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Genetics

Inducible, सेल प्रकार- Arabidopsis में विशेष अभिव्यक्ति lhgr के माध्यम से thaliana-मध्यस्थता ट्रांस-सक्रियण

Published: April 19, 2019 doi: 10.3791/59394
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1, 3, 3, 1, 2
1Department of Developmental Physiology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 2Department of Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg, 3Department of Stem Cell Biology, Centre for Organismal Studies (COS) Heidelberg
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम ट्रांसजेनिक अरेबिडोप्सिस थालियाना लाइनों के एक सेट के उत्पादन और अनुप्रयोग का वर्णन करते हैं, जो तीन मुख्य विभज्योतक में, ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति को सक्षम करने में समर्थ बनाता है, प्ररोह-शीर्षस्थ विभज्योतक, मूल शीर्षस्थ विभज्योतक, और कैंबीयम ।

Abstract

Inducible, ऊतक विशिष्ट अभिव्यक्ति एक महत्वपूर्ण और शक्तिशाली करने के लिए आनुवंशिक क्षोभ के spatio-लौकिक गतिशीलता का अध्ययन उपकरण है । सिद्ध और बेंचमार्क LhGR प्रणाली के साथ लचीला और कुशल GreenGate क्लोनिंग प्रणाली का मेल (यहां जीआर-LhG4) inducible अभिव्यक्ति के लिए कहा, हम ट्रांसजेनिक Arabidopsis लाइनों का एक सेट है कि एक effector की अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते है उत्पंन किया है तीन मुख्य संयंत्र meristems में विशिष्ट कोशिका प्रकार की एक श्रृंखला में कैसेट । यह अंत करने के लिए, हम पहले से विकसित जीआर-LhG4 प्रणाली एक chimeric ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर और एक सजात पॉप प्रकार अभिव्यक्ति के स्तर की एक विस्तृत श्रृंखला पर तंग नियंत्रण सुनिश्चित करने के प्रमोटर के आधार पर चुना । इसके अलावा, जहां सिंथेटिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर सक्रिय है अभिव्यक्ति डोमेन विज़ुअलाइज़ करने के लिए, एक एर-स्थानीयकृत mTurquoise2 फ्लोरोसेंट रिपोर्टर नियंत्रण में pOp4 या pOp6 प्रमोटर ड्राइवर लाइनों में एंकोडेड है । यहाँ, हम एक ड्राइवर या effector लाइन उत्पन्न करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन और कैसे सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रेरित किया जा सकता है और गोली मार शीर्षस्थ विभज्योतक, रूट शीर्षस्थ विभज्योतक और arabidopsisके केंबियम में पालन करने के लिए प्रदर्शन. कई या सभी ड्राइवर लाइनों का उपयोग करके, एक या कई कारकों (effectors) सिंथेटिक पॉप प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त करने के संदर्भ विशिष्ट प्रभाव तेजी से मूल्यांकन किया जा सकता, उदाहरण के लिए एक पार के F1 पौधों में एक effectors और कई के बीच ड्राइवर रेखाएं । इस दृष्टिकोण VND7 की अस्थानिक अभिव्यक्ति, एक एनएसी प्रतिलेखन कारक एक सेल स्वायत्त तरीके से अस्थानिक माध्यमिक सेल दीवार बयान उत्प्रेरण में सक्षम द्वारा उदाहरण है ।

Introduction

Postgenomic युग में जीव विज्ञान में एक प्रमुख सीमा एक दिया कारक या आनुवंशिक क्षोभ की संदर्भ विशिष्ट भूमिका को समझने के लिए है । इस तरह के नुकसान के रूप में संचक आनुवंशिक perturbations समारोह और लाभ के समारोह के दृष्टिकोण अक्सर केवल अनुमति जीवन के अंत बिंदु विश्लेषण-लंबी अनुकूलन प्रक्रियाओं, प्राथमिक और द्वितीयक प्रभाव के बीच भेद obfuscating । इसके अलावा, संदर्भ विशिष्ट कार्यों नकाबपोश या दूर ऊतकों में बड़े पैमाने पर प्रभाव या विकास के अन्य चरणों के दौरान पतला किया जा सकता है. इसके अलावा, चरम मामलों में, घातकता किसी भी यंत्रवादी अंतर्दृष्टि को बाधित कर सकता है । आदर्श रूप में, इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, एक समय में एक विशिष्ट कोशिका प्रकार के रूप में एक विशिष्ट संदर्भ के भीतर तीव्र आनुवंशिक क्षोभ के प्रभाव का विश्लेषण कर सकता है एक तरह से हल । यह प्राप्त करने के लिए, आनुवंशिक उपकरण inducible के लिए, सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति1आवश्यक हैं । एक दिए गए effector के लिए एक प्रतिक्रिया की spatiotemporal गतिशीलता के तेजी से मूल्यांकन के लिए एक संसाधन प्रदान करने के लिए, हम जीआर-LhG4 प्रणाली के सिद्ध प्रभावकारिता के साथ GreenGate2 प्रणाली द्वारा प्रदान की क्लोनिंग की आसानी संयुक्त है3, 4,5,6. हम चिंराट ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर LhG4 अभिव्यक्त लाइनों का एक सेट उत्पंन किया है चूहा corticoid रिसेप्टर (जीआर)7 अच्छी तरह से विशेषता सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के नियंत्रण के अंतर्गत के लिगामेंट बाध्यकारी डोमेन के लिए संगलित त । आराम की स्थिति में, प्रतिलेखन कारक नाभिक के बाहर रहता है, के रूप में जीआर डोमेन cytosolic HSP90 से बंधे है । सिंथेटिक लिडऔर dexamethasone (Dex) के अलावा, परमाणु स्थानांतरण प्रेरित है और LhG4 अभिव्यक्ति कैसेट के प्रतिलेखन एक सजात सिंथेटिक पॉप-प्रकार के प्रमोटर के नियंत्रण में, जैसे एक mTurquoise2 रिपोर्टर के रूप में मध्यस्थता करेगा शामिल करने के बाद अभिव्यक्ति डोमेन विज़ुअलाइज़ करने के लिए ड्रायवर पंक्तियाँ में सम्मिलित किया गया है ।  इस प्रकार, चालक लाइनों तकनीकी रूप से भी एक effector कैसेट होते हैं । एक के साथ एक effector कैसेट ले जाने की रेखा के साथ चालक लाइनों के एक सेट के पार, उदाहरण के लिए, एक ही पॉप के नियंत्रण में ब्याज की एक जीन प्रकार प्रमोटर इस प्रकार effector अभिव्यक्ति के तीव्र या दीर्घकालिक परिणामों के तेजी से मूल्यांकन की अनुमति देता है सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में ।

यहां, हम एक के लिए ड्राइवर और effector लाइनों उत्पंन और कैसे सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति प्रेरित किया जा सकता है और गोली मार शीर्षस्थ विभज्योतक, रूट शीर्षस्थ विभज्योतक और केंबियम में पालन करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का वर्णन प्रोटोकॉल प्रदान अरैडिडोप्सिस । इस दृष्टिकोण के कौशल और विशिष्टता का वर्णन करने के लिए, हम अच्छी तरह से ज्ञात ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर VND7 जो दारू की तरह माध्यमिक कोशिका दीवार thickenings ectopically9ड्राइविंग में सक्षम है का उपयोग । Pscr10,11 चालक लाइन और pOp6 के बीच एक क्रॉस से F1 इलाज : VND7 effector लाइन arabidopsis स्टेम के स्टार्च म्यान कोशिकाओं में अस्थानिक जाइलम की तरह कोशिकाओं के गठन की ओर जाता है.

चालक और effector अभिव्यक्ति plasmids के निर्माण के लिए आवश्यक बड़े डीएनए विधानसभाओं के उत्पादन की सुविधा के लिए, हम तेजी से और कुशल GreenGate क्लोनिंग विधि2का इस्तेमाल किया । GreenGate क्लोनिंग प्रकार द्वितीय एस इको31i या उसके isoschizomer Bsaमैं2के रूप में प्रतिबंध एंजाइमों पर आधारित है । इन एंजाइमों उनकी असममित मांयता साइटों के अनुप्रवाह में कटौती आधार संरचना के साथ overhangs उत्पादन । पारिस्थितिकी31i/Bsai को शामिल करके ओलिओन्यूक्लिओटाइड में प्रतिबंध साइटों और डीएनए तत्वों के लिए विशिष्ट अधिकता दृश्यों का आवंटन, मॉड्यूलर क्लोनिंग हासिल की है, बड़ी विधानसभाओं के उत्पादन की सुविधा । Greengate ढांचे में, डीएनए मॉड्यूल एक-एफ श्रेणियों में गिर अधिकता अनुक्रम कि एडेप्टर के रूप में काम करते है और उस क्रम में इकट्ठे होते है पर आधारित है । इसलिए, अपने वांछित उत्पाद बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन प्राइमरों चयनित मॉड्यूल2 के साथ अनुसार होना चाहिए (चित्र 1a). अगर वहां एक आंतरिक पर्यावरण31i/Bsaमैं साइट और अनुक्रम greengate प्रवेश और गंतव्य मॉड्यूल के साथ संगत नहीं है, तो आप mutagenizing बिना आगे बढ़ सकते हैं, लेकिन कम दक्षता के साथ । वैकल्पिक रूप से, साइट का उपयोग करें निर्देशित mutagenesis को हटाने केलिए पारिस्थितिकी31i/

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Protocol

वैक्टर और मॉड्यूल गैर लाभ भंडार, Addgene (https://www.addgene.org) से प्राप्त किया जा सकता है ।

1. क्लोनिंग का उपयोग कर GreenGate

  1. डिजाइन प्राइमरों तालिका 1में सूचीबद्ध overhangs का उपयोग कर, मॉड्यूल प्रकार के साथ ' nnnn ' की जगह नीचे सूचीबद्ध-विशिष्ट एडेप्टर अनुक्रम: फॉरवर्ड: 5 ए ggtctc एक nnnn (एन) सीए* + विशिष्ट अनुक्रम 3 ́, रिवर्स: 5 है ggtctc एक nnnn (n) + रिवर्स विशिष्ट अनुक्रम के पूरक 3 ́ । पठन फ़्रेम का रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए रेखांकित कुर्सियां जोड़ें ।
    मॉड्यूल ओवरहैंग:
    नोट: डिफ़ॉल्ट GreenGate ढांचे में, छह मॉड्यूल, ए-एफ, एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में एक संयंत्र रूपांतरण वेक्टर रीढ़ के साथ इकट्ठे हुए हैं (चित्रा 1 सी). आमतौर पर, एक मॉड्यूल प्रमोटर दृश्यों, एक बी मॉड्यूल एक एन टर्मिनल टैग या "डमी" अनुक्रम6, एक सी मॉड्यूल एक सीडी, एक डी मॉड्यूल एक सी टर्मिनल टैग या डमी, एक ई मॉड्यूल एक टर्मिनेटर, और एक एफ मॉड्यूल ट्रांसजेनिक के चयन के लिए एक प्रतिरोध कैसेट बंदरगाह होगा पौधों. अन्य preassembled इकाइयों के साथ युग्मन के लिए एडाप्टर के बजाय F मॉड्यूल2का उपयोग करने के लिए उपलब्ध हैं ।
  2. पीसीआर प्रवर्धन
    1. मानक प्रोटोकॉलों के अनुसार पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा अभिकल्पित प्राइमर्स के साथ ब्याज का अनुक्रम बढ़ाना ।
    2. एक agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद अलग । उत्पाद और स्तंभ निर्माता के निर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक किट ( सामग्री तालिकादेखें) का उपयोग करके सही अंश को शुद्ध करते हैं ।
  3. प्रविष्टि मॉड्यूल निर्माण
    1. अलग से डाइजेस्ट मॉड्यूल वेक्टर और पीसीआर टुकड़ा (कदम १.२.) (चित्र 1 ए, बी) पारिस्थितिकीके साथ 31i/Bsaमैं का उपयोग 100-500 एनजी डीएनए (वेक्टर या टुकड़ा), 3 μl 10X पाचन बफर, और 5-10 U पारिस्थितिकी31i एक ट्यूब में और मात्रा लाने के लिए 30 μl के साथ ddh2ओ ।
    2. मिश्रण धीरे ऊपर और नीचे pipetting और नीचे संक्षेप में १,००० x gपर नीचे स्पिन । 15 मिनट (या खरीदी प्रतिबंध एंजाइम की समय सिफारिश के बाद) के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
    3. पाचन के बाद, स्तंभ एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर प्रत्येक नमूने को शुद्ध ( सामग्री की तालिकादेखें) और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर २६० एनएम (आयुध डिपो२६०) पर ऑप्टिकल घनत्व का निर्धारण करके प्राप्त डीएनए की मात्रा ।
    4. मिलाएं 30-१०० एनजी पचा और 10-५० पचा वेक्टर ऊपर और नीचे कई बार pipetting और 1 μl t4 ligase (5 U/μl, और 3 μl 10 x t4 बंधाव बफर द्वारा 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 30 μl की कुल मात्रा में (सिफारिश के बाद T4 ligase आपूर्तिकर्ता की) ( सामग्री तालिकादेखें).
      नोट: वांछित मोलर अनुपात प्रविष्टि मॉड्यूल की गणना: गंतव्य वेक्टर (जैसे, 3:1) के लिए एकाग्रता और प्रवेश मॉड्यूल आवेषण की लंबाई के आधार पर बंधाव के लिए ।
    5. रूपांतरण की दक्षता में वृद्धि करने के लिए, गर्मी में टी 4 ligase ६५ ° c 20 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबैटिंग द्वारा ।
    6. मानक प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुसार सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं को बदलने के लिए लिगेशन उत्पाद का उपयोग करें और एम्पीसिलीन (१०० Μg/एमएल) के साथ अगार प्लेटों पर बैक्टीरिया फैल
    7. रात भर के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया के साथ थाली सेते ।
    8. कालोनी के लिए स्क्रीन के साथ कालोनियों पीसीआर द्वारा वांछित प्रवेश मॉड्यूल का उपयोग कर प्राइमरों 86a1 (5 ′-gttgtggaattgtgagc-3 ') और 86a1 (5 ′-gttttcccagtcacgacg-3 ′) और मानक पीसीआर शर्तों ।
      नोट: इस प्राइमर संयोजन के रूप में सभी प्रवेश मॉड्यूल के लिए मांय है प्रवेश वेक्टर रीढ़ के लिए बाइंड ।
    9. प्लाज्मिड अलगाव के लिए एकल कालोनियों का चयन करें । एम्पीसिलीन के साथ पूरक 2 मिलीलीटर पौंड तरल संस्कृति का उपयोग करें (१०० μg/एमएल) और एक ३७ ° c shaker में रातोंरात सेते ।
    10. एक मिनी-प्रेप किट या वांछित निष्कर्षण प्रोटोकॉल के साथ रातोंरात तरल संस्कृति से plasmids अलग ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    11. सही डालने के साथ plasmids की पहचान करने के लिए, प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण प्रदर्शन, उदाहरण के लिए दो एंजाइमों का चयन करके कि आपके डालने में विशिष्ट कटौती प्लाज्मिड, 2 μl 10 x पाचन बफर, 5-10 U का चयनित प्रतिबंध एंजाइमों और ddh 2 के २०० मिश्रण से O से 20 μL ।
    12. चयनित plasmids अनुक्रम 86a1 और 86a1 प्राइमरों का उपयोग (1.3.9 कदम देखें.).
  4. गंतव्य मॉड्यूल निर्माण:
    नोट: गंतव्य प्लाज्मिड के लिए वांछित गंतव्य मॉड्यूल का उपयोग करें pGGZ001, pGGZ002 या pGGZ0032 (चित्रा 1c).
    1. एक ट्यूब में जोड़ें और मिश्रण ५० – १५० एनजी खाली गंतव्य वेक्टर (pGGZ003, उदाहरण के लिए), 50-300 एनजी प्रत्येक भरी हुई प्रविष्टि मॉड्यूल की, 2 μL 10 x पाचन बफर बफर, १.५ μL 10 मिमी एटीपी, 1 μL T4 Ligase (30 U/μL), 5-10 यू μL पारिस्थितिकी31i और dH2ओ की कुल मात्रा 20 μl.
      नोट: वांछित मोलर अनुपात प्रविष्टि मॉड्यूल की गणना: गंतव्य वेक्टर (उदाहरण के लिए 3:1) लिगेशन के लिए एकाग्रता और प्रवेश मॉड्यूल आवेषण की लंबाई के आधार पर ।
    2. मिश्रण और GreenGate प्रतिक्रिया2 एक पीसीआर thermocycler का उपयोग कर 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए 30 बार और 2 मिनट के लिए 16 डिग्री सेल्सियस के बीच बारी, 5 मिनट के एक कदम के बाद ५० डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट में ८० डिग्री सेल्सियस पर ।
    3. दक्षता बढ़ाने के लिए, प्रतिक्रिया करने के लिए 1 μL T4 Ligase (30 U/μL) और १.५ μL 10 मिमी एटीपी जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट, टी 4 डीएनए Ligase की गर्मी inactivation के बाद ६५ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ।
    4. सक्षम ई. कोलाई को रूपांतरित करने के लिए लिगेशन अभिक्रिया का उपयोग करें तथा आगर प्लेटों पर बैक्टीरिया को उपयुक्त चयनात्मक एजेंट स्पेक्टिनोमाइसिन (५० μg/mL) के साथ मिलाकर फैलाएं ।
    5. रात भर के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेट पर परिवर्तित ई. कोलाई सेबेट ।
    6. रूपांतरण की पुष्टि करने के लिए, प्रत्येक चयनित एकल कालोनियों को क्रमशः स्पेक्टिनोमाइसिन (५० μg/mL) और एम्पीसिलीन (१०० μg/mL) पर फिर से स्ट्रीक करें जिसमें प्लेट्स होती हैं । केवल कालोनियों है कि spectinomycin पर नहीं बल्कि एम्पीसिलीन प्लेटों पर विकसित का उपयोग करें ।
    7. ई-कोलाई कॉलोनियों को रात के ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं ।
    8. प्लाज्मिड अलगाव के लिए एकल कालोनियों का चयन करें । 2 मिलीलीटर पौंड तरल संस्कृति spectinomycin (५० μg/एमएल) के साथ पूरक का उपयोग करें और एक ३७ ° c shaker पर रातोंरात सेते ।
    9. एक मिनी तैयारी किट ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ इसी plasmids अलग ।
    10. प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण द्वारा जांच करें (देखें 1.3.12.) और चयनित अनुक्रम प्राइमरों 88c3 (5 ′-acctctcgggcttctgg-3 ′), 88c3 (5 '-cctttttacggttcctg-3 ′) का उपयोग कर सकारात्मक constructs । सम्मिलित करें इन प्राइमरों के साथ पूरी तरह से अनुक्रम नहीं किया जा सकता है, तो अनुक्रमण के लिए आंतरिक प्राइमरों डिजाइन.
      नोट: पॉप दोहराने दृश्यों की सही संख्या के साथ क्लोन की पहचान करने के लिए (चर्चा देखें), प्राइमरों pOp6 (pOp6_ F, 5 '-tgcatatgtcgagctcaagaa-3 ′; और pOp6_f, 5 '-cttatataggaagggtctt-3 ′) कि बांध में कम flanking दृश्यों पीसीआर प्रवर्धन और बाद जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए आकार से भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  5. मध्यवर्ती supermodule निर्माण
    1. प्रवेश मॉड्यूल के दो स्वतंत्र सेट गठबंधन करने के लिए, के रूप में एकीकृत रिपोर्टर-effector कैसेट के साथ जीआर-LhG4 चालक लाइनों पैदा करने के लिए आवश्यक, पहले दो मध्यवर्ती plasmids का निर्माण, supermodules2बुलाया, अंतिम अभिव्यक्ति कोडांतरण से पहले pGGZ001 या pGGZ003 में प्लाज्मिड ।
    2. पहले supermodule और एच के अंत में F-H एडेप्टर जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें-दूसरा supermodule की शुरुआत में एक अनुकूलक (उन दो constructs के बीच कनेक्शन के रूप में सेवा)2वर्णित के रूप में.
      नोट: केवल pGGN000 मध्यवर्ती मॉड्यूल प्रतिरोध कैसेट किया जाता है । अभिव्यक्ति प्लाज्मिड उत्पन्न करने के लिए, गंतव्य वेक्टर और pGGN000 और pGGM000 मध्यवर्ती supermodules के साथ GreenGate प्रतिक्रिया प्रदर्शन. वैकल्पिक रूप से, मिश्रण गंतव्य वेक्टर, pGGN000 मध्यवर्ती supermodule, और शेष एकल मॉड्यूल GreenGate प्रतिक्रिया2प्रदर्शन करने के लिए । उत्तरार्द्ध विधि पूर्व की तुलना में कम कुशल है, लेकिन तेजी से किया जा सकता है ।
    3. एक pGGM000/pGGN000 supermodule बनाने के लिए, 1 μL (30 एनजी/μL) खाली मध्यवर्ती वेक्टर (pGGM000 या pGGN000), 2 μL 10 x पाचन बफर, १.५ μL 10 मिमी एटीपी, 1 μL T4 Ligase (30 U/μL) के साथ प्रत्येक प्रविष्टि मॉड्यूल के १.५ μL (100-300 ng/μL) मिश्रण , और 5-10 U पारिस्थितिकी31i की कुल मात्रा में 20 μl ।
      नोट: वांछित मोलर अनुपात प्रविष्टि मॉड्यूल की गणना: गंतव्य वेक्टर (उदा., 3:1) के लिए एकाग्रता और प्रवेश मॉड्यूल आवेषण की लंबाई के आधार पर बंधाव के लिए
    4. मिक्स और 1.4.2 कदम के रूप में GreenGate प्रतिक्रिया प्रदर्शन
    5. दक्षता बढ़ाने के लिए, 1 μL T4 Ligase और १.५ μL ATP (10 मिमी) जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं, गर्मी-inactivation के बाद ६५ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए.
    6. सक्षम ई. कोलाई को रूपांतरित करने के लिए 10 μl का उपयोग करें और कनमीसिन (५० μg/mL) युक्त प्लेटों पर लकीर ।
    7. बदल E. कोलाई की थाली पर ३७ ° c में रातोंरात ऊष्मायन प्रदर्शन ।
    8. (५० μg/एमएल) और एम्पीसिलीन (१०० μg/एमएल) प्लेटों युक्त क्रमशः कनमीसिन पर प्रत्येक चयनित एकल कालोनियों के फिर से लकीर ।
    9. प्लेट पर ई-कोलाई कॉलोनियों का ३७ डिग्री सेल्सियस पर ओवरनाइट इंक्यूबेशन करते हैं ।
    10. एकल कालोनियों का चयन करें कि केवल कनमीसिन पर नहीं बल्कि प्लाज्मिड अलगाव के लिए एम्पीसिलीन पर विकसित. 2 एमएल £ तरल कनमीसिन (५० μg/एमएल) के साथ पूरक संस्कृति का प्रयोग करें और एक ३७ ° c shaker में रातोंरात सेते ।
    11. एक मिनी तैयारी किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर इसी plasmids अलग ।
    12. प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण द्वारा plasmids की जाँच करें (1.3.12 देखें.) तथा 87E2 (5 ́-AGGCATCAAACTAAGAAG-3 ́) का उपयोग करते हुए अनुक्रमण द्वारा पुष्टि करें ( 5 ́-सीजीटीसीसीसीजीटीजीजीसी-3 ́) pGGM000/pGGN000 बैकबोन के लिए अनीलन । सम्मिलित करें इन प्राइमरों के साथ पूरी तरह से अनुक्रम नहीं किया जा सकता है, तो अनुक्रमण के लिए आंतरिक प्राइमरों डिजाइन.
      नोट: यदि pGGM000 या pGGN000 वैक्टर में क्लोनिंग असफल है, एक संभव समाधान के लिए pGGM000 या पारिस्थितिकी31i, एक जेल पर चलाने के साथ pGGN000 पचाने और जेल से शुद्ध PGGM000 या pGGN000 बैकबोन (लगभग २००० बीपी) टुकड़ा बिना Ccdb कैसेट (लगभग १४०० बीपी) । इसके बाद लिगेशन रिएक्शन के साथ सामान्य रूप से आगे बढ़ें ।
  6. एक. tumefaciens psoup+ तनाव (जैसे ASE), रूपांतरण गंतव्य वैक्टर में प्रतिकृति के पीएसए मूल के रूप में (एक. क्लॉरॅंफेनिकोल (३४ μg/एमएल), कनमीसिन (५० μg/एमएल), spectinomycin (५० μg/ml) और टेट्रासाइक्लिन (१२.५ μg/ दो से तीन दिनों के लिए एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली पर tumefaciens ।

2. अरेइडोप्सिस ट्रांसजेनिक पौधों की पीढ़ी

  1. अरैडिडोप्सिस थैलियानाका रूपांतरण ।
    नोट: एक. thaliana पौधों के अनुसार झांग एट अल., २००६13बदलना ।
  2. ट्रांसजेनिक लाइनों का चयन ।
    1. रूपांतरित पौधों का चयन करने के लिए, सल्फाडाइज़ीन15के प्रतिरोध के लिए गैबी-कैट14 में उपयोग की गई चयन योजना का उपयोग करें ।
    2. एक संभव एकल एकीकरण घटना के साथ स्थिर लाइनों का चयन करने के लिए, जनरेशन टी 2 में उन का चयन करें, कि दिखाने के प्रतिरोध मार्कर में 3:1 अलगाव अनुपात. T3 पीढ़ी के लिए इन पंक्तियों का प्रचार और प्रतिरोध जीन के लिए पौधों समयुग्मजी का चयन करें । वैकल्पिक रूप से, एकल संमिलन रेखाओं का चयन करने के लिए एक दक्षिणी ब्लॉट विश्लेषण या एक मानक मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (SA-qPCR)16 निष्पादित करें ।

3. Arabidopsis चालक लाइनों में ट्रांस सक्रियण के प्रेरण

  1. जड़
    1. 1 और 2 चरण के माध्यम से जनरेट किया गया एक. thaliana ड्राइवर लाइनों में रिपोर्टर अभिव्यक्ति का परीक्षण करने के लिए, नीचे वर्णित के रूप में बीज ।
      1. ७०% इथेनॉल + ०.०१% गैर ईओण डिटर्जेंट के 0.5-1.0 मिलीलीटर जोड़ें एक १.५ मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब में लगभग १०० बीज (20 मिलीग्राम) और ट्यूब एक बार उलटा । 15 एस के लिए १००० एक्स जी पर नीचे स्पिन और supernatant महाप्राण ।
      2. 0.5-1.0 मिलीलीटर निरपेक्ष इथेनॉल जोड़ें । ट्यूब को कई बार पलटे, 15 एस के लिए १,००० x जी के लिए नीचे स्पिन और supernatant त्यागने ।
      3. पूर्ण इथेनॉल के 0.5-1.0 मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूब टी पलटे कुछ बार, तो 15 एस के लिए १,००० एक्स जी पर नीचे स्पिन और supernatant त्यागने ।
      4. बीज हुड के अंदर सूखी अनुमति देते हैं । यदि बीज को ट्यूबों में स्तरीकृत होने जा रहे है कदम 3.1.1.6 के साथ जारी है ।
      5. बाँझ पानी की 0.5-1.0 मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूब पलटी कुछ बार । 15 एस के लिए १,००० एक्स जी पर नीचे स्पिन और supernatant त्यागने ।
      6. बाँझ पानी की 0.5-1.0 मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूब पलटी कई बार. 15 एस के लिए १,००० एक्स जी पर नीचे स्पिन और supernatant त्यागने ।
      7. बाँझ पानी की 0.5-1.0 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. आधी ताकत मुर्शिज और Skoog मध्यम, पीएच ५.८ तैयार करने और ०.९% संयंत्र आगर और 1% sucrose जोड़ें । Autoclaving के बाद जोड़ें Dexamethasone (डेक्स), DMSO में भंग करने के लिए 10-30 μM की अंतिम एकाग्रता प्लेटों को शामिल करने के लिए और DMSO के बराबर राशि प्लेटों को नियंत्रित करने के लिए क्रमशः ।
    3. प्लेटों पर जड़ इमेजिंग के लिए बीज रखो और उन्हें अंधेरे और ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) में ४८ घंटे के लिए स्तरित होना ।
    4. एक संयंत्र इनक्यूबेटर में एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में प्लेट्स रखो (लंबे दिन (16/8 एच), 22 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता, ६५%) और उन्हें पांच दिन तक उगाते हैं ।
    5. अंकुरण के पांच दिनों के बाद (डेग), छवि संनाभि लेजर स्कैनिंग microscopy का उपयोग अंकुरों ।
  2. तना
    1. 2.1.1 में वर्णित के रूप में बीज । और 1/2 एमएस, ०.९% संयंत्र आगर और 1% सुक्रोज प्लेटों पर बीज डाल दिया । अंधेरे और ठंड में ४८ घंटे के लिए stratify (4 ° c) ।
    2. अंकुरण के छः से सात दिन बाद, अंकुरों को मिट्टी में, प्रत्येक पौधे को एक ही बर्तन में (लंबा दिन (16/8 एच), 22 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता, ६५%) हस्तांतरित करें ।
    3. डेक्स या नकली समाधान के साथ पानी से उपजी में ट्रांस सक्रियण प्रेरित, या Dex या नकली समाधान में पौधों की सूई, क्रमशः ।
    4. पानी के लिए, इथेनॉल में भंग 25 मिमी Dex के एक शेयर से तैयार जल में एक 25 μM Dex समाधान का उपयोग करें । प्रेरण के वांछित समय तक हर 2-3 दिन पानी ।
    5. सूई के लिए, एक 1 एल बीकर, ७५० मिलीलीटर पानी से युक्त ०.०२% silwet एल-७७ डेक्स और नकली उपचार, क्रमशः के लिए डेक्स या DMSO के बराबर राशि के 25 μM के साथ तैयार । प्रेरण में या नकली समाधान में 30 एस के लिए एकल पौधों डुबकी । इमेजिंग के वांछित समय तक हर 2-3 दिन दोहराएं ।
      नोट: सूई के बाद, पौधों को एक घंटे के लिए उच्च आर्द्रता में बनाए रखा जाना चाहिए ।
  3. शूट शीर्षस्थ मेरिस्टेम (SAM)
    1. 2.1.1 में वर्णित के रूप में बीज । 1/2 एमएस, ०.९% प्लांट आगर और 1% सुक्रोज मीडियम के साथ प्लेट्स तैयार करें और प्लेट्स पर बीज लगाएं । स्तरीकरण के लिए दो दिन तक प्लेटों को अंधेरे और ठंड में स्टोर करें ।
    2. एक पादप इनक्यूबेटर में प्लेटों को ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखें । अंकुरण के छः से सात दिन बाद, अंकुरों को मिट्टी में, प्रत्येक पौधे को एक ही बर्तन में (लंबा दिन (16/8 ध), 22 डिग्री सेल्सियस, आर्द्रता, ६५%) हस्तांतरित करें ।
    3. जब स्टेम के आसपास 1 सेमी लंबी (25-30 dag), H20 में 10-50 Μm Dex के साथ पुष्पक्रम सैम स्प्रे एक चेहरा मुखौटा पहने हुए । विकास के बाद के चरणों में प्रेरण और इमेजिंग के लिए, लंबे समय तक उपजी या साइड शूट के SAMs प्रेरित ।
      नोट: SAMs भी स्प्रे बूंदों को रोकने के लिए Dex समाधान paintbrushing द्वारा प्रेरित किया जा सकता है । जब डेक्स छिड़काव द्वारा लागू किया जाता है एक मुखौटा का उपयोग करें ।
    4. 24-48 एच प्रेरण के बाद, SAMs काटना और इमेजिंग के लिए आगे बढ़ना (देखें ४.३) ।
      नोट: जीन सिलैंसिंग की संभाव्यता को कम करने के लिए प्रोपेगेशन के लिए केवल अन-प्रेरित पौधों का उपयोग किया गया था । टी2/T3 में पौधों इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया ।

4. Arabidopsis चालक लाइनों में रिपोर्टर अभिव्यक्ति की इमेजिंग ।

  1. जड़
    1. एक 10 μg/एमएल propidium आयोडाइड (PI) समाधान करने के लिए थाली से अंकुर हस्तांतरण और उंहें 5 मिनट के लिए जवाबी दाग ।
    2. एक खुर्दबीन इमेजिंग चैंबर में जड़ें प्लेस (1-अच्छी तरह से कवर ग्लास द्वितीय पर ऊतक संस्कृति चैंबर, सामग्री की मेजदेखें) और छवि उन्हें एक 63x पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ एक संनाभि लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें).
    3. PI प्रतिदीप्ति को विज़ुअलाइज़ करने के लिए, ४८८ एनएम के उत्तेजन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करें और ५९० और ६६० एनएम के बीच उत्सर्जन को एकत्रित करे । MTurquoise2 के लिए प्रतिदीप्ति उपयोग ४५८ एनएम उत्तेजना और ४६० और ६१५ एनएम के बीच उत्सर्जन इकट्ठा ।
  2. तना
    1. एक उस्तरा ब्लेड के साथ पौधों की उपजी क्षैतिज हाथ काट वर्गों प्रदर्शन, लगभग 3 सेमी के एक खंड छांटना । काटने के लिए वांछित अनुभाग के विपरीत पक्ष पर उंगली से स्टेम को ठीक करें । कई महीन कटौती क्रमिक रूप से प्रदर्शन लेकिन ध्यान दें कि स्टेम में एक समान स्थिति से केवल वर्गों की तुलना की जानी चाहिए ।
    2. प्रत्येक कटौती के बाद, एक पेट्री पकवान नल का पानी युक्त में razorblade विसर्जित और स्टेम वर्गों इकट्ठा । इस बिंदु पर वर्गों दाग या सीधे माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट ।
    3. धुंधला करने के लिए, एक छोटे पेट्री डिश में पानी के PI समाधान के २५० μg/mL का 1 मिलीलीटर तैयार करें ( सामग्रियों की तालिकादेखें) । 5 मिनट के लिए वर्गों को विसर्जित कर दिया और उंहें पानी में कुल्ला । उन्हें ठीक संदंश या एक अच्छा पेंट ब्रश के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण । Coverslip के साथ नमूने निचोड़ नहीं करने के लिए ध्यान रखना ।
    4. एक 25x सूई पानी के विसर्जन लेंस के साथ एक संनाभि लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि नमूने ( सामग्री की तालिकादेखें) । ५६१ एनएम लेजर लाइट का उपयोग करने के लिए PI प्रतिदीप्ति उत्तेजित और ५७० से ६२० एनएम को इकट्ठा । उपयोग ४०५ एनएम को उत्तेजित करने के लिए mTurquoise2 fluorophore ड्राइवर लाइन द्वारा एंकोडेड effector और constructs ४२५ से ४७५ एनएम उत्सर्जन इकट्ठा ।
  3. प्ररोह शीर्षस्थ विभज्योतक
    1. डंठल के साथ गोली मार टिप के नीचे 2 सेमी काट । एक हाथ में स्टेम पकड़ो और ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए फूल कलियों और बड़े प्राइमोर्डिया हटाने । युवा प्राइमोर्डिया को दूर करने के लिए, एक ईमानदार स्थिति में 3% agarose युक्त एक पेट्री डिश में सैम को ठीक । एक द्विनेत्री और संदंश का उपयोग करने के लिए सैम के पास युवा primordia दूर । वैकल्पिक रूप से, एक इंजेक्शन प्रवेशनी ( सामग्री की मेजदेखें) का उपयोग करने के लिए इन प्राइमोर्डिया काट ।
    2. 5-10 मिनट के लिए एक २५० μg/एमएल PI समाधान में विच्छेदित सैम दाग । या तो सीधे तैयार सैम के शीर्ष पर धुंधला समाधान की कुछ बूंदें pipetting या एक धुंधला समाधान के साथ भरा ट्यूब करने के लिए नमूना स्थानांतरण द्वारा धुंधला प्रदर्शन । रहो सैम पूरी तरह से धुंधला प्रक्रिया के दौरान जलमग्न ।
    3. एक छोटी पेट्री डिश में दाग सैम प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 3% agarose मध्यम और ddh2ओ के साथ सैम को कवर ।
    4. छवि विच्छेदित एक संनाभि लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक 25 x सूई पानी के विसर्जन लेंस के साथ सुसज्जित sams ( सामग्री की मेजदेखें) ।
    5. ५६१ एनएम लेजर लाइट का उपयोग करने के लिए PI प्रतिदीप्ति उत्तेजित और ५७० से ६२० एनएम को इकट्ठा । MTurquoise2 फ्लोरफोर को उत्तेजित करने के लिए ४०५ एनएम का इस्तेमाल करें और ४२५ से ४७५ एनएम तक उत्सर्जन को कलेक्ट कर लें ।
      ०.५ μm के एक कदम आकार के साथ जेड दिशा में ५० μm फैले रिकॉर्ड छवि के ढेर ।
      नोट: सैम इमेजिंग के रूप में यहां वर्णित एक ईमानदार संनाभि लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप और एक लेंस की आवश्यकता है (यहां, एक पानी सूई लेंस) लंबे समय से काम कर रहे दूरी के साथ ।

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Representative Results

चालक और effector लाइनों के GreenGate क्लोनिंग के माध्यम से उत्पादन

GreenGate क्लोनिंग प्रणाली GoldenGate क्लोनिंग पर आधारित है और प्रकार का उपयोग करें IIS प्रतिबंध endonuclease बीएसएमैं या उसके isoschizomer पारिस्थितिकी31i । के रूप में एंजाइम अपनी असममित मांयता साइट से दूर overhangs पैदा करता है, overhangs की आधार संरचना स्वतंत्र रूप से चुना जा सकता है, जो आधार है प्रणाली की प्रतिरूपकता फार्म का । प्रत्येक पीसीआर जनित तत्व, उदाहरण के लिए, एक प्रमोटर अनुक्रम, सीडी, या टर्मिनेटर, पहले प्रतिबंध डाइजेस्ट द्वारा उत्पादित एक मॉड्यूल उत्पंन करने के लिए मिलान overhangs के साथ एक नामित प्रवेश सदिश में डाला जाता है । Subcloning के बाद, मिलान मॉड्यूल की एक संख्या, आमतौर पर छह, एक द्विआधारी संयंत्र गंतव्य वेक्टर में निर्माण की विधानसभा में जिसके परिणामस्वरूप greengate बंधाव प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किया जाता है ।

चालक लाइनों के लिए, ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर (पीटी) के डीएनए दृश्यों वाले मॉड्यूल, जीआर-LHG4 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, pOp6 प्रमोटर, और mTurquoise2 रिपोर्टर एक एन टर्मिनल संकेत पेप्टाइड और एक सी-टर्मिनल ईआर प्रतिधारण संकेत करने के लिए संगलित पहले 2,8 (चित्रा 2) वर्णित के रूप में टर्मिनेटर और विभिन्न एडाप्टर मॉड्यूल और ट्रांसजेनिक चयन के लिए एक मॉड्यूल सहित संगलित. Effector लाइनों pOp6 प्रमोटर के साथ निर्माण किया गया, और एक Effector कैसेट, ब्याज और टर्मिनेटर के एक जीन से मिलकर उदाहरण के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्रांसजेनिक संयंत्र चयन के लिए एक प्रतिरोध जीन एंकोडिंग मॉड्यूल (चित्रा 2) ।

चालक लाइनों के प्रेरण और रिपोर्टर प्रतिदीप्ति के दृश्य

Dex के साथ प्रेरण रूट एंडोडर्मिस (pscr> > sp-mTurquoise2-hdel, चित्रा3 ए), फ्लोएम पूर्वगामी और कैंबियम में सेल प्रकार विशिष्ट mTurquoise2 अभिव्यक्ति के लिए सुराग (pSMXL5> > sp-mTurquoise2-hdel 17, चित्रा 3b), और गोली मार शीर्षस्थ विभज्योतक में स्टेम सेल (pCLV3> > SP-mTurquoise2-hdel 18, चित्रा 3 सी) ।

ट्रांस-सक्रियण के केंबियम के स्टार्च म्यान कोशिकाओं में VND7

ट्रांस-सक्रियण के लिए एक परीक्षण के मामले के रूप में, हम एक effector माध्यमिक सेल दीवार मास्टर ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर VND7 VP16 सक्रियण डोमेन, जो माध्यमिक कोशिका दीवार गठन स्वायत्त प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है करने के लिए संगलित एंकोडिंग लाइन उत्पन्न जब 8,9,19,20गलत व्यक्त ।

क्रमशः प्रेरित या नकली पौधों के लिए या तो 15 μM के डेक्स या DMSO के साथ एक भी उपचार के 5 दिनों के बाद, स्टेम वर्गों स्टार्च म्यान में अस्थानिक lignification के दृश्य के लिए तैयार थे । Propidium आयोडाइड स्टेम में मजबूत अपनत्व ऊतक के संबंध में पता चलता है । डेक्स द्वारा प्रेरित नमूनों में स्टार्च म्यान कोशिकाओं, लेकिन नकली में नहीं PI चैनल के लिए एक मजबूत संकेत दिखाया और कुछ कोशिकाओं जाइलम कोशिकाओं में कोशिका दीवार की विशिष्ट जालिकारूपी मोटा होना दिखा (चित्रा 4).

Figure 1
चित्रा 1 । GreenGate क्लोनिंग सिद्धांत । A) प्रकार IIS प्रतिबंध endonucleases, जैसे Bsai/Eco31i, गैर-palindromic दृश्यों (लाल) को पहचानने और एक निर्धारित दूरी में asymmetrically अनुक्रम (नीला) के स्वतंत्र रूप से काट । पारिस्थितिकी31I ' GGTCTC ' पहचानता है, मांयता साइट के दूसरे नाभिकोटाइड डाउनस्ट्रीम से कटौती और एक चार आधार 5 ' overhang बनाता है । ख) GreenGate क्लोनिंग प्रणाली छह अलग प्रवेश वैक्टर pGGA000-pGGF000 के साथ एक मॉड्यूलर प्रणाली पर आधारित है । इन वैक्टर एक Ampicillin प्रतिरोध कैसेट (Ampicillin) और एक Ccdb प्रत्येक प्रवेश वेक्टर (उदा pGGA000 प्रवेश वेक्टर) और ' GGTCTC पारिस्थितिकी31i मांयता साइटों के लिए विशिष्ट adaptors द्वारा flanked कैसेट होते हैं । पारिस्थितिकी31i पाचन PGGA000 विज्ञप्ति ccdb और बनाता है pGGA000-विशिष्ट चार न्यूकोटाइड overhangs (गहरा नीला) । Insert1 प्राइमरों द्वारा ' ggtctc ' और pGGA000 विशिष्ट adaptors शरण और pGGA000 में ligated पाचन के बाद परिलक्षित होता है । यही प्रक्रिया अन्य मॉड्यूलों के साथ अपनाई जाती है । ग) अंतिम GreenGate प्रतिक्रिया को जोड़ती है the पारिस्थितिकी31i पाचन of the गंतव्य वेक्टर pGGZ001 and the छह प्रवेश वैक्टर PGGA000-pGGF000 and the युगलिगेशन of the सभी मॉड्यूल in the गंतव्य वेक्टर । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 । ड्राइवर और effector लाइनों के साथ डेक्स-inducible LhGR/ ड्राइवर लाइनों में, ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों (pTS) सिंथेटिक ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर LhG4 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं, जो कि ट्रांसलायत चूहा ग्लूकोऑर्टीकॉयड रिसेप्टर (जीआर) के लिगामेंट बाध्यकारी डोमेन के लिए किया जाता है और इस तरह से रोकता है, डेक्स के अभाव में, न्यूक्लियर ट्रांसलोकेशन । Effector लाइन एक transcriptional एक पॉप तत्व और एक ंयूनतम 35s प्रमोटर के साथ एक टाटा बॉक्स से प्रेरित कैसेट बंदरगाहों । एक ड्राइवर लाइन के साथ पार कर दी और Dex प्रेरण पर, LhG4 को पॉप-टाइप तत्वों को रिपोर्टर कैसेट और effector मॉड्यूल में उन लोगों को बांध, mTurquoise2 और effector के ट्रांसक्रिप्शन उत्प्रेरण । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 । रूट, स्टेम, और सैम में प्रेरित चालक लाइनों । A) Dex-प्रेरित ड्राइवर लाइन pscr > >SP-mTurquoise2-hdel (५० μm Dex में अंकुरित) जड़ में और नकली उपचार । बिजूका-प्रवर्तक (पीसीआर) एंडोडर्मिस, कॉर्टेक्स/एंडोडर्मिस इनिशियल (सीईआई) और शांत केंद्र (क्यूसी) में अभिव्यक्ति को मध्यस्थता करता है । कोशिकाओं propidium आयोडाइड (PI) के साथ जवाबी दाग रहे हैं । स्केल पट्टियां = 20 μm. B) Dex-प्रेरित ड्राइवर लाइन pSMXL5 > >SP-mTurquoise2-hdel (एक ५० μm Dex समाधान में डूबा हुआ है और 3 दिनों के बाद कल्पना) में स्टेम और नकली उपचार में । SMXL5 प्रमोटर (pSMXL5) कैंबियम स्टेम सेल डोमेन और फ्लोएम प्रेकर्सर्स में अभिव्यक्ति को मध्यस्थता करता है । कोशिकाओं propidium आयोडाइड (PI) के साथ जवाबी दाग रहे हैं । स्केल पट्टियां = १०० μm. C) डैक्स-प्रेरित ड्राइवर लाइन pCLV3 > >SP-mTurquoise2-hdel (10 μm, ४८ h) साम में । CLAVATA3 प्रमोटर (पीCLV3) स्टेम सेल डोमेन में अभिव्यक्ति की मध्यस्थता करता है । नीचे शो में चित्र XZ और YZ पार वर्गों, Dex प्रेरित और नकली इलाज, क्रमशः । कोशिकाओं propidium आयोडाइड (PI) के साथ जवाबी दाग रहे हैं । स्केल पट्टियां = 20 μm. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 । अस्थानिक लिग्निफिकेशन तने के स्टार्च आवरण में होता है । एक) अस्थानिक lignification पांच दिनों के बाद ड्राइवर लाइन pscr > > स्टेम में VND7-VP16 के Dex प्रेरण देखा जाता है । बिजूका-प्रवर्तक (पीसीआर) स्टेम में स्टार्च म्यान कोशिकाओं में अभिव्यक्ति को मध्यस्थता करता है । वाम छवि PI चैनल और उज्ज्वल क्षेत्र के विलय से पता चलता है, सही छवि केवल PI चैनल से पता चलता है. ख) नकली नियंत्रण स्टार्च म्यान कोशिकाओं में कोई संकेत नहीं दिखाता है । कोशिकाओं propidium आयोडाइड (PI) के साथ जवाबी दाग रहे हैं । स्केल पट्टियां = १०० μm. PI प्रतिदीप्ति है झूठा-हरे रंग में, जबकि क्लोरोप्लास्ट ऑटो फ्लोरेसेंस सभी छवियों में लाल है । श्वेत आर्रोहेड स्टार्च आवरण कोशिकाओं को इंगित करते हैं । वाम छवि PI चैनल और उज्ज्वल क्षेत्र के विलय से पता चलता है, सही छवि केवल PI चैनल से पता चलता है.  इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

मॉड्यूल 5 ' ओवरहैंग के लिए आम तौर पर इस्तेमाल किया 3 ' ओवरहैंग
ए Acct प्रमोटर AACA
बी AACA एन-टर्मिनल टैग GGCT
सी GGCT कोडन अनुक्रम TCAG
डी TCAG सी-टर्मिनल टैग CTGC
ई CTGC टर्मिनेटर Acta
एफ Acta प्रतिरोध कैसेट GTAT

तालिका 1: प्राइमर डिजाइन के लिए इस्तेमाल Overhangs हो जाता है

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Discussion

यहां, हम उत्पंन करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन और inducible, सेल प्रकार विशिष्ट ट्रांससक्रियण के लिए एक बहुमुखी और व्यापक toolkit लागू होते हैं । चालक लाइनों के साथ पॉप प्रमोटर के नियंत्रण में effector कैसेट ले जाने लाइनों को पार करने, F1 पीढ़ी में गलत अभिव्यक्ति प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है, कोशिका प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला में आनुवंशिक क्षोभ का तेजी से आकलन को सक्षम करने से । वैकल्पिक रूप से, effector constructs ड्राइवर लाइनों को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या, क्लोनिंग रणनीति, ड्राइवर और effector का निर्माण भी एक टी-डीएनए पर संयुक्त किया जा सकता है अनुकूल ढालने के द्वारा । इस प्रणाली के लिए अनुप्रयोगों के लिए स्थानिक रूप और अस्थाई नियंत्रित गलत अभिव्यक्ति अध्ययन से डोमेन-विशिष्ट दस्तक नीचे या जीन संपादन और कोशिका प्रकार के विशिष्ट संपूरण के लिए श्रेणी ।

यहां वर्णित प्रक्रियाओं में से कोई भी सामांय आणविक जीवविज्ञान तकनीकों के लिए सुसज्जित प्रयोगशालाओं के लिए एक चुनौती पैदा करनी चाहिए । LhG4 अभिव्यक्ति प्रणाली को अच्छी तरह से परीक्षण किया गया है और यह सुनिश्चित करता है गैर-leaky और tuneable अभिव्यक्ति है कि उच्च स्तर8करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, हालांकि हम चेतावनी है कि प्रेरक एकाग्रता की गतिशील रेंज प्रत्येक ड्राइवर के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए और effector लाइन संयोजन मॉड्यूलर GreenGate क्लोनिंग के साथ इस सिद्ध प्रणाली के संयोजन के लिए जो एक विशिष्ट प्रमोटर उपलब्ध है किसी भी सेल प्रकार में inducible अभिव्यक्ति के लिए एक तेजी से और सरल तरीका प्रदान करता है । हमने पाया है कि पुनर्संयोजन की घटनाओं plasmids कि पॉप प्रकार के प्रमोटर के दोहराव दृश्यों शामिल के प्रवर्धन के दौरान हो सकता है । इन अक्सर ओपी अनुक्रम के कम दोहराता है, जो पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता में परिणाम । अंतिम निर्माण हमेशा एस्चेरिचिया कोलाई और एग्रोबैक्टीरियम tumefaciensमें अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए । हालांकि, सामयिक पुनर्संयोजन घटनाओं केवल ई. कोलाईमें पाया गया ।

इस प्रकार इस तकनीक के आवेदन को सीमित करने के लिए समय ट्रांसजेनिक पौधों को उत्पन्न करने के लिए है ।  जीन सिलैंसिंग के लिए परीक्षण करना, टी 2 पीढ़ी में प्रारंभ करना और केवल स्थिर रेखाओं को बनाए रखना महत्वपूर्ण महत्व का है । साइलैंसिंग की संभावना को कम करने के लिए, हम बीजों को केवल गैर-प्रेरित पौधों के रूप में एकत्रित करने की सलाह देते हैं ।

तकनीक यहां वर्णित अंय ट्रांस-सक्रियकरण सिस्टम21,22के लिए मानार्थ है, क्योंकि यह एक व्यापक संसाधन प्रदान करता है और inducible अभिव्यक्ति के साथ ऊतक विशिष्टता को जोड़ती है । इस विधि के एक संभावित भविष्य के विकास के लिए और अधिक सेल प्रकार विशेष प्रमोटरों का समावेश है जीआर-LhG4 ड्राइव करने के लिए, मुख्य meristems के बाहर के ऊतकों में उदाहरण के लिए । Effectors के बारे में, एक रोमांचक संभव विस्तार अत्यधिक कुशल जीन संपादन उपकरण के adaption है सेल प्रकार के लिए अनुमति देने के लिए विशिष्ट दस्तक23बहिष्कार ।

चालक लाइनों Schürholz एट अल में वर्णित २०१८8 से उपलब्ध है nasc (http://arabidopsis.info/), डीएनए Lampropoulos एट अल में वर्णित constructs, २०१३2 और Schürholz एट अल., २०१८8 addgene (https://www.addgene.org/) से उपलब्ध हैं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हमारी प्रयोगशालाओं में कार्य जर्मन अनुसंधान प्रतिष्ठान (डीएफजी) द्वारा समर्थित है अनुदान दो 1660/6-1 (को दप) और जीआर 2104/4-1 (को टीजी) और SFB1101 (टीजी और जे यू एल) और एक यूरोपीय अनुसंधान परिषद consolidator अनुदान (PLANTSTEMS ६४७१४८) द्वारा टीजी  दप ग्रांट WO 1660/2 के माध्यम से DFG की एमी Noether फैलोशिप के माध्यम से समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Carl Roth GmbH + Co. KG K029.1
ATP Sigma-Aldrich A9187
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Column purification Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (250)
Culture chamber for imaging Sarstedt AG & Co. KG 1-well tissue culture chamber, on cover glass II
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4903
DMSO Fisher Scientific, UK D139-1
Eco31I Thermo Fisher Scientific FD0294
injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) Sterican, Braun
Kanamycin Carl Roth GmbH + Co. KG T832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv Leica, Wetzlar, Germany
MS medium Duchefa, Haarlem, Netherlands M0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA water immersion objective Nikon, Minato, Tokyo, Japan
Petri dish 35/10 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 627102
Petri dish 60/150 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 628102
Petri dish 120/120/17 Greiner Bio-One GmbH, Germany 688102
Plant agar Duchefa, Haarlem, Netherlands P1001
Plasmid extraction Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170
Razorblade Classic, Wilkinson Sword GmbH 7005115E
Reaction tubes Sarstedt AG & Co. KG 72.690.001
Silwet L-77 Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
Spectinomycin AppliChem GmbH 3834.001
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000c
Sucrose Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Sulfadiazine Sigma-Aldrich S6387
Tetracycline AppliChem GmbH 2228.0025
T4 Ligase 5 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0011
T4 Ligase 30 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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आनुवंशिकी मुद्दा १४६ inducible अभिव्यक्ति ट्रांससक्रियण प्रमोटर-रिपोर्टर अध्ययन अभिव्यक्ति नियंत्रण गलत अभिव्यक्ति कार्यात्मक आनुवंशिकी
Inducible, सेल प्रकार- <em>Arabidopsis</em> में विशेष अभिव्यक्ति lhgr के माध्यम से thaliana-मध्यस्थता <em>ट्रांस</em>-सक्रियण
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López-Salmerón, V.,… More

López-Salmerón, V., Schürholz, A. K., Li, Z., Schlamp, T., Wenzl, C., Lohmann, J. U., Greb, T., Wolf, S. Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation. J. Vis. Exp. (146), e59394, doi:10.3791/59394 (2019).

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