Summary
Hier beschrijven we de generatie en toepassing van een geheel van transgene Arabidopsis thaliana lijnen inschakelen afleidbare, weefsel-specifieke expressie in de drie belangrijkste meristems, het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en het cambium.
Abstract
Afleidbare, weefsel-specifieke expressie is een belangrijk en krachtig hulpmiddel om te studeren de spatio-temporele dynamiek van genetische perturbation. De flexibele en efficiënte GreenGate klonen systeem met het bewezen en warempel LhGR systeem (hier genoemd GR-LhG4) voor de afleidbare expressie te combineren, hebben we gegenereerd een verzameling transgene Arabidopsis lijnen die de uitdrukking van een effector kan rijden cassette in een aantal specifieke celtypes in de drie belangrijkste plant meristems. Te dien einde, kozen we voor de eerder ontwikkelde GR-LhG4-systeem dat is gebaseerd op een chimeer transcriptiefactor en de promotor van een cognaat pOp-type zorgen voor een strakke controle over een breed scala van expressie niveaus. Bovendien, om te visualiseren het domein van de expressie waar de synthetische transcriptiefactor actief is, is een verslaggever ER-gelokaliseerde mTurquoise2 fluorescerende onder controle van de promoter pOp4 of pOp6 gecodeerd in stuurprogramma lijnen. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor het genereren van een stuurprogramma of effector lijn en demonstreren hoe cel type specifieke expressie kan worden geïnduceerd en volgde in het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en de cambium van Arabidopsis. Met behulp van meerdere of alle stuurprogramma lijnen, het specifieke effect van kader uiting te geven aan een of meerdere factoren (effectoren) onder controle van de promoter synthetische pOp kan worden beoordeeld snel, bijvoorbeeld in F1 planten van een kruising tussen een effector en meerdere stuurprogramma lijnen. Deze aanpak wordt geïllustreerd door de ectopische uitdrukking van VND7, een NAC transcriptiefactor staat inducerende ectopische cel van de secundaire muur depositie op autonome wijze van een cel.
Introduction
Een belangrijke beperking in de biologie in het postgenomic tijdperk is te ontcijferen van de specifieke rol van de context van een gegeven factor of genetische perturbation. Constitutieve genetische verstoringen zoals verlies-van- en winst-van-functie benaderingen vaak alleen toestaan eindpunt analyse van levenslang aanpassing processen, het onderscheid tussen primaire en secundaire effecten obfuscating. Daarnaast kunnen specifieke functies van de context worden gemaskeerd of verdund door grootschalige effecten in verre weefsels of tijdens de andere fasen van ontwikkeling. Bovendien, in extreme gevallen, kan letaliteit beletsel voor ieder mechanistische inzicht. Ideaal, om deze kwesties te omzeilen, kan een analyseren het effect van acute genetische perturbation binnen een specifieke context, zoals een specifieke celtype in een time-resolved wijze. Om dit te bereiken, zijn genetische hulpmiddelen voor afleidbare, cel type-specifieke expressie vereist1. Om een bron voor de snelle beoordeling van de spatio dynamiek van een reactie op een bepaalde effector, hebben wij gebundeld in het gemak van het klonen van de GreenGate systeem2 voorzien van de bewezen doeltreffendheid van de GR-LhG4 systeem3, 4,5,6. We hebben een verzameling lijnen uiten het chimeer transcriptiefactor dat lhg4 tot het ligand bindend domein van de rat corticoid receptor (GR)7 onder de controle van goed gekarakteriseerd cel type specifieke initiatiefnemers8 gesmoltengegenereerd. In rust voorwaarden, blijft de transcriptiefactor buiten de kern, zoals het domein GR is gebonden door de cytosolische HSP90. Met de toevoeging van synthetische ligand dexamethason (Dex), nucleaire translocatie wordt geïnduceerd en LhG4 zal bemiddelen transcriptie van expressie cassettes onder controle van de promotor van een cognaat synthetische pOp-type , zoals een mTurquoise2 verslaggever opgenomen in de regels van de bestuurder te visualiseren van het domein van de expressie na inductie. Dus, de bestuurder regels technisch bevatten ook een effector cassette. Het overschrijden van een verzameling stuurprogramma lijnen met een lijn met een effector cassette met, bijvoorbeeld, een gen van belang onder controle van de promoter pOp-type dezelfde dus laat de snelle beoordeling van de acute of langdurige gevolgen van effector expressie in een groot aantal celtypes.
Hier bieden we een protocol met een beschrijving van de procedures die noodzakelijk zijn voor het genereren van de bestuurder en effector lijnen en aantonen hoe cel type specifieke expressie kan worden geïnduceerd en volgde in het schieten apicale meristeem, de wortel apicale meristeem en de cambium van Arabidopsis. Om te illustreren de dapperheid en de specificiteit van deze aanpak, we gebruik maken van de bekende transcriptiefactor VND7 die in staat van rijden xylem-achtige secundaire cel muur heeft ectopically is9. Behandeling van de F1 van een kruising tussen de pSCR10,11 driver regel en de regel pOp6:VND7 effector leidt tot de vorming van ectopische xylem-achtige cellen in de schede van de zetmeel cellen van de Arabidopsis voortvloeien.
Ter vergemakkelijking van de generatie van grote verzamelingen van DNA nodig voor de bouw van de bestuurder en effector expressie plasmiden, gebruikten we de snelle en efficiënte GreenGate klonen van methode2. Het klonen van GreenGate is gebaseerd op de enzymen van de beperking van type II S zoals Eco31I of de isoschizomer Bsaik2. Deze enzymen knippen stroomafwaarts van hun sites van de asymmetrische erkenning overhangen met variërende basis samenstelling produceren. Door de integratie van Eco31I /Bsaik beperking sites in oligonucleotides en specifieke overstek sequenties aan DNA-elementen toe te wijzen, modulaire klonen is bereikt, het vergemakkelijken van het genereren van grote verzamelingen. In het kader van GreenGate vallen DNA modules in de categorieën A-F op basis van de volgorde van de overhang die dienen als adapters en worden geassembleerd in die volgorde. Daarom moet de inleidingen aan het versterken van uw gewenste product ontworpen overeenkomstig de geselecteerde module2 (figuur 1A). Als er een interne Eco31I is /Bsaik site en de volgorde is niet compatibel met de GreenGate ingang en bestemming modules, kunt u doorgaan zonder mutagenizing, maar met lagere efficiëntie. Als alternatief, plaats-geleide mutagenese kunt verwijderen Eco31I /Bsaik beperkingsplaatsen verzorgen als u niet wilt wijzigen van aminozuren in genproducten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vectoren en modules kunnen worden verkregen bij de non-profit repository, Addgene (https://www.addgene.org).
1. klonen met behulp van GreenGate
- Ontwerp primers met behulp van de in tabel 1genoemde overhangen, ter vervanging van 'NNNN' met module type-specifieke adapter sequenties hieronder: vooruit: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + specifieke volgorde 3´, Reverse: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + omgekeerde aanvulling van specifieke reeks 3´. De onderstreepte bases om handhaving van het leesraam toevoegen.
Module overhangt:
Opmerking: In de standaard GreenGate kader, zes modules, A-F, worden geassembleerd met een plant transformatie vector backbone in één expressie plasmide (Figuur 1 c). Typisch, de A-module zal haven promotor sequenties, een B-module een N-terminal tag of "dummy" reeks6, een C-module een cd's, een D-module een C-terminal tag of dummy, een E-module een terminator, en een F-een weerstand cassette voor selectie van transgene planten. Adapter voor koppeling met andere voorgemonteerd eenheden zijn beschikbaar voor gebruik in de plaats van de F module2. - PCR versterking
- De opeenvolging van belang met de ontworpen inleidingen versterken door de polymerase-kettingreactie (PCR) volgens standaardprotocollen.
- Scheiden van het PCR-product op een agarose gel. Accijns- en kolom zuiveren het juiste fragment met behulp van een commerciële kit (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant.
- Vermelding module creatie
- Afzonderlijk verteren de module vector en het PCR fragment (stap 1.2.) (Figuur 1 A, B) met Eco31I/Bsamij using 100-500 ng van DNA (Vector- of Fragment), 3 µL 10 x spijsvertering buffer en 5-10 U Eco31I in een buis en breng het volume aan 30 µL met ddH2O.
- Meng zachtjes door pipetteren omhoog en omlaag en draai naar beneden kort aan de 1000 x g. Incubeer bij 37 ° C op een warmte blok voor de 15 min (of naar aanleiding van de aanbeveling van de tijd van de gekochte restrictie-enzym).
- Na de vertering, kolom zuiveren elk monster met een commerciële kit (Zie Tabel van materialen) en kwantificeren van het verkregen DNA door bepaling van de optische dichtheid bij 260 nm (OD260) met behulp van een spectrofotometer.
- Mix de 30-100 ng invoegen en de 10 – 50 ng verteerd vector verteerd door pipetteren op en neer meerdere malen en incubeer met 1 µL T4 Ligase (5 U/µL, en 3 µL 10 x T4 afbinding buffer in een totaal volume van 30 µL bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (naar aanleiding van de aanbeveling van de T4 ligase leverancier) (Zie Tabel van materialen).
Opmerking: Bereken de gewenste molaire verhouding vermelding module: bestemming vector (bijvoorbeeld 3:1) voor de afbinding afhankelijk van de concentratie en de lengte van de vermelding module inserts. - Het vergroten van de efficiëntie van transformatie, warmte inactivering van de T4 ligase door het broeden van de reactie bij 65 ° C gedurende 20 min.
- Gebruik de afbinding product te transformeren bevoegde E. coli cellen volgens de standaard lab protocollen en de verspreiding van de bacteriën op agar platen aangevuld met ampicilline (100 µg/mL)
- Incubeer de plaat met bacteriën bij 37 ° C's nachts.
- Scherm voor kolonies met de gewenste vermelding module door PCR met behulp van de inleidingen 86A1 (5 '-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3), 86A2 (5 '-GTTTTCCCAGTCACGACG-3) en standaardvoorwaarden van de PCR van de kolonie.
Opmerking: Deze combinatie primer is geldig voor alle post modules zoals de primers met de vermelding vector backbone binden. - Selecteer één kolonies voor de isolatie van de plasmide. Gebruik van vloeibare cultuur 2 mL LB aangevuld met ampicilline (100 µg/mL) en na een nacht bebroeden in een shaker 37 ° C.
- Isoleren plasmiden uit de overnachting vloeibare cultuur met een mini Prep Kit of de gewenste winning protocol (Zie Tabel van materialen).
- Ter identificatie van plasmiden met de juiste invoegen, restrictie-enzym analyse uitvoeren, bijvoorbeeld door het selecteren van twee enzymen die gesneden uniek in uw invoegen door het mengen van 200 ng van plasmide, 2 µL 10 x spijsvertering buffer, 5-10 U van geselecteerde restrictie-enzymen en ddH2 O van 20 µL.
- Volgorde van de geselecteerde plasmiden met behulp van de inleidingen, 86A1 en 86A2 (zie stap 1.3.9.).
- Bestemming module creatie:
Opmerking: Voor de bestemming plasmide gebruiken de gewenste bestemming module pGGZ001, pGGZ002 of pGGZ0032 (Figuur 1 c).- Voeg in een buis en Meng 50 – 150 ng lege bestemming vector (pGGZ003, bijvoorbeeld), 50-300 ng van elk gevuld vermelding module 2 µL 10 x spijsvertering buffer buffer, 1.5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL), 5-10 U µL Eco31I en dH2O tot een totaal volume van 20 µl.
Opmerking: Bereken de gewenste molaire verhouding vermelding module: bestemming vector (bijvoorbeeld 3:1) voor de afbinding afhankelijk van de concentratie en de lengte van de vermelding module inserts. - Mengen en voeren van de GreenGate reactie2 met behulp van een PCR thermocycler afwisselend 30 keer 37 ° C gedurende 5 minuten en 16 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door enkele stappen van 5 min bij 50 ° C en 5 min bij 80 ° C.
- Het vergroten van de efficiëntie, voeg 1 µL T4 Ligase (30 U/µL) en 1,5 µL 10 mM ATP tot de reactie en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door warmte-inactivatie van T4 DNA Ligase bij 65 ° C gedurende 20 min.
- Gebruik de afbinding reactie te transformeren bevoegde E. coli en verspreiding van de bacteriën op agar platen aangevuld met de juiste selecterende stof spectinomycine (50 µg/mL).
- Incubeer de getransformeerde E. coli op de plaat bij 37 ° C's nachts.
- Om te bevestigen transformatie, Strijk opnieuw elk van de geselecteerde enkele kolonies op spectinomycine (50 µg/mL) en ampicilline (100 µg/mL) met platen, respectievelijk. Gebruik alleen de koloniën die groeien op spectinomycine maar niet op ampicilline platen.
- Incubeer de kolonies van de E. coli's nachts bij 37 ° C.
- Selecteer één kolonies voor plasmide isolatie. Gebruik van vloeibare cultuur 2 mL LB aangevuld met spectinomycine (50 µg/mL) en na een nacht bebroeden bij een shaker 37 ° C.
- Isoleren van de overeenkomstige plasmiden met een mini Prep Kit (Zie Tabel van materialen).
- Controleren door restrictie-enzym-analyse (zie 1.3.12.) en volgorde geselecteerd positieve constructies met behulp van primers 88C 3 (5 '-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3 '), 88C 4 (5 '-CCTTTTTACGGTTCCTG-3). Als de invoegen kan niet met deze inleidingen worden gesequenced, interne inleidingen voor het rangschikken te ontwerpen.
Opmerking: Om te identificeren klonen met het juiste aantal pOp herhalen sequenties (zie discussie), de inleidingen pOp6 (pOp6_F, 5 '-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3 '; en pOp6_R, 5 '-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3 ') die binden in de kort flankerende sequenties kan worden gebruikt voor PCR versterking en latere gelelektroforese te discrimineren door grootte.
- Voeg in een buis en Meng 50 – 150 ng lege bestemming vector (pGGZ003, bijvoorbeeld), 50-300 ng van elk gevuld vermelding module 2 µL 10 x spijsvertering buffer buffer, 1.5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL), 5-10 U µL Eco31I en dH2O tot een totaal volume van 20 µl.
- Tussenliggende supermodule creatie
- Combineren van twee onafhankelijke sets voor vermelding modules, zoals vereist voor het genereren van de GR-LhG4 bestuurder lijnen met geïntegreerde verslaggever-effector cassette, eerste bouwen twee tussenliggende plasmiden, genaamd supermodules2, voor het monteren van de uiteindelijke expressie plasmide in pGGZ001 of pGGZ003.
- Zorg ervoor dat F-H adapter toevoegen aan het einde van de eerste supermodule en H-A adapter aan het begin van de tweede supermodule (die dienen als verbindingen tussen twee constructies) als beschreven2.
Opmerking: Alleen de tussenliggende module van de pGGN000 draagt de weerstand cassette. Voor het genereren van de expressie plasmide, uitvoeren van de GreenGate reactie met de vector van de bestemming en de pGGN000 en de pGGM000 tussentijdse supermodules. U kunt ook mengen bestemming vector, de intermediaire supermodule pGGN000 en de resterende enkele modules voor het uitvoeren van de GreenGate reactie2. De laatste methode is minder efficiënt dan de voormalige maar kan sneller worden. - Als u wilt maken een pGGM000/pGGN000-supermodule, meng 1.5 µL (100-300 ng/µL) van elk van de modules van de toegang met 1 µL (30 ng/µL) lege tussenliggende vector (pGGM000 of pGGN000), 2 µL 10 x spijsvertering buffer, 1.5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL) , en 5-10 U Eco31I in een totaal volume van 20 µL.
Opmerking: De gewenste molaire verhouding vermelding module: bestemming vector (bijvoorbeeld 3:1) voor de afbinding afhankelijk van de concentratie en de lengte van de vermelding module inserts berekenen - Mengen en voeren van de GreenGate reactie zoals in stap 1.4.2
- Te vergroten doelmatigheid, voeg 1 µL T4 Ligase en 1,5 µL ATP (10 mM), en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, gevolgd door warmte-inactivering bij 65 ° C gedurende 20 min.
- Gebruik 10 µL van de afbinding reactie om te transformeren bevoegde E. coli en streep op platen met kanamycine (50 µg/mL).
- Overnachting incubatie van de getransformeerde E. coli uitvoeren op de plaat bij 37 ° C.
- Strijk opnieuw elk van de geselecteerde enkele kolonies op kanamycine (50 µg/mL) en ampicilline (100 µg/mL) met platen, respectievelijk.
- Uitvoeren van overnachting incubatie van de E. coli kolonies op de plaat bij 37 ° C.
- Selecteer één koloniën die alleen op kanamycine maar niet op ampicilline voor plasmide isolatie groeien. Gebruik van vloeibare cultuur 2 mL LB aangevuld met kanamycine (50 µg/mL) en na een nacht bebroeden in een shaker 37 ° C.
- Isolaat de overeenkomstige plasmiden met behulp van een mini prep kit (Zie Tabel van materialen).
- De plasmiden controleren door restrictie-enzym-analyse (zie 1.3.12.) en bevestig met sequencing met behulp van primers 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) en 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) met de pGGM000/pGGN000-backbone gloeien. Als de invoegen kan niet met deze inleidingen worden gesequenced, interne inleidingen voor het rangschikken te ontwerpen.
Opmerking: Als het klonen in de pGGM000 of pGGN000 vectoren is mislukt, een mogelijke oplossing is te verteren de pGGM000 of de pGGN000 met Eco31I, op een gel in werking en te zuiveren van de gel de pGGM000 of pGGN000 fragment van de ruggengraat (ongeveer 2000 bp) zonder de ccdB cassette (ongeveer 1400 bp). Ga vervolgens verder normaal met de reactie van de afbinding.
- Transformeren een A. tumefaciens pSOUP+ stam (bijvoorbeeld ASE), als de oorsprong van de pSa van replicatie (ori A. tum.) in de bestemming vectoren vereist de aanwezigheid van de helper plasmide pSOUP12. Streak uit bacteriën op LB platen met chlooramfenicol (34 µg/mL), kanamycine (50 µg/mL), spectinomycine (50 µg/mL) en tetracycline (12,5 µg/mL). Incubeer de getransformeerde A. tumefaciens op de plaat in een incubator 28 ° C gedurende twee tot drie dagen.
2. productie van Arabidopsis transgene planten
- Transformatie van Arabidopsis thaliana.
Opmerking: Transformeren A. thaliana planten volgens Zhang et al., 200613. - Selectie van transgene lijnen.
- Schakel de getransformeerde planten, gebruik van de regeling van de selectie voor weerstand tegen sulfadiazine15op GABI-Kat14 gebruikt.
- Schakel stabiele lijnen met een mogelijke integratie van de enkel evenement, kiezen in generatie T2, die aantonen dat de verhouding 3:1 segregatie in de markering van de weerstand. Deze lijnen naar T3 generatie doorgeven en selecteer de planten die homozygoot zijn voor het gen van de weerstand. U kunt ook uitvoeren een Southern Blot analyse of een standaard kwantitatieve real-time PCR (SA-qPCR)16 om één invoeging regels te selecteren.
3. inductie voor trans-activation in Arabidopsis stuurprogramma lijnen
- Root
- Om te testen verslaggever expressie in A. thaliana stuurprogramma regels gegenereerd door stappen 1 en 2, steriliseren van zaden, zoals hieronder beschreven.
- Toevoegen van 0.5-1.0 mL van 70% Ethanol + 0,01% niet-ionogene wasmiddel op ongeveer 100 zaden (20 mg) in een 1,5 ml reactiebuis en omkeren de buis een paar keer. Spin down bij 1000 x g gedurende 15 s en aspirate het supernatant.
- Toevoegen van 0.5-1.0 mL absolute ethanol. De buis meerdere malen omkeren, spin down voor 1.000 x g voor 15 s en negeren de bovendrijvende substantie.
- Toevoegen van 0.5-1.0 mL van absolute ethanol en omkeren de buis t een paar keer, draai vervolgens neer bij 1.000 x g gedurende 15 s en negeren de bovendrijvende substantie.
- Laat de zaden te drogen in de kap. Als zaden zijn gonna worden gelaagde in buizen gaat u verder met stap 3.1.1.6.
- Toevoegen van 0.5-1.0 mL steriel water en omkeren de buis een paar keer. Spin down bij 1.000 x g gedurende 15 s en negeren de bovendrijvende substantie.
- Toevoegen van 0.5-1.0 mL steriel water en omkeren de buis meerdere malen. Spin down bij 1.000 x g gedurende 15 s en negeren de bovendrijvende substantie.
- Toevoegen van 0.5-1.0 mL steriel water.
- Voorbereiden halve sterkte Murashige en Skoog middellange, pH 5,8 en toevoegen van 0,9% plant agar en 1% sucrose. Nadat autoclaaf toegevoegd dexamethason (Dex), opgelost in DMSO, om een eindconcentratie van 10-30 µM op inductie platen en een gelijke hoeveelheid van DMSO aan controle platen, respectievelijk.
- Zaden voor root imaging zetten platen en stratificeren hen gedurende 48 uur in duisternis en kou (4 ° C).
- Zet platen in een verticale positie in een plant incubator (lange dag 16/8 h, 22 ° C, luchtvochtigheid, 65%) en ze groeien voor vijf dagen.
- Vijf dagen na de kieming (dag), het imago van de zaailingen met behulp van confocale laser scanning microscopie.
- Om te testen verslaggever expressie in A. thaliana stuurprogramma regels gegenereerd door stappen 1 en 2, steriliseren van zaden, zoals hieronder beschreven.
- Stam
- Steriliseren zaden zoals beschreven in 2.1.1. en zaden zetten in ½ MS, 0,9% plant agar en 1% sacharose platen. Stratificeren gedurende 48 uur in duisternis en kou (4 ° C).
- Zes tot zeven dagen na ontkieming, dragen de zaailingen bodememissies, elke plant in een gemeenschappelijke pot (lange dag 16/8 h, 22 ° C, luchtvochtigheid, 65%).
- Induceren trans-activering in stengels door drenken met Dex of mock oplossing of door dompelen de planten in Dex of mock oplossingen, respectievelijk.
- Gebruik voor het drenken, een 25 µM Dex oplossing in water bereid uit een voorraad van 25 mM Dex in ethanol opgelost. Water elke 2-3 dagen tot de gewenste tijdstip van inductie.
- Voorbereiden om te dompelen, een bekerglas van 1 L, 750 mL water met 0,02% silwet L-77 met 25 µM van Dex of equivalente hoeveelheid DMSO voor de Dex en mock behandeling, respectievelijk. Dompel één planten voor 30 s in de inductie of in de mock oplossing. Herhaal elke 2-3 dagen tot de gewenste tijd voor imaging.
Opmerking: Na het dompelen, de planten moeten worden gehandhaafd in hoge luchtvochtigheid gedurende één uur.
- Shoot apicale meristeem (SAM)
- Steriliseren zaden zoals beschreven in 2.1.1. Voorbereiding van de platen met ½ MS, 0,9% plant agar en 1% sacharose medium en zaden op de platen. De platen voor twee dagen in duisternis en kou voor de stratificatie opslaan.
- Platen in een verticale positie in een incubator van de plant plaatsen Zes tot zeven dagen na ontkieming, de zaailingen overbrengen in de bodem, elke plant in een gemeenschappelijke pot (lange dag 16/8 h, 22 ° C, luchtvochtigheid, 65%).
- Wanneer de stengel is ongeveer 1 cm lang (25-30 dag), spray de bloeiwijze SAM met 10-50 µM Dex in H20 het dragen van een gezichtsmasker. Voor de inductie en beeldvorming in latere stadia van ontwikkeling, induceren SAMs langere stengels of zijde scheuten.
Opmerking: SAMs kunnen ook worden veroorzaakt door paintbrushing de Dex-oplossing om te voorkomen dat spray druppels. Gebruik een masker wanneer Dex wordt toegepast door sproeien. - 24-48 h na inductie, ontleden de SAM's en gaat u verder met de beeldvorming (zie 4.3).
Opmerking: Alleen un-geïnduceerde planten werden gebruikt voor de voortplanting te verminderen de kans op gene monddood maken. Planten in T2/T3 werden gebruikt voor de beeldvorming.
4. beeldvorming van verslaggever expressie in Arabidopsis stuurprogramma lijnen.
- Root
- Zaailingen van bord overbrengen in een 10 µg/mL propidium jodide (PI) oplossing en tegen vlekken hen gedurende 5 minuten.
- Plaats de wortels in een Microscoop imaging kamer (1-well weefselkweek kamer op cover glas II, Zie Tabel van materialen) en beeld met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 63 x water onderdompeling doelstelling (Zie Tabel van materialen).
- Gebruiken om te visualiseren PI fluorescentie, een golflengte van de excitatie van 488 nm en verzamelen emissie tussen 590 en 660 nm. Fluorescentie 458 nm excitatie gebruik voor mTurquoise2 en emissie verzamelen tussen 460 en 615 nm.
- Stam
- Uitvoeren van horizontale hand gesneden delen van de plant stengels met een scheermesje, middendoor een segment van ongeveer 3 cm. het herstellen van de stengel met de vinger aan de andere kant van de gewenste sectie te knippen. Voert verscheidene fijne besnoeiingen opeenvolgend maar merk op dat alleen de secties van een soortgelijk standpunt in de stam moeten worden vergeleken.
- Na elke knippen, de razorblade in een petrischaal met tap water onderdompelen en het verzamelen van de secties van de stam. Vlekken van secties op dit punt of rechtstreeks monteren op Microscoop dia's.
- Voor vlekken, bereiden een 1 mL 250 µg/ml van PI oplossing van water in een kleine petrischaal (Zie Tabel van materialen). De secties gedurende 5 min. onderdompelen en spoel ze af in water. Overbrengen naar de Microscoop dia's met fijne pincet of een fijne kwast. Zorg niet knijpen de monsters met het dekglaasje aan.
- Afbeelding van de monsters met behulp van een confocale laser scanning microscoop met een 25 x dompelen water onderdompeling lens (Zie Tabel van materialen). Gebruik 561 nm laserlicht excite PI fluorescentie te verzamelen van 570 tot 620 nm. Gebruik 405 nm te prikkelen de mTurquoise2 fluorophore effector gecodeerd door de bestuurder lijn constructies en verzamelen van emissie van 425 tot 475 nm.
- Shoot apicale meristeem
- Snij de stengel 2 cm onder de tip van schieten met een tang. Houd de stengel in de ene hand en fijne pincet gebruiken om de bloemknoppen en de grote primordia te verwijderen. Als wilt verwijderen jonge primordia, correctie van de SAM in rechtop in een petrischaal met 3% agarose. Gebruik een verrekijker en pincet te verwijderen jonge primordia dicht bij de SAM. Ook gebruiken een injectie canule (Zie Tabel van materialen) aan deze primordia afgesneden.
- Vlekken van de ontleed SAM in een oplossing van 250 µg/mL PI voor 5-10 min. kleuring hetzij rechtstreeks door een paar druppels kleurstofoplossing bovenop de bereid SAM pipetteren uitvoeren of het monster overbrengen in een buis gevuld met kleurstofoplossing. Houd de SAM volledig ondergedompeld tijdens de kleuring procedure.
- Plaats de gekleurde SAM in een kleine petrischaal (Zie Tabel van materialen) met 3% agarose medium en bedek de SAM met ddH2O.
- Afbeelding ontleed SAMs met behulp van een confocale laser scanning microscoop voorzien van een 25 x dompelen water onderdompeling lens (Zie Tabel van materialen).
- Gebruik 561 nm laserlicht excite PI fluorescentie te verzamelen van 570 tot 620 nm. Gebruik 405 nm te prikkelen de mTurquoise2 fluorophore en verzamel aflevering van 425 tot 475 nm.
Afbeeldingsstapels verspreid over 50 µm in z-richting met een stap grootte van 0,5 µm opnemen.
Opmerking: SAM imaging zoals hier beschreven vereist een rechtop confocale laser scanning microscoop en een lens (hier, een water dompelen lens) met lange afstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generatie van bestuurder en effector lijnen door GreenGate klonen
De GreenGate klonen systeem is gebaseerd op GoldenGate klonen en gebruik de type IIS beperking endonuclease Bsaik of zijn isoschizomer Eco31I. Zoals het enzym produceert overhangen verre van de asymmetrische erkenning-site, de basis samenstelling van de overhangen kunnen vrij worden vormen gekozen, die de basis vormt de modulariteit van het systeem. Elk element van PCR-gegenereerd, bijvoorbeeld, een opeenvolging van de promotor, cd's of terminator, eerst wordt ingevoegd in een vector van het aangewezen item met bijpassende overhangen geproduceerd door beperking digest voor het genereren van een module. Na het subcloning, worden een aantal overeenkomende modules, meestal zes, gebruikt voor de GreenGate afbinding reactie, resulterend in de vergadering van de constructie in een binaire plant bestemming vector.
Modules met de DNA-sequenties van weefsel-specifieke promotor (pTS), de transcriptiefactor GR-LHG4, de promotor van de pOp6 en de mTurquoise2-verslaggever gesmolten tot een N-terminal signaal peptide stuurprogramma lijnen, en een C-terminal ER retentie signaal waren gesmolten afsluitweerstanden en diverse adapter modules en een module voor transgene selectie zoals eerder beschreven 2,8 (Figuur 2). Effector lijnen werden geconstrueerd met pOp6 promotor, en een effector cassette, bijvoorbeeld bestaande uit een gen van belang, evenals terminator en een module codering van een gen van de weerstand voor de transgene plant selectie (Figuur 2).
Inductie van stuurprogramma lijnen en visualisatie van verslaggever fluorescentie
Inductie met Dex leidt tot cel type-specifieke mTurquoise2 expressie in de endodermis wortel (pSCR>> SP-mTurquoise2-HDEL, figuur 3A), floëem precursoren en cambium (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, Figuur 3B), en de cellen van de stam in het schieten apicale meristeem (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, Figuur 3 c).
Trans-activering van VND7 in zetmeel schede cellen van het cambium
Als een test case voor trans-activering, we genereerden een effector lijn codering die de cel van de secundaire muur master transcriptiefactor VND7 bij het VP16 activering domein, waarvan is aangetoond gesmolten voor het opwekken van de secundaire muur vorming cel autonoom wanneer misexpressed 8,9,19,20.
Na 5 dagen van een enkele behandeling met 15 µM van Dex of DMSO voor de geïnduceerde of de mock planten respectievelijk waren stam secties voorbereid op de visualisatie van ectopische lignification in de schede van zetmeel. Propidium jodide toont in de stengel sterke affiniteit met lignified weefsel. De cellen van de schede zetmeel in geïnduceerde monsters door Dex, maar niet in de mock toonde een sterk signaal voor het kanaal van PI en bepaalde cellen tonen de typische reticulate verdikking van de celwand in xylem cellen (Figuur 4).
Figuur 1. De GreenGate klonen principe. A) Type IIS beperkingsendonucleases, zoals Bsaik /Eco31I, herkennen niet-palindromische sequenties (rood) en snijd asymmetrisch in een gedefinieerde afstand onafhankelijk van de volgorde (blauw). Eco31I 'GGTCTC' herkent, snijdt van de tweede nucleotide stroomafwaarts van de site van erkenning en creëert een overstek vier basis 5'. B) de GreenGate klonen systeem is gebaseerd op een modulair systeem met zes verschillende vermelding vectoren pGGA000-pGGF000. Deze vectoren bevatten een ampicilline-resistentie cassette (AmpR) en een cassette ccdB geflankeerd door de specifieke adapters voor elke vermelding vector (b.v. pGGA000 post vector) en de 'GGTCTC' Eco31I erkenning sites. Eco31I vertering van pGGA000 releases ccdB en wordt gemaakt van de pGGA000-specifieke vier nucleotide overhangen (donker blauw). Insert1 wordt versterkt door inleidingen herbergen van 'GGTCTC' en pGGA000 specifieke adapters en na vertering afgebonden in pGGA000. Dezelfde procedure wordt gevolgd met de andere modules. C) de uiteindelijke reactie van GreenGate combineert de Eco31I vertering van de bestemming vector pGGZ001 en de zes post vectoren pGGA000-pGGF000 en de gelijktijdige Afbinding van alle modules in de bestemming vector. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Overzicht van het systeem van de Dex-afleidbare LhGR/pOp met bestuurder en effector lijnen. In stuurprogramma lijnen, weefsel-specifieke initiatiefnemers (pTS) bepalen de uitdrukking van de synthetische transcriptiefactor LhG4, die translationally is gesmolten tot het ligand bindend domein van rat glucocorticoide receptor (GR) en daarmee voorkomt dat, bij gebrek aan Dex, de nucleaire translocatie. De lijn effector herbergt een transcriptionele cassette gedreven door een pOp -element en een TATA doos met een minimale 35S -promotor. Gekruist met een driver regel en na Dex inductie, bindt GR-LhG4 aan de pOp-achtige elementen in de verslaggever cassette en die in de module effector inducerende van de transcriptie van de mTurquoise2 en de effector. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Geïnduceerde stuurprogramma lijnen in wortel, stam en SAM. A) Dex-geïnduceerde driver regel pSCR >>SP-mTurquoise2-HDEL (ontkiemd in 50 µM Dex) in de wortel en de mock behandeling. De SCARECROW promotor (pSCR) bemiddelt expressie in de endodermis, cortex/endodermis eerste (CEI) en rustige centrum (QC). Cellen zijn contra gekleurd met propidium jodide (PI). Schaal bars = 20 µm. B) Dex-geïnduceerde driver regel pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (ondergedompeld in een oplossing van 50 µM Dex en gevisualiseerd na 3 dagen) in bij de stam en de mock behandeling. SMXL5 promotor (pSMXL5) bemiddelt expressie in de cel van de stam cambium de precursoren domein en floëem. Cellen zijn contra gekleurd met propidium jodide (PI). Schaal bars = 100 µm. C) Dex-geïnduceerde driver regel pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 µM, 48 h) in de SAM. De promotor van de CLAVATA3 (pCLV3) bemiddelt expressie in de cel van de stam-domein. Foto's in de bodem tonen XZ- en YZ Kruis secties, Dex-geïnduceerde en mock behandeld, respectievelijk. Cellen zijn contra gekleurd met propidium jodide (PI). Schaal bars = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Ectopische lignification in de schede van de zetmeel van de stengel. A) ectopische lignification is gezien vijf dagen na Dex inductie van de driver regel pSCR >> VND7-VP16 in de stengel. De SCARECROW promotor (pSCR) bemiddelt expressie in de cellen van de schede zetmeel in de stengel. Linker beeld toont samenvoegen van PI kanaal en heldere veld, juiste beeld toont alleen PI kanaal. B) voor de mock besturingselement geeft geen signaal in de cellen van de schede zetmeel. Cellen zijn contra gekleurd met propidium jodide (PI). Schaal bars = 100 µm. PI fluorescentie is onwaar-gekleurde in het groen terwijl chloroplast auto fluorescentie is rood in alle beelden. Witte pijlpunten wijs zetmeel schede cellen. Linker beeld toont samenvoegen van PI kanaal en heldere veld, juiste beeld toont alleen PI kanaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Module | 5' overhang | meestal gebruikt voor | 3' overhang |
| A | ACCT | promotor | AACA |
| B | AACA | N-terminale tag | GGCT |
| C | GGCT | Codering van volgorde | TCAG |
| D | TCAG | C-terminal tag | CTGC |
| E | CTGC | Terminator | ACTA |
| F | ACTA | weerstand cassette | GTAT |
Tabel 1: Overhangen gebruikt voor primer design
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor het genereren en toepassen van een veelzijdige en uitgebreide toolkit voor afleidbare, cel type specifieke trans-activering. Overschrijding van lijnen uitvoering effector cassettes onder controle van de promoter pOp met stuurprogramma lijnen kunt deelneemt bestudeert de effecten van verkeerde expressie in de F1-generatie, de snelle beoordeling van genetische perturbation in een breed scala van celtypes inschakelen. U kunt ook effector constructies kunnen worden gebruikt om het stuurprogramma lijnen transformeren of, door aanpassing van de klonen strategie, de bestuurder en de effector construct kan ook worden gecombineerd op een T-DNA. Toepassingen voor deze systeem variëren van ruimtelijk en stoffelijk geregeld mis expressie studies domeinspecifieke knock-down of gene bewerken en celtype specifieke complementatie.
Geen van de hier beschreven procedures moeten een uitdaging naar labs uitgerust voor algemene moleculaire biologietechnieken. De LhG4 expressie systeem grondig is getest en zorgt ervoor dat niet-lekkende en tuneable expressie die kan worden gereden op hoog niveau8, hoewel wij waarschuwen dat het dynamisch bereik van de inductor concentratie empirisch moet worden bepaald voor elk stuurprogramma en effector lijn combinatie deze bewezen systeem te combineren met modulaire GreenGate klonen biedt een snelle en eenvoudige manier om afleidbare expressie in elk celtype waarvoor een specifieke promotor beschikbaar is. We hebben gemerkt dat gebeurtenissen kunnen plaatsvinden tijdens de amplificatie van plasmiden met de, die de repetitieve sequenties van de pOp-achtige promotor bevatten recombinatie. Deze resulteren vaak in met minder herhalingen van de reeks OP, die door PCR kan worden beoordeeld. Definitieve constructies moeten altijd worden bevestigd door sequentiebepaling in Escherichia coli en Agrobacterium tumefaciens. De occasionele recombinatie gebeurtenissen waren echter alleen gedetecteerd in E. coli.
Beperking van de toepassing van deze techniek is dus de tijd voor het genereren van transgene planten. Het is van cruciaal belang om te testen voor gene monddood maken, beginnen in de T2-generatie, en alleen het onderhouden van stabiele lijnen. Om te minimaliseren van de kans monddood maken, is het aan te raden het verzamelen van zaden enige vorm niet-geïnduceerde planten.
De hier beschreven techniek is gratis naar andere trans-activering systemen21,22, want het biedt een uitgebreide bron en weefsel specificiteit met afleidbare expressie combineert. Een mogelijke toekomstige ontwikkeling van deze methode is de opneming van meer cel type-specifieke initiatiefnemers naar station GR-LhG4, bijvoorbeeld in weefsels buiten de belangrijkste meristems. Met betrekking tot de effectoren is een spannende mogelijke uitbreiding de aanpassing van hoogefficiënte gen bewerkingsgereedschappen te voorzien in cel type-specifieke knock outs23.
De lijnen van de bestuurder in Schürholz et al. 20188 beschreven zijn verkrijgbaar bij NASC (http://arabidopsis.info/), DNA-constructs beschreven in Lampropoulos et al., 20132 en Schürholz et al., 20188 zijn verkrijgbaar bij Addgene (https://www.addgene.org/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Werk in onze laboratoria wordt ondersteund door de Duitse Research Foundation (DFG) subsidies WO 1660/6-1 (S.W.) en GR 2104/4-1 (T.G.) en SFB1101 (aan T.G. en J.U.L) en door een Europese Onderzoeksraad consolidator toekennen (PLANTSTEMS 647148) T.G. S.W. wordt ondersteund door de Emmy Noether Fellowship van de DFG door Grant WO 1660/2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
