immersion d’eau (voir Table des matières).
    3. Pour visualiser la fluorescence de la PI, utiliser une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et collecter leurs émissions entre 590 et 660 nm. Pour la fluorescence mTurquoise2 utiliser une excitation 458 nm et recueillir des émissions entre 460 et 615 nm.
  2. Tige
    1. Effectuer la main horizontale, couper des sections de tiges des plantes avec une lame de rasoir, exciser un segment d’environ 3 cm. fixer la tige avec le doigt sur le côté opposé de la section désirée pour couper. Effectuer plusieurs coupes fines séquentiellement, mais notez que seules les sections d’une position similaire à la tige doivent être comparées.
    2. Après chaque coupe, immerger le rasoir dans une boîte de pétri contenant de l’eau du robinet et de recueillir les sections de la tige. Teindre des sections à ce stade ou monter directement sur les lames de microscope.
    3. Pour la coloration, préparer un 1 mL de 250 µg/mL de solution de PI de l’eau dans une petite boîte de pétri (voir Table des matières). Plonger les sections pendant 5 min et rincer à l’eau. Transférez-les sur lames de microscope avec une pince fine ou un pinceau fin. Prendre soin de ne serrer pas les échantillons avec le couvre-objet.
    4. Image des échantillons à l’aide d’un confocal laser scanning microscope avec un 25 x lentille d’immersion de l’eau de trempage (voir Table des matières). Utilisation 561 nm laser lumière pour exciter la fluorescence de la PI et de collecter de 570 à 620 nm. Utilisation de 405 nm pour exciter l’effecteur de fluorophore mTurquoise2 codée par le pilote de ligne constructions et recueillir des émissions de 425 à 475 nm.
  3. Méristème Apical
    1. Couper la tige 2 cm au-dessous de l’extrémité de la pousse avec une pince. Tenir la tige d’une main et utilisez la pince fine pour éliminer les boutons floraux et les primordiums grands. Pour supprimer les primordiums jeunes, fixer le SAM en position verticale dans une boîte de pétri contenant 3 % d’agarose. Utilisez un jumelles et les forceps pour supprimer primordiums jeunes près de SAM. Vous pouvez également utiliser une canule d’injection (voir Table des matières) pour couper ces primordiums.
    2. Teindre le SAM disséqué dans une solution de 250 µg/mL PI pendant 5-10 min. effectuer la coloration soit directement en pipettant également, quelques gouttes de solution par dessus le SAM préparé de coloration ou transférer l’échantillon dans un tube rempli de solution de coloration. Gardez le SAM complètement submergée pendant la procédure de marquage.
    3. Placez le SAM teinté dans une petite boîte de pétri (voir Table des matières) avec 3 % d’agarose moyen et couvrir le SAM avec FD2O.
    4. Image disséqué SAMs utilisant un confocal laser scanning microscope avec un 25 x lentille d’immersion de l’eau de trempage (voir Table des matières).
    5. Utilisation 561 nm laser lumière pour exciter la fluorescence de la PI et de collecter de 570 à 620 nm. Utilisation de 405 nm pour exciter la mTurquoise2 fluorophore et collecter des émissions de 425 à 475 nm.
      Enregistrer les piles d’image s’étendant sur 50 µm dans z-direction avec une taille d’étape de 0,5 µm.
      Remarque : SAM d’imagerie tel que décrit ici nécessite une verticale confocale à balayage microscope et un objectif (ici, une eau de trempage lentille) avec longue distance de travail laser.

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Representative Results

Génération des lignes pilote et effectrices par clonage de GreenGate

Le GreenGate clonage système est issu de GoldenGate clonage et l’utilisation de l’endonucléase de restriction IIS de type BsaI ou son isochizomère Eco31I. Comme les surplombs de produit enzyme éloigné de son site de reconnaissance asymétrique, la composition en bases du porte-à-faux peuvent être librement choisie, qui est la base forme la modularité du système. Chaque élément généré par PCR, par exemple, une séquence promotrice, CD ou terminator, est inséré dans un vecteur d’entrée désignés avec des surplombs produites par sommaire de restriction pour générer un module. Après subcloning, un certain nombre de modules correspondants, généralement six, est utilisé pour la réaction de ligature de GreenGate résultant dans l’assemblage de la construction dans un vecteur de destination de plantes binaire.

Pour les lignes correspondant au pilote, modules contenant les séquences d’ADN du promoteur tissu-spécifique (pTS), le facteur de transcription GR-LHG4, le promoteur pOp6 et le journaliste mTurquoise2 fusionné à un peptide signal de N-terminale et un signal de rétention ER C-terminal ont été fondue dont les terminators et divers modules d’adaptation et un module de sélection transgénique comme décrit plus haut 2,8 (Figure 2). Lignes d’effecteur ont été construits avec le promoteur pOp6 et une cassette d’effecteur, composé par exemple d’un gène d’intérêt et de terminator, mais aussi un module de codage d’un gène de résistance pour la sélection des plantes transgéniques (Figure 2).

Induction de lignes correspondant au pilote et la visualisation de la fluorescence de journaliste

Induction avec Dex conduit à l’expression de mTurquoise2 spécifiques de type de cellule dans l’endoderme des racines (pSCR>> SP-mTurquoise2-HDEL, Figure 3 a), précurseurs du phloème et le cambium (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, Figure 3 b) et les cellules souches dans le méristème apical (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, Figure 3).

Trans-activation de VND7 dans les cellules bordantes amidon du cambium

Comme un cas de test pour trans-activation, nous avons généré une ligne effecteur codant que le facteur de transcription maître de mur de cellule secondaire VND7 fondu à la domaine d’activation VP16, qui a été montré pour induire la cellule de formation mur cellulaire secondaire autonome lorsque misexpressed 8,9,19,20.

Après 5 jours d’un seul traitement avec 15 µM de Dex ou le DMSO pour l’induit ou les plantes simulacres respectivement, les sections de tige ont été préparées pour la visualisation de la lignification ectopique dans la gaine de l’amidon. L’iodure de Propidium présente dans la tige forte affinité pour les tissus lignifiés. Cellules de la gaine de l’amidon en induit des échantillons de Dex, mais pas dans le simulacre a montré un signal fort pour le canal de la PI et certaines cellules montrent l’épaississement réticulé typique de la paroi cellulaire dans les cellules du xylème (Figure 4).

Figure 1
Figure 1. Le GreenGate clonage principe. A) endonucléases de restriction de Type IIS, comme Bsaje /Eco31I, reconnaître les séquences non-palindromiques (rouge) et couper de façon asymétrique à une distance définie indépendamment de l’ordre (bleu). Eco31I reconnaît « GGTCTC », coupe de la deuxième nucléotides en aval du site reconnaissance et crée un faux quatre base 5'. B) le GreenGate clonage système repose sur un système modulaire avec six entrée différents vecteurs pGGA000-pGGF000. Ces vecteurs contiennent une cassette de résistance de l’ampicilline (AmpR) et une cassette de la BCDC flanqué par les adaptateurs spécifiques pour chaque vecteur d’entrée (par exemple pGGA000 vecteur d’entrée) et la reconnaissance de « GGTCTC » Eco31I sites. Eco31I digestion des pGGA000 libère la BCDC et crée les surplombs de nucléotides quatre pGGA000 spécifiques (bleu foncé). Insert1 est amplifiée par les amorces hébergeant des adaptateurs spécifiques « GGTCTC » et pGGA000 et après digestion ligué dans pGGA000. La même procédure est suivie avec les autres modules. C) la réaction finale de GreenGate combine la digestion Eco31I de la pGGZ001 de vecteur de destination et les vecteurs de six entrée pGGA000-pGGF000 et la ligature simultanée de tous les modules dans le vecteur de la destination. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Aperçu du système Dex-inducible LhGR/pOp avec des lignes pilote et effectrices. En lignes correspondant au pilote, promoteurs de tissu-spécifique (pTS) contrôlent l’expression du facteur de transcription synthétique LhG4, qui est fusionnée translationnelle pour le domaine de liaison du ligand du récepteur des glucocorticoïdes (GR) rat et empêche ainsi, en l’absence de Dex, la translocation nucléaire. La ligne de l’effecteur recèle une cassette transcriptionnelle pilotée par un élément pOp et une boîte TATA avec un promoteur d’un minimum de 35 s . Croisé avec une ligne de conducteur et à induction Dex, GR-LhG4 lie les éléments de type pOp dans la cassette de journaliste et à ceux dans le module de l’effecteur, induisant la transcription de mTurquoise2 et de l’effecteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Lignes de conducteur induit en racine, tige et SAM. A) ligne pilote induite pSCR >>SP-mTurquoise2-HDEL (germent à 50 µM Dex) dans la racine et le traitement simulé. Le promoteur de l’ÉPOUVANTAIL (pSCR) intervient dans l’expression dans l’endoderme, cortex/endoderme initiale (CEI) et le centre quiescent (QC). Les cellules sont Counter-tachés avec l’iodure de propidium (PI). Barreaux de l’échelle = 20 µm. B) ligne pilote induite pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (trempé dans une solution de Dex de 50 µM et visualisé après 3 jours) en dans la tige et un traitement simulé. Promoteur de SMXL5 (pSMXL5) intervient dans l’expression dans les précurseurs des cellules souches cambium domaine et du phloème. Les cellules sont Counter-tachés avec l’iodure de propidium (PI). Barreaux de l’échelle = 100 µm. C) ligne pilote induite pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 µM, 48 h), dans la SAM. Le promoteur de la CLAVATA3 (pCLV3) intervient dans l’expression dans le domaine des cellules souches. Photos en bas montrent XZ et YZ croisent sections, induite et simulacres traités, respectivement. Les cellules sont Counter-tachés avec l’iodure de propidium (PI). Barreaux de l’échelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Lignification ectopique dans la gaine de l’amidon de la tige. A) lignification ectopique est vus cinq jours après l’induction de la ligne pilote Dex pSCR >> VND7-VP16 dans la tige. Le promoteur de l’ÉPOUVANTAIL (pSCR) intervient dans l’expression dans les cellules de la gaine de l’amidon dans la tige. Image de gauche montre fusion de canal de PI et de champ lumineux, bonne image ne montre que canal PI. B) le contrôle maquette affiche pas de signal dans les cellules bordantes de fécule. Les cellules sont Counter-tachés avec l’iodure de propidium (PI). Barreaux de l’échelle = 100 µm. PI fluorescence est faux-coloré en vert tout en chloroplastes, auto fluorescence est rouge dans toutes les images. Pointes de flèche blanches point pour cellules de la gaine de l’amidon. Image de gauche montre fusion de canal de PI et de champ lumineux, bonne image ne montre que canal PI.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Module 5' surplomb généralement utilisé pour 3' surplomb
A ACCT promoteur AACA
B AACA Balise N-terminal GGCT
C GGCT Séquence codante TCAG
D TCAG Balise de C-terminal CTGC
E CTGC Terminator ACTA
F ACTA cassette de résistance GTAUX

Tableau 1 : Surplombs, utilisés pour la conception d’amorce

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Discussion

Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour générer et appliquer un outil polyvalent et complet pour inductible, cellule type spécifique trans-activation. Traversée de lignées porteuses de cassettes d’effecteur sous contrôle du promoteur pOp avec des lignes de pilote permet étudie les effets de l’expression erronée dans la génération F1, ce qui permet une évaluation rapide de perturbation génétique dans un large éventail de types de cellules. Alternativement, effecteur des constructions peuvent être utilisées pour transformer les lignes correspondant au pilote ou, en adaptant le clonage stratégie, pilote et effectrices construct peut également être combiné sur un ADN-T. Applications pour cette gamme de système de spatialement et temporellement contrôlée des études d’expression erronée de précipitation spécifique au domaine ou gène d’édition et de type cellulaire spécifique complémentation.

Aucune des procédures décrites ici ne devrait poser un défi aux laboratoires équipés pour les techniques de biologie moléculaire. Le système d’expression de LhG4 a été testé et assure un expression non perméables et accordable qui peut être branchée à la haute degré8, bien que nous mettons en garde que la plage dynamique de concentration inducteur empiriquement déterminer pour chaque pilote et combinaison de ligne effecteur combinant ce système éprouvé avec le clonage de GreenGate modulaire offre un moyen rapid et simple à l’expression inductible dans n’importe quel type de cellule pour laquelle un promoteur spécifique est disponible. Nous avons remarqué que la recombinaison événements peuvent se produire au cours de l’amplification des plasmides contenant les séquences répétitives du promoteur pOp-type . Ils résultent souvent en ayant moins de répétitions de la séquence de l’OP, qui peut être évalué par PCR. Constructions finales doivent toujours être confirmées par séquençage chez Escherichia coli et Agrobacterium tumefaciens. Toutefois, les événements de recombinaison occasionnels ont été seulement détectés chez e. coli.

Limiter l’application de cette technique est donc le moment pour générer des plantes transgéniques.  Il est d’une importance cruciale pour tester la gene silencing, à partir de la génération de T2 et de maintenir uniquement les lignes stables. Pour minimiser le risque de faire taire, nous conseillons de collecter des graines seule forme induite par les plantes.

La technique décrite ici est gratuite pour les autres trans-activation des systèmes21,22, car elle fournit un ensemble de ressources et combine la spécificité tissulaire avec expression inductible. Une évolution future possible de cette méthode est l’incorporation de plus promoteurs spécifiques au type de cellule sur disque GR-LhG4, par exemple dans les tissus à l’extérieur les méristèmes principales. Au sujet des effecteurs, une éventuelle expansion passionnante est l’adaptation du gène hautement efficace outils permettant de cellule spécifique au type knock outs23d’édition.

Les lignes de pilote décrits dans Schürholz Al 20188 sont disponibles auprès de NASC (http://arabidopsis.info/), constructions d’ADN décrit dans Lampropoulos et coll., 20132 et Schürholz et al., 20188 sont disponibles auprès de Addgene (https://www.addgene.org/).

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Travail dans nos laboratoires est pris en charge par le fondation de recherche allemande (DFG) subventions WO 1660/6-1 (S.W.) et GR 2104/4-1 (à T.G.) et SFB1101 (à T.G. et J.U.L) et par un Conseil de recherche européen consolidator grant (PLANTSTEMS 647148) à T.G.  S.W. est pris en charge par le biais de l’Emmy Noether Fellowship de la DFG par Grant WO 1660/2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Carl Roth GmbH + Co. KG K029.1
ATP Sigma-Aldrich A9187
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Column purification Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (250)
Culture chamber for imaging Sarstedt AG & Co. KG 1-well tissue culture chamber, on cover glass II
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4903
DMSO Fisher Scientific, UK D139-1
Eco31I Thermo Fisher Scientific FD0294
injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) Sterican, Braun
Kanamycin Carl Roth GmbH + Co. KG T832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv Leica, Wetzlar, Germany
MS medium Duchefa, Haarlem, Netherlands M0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA water immersion objective Nikon, Minato, Tokyo, Japan
Petri dish 35/10 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 627102
Petri dish 60/150 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 628102
Petri dish 120/120/17 Greiner Bio-One GmbH, Germany 688102
Plant agar Duchefa, Haarlem, Netherlands P1001
Plasmid extraction Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170
Razorblade Classic, Wilkinson Sword GmbH 7005115E
Reaction tubes Sarstedt AG & Co. KG 72.690.001
Silwet L-77 Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
Spectinomycin AppliChem GmbH 3834.001
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000c
Sucrose Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Sulfadiazine Sigma-Aldrich S6387
Tetracycline AppliChem GmbH 2228.0025
T4 Ligase 5 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0011
T4 Ligase 30 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0013

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References

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Génétique numéro 146 expression inductible trans-activation études de promoteur-journaliste contrôle de l’expression mauvaise expression génétique fonctionnelle
Inductible, Expression spécifique au Type cellulaire chez <em>Arabidopsis thaliana</em> médiation par le biais de LhGR <em>Trans</em>-Activation
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López-Salmerón, V., Schürholz, A. K., Li, Z., Schlamp, T., Wenzl, C., Lohmann, J. U., Greb, T., Wolf, S. Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation. J. Vis. Exp. (146), e59394, doi:10.3791/59394 (2019).

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