Summary
Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.
Abstract
Expressão inducible, tecido-específica é uma ferramenta importante e poderosa para estudar a dinâmica espaço-temporal da perturbação genética. Combinando o GreenGate flexível e eficiente sistema com o comprovada e aferido LhGR sistema (aqui denominado GR-LhG4) para a expressão inducible de clonagem, geraram um conjunto de linhas de Arabidopsis transgênicas que pode guiar a expressão de um efetor gaveta em uma variedade de tipos de célula específica nos três os meristemas planta principal. Para este fim, escolhemos o sistema GR-LhG4 previamente desenvolvido, com base em um fator de transcrição quimérico e cognato pOp-tipo promotor garantindo controlo apertado sobre uma ampla gama de níveis de expressão. Além disso, para visualizar o domínio de expressão onde o fator de transcrição sintética está ativo, um repórter fluorescentes mTurquoise2 ER-localizada sob o controle do promotor pOp4 ou pOp6 é codificado em linhas de motorista. Aqui, descrevemos as etapas necessárias para gerar uma linha de driver ou efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium de Arabidopsis. Usando vários ou todos os driver de linhas, o efeito de contexto específico de expressar um ou múltiplos fatores (efetores) sob controle do promotor sintético pOp pode ser avaliadas rapidamente, por exemplo em plantas de F1 de um cruzamento entre um efetor e múltiplo linhas de motorista. Esta abordagem é exemplificada pela expressão ectópica de VND7, um factor de transcrição do NAC capaz de induzir a deposição de parede ectópica secundária de célula de forma autónoma de célula.
Introduction
Uma grande limitação em biologia na era postgenomic é para decifrar o papel específico do contexto de um determinado fator ou perturbação genética. Perturbações genéticas constitutivas como abordagens da função de perda e ganho-de-função muitas vezes só permitem a análise de ponto de extremidade de processos de adaptação ao longo da vida, ofuscando a distinção entre efeitos primários e secundários. Além disso, funções específicas do contexto podem ser mascaradas ou diluídas por efeitos de grande escala em tecidos distantes ou durante as outras fases do desenvolvimento. Além disso, em casos extremos, a letalidade pode exclui qualquer visão mecanicista. Idealmente, para contornar esses problemas, pode-se analisar o efeito aguda perturbação genética dentro de um contexto específico, como um tipo específico de célula de forma tempo-resolvido. Para conseguir isso, ferramentas genéticas para expressão de tipo específico de célula inducible, são necessários1. Para fornecer um recurso para a rápida avaliação da dinâmica de uma resposta a uma determinado efetoras spatiotemporal, combinamos a facilidade de clonagem fornecidos pelo sistema GreenGate2 com a eficácia comprovada do sistema a GR-LhG4,3, 4,5,6. Podemos ter gerado um conjunto de linhas que expressam o fator de transcrição quimérico que lhg4 fundido para o domínio de ligação do ligante do receptor (GR) corticoide rato7 sob o controle de célula bem caracterizadas de promotores específicos tipo8. Em condições de repouso, o fator de transcrição permanece fora do núcleo, como o domínio GR é ligado pelo HSP90 citosólica. Com a adição de dexametasona ligante sintético (Dex), translocação nuclear é induzida e LhG4 vai mediar a transcrição das fitas de expressão sob controle de um promotor de cognato sintético pOp-tipo , tais como um repórter mTurquoise2 incluídas nas linhas de motorista Visualizar o domínio de expressão após a indução. Assim, as linhas de motorista tecnicamente também contêm uma gaveta effector. O cruzamento de um conjunto de linhas de motorista com uma linha carregando uma gaveta effector com, por exemplo, um gene de interesse sob o controle do promotor pOp-tipo mesmo assim, permite a avaliação rápida das consequências agudas ou a longo prazo da expressão effector em uma ampla gama de tipos de células.
Aqui, nós fornecemos um protocolo descrevendo os procedimentos necessários para gerar as linhas de driver e efetoras e demonstrar como expressão específica do tipo celular pode ser induzida e seguido no meristema apical de fotos, a meristema apical de raiz e o cambium da Arabidopsis. Para ilustrar a valentia e a especificidade desta abordagem, nós utilizamos o fator de transcrição conhecidos VND7 que é capaz de conduzir o engrossamento em espiral do tipo xilema secundário celular parede ectopically9. Tratamento de F1 de um cruzamento entre o Carbono2grl3vuoluk10,11 motorista e a pOp6:VND7 effector linha leva à formação de células de xilema, como gravidez ectópica na bainha de amido células da Arabidopsis da haste.
Para facilitar a geração de grandes conjuntos de DNA necessária para a construção de plasmídeos de expressão driver e efetoras, usamos o rápido e eficiente GreenGate clonagem método2. GreenGate clonagem é baseado no tipo II S, enzimas de restrição como Eco31I ou sua isoschizomer BsaI2. Estas enzimas cortar a jusante de seus sites de reconhecimento assimétrica produzindo saliências com variando a composição de base. Incorporando o Eco31I /Bsaeu restrição sites em oligonucleotides e alocando sequências específicas saliência para elementos de DNA, clonagem modular é alcançado, facilitando a geração de grandes módulos (assemblies). No quadro GreenGate, módulos de DNA se enquadram em categorias A-F com base na sequência de saliência que servem como adaptadores e são montadas nessa ordem. Portanto, as primeiras demão projetadas para amplificar seu produto desejado devem estar de acordo com o módulo selecionado2 (figura 1A). Se há um interno Eco31I /Bsaeu site e a sequência não é compatível com os módulos de entrada e destino GreenGate, você pode prosseguir sem mutagenizing, mas com menor eficiência. Como alternativa, use o mutagenesis local-dirigido para remover Eco31I /Bsaeu locais de restrição, tomando cuidado para não alterar os aminoácidos em produtos de genes.
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Protocol
Vetores e módulos podem ser obtidos no repositório sem fins lucrativos, Addgene (https://www.addgene.org).
1. clonagem usando GreenGate
- Cartilhas do projeto usando as saliências listadas na tabela 1, substituir 'NNNN' com sequências de tipo-específico do adaptador do módulo listado abaixo: para a frente: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + 3´ de sequência específica, reverter: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + reverso complemento de 3´ sequência específica. Adicione as bases sublinhadas para garantir a manutenção do quadro de leitura.
Saliências de módulo:
Nota: no âmbito GreenGate padrão, seis módulos, A-F, são montados com um backbone de vetor de transformação de plantas em uma expressão do plasmídeo (Figura 1). Normalmente, o um módulo dará abrigo sequências de promotor, um B-módulo um N-terminal tag ou "dummy" sequência6, um C-módulo um CDS, uma marca D-módulo C-terminal ou manequim, um módulo E um terminador e um F-módulo uma gaveta de resistência para a seleção dos transgênicos plantas. Adaptador para acoplamento com outras unidades preassembled estão disponíveis para uso em vez do F de módulo2. - Amplificação por PCR
- Amplifica a sequência de interesse com os primers desenhados por reação em cadeia da polimerase (PCR) de acordo com protocolos padrão.
- Separe o produto do PCR em um gel de agarose. Impostos especiais de consumo e coluna purificam o fragmento correto usando um comercial kit (veja a Tabela de materiais) conforme as instruções do fabricante.
- Criação do módulo de entrada
- Separadamente, digerir o vetor de módulo e o fragmento PCR (etapa 1.2.) (Figura 1 A, B) com Eco31I/Bsaeu usando 100-500 ng de DNA (vetor ou fragmento), 3 µ l 10 x buffer de digestão e 5-10 U Eco31I em um tubo e levar o volume a 30 µ l com DDQ2O.
- Misture delicadamente por pipetagem para cima e para baixo e spin-down brevemente a 1.000 x g. Incube a 37 ° C, em um bloco de calor por 15 min (ou na sequência da recomendação de tempo a enzima de restrição comprado).
- Após a digestão, a coluna purificar cada amostra usando um comercial kit (veja a Tabela de materiais) e quantificar o DNA obtido através da determinação da densidade óptica em 260 nm (OD260), utilizando um espectrofotômetro.
- Mix de 30 a 100 ng digerido insert e o vetor de ng digerido 10 – 50 pipetando acima e para baixo várias vezes e incubar com 1 µ l T4 Ligase (5 U / µ l e 3 µ l 10 x buffer de ligadura T4 em um volume total de 30 µ l à temperatura ambiente durante 1 h (seguindo a recomendação do fornecedor T4 ligase) (ver Tabela de materiais).
Nota: Calcule o vetor de módulo: destino de entrada desejada relação molar (por exemplo, 3:1) para a ligadura dependendo da concentração e comprimento das inserções do módulo de entrada. - Para aumentar a eficiência de transformação, o calor inativar o T4 ligase incubando a reação a 65 ° C por 20 min.
- Uso o produto da ligadura para transformar competentes de Escherichia coli células de acordo com os protocolos de laboratório padrão e a propagação de bactérias em placas de ágar suplementadas com ampicilina (100 µ g/mL)
- Incube a placa com bactérias a 37 ° C durante a noite.
- Tela para colônias com o módulo de entrada desejado por PCR utilizando os primers 86A1 (5 '-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3 ') e 86A2 (5 '-GTTTTCCCAGTCACGACG-3 ') e condições padrão PCR de colônia.
Nota: Esta combinação de cartilha é válida para todos os módulos de entrada como os primers bind para o backbone do vetor de entrada. - Selecione única colônias para o isolamento do plasmídeo. Use cultura líquida de 2 mL LB suplementada com ampicilina (100 µ g/mL) e incubar durante uma noite em um shaker de 37 ° C.
- Plasmídeos isolados da cultura líquida durante a noite com um Kit de mini-preparação ou a extração desejada protocolo (consulte Tabela de materiais).
- Para identificar os plasmídeos com a inserção correta, executar análise de enzimas de restrição, por exemplo selecionando duas enzimas que cortam com exclusividade na sua inserção pela mistura de 200 ng do plasmídeo, 2 µ l 10 x buffer de digestão, 5-10 U de selecionado enzimas de restrição e ddH2 O a 20 µ l.
- Sequenciar os plasmideos selecionados usando as primeiras demão 86A1 e 86A2 (consulte a etapa 1.3.9.).
- Criação do módulo de destino:
Nota: Para o plasmídeo de destino use o destino desejado módulo pGGZ001, pGGZ002 ou pGGZ0032 (Figura 1).- Em um tubo adicione e misture o vetor de destino vazio 50-150 ng (pGGZ003, por exemplo), cheio de 50 a 300 ng de cada módulo de entrada, 2 µ l 10 x buffer de buffer de digestão, 1,5 µ l 10mm ATP, 1 µ l T4 Ligase (30 U / µ l), 5-10 µ l de U Eco31I e dH2O para um volume total de 20 µ l.
Nota: Calcule o vetor de módulo: destino de entrada desejada relação molar (por exemplo, 3:1) para a ligadura dependendo da concentração e comprimento das inserções do módulo de entrada. - Misture e realizar a reação GreenGate2 usando um PCR thermocycler alternando 30 vezes entre 37 ° C por 5 min e 16 ° C por 2 min, seguido por passos simples de 5 min a 50 ° C e 5 min a 80 ° C.
- Para aumentar a eficiência, adicionar 1 µ l T4 Ligase (30 U / µ l) e 1,5 µ l 10mm ATP para a reação e incube por 1h à temperatura ambiente, seguida por calor-inactivação de T4 DNA Ligase a 65 ° C por 20 min.
- Utilize a reação da ligadura competentes de Escherichia coli e espalhar as bactérias em placas de ágar, suplementadas com a espectinomicina apropriado agente seletivo (50 µ g/mL).
- Incube a Escherichia coli transformada na placa a 37 ° C durante a noite.
- Para confirmar a transformação, re-marcam cada uma das colónias única selecionadas na espectinomicina (50 µ g/mL) e ampicilina (100 µ g/mL) contendo placas, respectivamente. Use apenas as colônias que crescem em espectinomicina mas não em placas de ampicilina.
- Incubar as colônias de Escherichia coli durante a noite a 37 ° C.
- Selecione única colônias para isolamento do plasmídeo. Use cultura líquida de 2 mL LB suplementada com espectinomicina (50 µ g/mL) e incubar durante uma noite em um shaker de 37 ° C.
- Isolar o plasmídeo correspondente com um Kit de mini-preparação (ver Tabela de materiais).
- Verifique pela análise de enzimas de restrição (Veja 1.3.12.) e sequência selecionada positivas construções usando as primeiras demão 88 3 (5 '-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3. '), 88 4 (5 '-CCTTTTTACGGTTCCTG-3 '). Se a inserção não pode ser totalmente sequenciada com estas primeiras demão, projetar primers internos para sequenciamento.
Nota: Para identificar clones com o número correto de sequências de repetição pOp (ver discussão), as primeiras demão pOp6 (pOp6_F, 5 '-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3 '; e pOp6colaram, 5 '-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3 ') que se ligam na suma, flanquear sequências pode ser usado para amplificação por PCR e eletroforese em gel subsequentes para discriminar por tamanho.
- Em um tubo adicione e misture o vetor de destino vazio 50-150 ng (pGGZ003, por exemplo), cheio de 50 a 300 ng de cada módulo de entrada, 2 µ l 10 x buffer de buffer de digestão, 1,5 µ l 10mm ATP, 1 µ l T4 Ligase (30 U / µ l), 5-10 µ l de U Eco31I e dH2O para um volume total de 20 µ l.
- Criação de supermodule intermediário
- Para combinar dois conjuntos independentes de módulos de entrada, conforme necessário para gerar as GR-LhG4 motorista linhas com gaveta integrada repórter-effector, primeiro construir dois plasmídeos intermediário, chamadas supermodules2, antes de montar a expressão final plasmídeo em pGGZ001 ou pGGZ003.
- Não se esqueça de adicionar o adaptador F-H no final do primeiro supermodule e adaptador de H-A no início da segunda supermodule (aqueles que servem como conexões entre duas construções) como descrito2.
Nota: Apenas o módulo intermediário pGGN000 carrega a gaveta de resistência. Para gerar o plasmídeo de expressão, realize a reação GreenGate com o vetor de destino e os pGGN000 e pGGM000 supermodules de intermédios. Como alternativa, misture o vetor de destino, pGGN000 supermodule de intermédios e os restantes módulos simples para realizar a reação de GreenGate2. O último método é menos eficiente do que o anterior, mas pode ser mais rápido. - Para criar um supermodule de pGGM000/pGGN000, misture 1,5 µ l (100-300 ng / µ l) de cada um dos módulos de entrada com 1 µ l (30 ng / µ l) vazio intermediário vetor (pGGM000 ou pGGN000), buffer de digestão 2 µ l x 10, 1,5 µ l 10mm ATP, 1 µ l T4 Ligase (30 U / µ l) e 5-10 U Eco31I em um volume total de 20 µ l.
Nota: Calcular o vetor de módulo: destino de entrada desejada relação molar (por exemplo, 3:1) para a ligadura dependendo da concentração e comprimento das inserções do módulo de entrada - Misture e realizar a reação GreenGate etapa 1.4.2
- Para aumentar a eficiência, adicionar 1 µ l T4 Ligase e 1,5 µ l ATP (10 mM) e incube por 1h à temperatura ambiente, seguida por calor-inativação a 65 ° C por 20 min.
- Use 10 µ l de reação da ligadura para transformar competentes de Escherichia coli e raia em placas contendo canamicina (50 µ g/mL).
- Realizar a incubação durante a noite da transformada e. coli na placa a 37 ° C.
- Re-marcam cada uma das colónias única selecionadas na canamicina (50 µ g/mL) e ampicilina (100 µ g/mL) contendo placas, respectivamente.
- Realizar a incubação overnight das colônias Escherichia coli na placa a 37 ° C.
- Selecione única colônias que crescem apenas em canamicina mas não ampicilina para isolamento do plasmídeo. Use cultura líquida de 2 mL LB suplementada com canamicina (50 µ g/mL) e incubar durante uma noite em um shaker de 37 ° C.
- Isolar o plasmídeo correspondente usando um prep mini kit (veja a Tabela de materiais).
- Verifique o plasmídeo por análise de enzimas de restrição (Veja 1.3.12.) e confirmar por sequenciamento utilizando primers 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) e 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) recozimento à coluna vertebral pGGM000/pGGN000. Se a inserção não pode ser totalmente sequenciada com estas primeiras demão, projetar primers internos para sequenciamento.
Nota: Se a clonagem em vetores pGGM000 ou pGGN000 não for bem sucedida, uma solução possível é digerir o pGGM000 ou pGGN000 com Eco31I, executado em um gel e purificar do gel, o fragmento de espinha dorsal (aproximadamente 2000 bp) pGGM000 ou pGGN000 sem o gaveta de ccdB (aproximadamente 1400 bp). Prossiga normalmente com a reação da ligadura.
- Transforme uma tensão de pSOUP+ da . tumefaciens (por exemplo, ASE), como a origem de replicação (ori r. tum...) em vetores o destino do pSa exigem a presença do auxiliar do plasmídeo pSOUP12. Raia para fora as bactérias em placas LB contendo cloranfenicol (34 µ g/mL), canamicina (50 µ g/mL), espectinomicina (50 µ g/mL) e tetraciclina (12,5 µ g/mL). Incube o transformado a. tumefaciens na placa em uma incubadora de 28 ° C durante dois ou três dias.
2. geração de plantas transgênicas de Arabidopsis
- Transformação de Arabidopsis thaliana.
Nota: Transforme a. thaliana plantas de acordo com Zhang et al., 2006,13. - Seleção de linhas transgénicas.
- Para selecionar as plantas transformadas, use o esquema de seleção usado no GABI-Kat14 para resistência à sulfadiazina15.
- Para selecionar linhas estáveis com um evento de integração único possível, escolha aqueles em geração T2, que mostram a relação de 3:1 segregação no marcador de resistência. Propagar essas linhas para geração de T3 e selecionar as plantas homozigotos para o gene de resistência. Como alternativa, execute uma análise de Southern Blot ou um padrão quantitativo em tempo real do PCR (SA-qPCR)16 para selecionar linhas de inserção única.
3. indução de trans-ativação em linhas de motorista de Arabidopsis
- Raiz
- Para testar a expressão de repórter na . thaliana motorista linhas geradas através as etapas 1 e 2, esterilizar as sementes, como descrito abaixo.
- Adicionar 0,5-1,0 mL de 70% etanol + 0,01% de detergente não-iônico para cerca de 100 sementes (20 mg) em um tubo de reação de 1,5 ml e inverter o tubo algumas vezes. Spin para baixo a 1000 x g por 15 s e aspire o sobrenadante.
- Adicionar 0,5-1,0 mL de etanol absoluto. Inverter o tubo várias vezes, spin para baixo para 1.000 x g durante 15 s e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 0,5-1,0 mL de etanol absoluto e inverter o tubo t algumas vezes, então spin para baixo a 1.000 x g durante 15 s e descartar o sobrenadante.
- Permitir que as sementes secar o interior do capô. Se as sementes vão ser estratificada em tubos de continuar com a etapa 3.1.1.6.
- Adicionar 0,5-1,0 mL de água estéril e inverter o tubo algumas vezes. Spin para baixo a 1.000 x g durante 15 s e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 0,5-1,0 mL de água estéril e inverter o tubo várias vezes. Spin para baixo a 1.000 x g durante 15 s e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 0,5-1,0 mL de água estéril.
- Prepare meia-força Murashige e Skoog médio, pH 5,8 e adicionar 0,9% planta agar e 1% de sacarose. Após a autoclavagem adicionar dexametasona (Dex), dissolvidos em DMSO, para uma concentração final de 10-30 µM para placas de indução e uma quantidade igual de DMSO para placas de controle, respectivamente.
- Colocar as sementes para a imagem latente de raiz em placas e estratificá-los por 48 h em escuridão e o frio (4 ° C).
- Coloque as placas na posição vertical em uma incubadora de planta (longo dia 16/8 h, 22 ° C, umidade, 65%) e cultivá-las por cinco dias.
- Cinco dias após a germinação (dag), as mudas usando laser confocal, microscopia eletrônica de varredura da imagem.
- Para testar a expressão de repórter na . thaliana motorista linhas geradas através as etapas 1 e 2, esterilizar as sementes, como descrito abaixo.
- Haste
- Esterilize as sementes conforme descrito em 2.1.1. e coloque as sementes ½ MS, ágar de planta de 0,9% e placas de sacarose 1%. Estratificar por 48 h em escuridão e o frio (4 ° C).
- Seis a sete dias após a germinação, transferi as mudas para o solo, cada planta em um único pote (longo dia 16/8 h, 22 ° C, umidade, 65%).
- Induzi trans-ativação em hastes regando com Dex ou solução simulada, ou mergulhando as plantas em Dex ou simulado, respectivamente.
- Para molhar, use uma solução de Dex 25 µM em água, preparada a partir de um estoque de 25 mM Dex dissolvido em etanol. Água a cada 2-3 dias até o tempo desejado de indução.
- Para mergulhar, prepare um copo de 1 L, 750 mL de água contendo 0,02% silwet L-77 com 25 µM de Dex ou quantidade equivalente de DMSO de Dex e tratamento simulado, respectivamente. Molhar plantas individuais por 30 s na indução ou na solução de simulação. Repeti a cada 2-3 dias até o tempo desejado da imagem.
Nota: Após a imersão, as plantas devem ser mantidas em alta umidade durante uma hora.
- Atire meristema Apical (SAM)
- Esterilize as sementes conforme descrito em 2.1.1. Preparar pratos com ½ MS, ágar de planta de 0,9% e 1% médio de sacarose e colocar as sementes em placas. Armazene as placas durante dois dias na escuridão e o frio para estratificação.
- Coloque as placas na posição vertical em uma incubadora de planta. Seis a sete dias após a germinação, transferi as mudas para o solo, cada planta em um único pote (longo dia 16/8 h, 22 ° C, umidade, 65%).
- Quando a haste é cerca de 1 cm de comprimento (25-30 dag), pulverize a inflorescência SAM com 10-50 µM Dex em H20 usando uma máscara de rosto. Para a indução e a imagem latente em fases posteriores do desenvolvimento, induzi SAMs de hastes mais ou brotações laterais.
Nota: SAMs também podem ser induzida por paintbrushing a solução de Dex para evitar que gotas de pulverização. Use uma máscara quando Dex é aplicado por pulverização. - 24-48 h após a indução, dissecar as SAMs e proceder à imagem (ver 4.3).
Nota: Apenas un-induzida de plantas foram usadas para propagação para reduzir a probabilidade de silenciamento. Plantas em T2/T3 foram usadas para a imagem latente.
4. imagem de expressão de repórter em linhas de motorista de Arabidopsis .
- Raiz
- Transferência de mudas de placa para uma solução de iodeto (PI) de propidium µ g/mL 10 e Counter-manchá-las por 5 min.
- Colocar as raízes em um microscópio de imagem câmara (câmara de cultura do tecido 1-bem no vidro tampa II, consulte Tabela de materiais) e imagem-los usando um laser confocal microscópio com um 63 x objetivo de imersão de água (ver Tabela de materiais).
- Para visualizar a fluorescência de PI, use um comprimento de onda de excitação de 488 nm e coletar a emissão entre 590 e 660 nm. Para mTurquoise2 fluorescência usar 458 excitação nm e recolher das emissões entre 460 e 615 nm.
- Haste
- Executar a mão horizontal seções de corte de caules das plantas com uma lâmina de barbear, excisão de um segmento de aproximadamente 3 cm. fixar a haste com o dedo no lado oposto da seção desejada para cortar. Executar vários cortes bem sequencialmente, mas note que apenas as seções de uma posição semelhante no tronco devem ser comparadas.
- Após cada corte, mergulhe a lâmina de barbear em uma placa de Petri contendo água da torneira e recolher as seções de tronco. Mancha seções neste ponto ou montar diretamente em corrediças do microscópio.
- Para a coloração, preparar um 1 mL 250 µ g/ml de solução de PI de água em um pequeno prato de petri (ver Tabela de materiais). Mergulhe as seções por 5 min e enxágue-os em água. Transferi-los para corrediças do microscópio com pinça fina ou um pincel fino. Tome cuidado para não apertar as amostras com a lamela.
- Imagem de amostras usando um laser confocal microscópio com um 25 x mergulhando lente de imersão de água (ver Tabela de materiais). Diodo emissor de luz de uso 561 nm laser para excitar a fluorescência de PI e coletar de 570 a 620 nm. Uso de 405 nm para excitar o efetor de fluoróforo mTurquoise2 codificado pelo driver linha construções e coletar emissão de 425 a 475 nm.
- Atire meristema Apical
- Corte o caule 2 cm abaixo da ponta do tiro com a pinça. Segure o tronco com uma mão e use a pinça fina para remover os botões florais e grande primordia. Para remover o jovem primordia, consertar o SAM em uma posição ereta em uma placa de Petri contendo 3% de agarose. Use um binóculo e a pinça para remover primordia jovem perto do SAM. Como alternativa, usar uma cânula de injeção (consulte a Tabela de materiais) para cortar estes primordia.
- Mancha o SAM dissecado em uma solução de 250 µ g/mL PI para 5-10 min. executar diretamente por pipetagem algumas gotas de solução em cima do SAM preparado a coloração coloração ou transfira a amostra para um tubo preenchido com solução de coloração. Mantenha o SAM totalmente submerso durante o processo de coloração.
- Coloque o SAM manchado em um pequeno prato de petri (ver Tabela de materiais) com 3% agarose médio e cubra o SAM com DDQ2O.
- Imagem dissecado SAMs usando um laser confocal microscópio equipado com um 25 x mergulhando lente de imersão de água (ver Tabela de materiais).
- Diodo emissor de luz de uso 561 nm laser para excitar a fluorescência de PI e coletar de 570 a 620 nm. Uso de 405 nm para excitar a mTurquoise2 fluoróforo e coletar a emissão de 425 a 475 nm.
Gravar imagem empilha abrangência 50 µm na direção-z com um tamanho de passo de 0,5 µm.
Nota: SAM de imagem conforme descrito aqui requer um laser confocal vertical digitalização microscópio e uma lente (aqui, uma água mergulhando lente) com longa distância de trabalho.
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Representative Results
Geração de linhas de driver e efetoras através de clonagem GreenGate
O GreenGate clonagem sistema baseia-se na GoldenGate clonagem e uso a endonuclease de restrição do tipo IIS Bsaeu ou sua isoschizomer Eco31I. Como saliências produz a enzima distante do seu local de reconhecimento assimétrica, a composição de base das saliências podem ser livremente escolhido, que é a base forma a modularidade do sistema. Cada elemento gerado pelo PCR, por exemplo, uma sequência de promotor, CDS ou terminador, primeiro é inserido em um vetor de entrada designado com saliências produzidas por síntese da restrição para gerar um módulo de correspondência. Depois de subcloning, um número de módulos correspondentes, geralmente seis, é utilizado para reação da ligadura GreenGate resultando na Assembleia da construção de um vetor de destino planta binário.
Para linhas de motorista, módulos que contém as sequências de DNA de tecido-específica promotor (pTS), o fator de transcrição GR-LHG4, o promotor pOp6 e o repórter mTurquoise2 fundiram a um peptídeo sinal do N-terminal e um sinal de retenção ER C-terminal foram fundido incluindo terminadores e vários módulos de adaptador e um módulo para a seleção de transgênico, conforme descrito anteriormente, 2,8 (Figura 2). Efetoras linhas foram construídas com pOp6 promotor e uma gaveta efetoras, por exemplo, consistindo de um gene de interesse e Exterminador do futuro, bem como um módulo de codificação de um gene de resistência para a seleção de plantas transgênicas (Figura 2).
Indução de motorista linhas e visualização de fluorescência de repórter
Indução com Dex leva à expressão de mTurquoise2 específico de tipo de célula na endoderme da raiz (Carbono2grl3vuoluk>> SP-mTurquoise2-HDEL, Figura 3A), precursores do floema e cambium (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, Figura 3B) e as células-tronco no meristema apical de fotos (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, Figura 3).
Trans-ativação de VND7 em células de bainha de amido do cambium
Como um caso de teste para trans-ativação, geramos uma codificação de linha efetor que o fator de transcrição mestre parede celular secundária VND7 fundiu-se ao domínio de ativação VP16, que tem sido mostrado para induzir a célula de formação de parede celular secundária autonomamente quando misexpressed 8,9,19,20.
Após 5 dias de um tratamento único com 15 µM de Dex ou DMSO para o induzido ou as plantas simuladas respectivamente, tronco seções estavam preparadas para a visualização de lignificação ectópica na bainha de amido. Iodeto de propidium mostra a tronco forte afinidade ao tecido alisamento prévio. As células de bainha de amido no induzido amostras por Dex, mas não a simulação mostrou um forte sinal para o canal de PI e algumas células apresenta o típico reticulado espessamento da parede celular nas células do xilema (Figura 4).
Figura 1. O GreenGate princípio de clonagem. A) as endonucleases de restrição do tipo IIS, como BsaeuEco31I, reconhecer sequências não-palíndromo (vermelho) e corte assimetricamente em uma distância definida independentemente da sequência (azul). Eco31I reconhece 'GGTCTC', cortes desde o nucleotídeo segundo a jusante do site reconhecimento e cria uma saliência quatro base 5'. B) o GreenGate clonagem sistema baseia-se em um sistema modular com seis vetores de entrada diferentes pGGA000-pGGF000. Estes vetores contêm uma gaveta de resistência de ampicilina (AmpR) e um estojo de ccdB ladeado pelos adaptadores específicos para cada vetor de entrada (por exemplo pGGA000 vetor de entrada) e o reconhecimento de 'GGTCTC' Eco31I sites. Digestão de Eco31I de pGGA000 libera ccdB e cria as saliências de nucleotídeo quatro pGGA000 específicos (azul escuro). Insert1 é amplificado por cartilhas abrigando 'GGTCTC' e pGGA000 adaptadores específicos e após digestão ligados em pGGA000. O mesmo procedimento com os outros módulos. C) a reação de GreenGate final combina a digestão Eco31I de pGGZ001 de vetor o destino e a entrada de seis vetores pGGA000-pGGF000 e a ligadura simultânea de todos os módulos para o vetor de destino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Visão geral do sistema de Dex-inducible LhGR/pOp com linhas de driver e efetoras. Em linhas de motorista, promotores tecido-específica (pTS) controlam a expressão do fator de transcrição sintética LhG4, que é fundida translationally para o domínio de ligação do ligante do receptor de glicocorticoide de rato (GR) e, assim, impede que, na ausência de Dex, a translocação nuclear. A linha effector abriga uma gaveta transcriptional guiada por um elemento pai e uma caixa TATA com um promotor 35S de mínima. Cruzou com uma linha de motorista e após indução de Dex, GR-LhG4 vincula-se aos elementos pOp-tipo na gaveta repórter e no módulo effector, induzindo a transcrição de mTurquoise2 e o efetor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Linhas de condutor induzido em raiz, caule e SAM. A) linha de motorista induzida por Dex Carbono2grl3vuoluk >>SP-mTurquoise2-HDEL (germinadas em 50 µM Dex) na raiz e tratamento simulado. O promotor de espantalho (Carbono2grl3vuoluk) Medeia a expressão na endoderme, córtex/endoderme inicial (CEI) e centro quiescente (QC). As células são Counter-manchadas com iodeto de propidium (PI). Escala de barras = 20 µm. B) linha de motorista induzida por Dex pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (mergulhado em uma solução de Dex 50 µM e visualizado após 3 dias) no tronco e tratamento simulado. Promotor de SMXL5 (pSMXL5) Medeia a expressão nos precursores de domínio e floema de células-tronco do cambium. As células são Counter-manchadas com iodeto de propidium (PI). Barras de escala = 100 µm. C) linha de motorista induzida por Dex pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 µM, 48 h), o Sam. O promotor de CLAVATA3 (pCLV3) Medeia a expressão no domínio de células-tronco. Fotos no fundo mostram XZ e YZ secções transversais, Dex-induzido e trocista tratados, respectivamente. As células são Counter-manchadas com iodeto de propidium (PI). Escala de barras = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Gravidez ectópica lignificação na bainha de amido da haste. A) gravidez ectópica lignificação é vistos cinco dias após a indução da Dex da linha motorista Carbono2grl3vuoluk >> VND7-VP16 no tronco. O promotor de espantalho (Carbono2grl3vuoluk) Medeia a expressão nas células da bainha de amido no tronco. Imagem à esquerda mostra mesclagem de canal de PI e campo claro, certo imagem mostra apenas o canal de PI. B) o controle de simulação não mostra nenhum sinal nas células da bainha de amido. As células são Counter-manchadas com iodeto de propidium (PI). Barras de escala = 100 µm. PI fluorescência é falso-cor verde ao cloroplasto auto fluorescência é vermelha em todas as imagens. Pontas de seta brancas apontam para as células da bainha de amido. Imagem à esquerda mostra mesclagem de canal de PI e campo claro, certo imagem mostra apenas o canal de PI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Módulo | 5' saliência | normalmente usado para | 3' saliência |
| A | ACCT | promotor | AACA |
| B | AACA | Marca do N-terminal | GGCT |
| C | GGCT | Sequência de código | TCAG |
| D | TCAG | Marca do C-terminal | CTGC |
| E | CTGC | Exterminador do futuro | ACTA |
| F | ACTA | gaveta de resistência | GTAT |
Tabela 1: Balanços, usados para o projeto da primeira demão
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Discussion
Aqui, descrevemos os passos necessários para gerar e aplicar um conjunto de ferramentas abrangente e versátil para inducible, célula tipo específico trans-ativação. Atravessando a fronteira transportando cassettes effector sob controle do promotor pOp com linhas de motorista permite estudar os efeitos de expressão mis na geração F1, permitindo a rápida avaliação de perturbação genética em uma ampla gama de tipos de células. Alternativamente, effector construções podem ser usadas para transformar linhas de motorista ou, adaptando-se a estratégia de clonagem, motorista e efetoras construção também pode ser combinada em um T-DNA. Aplicações para esta faixa de sistema de espacial e temporalmente controlaram estudos mis expressão ao domínio específico. o knock-down ou complementação específica edição e célula-tipo de gene.
Nenhum dos procedimentos descritos aqui deve representar um desafio para laboratórios equipados para as técnicas de biologia molecular geral. O sistema de expressão LhG4 tem sido exaustivamente testado e garante níveis de expressão não-gotejantes e ajustável que pode ser conduzido para alta8, embora nós advertimos que a gama dinâmica de concentração de indutor deve ser determinada empiricamente para cada driver e combinação de linha effector combinando este sistema comprovado com a clonagem de GreenGate modular oferece uma maneira rápida e simples de expressão inducible em qualquer tipo de célula para que um promotor específico está disponível. Notamos que eventos podem ocorrer durante a amplificação de plasmídeos que contêm as sequências repetitivas do promotor pOp-tipo de recombinação. Estas muitas vezes resultam em ter menos repetições da sequência de OP, que podem ser avaliados por PCR. Construções de finais sempre devem ser confirmadas por sequenciamento em Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens. No entanto, os eventos de recombinação ocasional só foram detectados em e. coli.
Limitar a aplicação dessa técnica é, portanto, o tempo para gerar plantas transgênicas. É de importância crítica para testar gene silenciar, começando na geração T2 e apenas manter linhas estáveis. Para minimizar a chance de silenciar, aconselhamos a coleta de plantas sementes única forma não induzida.
A técnica descrita aqui é cortesia para outros trans-ativação sistemas21,22, pois fornece um recurso abrangente e combina a especificidade de tecido com expressão inducible. Um possível futuro desenvolvimento desse método é a incorporação de mais promotores de tipo específico de célula para unidade GR-LhG4, por exemplo nos tecidos fora os principais meristemas. Em matéria de efetores, uma excitante possível expansão é a adaptação do gene altamente eficiente ferramentas para permitir a células específicas do tipo batida saídas23de edição.
As linhas de motorista descritas em Schürholz et al 20188 estão disponíveis do NASC (http://arabidopsis.info/), construções de DNA descrito em Lampropoulos et al., 20132 e Schürholz et al, 20188 estão disponíveis em Addgene (https://www.addgene.org/).
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Trabalho em nossos laboratórios é suportado pelo Fundação de pesquisa alemã (DFG) subvenções WO 1660/6-1 (S.W.) e GR 2104/4-1 (T.G.) e SFB1101 (para T.G. e J.U.L) e por um Conselho Europeu de investigação consolidador conceder (PLANTSTEMS 647148) de T.G. S.W. é suportado através de Emmy Noether comunhão da DFG através de Grant WO 1660/2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
References
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